ES2246769T3

ES2246769T3 - Composicion de acidos grasos que contiene al menos 80% en peso de epa y dha o sus derivados y su uso farmaceutico.

Info

Publication number: ES2246769T3
Application number: ES00110811T
Authority: ES
Inventors: Hajime Shibuya
Original assignee: Pro Aparts Investimentos e Consultoria Ltda
Current assignee: Pro Aparts Investimentos e Consultoria Ltda
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2000-05-22
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2020-05-22
Also published as: DE60022987T2; DK1157692T3; DE60022987D1; ATE305810T1; EP1157692B1; EP1157692A1; PL347655A1

Abstract

Composición de ácidos grasos que contiene al menos 80% en peso del ácido 5, 8, 11, 14, 17-eicosapentanoico(EPA) C20:5 W-3 (enlaces dobles todos cis) y ácido 4, 7, 10, 13, 16, 19-docosaexaenoico (DHA) C22:6 W-3 (enlaces dobles todos cis), en la que la proporción EPA:DHA es entre 0, 9 y 1, 5 y otros ácidos W-3 C C20, C21 y C22 constituyen menos del 3% y en la que dichos ácidos pueden estar presentes en la forma de ácidos libres o sus sales o ésteres de alquilo de cadena corta C1-C3.

Description

Composición de ácidos grasos que contiene al menos 80% en peso de EPA y DHA o sus derivados y su uso farmacéutico.

La presente invención se refiere a una composición de ácidos grasos que contiene al menos 80% en peso del ácido 5,8,11,14,17-eicosapentanoico (EPA) y del ácido 4,7,10,13,16,19-docosaexanoico (DHA) (todos los dobles enlaces cis), o sus derivados, en la que la proporción entre EPA y DHA es entre 0,9 y 1,5 y otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} constituyen menos del 3 por ciento, y a su utilización farmacéutica.

En la década de 1970, Bang, Dyerberg y otros autores informaron a la comunidad científica sobre los beneficios útiles potenciales de una dieta que contiene una fuente de ácidos grasos poliinsaturados como los aceites de pescado (H.O. Bang et al., Lancet 1, 1143, 1971; J. Dyerberg et al., Am J. Clin. Nutr. 28, 958, 1975).

Mediante el estudio de una población de Esquimales de Groenlandia, descubrieron que aunque su dieta era relativamente rica en ácidos y pobre en carbohidratos, la incidencia de enfermedades cardiovasculares era muy baja en comparación con otras poblaciones y con la opinión científica del momento.

Entre los descubrimientos sintomáticos de menor importancia se vio mediante ensayos serológicos que los Esquimales tenían niveles plasmáticos de lípidos totales, colesterol, lipoproteínas y triglicéridos menores que los de los Esquimales que vivían en Dinamarca que se tomaron como grupo de referencia.

En base a un análisis en profundidad del patrón lipídico, se pensó que las diferencias podrían atribuirse a los niveles altos de ácidos \omega-3 poliinsaturados de la dieta de los Esquimales que de hecho ingerían grandes cantidades de grasas todas de origen marino (aceites de pescado), que contenían porcentajes altos de dichos ácidos. También se concluyó que las diferencias podrían no tener un origen genético, ya que los Esquimales que migraron a Dinamarca y que se vieron obligados a seguir una dieta más de tipo occidental, más rica en grasas saturadas, mostraron una incidencia de enfermedades cardiovasculares más similar a la de los Esquimales que habían nacido y crecido en Dinamarca (J. Dyerberg et al., Dan. Med. Bull. 24, 52, 1977; J. Dyerberg et al., Lancet 2, 117, 1978; ibid 2, 433, 1979).

Debido a que la patología cardiovascular es la causa principal de mortalidad en todos los países, más que las enfermedades tumorales, resulta obvio que dichos descubrimientos podían resultar en un número enorme de estudios e investigaciones durante las décadas siguientes, residiendo el mayor compromiso en el campo científico y farmacéutico.

Un propósito adicional de dichos estudios ha sido verificar el intervalo de los efectos posibles de los ácidos grasos \omega-3, aparte del control de la homeostasis, en el patrón lipídico y en la aterosclerosis (Bang, Dyerberg, etc., mencionados más arriba), también en enfermedades mediadas por el metabolismo tales como hipertensión (R. Lorenz et al., Circulation 67, 504, 1983; J.Z. Mortensen et al., Thromb. Haemost., 50 543, 1983), enfermedades tumorales (R.A. Karamali et al., J. Nat. Cancer Inst. 75, 457, 1984), diabetes, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, etc., así como en los mecanismos de acción implicados, relacionados habitualmente con la acción de todos los eicosanoides C_{20} y sus metabolitos (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos, leucotrienos).

Los resultados de dichos estudios resultaron en conocimientos numerosos e importantes respecto a los efectos de los ácidos \omega-3, pero se necesita profundizar en las investigaciones en este campo debido a que la mayoría de dichos estudios mostraron fallos graves como se subraya en las revisiones de los estudios disponibles (H.R. Knapp et al., Proceeding of AOCS Short Course on polyunsaturated fatty acids and eicosanoids, editor W.E.M. Lands, páginas 41-55, American Oil Chemists Society; K.B\diameternaa, Tidskr. Nor. Laegeforen N.28, 1987, 2425-8).

Pensamos que desafortunadamente demasiados de dichos estudios han sido realizados en los "aceites de pescado" como tales o refinados de manera sencilla o alternativamente en los denominados ácidos \omega-3 como si fueran entidades únicas o mezclas "simples" o mezclas reproducibles, también debido a la extrema dificultad de purificar dichas mezclas complejas y/o de aislar los componentes individuales todos muy similares entre sí respecto a sus propiedades físicas y químicas: todo esto ha dificultado- sólo con algunas excepciones- detectar y definir los efectos de los componentes individuales. Por ejemplo, el efecto de los aceites de pescado en la prevención de la aterosclerosis o hiperlipemia, reivindicado por Dyerberg et al. (véase más arriba), por Casali et al., J. Surg. Res., 40, 6, 1986; por Weiner et al., N. Engl. J. Med., 315, 841, 1986; por H.R. Davis et al., Artheriosclerosis 7, 441, 1987; ha sido desmentido por J. Thiery et al., Atherosclerosis 63, 53, 1987.

De manera similar, el efecto en la enfermedad coronaria ha sido evaluado por D. Kromhout et al., N. Engl. J. Med., 312, 1205, 1985 y por R.B. Shekelle et al., N. Engl. J. Med., 313, 820, 1985 y posteriormente desmentido por S.E. Vallset et al., N. Engl. J. Med., 313, 820, 1985 y por J.D. Curb et al., N. Engl. J. Med., 313, 821, 1985.

Por otra parte, como también se prueba en la Pat. It. No. 1.235.879, se ha visto que el ácido eicosapentanoico (EPA), que ha sido considerado el más importante de los ácidos poliinsaturados marinos perteneciente a la serie \omega-3 (véase más arriba), no tiene ninguna acción significativa en la hipertensión (en: Prostaglandins, Vol. 32 (2), 179, 1986; Terano et al., Atherosclerosis 46, 321, 1983; Yoshida et al., Artery 14, 295, 1987; Yin et al., Clin. Exp. Pharm. Phys., 15, 275, 1988).

Se podrían citar otras muchas incongruencias.

En conclusión, muchos datos de la bibliografía, mostrados como si se hubieran obtenido a partir de composiciones constantes, llevan a conclusiones opuestas y a una mayor confusión.

De hecho, la composición del aceite de pescado es muy compleja en términos del número y estructura de los ácidos grasos constituyentes. Una primera clasificación divide dichos ácidos en ácidos saturados, mono-insaturados y poliinsaturados y, dentro de cada clase, de acuerdo con el número progresivo de átomos de carbono (habitualmente, de C_{14} a C_{22}) y, en el caso de los ácidos poliinsaturados, de acuerdo con el número de enlaces dobles. En términos de ácidos específicos, la composición de la mayoría de las especies marinas está constituida por al menos 6 a 10 ácidos grasos principales.

Utilizando la convención X : Y \omega : z (o n : z) en la que X es el número de átomos de carbono de la cadena del ácido, Y es el número de enlaces dobles y z es el número de la posición del primer carbono implicado en un doble enlace empezando por el extremo metilo (\omega o n) de la cadena, los ácidos grasos más comunes son C14 : 0, C16 : 0 de los ácidos saturados, C16 : 1 \omega-6, C18 : 1 \omega-6 de los ácidos monoinsaturados, C20 : 5 \omega-3 (ácido eicosapentanoico, EPA) y C_{22} : 6 \omega-3 (ácido docosaexanoico, DHA) de los ácidos poliinsaturados (R.G. Ackman, Fatty acid composition in fish-oils. En: Nutritional Evaluation of Long Chain Fatty Acids. S.M. Barlow y M.E. Standsby Ed., p. 25-78, 1982. Academic Press, Nueva York, N.Y.).

Estos componentes representan habitualmente hasta el 80-85% del total, pero además la bibliografía muestra muchos otros ácidos secundarios, cada uno en una cantidad variable desde trazas hasta un pequeño porcentaje, y en total hasta aproximadamente 50 y, en cualquier caso, siempre en el orden de varias decenas, de acuerdo con la especie marina y otros factores individuales, medioambientales y biológicos.

En esta situación, no resulta sorprendente que varias preparaciones de aceite de pescado puedan rendir, probablemente en relación con los distintos lotes, resultados conflictivos (véase la bibliografía más arriba) o incluso efectos clínicos opuestos (véanse los efectos en restenosis después de una angioplastia coronaria: G.J. Dehmer et al., N. Engl. J. Med., 318, 733, 1988; L.E. Grigg et al., J. Am. Coll. Cardiol., 13, 665, 1989; G.J. Reis et al., Lancet, 2, 177, 1989).

Las preparaciones que están constituidas de acuerdo con la definición habitual por ácidos \omega-3 "enriquecidos" también constituyen una generalización inaceptable porque no existe una demostración de que sean equivalentes desde un punto de vista biológico. Por el contrario, se sabe y está documentado que incluso una pequeña modificación en el número o en la posición de un enlace doble o en el número de átomos de carbono puede condicionar de una manera definitiva la actividad biológica de la sustancia o incluso puede inducir un efecto opuesto, todo esto fuera de la misma clase de ácidos (por ejemplo ácidos poliinsaturados frente a ácidos monoinsaturados frente a ácidos saturados, o ácidos \omega-3 frente a \omega-6), pero también dentro de la misma clase, por ejemplo entre los distintos ácidos \omega-3.

Véanse, por ejemplo, los efectos del ácido araquidónico C_{20: 4}\omega-6, que mediante la acción de la ciclo-oxigenasa rinde eicosanoides que tienen globalmente actividad vasoconstrictora y pro-agregante, en contraste con los efectos obtenidos con EPA C_{20}: 5\omega-3, que difiere por tener sólo 1 enlace doble más (A. Bonanone et al., Trombosi & Aterosclerosi 1, 5, 1990); véase DHA C_{22} : 6 \omega-3 que muestra un tropismo muy alto para algunos tejidos (retina, testículos, etc.) y especialmente para el tejido del sistema nervioso (tejido cerebral, en el que constituye 20-40% del contenido en fosfolípidos) y que actualmente es la base de estudios específicos sobre patologías relacionadas, tales como demencia, defectos en el aprendizaje, etc., una descripción bastante diferente de la de EPA C_{20}: 5\omega-3 (A. Leaf et al., N. Engl. J. Med., 318, 549, 1988; M. Neuringer et al., Nutr. Rev., 44, 285, 1986); véase el ácido linoleico C18: 2\omega-6 que es capaz de inducir una disminución significativa de la colesterolemia, de forma diferente que otros ácidos de la serie \omega-6 (M.S. Brown et al., Science 232, 34, 1986; J. Shepherd et al., J. Lipid Res., 21, 91, 1980); etc.

Para concluir, con la excepción de relativamente pocos estudios que se han llevado a cabo con composiciones suficientemente definidas de ácidos poliinsaturados, respecto a los componentes principales de los aceites de pescado y los que se aíslan más fácilmente - por ser los más abundantes - tales como EPA y DHA, no es posible estar seguros de los resultados obtenidos y por lo tanto de la eficacia real de dichas mezclas y ni siquiera de la reproducibilidad de su efecto.

La mención generalizada de ácidos \omega-3 y las evaluaciones de sus efectos biológicos/clínicos globales - como si todos los componentes de la clase fueran equivalentes- también nos parece bastante inaceptable y debe volverse a evaluar de nuevo.

Un ejemplo típico de generalización injustificada está representado por la Pat. It. 1.235.879. Esta patente reivindica una composición de ácidos grasos que comprende al menos un 80% en peso de ácidos poliinsaturados \omega-3 en la que EPA y DHA - en la proporción de 1 : 2 a 2 : 1, que es entre 0,5 y 2 - constituyen al menos el 75% y otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} constituyen al menos el 3%. Otras reivindicaciones se refieren a composiciones que comprenden al menos un 90% (ó 95%) de ácidos \omega-3 en las que EPA y DHA constituyen al menos el 85% (o respectivamente 90%), mientras que otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} constituyen al menos un 4,5% en peso. Creemos que dichas reivindicaciones, tal y como están expresadas, son bastante ambiguas ya que llevan a pensar que otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} tienen la misma actividad que EPA y DHA lo que no está completamente demostrado ya que nunca han sido aislados como productos puros ni ensayados para determinar sus efectos biológicos, farmacológicos y clínicos y, por lo tanto, llevan a pensar que contribuyen de manera relevante en la composición reivindicada y que, al final, su presencia, en una cantidad de al menos el 3% o mejor del 4,5% o más, es una ventaja en lo concerniente a la pureza y eficacia de la composición.

Por el contrario, pensamos que dichos componentes secundarios deben considerarse como impurezas para todos los propósitos y que, al estar presentes en los aceites de pescado naturales, su presencia en las composiciones concentradas reivindicadas se debe esencialmente a las dificultades del aislamiento al ser ácidos de cadena larga C_{20}, C_{21} y C_{22}y compuestos altamente insaturados (C_{20:4}\omega-3, C_{21:5}\omega-3, C_{22:5} \omega-3) que difieren muy poco en todos los parámetros químico-físicos de EPA (C_{20:5}\omega-3) y DHA (C_{22:6}\omega-3) requeridos. De hecho, en dicha patente puede leerse, página 10, línea 4 y siguientes: otros ácidos \omega-3 de las series C_{20}, C_{21} y C_{22}se obtendrán más o menos en sus concentraciones originales, por ejemplo 3 a 5% en peso, típicamente al menos 4,5%. Por lo tanto, el ácido particular C_{21:5}\omega-3 está presente normalmente en concentraciones de al menos 1,5% en peso y el ácido C_{22:5}\omega-3 normalmente en una concentración de aproximadamente 3,0% en peso.

Una vez especificado lo anterior, hemos pensado, descubierto y estudiado una composición limitada de una manera mucho más estricta y, por lo tanto, mucho más reproducible en cuanto a sus componentes y efectos, es decir, una composición de ácidos grasos que comprende al menos un 80% en peso de EPA y DHA (o sus derivados), en la que la proporción EPA a DHA está entre 0,9 y 1,5, preferiblemente entre 1 y 1,4, y otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22}son menos del 3%.

Las composiciones especialmente preferidas son las que contienen al menos un 85% o al menos un 90% o al menos un 95% en peso de EPA y DHA, siempre con la proporción y contenido total de ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22}especificados más arriba. Los derivados de EPA y DHA están representados por ésteres C_{1}-C_{3}, preferiblemente los ésteres de etilo, o adicionalmente las sales con bases aceptables desde un punto de vista farmacéutico.

Utilizando la composición especificada más arriba, hemos descubierto en primer lugar una reproducibilidad total de los efectos biológicos y hemos demostrado además su eficacia frente a casos leves y moderados de hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (con descenso de los valores de VLDL e incremento de los valores de HDL), hipertensión sistólica y diastólica, y de hiperactividad del factor VII de la coagulación sanguínea, es decir, frente a los denominados factores de riesgo cardiovascular; sobre todo, hemos mostrado una eficacia muy alta en las formas más claras de hiperlipidemia e hipertensión, siendo dichas composiciones por el contrario bastante ineficaces en situaciones normales sin modificación de los parámetros relacionados por debajo de los valores fisiológicos.

Utilizando las mismas composiciones también hemos descubierto que eran capaces de detener varias formas de patologías cardiacas tales como arritmia, fibrilación cardiaca atrial y/o ventricular y - por la especial gravedad de estas patologías - este resultado también representa un objetivo principal de la presente invención.

Junto a la deficiencia cardiaca (fallo de bombeo, de origen mecánico), los problemas cardiacos de tipo eléctrico tales como arritmia y fibrilación son las causas principales de muerte en sujetos cardiopáticos, ambas principalmente y como una complicación secundaria post-infarto: por lo tanto, resulta obvio el interés en la utilización preventiva y terapéutica de las composiciones que se están discutiendo.

Es por lo tanto consecuente la indicación terapéutica en la prevención primaria y especialmente secundaria, en pacientes con infarto de miocardio previo, de las complicaciones en el paciente cardiopático, para superar los problemas que derivan de hiperexcitabilidad eléctrica, de enfermedades graves en la difusión de la excitación y de otros problemas con el umbral de la polarización eléctrica de las células del miocardio (arritmia, fibrilación) y para reducir el riesgo de mortalidad, especialmente la denominada "muerte súbita" producida principalmente por la aparición rápida y fatal de crisis de fibrilación ventricular.

Respecto a la composición de ácidos grasos según la presente invención, ésta se obtiene de acuerdo con los procesos generales conocidos previamente en la bibliografía, pero utilizando obviamente algunas precauciones absolutamente esenciales para el propósito requerido. En primer lugar, el aceite de pescado se somete a procesos hidrolíticos, por ejemplo utilizando hidróxido potásico alcohólico y en condiciones experimentales suaves para evitar daños en la estructura delicada de los componentes poliinsaturados (calentar a temperatura moderada, presencia de antioxidantes, atmósfera inerte, etc.). Una alternativa a la utilización de hidróxido potásico puede ser la utilización de hidróxido de litio que rinde las sales correspondientes de los ácidos grasos, de los que los componentes saturados o menos insaturados son menos solubles y pueden eliminarse por filtración, permitiendo, por lo tanto, un primer fraccionamiento y enriquecimiento de la mezcla de ácidos grasos poliinsaturados.

Aunque estos procesos rinden directamente, a través de las sales correspondientes, los ácidos grasos, la composición de la invención constituida por los ésteres, especialmente por los ésteres de etilo, se obtiene mediante esterificación directa, al final del proceso para obtener la composición concentrada o, preferiblemente, es posible proceder con la transesterificación directa de los aceites de pescado (en lugar de la hidrólisis), que se lleva a cabo en presencia del alcanol C_{1}-C_{3} adecuado, preferiblemente de etanol, y de un catalizador alcalino, por ejemplo hidróxido potásico, o incluso de un catalizador ácido como H_{2}SO_{4}.

La mezcla de ácidos grasos o de los ésteres correspondientes se compleja después con urea, llevándose a cabo dicha reacción preferiblemente en etanol o incluso en metanol. Se sabe que la urea, bajo condiciones especiales, cristaliza en cristales hexagonales formando canales capaces de incluir las cadenas lineales de los ácidos grasos. También se sabe que la urea es capaz de incluir y complejar los ácidos y ésteres saturados y/o monoinsaturados, dando lugar a la precipitación del complejo que después se elimina por filtración lo que permite fraccionar la mezcla y recuperar a partir de la disolución una composición muy enriquecida en componentes poliinsaturados, tales como EPA y DHA.

Una tercera fase esencial para obtener una composición muy enriquecida en EPA y DHA, que se lleva a cabo frecuentemente pero no necesariamente como etapa final del proceso, consiste en una destilación de la mezcla que puede realizarse de acuerdo con todas las técnicas conocidas por el experto, pero siempre teniendo cuidado de trabajar a temperatura y presión reducidas para evitar incluso degradaciones parciales (isomerización, polimerización, etc.) de las estructuras poliinsaturadas.

Uno de los procesos que habitualmente se sigue es la destilación molecular, que permite llevar a cabo la destilación en una capa fina de material aceitoso y evitar, mediante un aporte continuo de material, un calentamiento prolongado de la masa total de la sustancia.

Es obvio que estos procesos en global también permiten la purificación del aceite de pescado y de los ácidos grasos relacionados de las sustancias contaminantes habituales presentes en los aceites crudos de origen marino o no (materia no saponificable, colesterol, plaguicidas, metales pesados, hidrocarburos clorados, etc.). Un proceso de acuerdo con lo descrito anteriormente es el descrito en la Patente Italiana No. 1.205.043.

Sin embargo, hemos descubierto que, para obtener la composición reivindicada en la presente memoria, es necesario tomar varias precauciones: sin ellas sería imposible alcanzar la concentración y proporciones deseadas de EPA y DHA y limitar los otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} por debajo del 3%. Si no, estos últimos se incrementarían respecto a la composición de partida y respecto a la concentración límite mencionada del 3% (véase de hecho la Pat. It. 1.235.879 mencionada: página 12, líneas 10 a 11 "dicho proceso no sólo aumenta los ácidos individuales..."; véanse también los valores relacionados de la Tabla 1 y Tabla 2).

Seleccionamos aceites de pescado con el fin de que la composición en ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} del material de partida esté próxima a y posiblemente sea menor que los valores deseados para la composición final, siendo habitualmente su contenido total menor del 4% y preferiblemente menor del 3%.

El ácido más abundante es habitualmente C_{22:5}\omega-3 (< 2,5%), seguido de C_{21:5}\omega-3 y C_{20:4}\omega-3 (< 1% cada uno) y otros en trazas.

Se sabe que la composición de los aceites depende de las especies marinas y de otros factores y que puede variar de acuerdo con causas medioambientales y biológicas.

Dos factores principales son la dieta de los peces y el metabolismo normal: ambos son importantes en la síntesis de los ácidos saturados (20 a 30% del total) y de los monoinsaturados más cortos, mientras que los ácidos monoinsaturados C_{20:1}y C_{22:1} y los ácidos poliinsaturados de cadena larga tienen su origen principalmente en la dieta. Los mecanismos de elongación de la cadena y desaturación juegan un papel secundario.

Debido a que el consumo de alimento cambia según los ciclos reproductores o migratorios, la dieta puede variar ampliamente la composición de los depósitos de grasa. De manera similar, la variación según los ciclos anuales de las temperaturas del agua, de las corrientes, etc., condiciona la composición y la disponibilidad de los ácidos grasos del fitoplancton de los invertebrados y crustáceos y, por lo tanto, de las especies marinas que se alimentan directamente de ellos, así como de las especies predadoras. La variabilidad alta también se debe al área de pesca y al tipo de cultivo acuícola utilizado para la producción. Dependiendo de éstos y de otros parámetros, los aceites de una especie marina puede cambiar hasta 5 a 10 veces los ácidos grasos presentes en cantidades menores y hasta 2 a 3 veces los presentes en cantidades mayores. Por lo tanto, es necesario una evaluación estricta por parte del productor, con análisis estrictos y realizados en lotes grandes de los aceites extraídos, con el propósito de obtener una composición media suficientemente constante. A pesar de las dificultades, mediante un control cuidadoso es posible obtener un aceite de pescado según las especificaciones definidas anteriormente.

Un aceite que normalmente se encuentra dentro de los requerimientos es el aceite de arenque, aunque por supuesto no se necesita estrictamente y sólo se menciona como un ejemplo.

Hemos descubierto que la utilización de una cantidad de urea en exceso respecto a la cantidad utilizada habitualmente y publicada en la bibliografía para eliminar los componentes saturados y monoinsaturados y para conseguir una mezcla enriquecida en ácidos poliinsaturados (3 partes en peso respecto a la mezcla de ácidos o ésteres), por ejemplo la utilización de hasta 1 a 2 partes adicionales en peso, por ejemplo divididas en 1 a 3 fases adicionales de complejación, ayuda en la inclusión y eliminación de una parte de los ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y especialmente C_{22}, reduciendo su presencia en la composición concentrada. En otras palabras, aunque habitualmente se reconoce que la urea es específica en la formación de complejos de ácidos monoinsaturados y saturados, con el resultado de que todos los demás componentes poliinsaturados incrementan su concentración (tanto EPA como DHA y los demás componentes secundarios mencionados anteriormente), hemos descubierto y adoptado el descubrimiento de que esta propiedad no es absoluta. El exceso de urea es por lo tanto capaz de incluir también a los ácidos con un grado más alto de insaturación, aunque parcialmente y con una dificultad de crecimiento progresiva, desde los ácidos di/trienoicos hasta los ácidos tetra/pentanoicos: mediante la utilización de una mezcla pre-enriquecida de ácidos poliinsaturados, es posible obtener una reducción significativa de ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} con una insaturación menor que EPA y DHA. El rendimiento de EPA y DHA disminuye sólo ligeramente, porque también están implicados moderadamente en el proceso de complejación e inclusión en la urea. Dichos tratamientos adicionales 1 a 3 con cantidades limitadas adicionales de urea (hasta 1 a 2 partes en peso) se llevan a cabo en los disolventes habituales, tales como etanol o metanol y también - si la urea está en la forma cristalográfica hexagonal necesaria - incluso sin ningún disolvente.

Para el propósito de conseguir las especificaciones definidas anteriormente, también hemos utilizado una innovación adicional: hemos descubierto que los ácidos y los ésteres con el mayor grado de insaturación tienen puntos de ebullición sólo un poco menores que los de los componentes menos insaturados de la misma longitud y, en particular, que los saturados.

Se ha descubierto que la diferencia en cuanto a los puntos de ebullición, importante para fraccionar mezclas muy complejas y para enriquecerlas en componentes con cadenas más largas y pesos moleculares mayores, es útil para nosotros para disminuir el contenido de los componentes menos insaturados en comparación con los más insaturados, por ejemplo de C_{22:5} \omega-3 en comparación con C_{22:6} \omega-3 (DHA) y de C_{20:4} \omega-3 en comparación con C_{20:5} \omega-3 (EPA), de manera que en conjunto los compuestos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} resultaron ser < 3%. Los ácidos/ésteres de la serie \omega-6 correspondientes también redujeron su contenido.

Dicho proceso se adoptará generalmente con la técnica de la destilación molecular, es decir, utilizando un vacío muy alto, temperatura relativamente baja y alimentación continua, reduciendo cualquier proceso de degradación de las estructuras poliinsaturadas producida por un calentamiento extremo y prolongado y, posiblemente, utilizando un equipo de dos etapas que permita en una sola etapa la separación de "cabezas" de destilación de punto de ebullición bajo y de "colas" no destiladas de punto de ebullición alto.

Respecto a la utilización de las composiciones de la invención, hemos descubierto que su eficacia es similar a la publicada en la mencionada Pat. It. n. 1.235.879 que se refiere especialmente a hipertensión leve (\sim 150 mm Hg) y a hipertrigliceridemia en general, véase página 7 línea 16 (> 2 mmoles/l, un poco superior a 200 mg/dl), pero sobre todo es evidente en las formas típicas, de origen familiar y genético, de hipertrigliceridemia e hipertensión. Dichas patologías también pueden definirse, como en la patente anterior, factores de riesgo cardiovascular, aunque es obvio que el descubrimiento obtenido con nuestra composición es inesperado y tiene un valor terapéutico y práctico mayor. Los estudios con nuestra composición se han realizado especialmente en sujetos con hipertrigliceridemia mayor de 1.000 mg/dl, o con presión sistólica mayor de 170 mm Hg y con tratamientos de 1 mes con 3 cápsulas de gelatina blanda diarias, conteniendo cada cápsula 1 g de la composición en estudio. Esta posología reducida en comparación con la adoptada en la mencionada Pat. It. 1.235.879 (6 g al día) es muy importante para garantizar un seguimiento alto del paciente respecto a la ingesta de cantidades más altas de sustancias aceitosas con propiedades organolépticas desagradables (olor y sabor a pescado y tendencia rancia) y, por lo tanto, desagradables para el
paciente.

Es notable la reducción del coste de la terapia, que habitualmente limita la posibilidad de reembolso de los medicamentos por el Servicio Nacional de Salud. Los resultados terapéuticos, especialmente la reducción de hipertrigliceridemia son excepcionales, sin mostrar nunca una reducción de los niveles en sangre por debajo de los considerados fisiológicos.

El efecto más importante obtenido con la composición en estudio ha sido la inhibición de situaciones peligrosas de arritmia cardiaca, producidas por la hiperexcitabilidad eléctrica de los miocitos y por enfermedades graves de la difusión de la excitación y de la conducción eléctrica provocadas a su vez por varios factores, sobre todo por situaciones de hipoxia o anoxia locales inducidas por bloqueo coronario y por estado de infarto. Para llevar a cabo controles rápidos y altamente reproducibles se ha preferido la técnica experimental in vivo en varias especies animales, especialmente en animales de tamaño pequeño como ratón y rata: por lo tanto, ha sido posible realizar una investigación amplia sin riesgos para el paciente y utilizando un número alto de animales para permitir una evaluación estadística
cuidadosa.

Se han evitado las técnicas basadas en las observaciones visuales de los animales para evaluar la respuesta electrofisiológica del miocardio por ser demasiado subjetivas. Un método que se adoptó utilizó aconitina como agente arritmogénico y ECG como sistema de medida, determinando el tiempo necesario para la aparición de arritmia cardiaca y taquicardia ventricular iniciales. Los animales se trataron con la composición en estudio y con las disoluciones control antes de inducir la arritmia con aconitina para verificar la acción preventiva y después de la arritmia para verificar el efecto terapéutico. En los experimentos que se llevaron a cabo con dosis más altas de aconitina, habitualmente la dosis más baja inducía 100% de mortalidad de los animales debido a los efectos cardiacos que se producen, también ha sido posible demostrar la eficacia de nuestra composición para prevenir la muerte del animal y/o prolongar su supervivencia mediante la estabilización de la membrana del miocito y de su excitabilidad eléctrica y mediante una reducción de las demás complicaciones inducidas por el estado de arritmia.

Otro método que se adoptó consistía en provocar arritmia y fibrilación ventricular en la rata anestesiada induciendo un estado isquémico mediante ligación coronaria sin la administración de agentes arritmogénicos. La composición en estudio también resultó eficaz en la prevención de arritmias derivadas de reperfusión coronaria.

En todos estos experimentos, la composición se administró tanto por vía parenteral como oral aunque para la utilización clínica puede adoptarse cualquier otra vía de administración que pueda garantizar una absorción sistémica, incluyendo las vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal, etc., y también la vía tópica. En el caso de la administración parenteral, la composición de ácidos grasos puede utilizarse como tal o en la forma de ésteres, preferiblemente mediante infusión lenta y en una formulación emulsionada y estabilizada, o en la forma de sal hidrosoluble y, en cualquier caso, manteniendo las precauciones necesarias comunes a las demás preparaciones lipídicas, obviamente siempre necesarias en la utilización clínica. La administración clínica por vía intravenosa o intramuscular es especialmente útil en una terapia aguda debido a la rapidez de su respuesta. Las formas farmacéuticas inyectables comprenden frascos o viales que contienen 0,25 a 5 g del ingrediente activo, hasta botellas para infusión lenta que contienen 5 a 10 g o más en 100, 250 y 500 ml de disolvente acuoso/emulsionante en forma estéril. Debido a su alta tolerancia, la dosificación nunca es un factor limitante. Las demás formulaciones que se prevén se preparan de acuerdo con la práctica habitual en la técnica farmacéutica.

En cualquier caso, la vía de administración preferida para utilización crónica o subcrónica es la vía oral para la que la formulación farmacéutica puede prepararse con técnicas y excipientes adoptados de manera convencional para ingredientes activos que están en forma aceitosa como los descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Hack Publ. Co., N.Y., EEUU. Para la utilización oral, la formulación preferida para la sustancia aceitosa es la de cápsulas blandas, especialmente gelatina blanda, pero también pueden utilizarse cápsulas duras y comprimidos en excipiente sólido, emulsiones, gránulos en excipientes dispersantes, gotas, jarabes, etc. En la práctica oral, la dosis unitaria comprende generalmente 250 a 1.500 mg del ingrediente activo, preferiblemente 500 a 1.000 mg, y la dosis diaria es habitualmente aproximadamente 0,5 a 5 g o más preferiblemente 1 a 3 g. Con la administración oral también es útil hacer notar que la respuesta terapéutica es habitualmente relativamente más lenta, dependiendo del tiempo de absorción, cuando la formulación contiene los ácidos grasos libres o sus sales, activos biológicamente como tales; si, por el contrario, se utilizan en la forma de ésteres, especialmente de ésteres de etilo, la respuesta es incluso más lenta debido a que el éster es en sí mismo poco o nada eficaz y su eficacia está unida a su tiempo de metabolización para dar lugar al ácido correspondiente. Por lo tanto, la administración está aún más condicionada por la utilización subcrónica o, en cualquier caso, por la utilización repetida, para saturar el depósito lipídico de cualquier región con derivados fisiológicos (ácidos, glicéridos, fosfolípidos, etc.) especialmente la región cardiaca y las células del miocardio.

Aún respecto a las distintas formulaciones farmacéuticas, éstas pueden comprender también obviamente, además de la composición de la invención y de otros medicamentos en combinación que tienen una actividad complementaria y/o sinérgica, uno o más vehículos aceptables desde un punto de vista farmacéutico muy conocidos en la técnica así como diluyentes, ligantes, estabilizantes, tensioactivos, lubricantes y similares, como es habitual y conocido en la técnica farmacéutica. Es altamente preferida, considerando el carácter poliinsaturado de la composición activa, la presencia de agentes antioxidantes tales como vitamina E (tocoferol), palmitato de ascorbilo, ácido ascórbico, hidroxitolueno y agentes similares, así como la presencia de conservantes, materias colorantes, saporíferos, perfumes y otros agentes farmacéuticos. Dichas formulaciones, además de su utilización farmacéutica, también pueden destinarse a su utilización como dietéticos o integradores alimentarios. El objetivo de la presente invención se ilustra mejor mediante algunos ejemplos.

Ejemplo 1

A. Por motivos de comparación, una muestra de 1 kg de una mezcla de aceites de pescado que tiene la composición mostrada en la Tabla 1 se trató bajo nitrógeno con etanol hirviendo y en presencia de ácido sulfúrico concentrado, según el Ejemplo 1 de la Pat. de EEUU 5.130.061. Después de la transesterificación y después de la destilación del etanol, extracción con hexano, evaporación en vacío del disolvente y destilación molecular de dos etapas, seguido de tratamiento con urea esencialmente de acuerdo con el proceso del Ejemplo 8, se obtuvo un aceite constituido (Tabla 1) por: EPA+DHA (ésteres de etilo) > 80% (81,3%), proporción < 0,9 (0,77, disminuida en comparación con el aceite de partida) y suma de los demás ácidos grasos \omega-3 (ésteres de etilo) C_{20}, C_{21} y C_{22} >> 3,0%
(7,6%).

B. Por motivos de comparación, una muestra de 1 kg de una mezcla de aceites de pescado que tiene la composición mostrada en la Tabla 2 se transesterificó con etanol y un catalizador básico para rendir los ésteres de etilo correspondientes; estos últimos se concentraron mediante la formación de complejos con urea y el concentrado se sometió a destilación molecular, como se reivindica (pero no se describe) en las reivindicaciones 14 y 15 de la Pat. It. 1.235.879, esencialmente de acuerdo con procesos conocidos de la bibliografía.

Se obtuvo un aceite constituido (Tabla 2) por: EPA+DHA (ésteres de etilo) > 80% (82,4%), proporción > 1,5 (1,65) y suma de los demás ácidos grasos \omega-3 (ésteres de etilo) C_{20}, C_{21} y C_{22} >> 3,0% (7,1%).

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	Tabla 1	Tabla 2
	Composición en ácidos	Composición de los	Composición en ácidos	Composición de los
	grasos del aceite de	ésteres de etilo	grasos del aceite de	ésteres de etilo
	partida (%)	obtenidos (%)	partida (%)	obtenidos (%)
C_{20:4} \omega-3	1,4	1,2	1,3	1,1
C_{20:5} \omega-3 (EPA)	9,8	35,5	16,8	51,3
C_{21:5} \omega-3	1,1	1,8	0,8	1,8
C_{22:5} \omega-3	1,3	4,6	2,3	4,2
C_{22:6} \omega-3 (DHA)	11,2	45,8	8,1	31,1

Ejemplo 2 A. Influencia de la composición del aceite de partida

Se utilizó un aceite (en este caso, aceite de arenque), caracterizado por un contenido relativamente alto de EPA (18,2%) y DHA (11,8%) y por un contenido limitado de otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22}, siendo su suma 3,9% como se muestra en la Tabla 3.

Se trató 1 kg de aceite con 2 l de etanol en presencia de 12 g de hidróxido potásico (o incluso etilato sódico) y se mantuvo en agitación durante 2 horas bajo nitrógeno, hasta que se completó la transesterificación de los glicéridos en ésteres de etilo. La mezcla de reacción se utilizó como tal o alternativamente se hizo ácida a pH 5-6 con ácido sulfúrico 1 M y se diluyó con hexano, después la fase alcohólica acuosa se desechó y la fase orgánica se lavó con agua, se secó y se evaporó a sequedad en vacío.

La mezcla de ésteres de etilo resultante se añadió con una disolución de 3 kg de urea a 18 l de etanol hirviendo, después se enfrió a temperatura ambiente y se mantuvo en agitación lenta toda la noche a 5-10º. El precipitado abundante constituido por el complejo de urea con los ésteres de los ácidos saturados y menos insaturados, se eliminó por filtración, el disolvente se destiló a presión reducida, el resto se disolvió con hexano, se lavó con agua, se secó y se llevó a sequedad.

Después de la destilación molecular en las condiciones habituales, se obtiene un aceite constituido (Tabla 3) por EPA+DHA (ésteres de etilo) > 80% (82,7%), proporción < 1,5 (1,26) y suma de los demás ácidos grasos \omega-3 (ésteres de etilo) C_{20}, C_{21} y C_{22} aproximadamente 4 a 5% (4,8%).

B. Influencia del tratamiento con urea

Se utilizó un aceite de pescado (Tabla 4) transesterificado en una disolución de etanol, por ejemplo de acuerdo con el Ejemplo 2A, pero el tratamiento con urea se divide en 3 etapas, respectivamente con 2, 1 y 0,5 partes en peso respecto a los ésteres de etilo crudos.

Se añade 1 kg de ésteres de etilo crudos a una mezcla de 2 kg de urea en 12 l de etanol hirviendo y bajo nitrógeno, después la mezcla se enfría a temperatura ambiente y después a 0-10º, con agitación lenta toda la noche. El complejo con urea precipitado se filtra y se trata sucesivamente con 1 kg de urea de acuerdo con el mismo proceso y después, después de una filtración adicional, con 0,5 kg de urea de nuevo. Después de la filtración del complejo nuevo y del tratamiento de acuerdo con métodos estándar, la mezcla se evapora a sequedad a temperatura y presión reducida y el resto se somete a destilación molecular. Al final se obtiene un aceite constituido (Tabla 4) por EPA+DHA (ésteres de etilo) > 85% (85,3%), proporción < 1,4 (1,29) y suma de los demás ácidos grasos \omega-3 (ésteres de etilo) C_{20}, C_{21} y C_{22} < 3% (2,7%).

C. Influencia de la destilación molecular

Se utiliza una muestra de ésteres de etilo (Tabla 5) obtenida con el proceso del ejemplo 2B. El producto se destila con destilación molecular en dos etapas; se desecha una fracción pequeña de punto de ebullición bajo y se recoge la fracción principal a 83-85º/10^{-4} mm, permaneciendo la fracción con el punto de ebullición más alto como fracción sin destilar. Mediante análisis por cromatografía de gases se vio que el producto estaba constituido (Tabla 5) por EPA+DHA (ésteres de etilo) > 85% (88,3%), proporción < 1,4 (1,32) y suma de los demás ácidos grasos \omega-3 (ésteres de etilo) C_{20}, C_{21} y C_{22} < 3% (2,2%).

1

Ejemplo 3

Se utiliza un aceite de pescado con un contenido alto en EPA y DHA y con un contenido reducido en otros ácidos grasos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22}, se llevan a cabo fases repetidas de concentración con urea y se realiza destilación molecular en condiciones controladas de vacío y temperatura.

Se somete 1 kg de aceite de pescado con la composición mostrada en la Tabla 6 a los procesos mostrados en los ejemplos 2A, 2B y 2C sucesivamente. Al final, se obtiene un aceite constituido por ésteres de etilo de ácidos grasos poliinsaturados como se muestra en la misma Tabla 6, es decir, por EPA+DHA (ésteres de etilo) >> 85% (90,1%), proporción EPA/DHA > 1 y < 1,4 (1,22) y suma de los demás ésteres de etilo de los ácidos grasos poliinsaturados \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} < 3% (2,2%).

Esta clase de aceites o similar se ha utilizado para todos los ensayos biológicos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6

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2

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Ejemplo 4

Con el fin de probar la capacidad de la composición de los aceites en estudio de disminuir los niveles sanguíneos de triglicéridos y de colesterol se pensó que era más sencillo utilizar un modelo experimental subagudo que consistía en pretratar los animales de laboratorio con dicha composición y en administrar después la sustancia capaz, en el animal sin tratar con el medicamento, de incrementar dichos niveles sanguíneos.

Se incluyeron en el experimento 4 grupos de ratas con un peso medio inicial de 235 g \pm 10: los grupos A y B se utilizaron como referencia, los grupos C y D se trataron oralmente con 50 mg/kg y 100 mg/kg respectivamente durante 7 días con la composición de aceites obtenida de acuerdo con el Ejemplo 2C (Tabla 5).

Al final, los grupos B, C y D se trataron con Triton WR1339 y, después de ayunar toda la noche, todos los grupos se sacrificaron y se obtuvo la sangre y se determinaron los triglicéridos y el colesterol total.

	Triglicéridos (mg/dl)	Colesterol total (mg/dl)
Grupo A	86 \pm 14	53 \pm 5
Grupo B	240\pm 35	182\pm 34
Grupo C	165 \pm 23	106 \pm 12
Grupo D	123 \pm 41	73 \pm 14

Como se sabe experimentalmente, el Triton es capaz de incrementar claramente el nivel de triglicéridos y colesterol mientras que la composición de ésteres de etilo en estudio fue capaz de disminuirlos hasta niveles fisiológicos induciendo una disminución notable y significativa estadísticamente de los valores medios (P < 0,05) respecto a los controles positivos (grupo B).

Ejemplo 5

Se ha verificado el efecto en formas graves de hiperlipemia en sujetos que tienen un riesgo incrementado de desarrollar rápidamente aterosclerosis y otras patologías cardiológicas utilizando cápsulas de gelatina blanda que contienen 1 g de la composición del Ejemplo 3 (Tabla 6).

El estudio se llevó a cabo en 6 sujetos con hiperlipoproteinemia de tipo V grave de larga duración, tratándoles durante 1 mes con 3 cápsulas diarias. El grupo control estaba constituido por 6 sujetos con parámetros hematológicos similares diagnosticados recientemente que se siguieron durante el mismo periodo con la única prescripción de una dieta baja en calorías y en contenido lipídico.

Los resultados se muestran en la Tabla siguiente (el contenido lipídico en mg/dl):

Tratamiento	Triglicéridos	Colesterol total	VLDL	LDL	HDL
Dieta con bajo contenido lipídico	1.343 \pm 530	383 \pm 78	236 \pm 85	88 \pm 43	33 \pm 8
3 cápsulas/día	475 \pm 136	212 \pm 54	93 \pm 12	112 \pm 24	38 \pm 7
\begin{minipage}[t]{160mm}(VLDL = lipoproteínas de muy baja densidad; LDL = lipoproteínas de baja densidad; HDL = lipoproteínas de alta densidad).\end{minipage}

Los datos anteriores demuestran claramente una caída muy importante de los niveles de triglicéridos así como una reducción significativa del colesterol total y una tendencia a la normalización del patrón lipoproteico.

Ejemplo 6

El experimento se llevó a cabo para probar el efecto de la composición obtenida de acuerdo con el Ejemplo 2C (Tabla 5), en la prevención de la mortalidad inducida por la administración rápida de un agente arritmogénico (aconitina) en la rata.

Se utilizaron varios grupos de 10 ratas macho que pesaban 220-250 g para determinar la dosis letal mínima para el 100% de los animales después de la administración intravenosa de aconitina a ratas conscientes, sin anestesiar.

La aconitina indujo un efecto rápido y directo en el miocardio con una aparición rápida de arritmia y fibrilación seguida, a algunas dosis, de la muerte del animal en los 20 minutos posteriores a la inyección. La arritmia pudo seguirse mediante registro ECG así como, en experimentos preliminares, mediante la observación visual del corazón (pecho abierto). Dicha dosis letal resultó ser 0,1 mg/kg i.v.

\newpage

Posteriormente, se trataron otros 3 grupos de 10 ratas por vía oral con 50, 75, 100 mg/kg de la composición en estudio durante 7 días, mientras que un grupo adicional se mantuvo como control. Dos horas después de la ultima administración, se inyectó a todos los animales i.v. 0,1 mg/kg de aconitina, con los resultados que se muestran más abajo.

	Control	50 mg/kg	75 mg/kg	100 mg/kg
Supervivencia de los animales	0/10	2/10	5/10	6/10

Por lo tanto, la composición en estudio fue capaz de prevenir la mortalidad inducida por un agente arritmogénico con una dosis eficaz en el 50% de los animales (DE 50) del orden de 75 mg/kg o un poco superior.

Ejemplo 7

El experimento quería verificar el efecto agudo de una composición de ésteres de etilo de ácidos grasos de acuerdo con la Tabla 5 y de las sales de potasio correspondientes, en la prevención de la muerte súbita inducida por un agente arritmogénico (aconitina) en la rata. Las sales de potasio se obtuvieron mediante tratamiento suave de los ésteres con KOH estequiométrico en agua : etanol 8 : 2 de acuerdo con métodos estándar.

Se trataron 4 grupos de 10 ratas con una administración oral única de 50 y 100 mg/kg de ésteres de etilo y con una inyección i.v. única de 50 y 100 mg/kg de sal de potasio, mientras que un grupo adicional se mantuvo como control. 1 hora después de la administración, todos los animales recibieron aconitina (0,1 mg/kg, i.v.), obteniéndose las respuestas siguientes:

	Control	50 mg/kg,	100 mg/kg,	50 mg/kg,	100 mg/kg,
		p.o.	p.o.	i.v.	i.v.
Supervivencia de los animales	0/10	0/10	1/10	3/10	7/10

Por lo tanto, es evidente que los ésteres de etilo son poco o nada eficaces como tales y que muestran algo de latencia del efecto para metabolizarse in vivo en la correspondiente forma activa de los ácidos. Como tales, los ésteres resultan más útiles en una administración oral continua y en terapia crónica que como agentes anti-arrítmicos con un efecto rápido en una emergencia. Los ácidos bajo la forma, por ejemplo, de sales de potasio hidrosolubles, son agentes anti-arrítmicos potentes y son capaces de prevenir la mortalidad inducida por agentes arritmogénicos.

Ejemplo 8

Para evaluar la actividad anti-arrítmica de la composición de la Tabla 5, administrada como un medicamento profiláctico, se ha utilizado una técnica que - mediante evaluación con ECG - permitió evaluar la prolongación del tiempo de aparición de la arritmia inicial inducida por la aconitina y después de la taquicardia ventricular en ratones.

Se trataron 6 grupos de ratones macho diariamente durante 1 mes respectivamente con disolución salina fisiológica por vía oral e intraperitoneal y con la composición en estudio, 50 y 150 mg/kg oralmente y 50-150 mg/kg intraperitonealmente.

1 hora después de la finalización del último tratamiento los animales de todos los grupos se anestesiaron con pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) y cada animal se situó individualmente en una mesa quirúrgica en su parte dorsal y se trató mediante infusión a través de la vena de la cola con aconitina (5 \mug/ml) con una velocidad de flujo de 0,25 ml/min. La arritmia inducida por la aconitina se detectó y determinó mediante ECG utilizando un fisiógrafo equipado con electrodos y accesorios útiles para el registro de ECG. El tiempo de aparición de la arritmia cardiaca inicial se tomó en el tiempo del primer signo discernible de desviación persistente (> de 5 segundos) del ritmo normal del seno; con un criterio similar se registró el tiempo de la transición de arritmia cardiaca a taquicardia ventricular persistente (> 5 seg.).

La aconitina indujo arritmia en el 100% de los animales.

Los resultados obtenidos son como sigue:

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Tratamientos	Tiempo de aparición de la	Tiempo de aparición de la
	arritmia inicial (seg.)	taquicardia inicial (seg.)
Disolución salina, p.o. (control)	155 \pm 4	193 \pm 8
50 mg/kg, p.o.	163 \pm 2 (P>0,05)	245 \pm 6
150 mg/kg, p.o.	196 \pm 10	286 \pm 12
Disolución salina, i.p. (control)	148 \pm 5	186 \pm 7
50 mg/kg, i.p.	182 \pm 7	264 \pm 14
150 mg/kg, i.p.	203 \pm 12	298 \pm 15

En conclusión, la infusión lenta de aconitina a los ratones anestesiados induce arritmia cardiaca y taquicardia ventricular: el tratamiento con la formulación en estudio es capaz de prolongar el tiempo de aparición de dichas formas patológicas generalmente de forma estadística.

Un descubrimiento similar se obtuvo utilizando como punto final el tiempo de parada cardiaca aunque los datos son relativamente más dispersos.

Ejemplo 9

Se siguió una técnica similar a la descrita en el Ejemplo 8, con la diferencia, sin embargo, de que el tratamiento se llevó a cabo en forma terapéutica poco después de la administración de dosis reducidas de aconitina (0,5 \mug/ml, 0,25 ml/min.) a los ratones anestesiados.

La composición de la Tabla 5 en la forma de sal de sodio, se inyectó en la vena de la cola a dosis de 50 y 100 mg/kg, determinando en este caso, debido a la variabilidad del tiempo de aparición de la desviación del ritmo normal del seno, sólo la aparición de formas arrítmicas persistentes (> 5 seg.) respecto al número total de animales por
grupo.

	Controles (disolución	50 mg/kg, i.v.	100 mg/kg, i.v.
	salina, i.v.)
Aparición de arritmia	9/10	3/10	1/10

Ejemplo 10

A. La composición de la Tabla 6 se evaluó, en comparación con una mezcla de grasas saturadas, para estudiar su capacidad de prevenir o disminuir la arritmia cardiaca inducida en la rata por una situación isquémica provocada por ligadura coronaria sin la utilización de agentes arritmogénicos. Este modelo experimental parece ser más comparable a la patología humana isquémica o de pre-infarto similar de origen aterosclerótico o de otro origen.

2 grupos de 20 ratas que pesaban 280 g \pm 15 se alimentaron con dieta estándar de laboratorio que contenía 22% de proteína y 15% de grasa saturadas. Durante este tiempo un grupo de animales se trató también por vía oral diariamente con 100 mg/kg de la composición de la Tabla 6.

Al final del tratamiento, las ratas de los dos grupos se anestesiaron con pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.), induciendo después una isquemia aguda de miocardio mediante la oclusión quirúrgica (ligadura) de la arteria coronaria descendente anterior izquierda que permite la llegada de sangre a la mayor parte del ventrículo izquierdo. 2 animales por grupo murieron durante la operación quirúrgica. La isquemia provocada por la ligadura coronaria se mantuvo durante 15 minutos evaluándose durante este tiempo la aparición de arritmia y evaluando mediante ECG los parámetros relacionados con los latidos ventriculares prematuros (PVB), taquicardia ventricular (VT) y fibrilación ventricular (VF), que pueden finalizar espontáneamente o también ser fatales con muerte súbita. La taquicardia ventricular se probó mediante muchos latidos consecutivos sin una onda P que se pudiera distinguir, la fibrilación ventricular se identificó como una actividad eléctrica caótica en el ECG control acoplada con una disminución rápida de la presión sanguínea. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla siguiente.

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Tratamiento	PVB	V	T	V	F	Tiempo del ritmo	Mortalidad
						del seno (seg.)	(%)
		%	seg.	%	seg.
Dieta estándar (con lípidos	224 \pm 11	83	25 \pm 5	55	130 \pm 20	590 \pm 40	50
saturados) (n=18)
Dieta estándar +100 mg/kg,	79 \pm 10	39	20 \pm 3	5,5	40	872 \pm 5	0
p.o. (n=18)

Por lo tanto, se ha mostrado que el tratamiento con la composición en estudio es capaz de reducir claramente y de forma significativa estadísticamente la arritmia inducida en la rata mediante isquemia experimental como muestran todos los parámetros examinados (latidos prematuros, taquicardia y fibrilación ventricular). En el ensayo descrito también se evitó la mortalidad consiguiente.

B. En los animales supervivientes (controles, n=9; tratados, n=18) el experimentó se continuó liberando la ligadura ocluyente con el fin de restaurar el flujo sanguíneo (reperfusión). Después de un control mediante ECG durante 10 minutos, todas las ratas supervivientes fueron finalmente sacrificadas. El propósito del ensayo era controlar los episodios de arritmia adicionales previsibles que se sabe que también se provocan por una situación de reperfusión ventricular. Esta situación puede estar relacionada clínicamente con situaciones post-isquémicas y post-infarto, con reperfusión coronaria después de angioplastía, etc.

Para el propósito anterior se evaluaron una vez más mediante ECG los latidos ventriculares prematuros (PVB), la taquicardia ventricular (VT) y la fibrilación ventricular (VF), con los resultados que se muestran más abajo en la presente memoria.

Tratamiento	PVB	V	T	V	F	Tiempo del ritmo	Mortalidad
						del seno (seg.)	(%)
		%	seg.	%	seg.
Dieta estándar (n=9)	158 \pm 25	78	12 \pm 5	33	10 \pm 6	265 \pm 9	11

Dieta estándar +100 mg/kg,	12 \pm 2	17	8 \pm 3	0	-	290 \pm 5	0
p.o. (n=18)

Como resulta evidente, la restauración del flujo sanguíneo después del periodo isquémico, provocó la aparición rápida de episodios de arritmia, incluyendo fibrilación ventricular, sin embargo menos grave y fatal, sólo en un animal.

Sin embargo, incluso en este caso los animales tratados con la composición de la Tabla 6 sufrieron un número menor de episodios arrítmicos, durante un tiempo más limitado y con la supervivencia de todos los animales.

Ejemplo 11 Preparación de cápsulas de gelatina blanda de 1 g

Composición
- Ésteres de etilo de ácidos grasos poliinsaturados (EPA+DHA > 85%;	1.000 mg
\, EPA/DHA = 0,9-1,5; otros \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22}, total < 3%)
- D,L-\alpha-tocoferol	0,3 mg
- Succinato de gelatina	233 mg
- Glicerol	67 mg
- Etil p-hidroxibenzoato sódico	1,09 mg
- Propil p-hidroxibenzoato sódico	0,54 mg
\hskip1cm Peso total \hskip3cm aproximadamente	1.300 mg

\newpage

Preparación

La composición de ésteres de ácidos grasos y los excipientes se pesan y homogeneizan en un tanque con un agitador de velocidad alta.

Después, la mezcla se trata con un molino coloidal y se desairea en un recipiente de acero inoxidable. Después, proceder a la inclusión en cápsulas de gelatina blanda utilizando equipos y procesos convencionales.

Claims

1. Composición de ácidos grasos que contiene al menos 80% en peso del ácido 5,8,11,14,17-eicosapentanoico (EPA) C_{20}:5 \omega-3 (enlaces dobles todos cis) y ácido 4,7,10,13,16,19-docosaexaenoico (DHA) C_{22:6} \omega-3 (enlaces dobles todos cis), en la que la proporción EPA:DHA es entre 0,9 y 1,5 y otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} constituyen menos del 3% y en la que dichos ácidos pueden estar presentes en la forma de ácidos libres o sus sales o ésteres de alquilo de cadena corta C_{1}-C_{3}.

2. Composición según la reivindicación 1, que contiene al menos 85% en peso de EPA y DHA.

3. Composición según la reivindicación 1, que contiene al menos 90% en peso de EPA y DHA.

4. Composición según la reivindicación 1, que contiene al menos 95% en peso de EPA y DHA.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la proporción EPA:DHA es entre 1,0 y 1,4.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que los demás ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} que constituyen menos del 3% están representados por el ácido C_{20:4} y/o C_{21:5} y/o C_{22:5} y otros ácidos en trazas.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que las sales aceptables desde un punto de vista farmacéutico están representadas por sales con bases inorgánicas y orgánicas.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que los ésteres de alquilo están representados por los ésteres de etilo.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para el tratamiento y/o profilaxis de múltiples factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y/o enfermedades cardiovasculares.

10. Proceso para la producción de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que un material aceitoso crudo de origen marino se somete a las etapas de trabajo siguientes en orden opcional: hidrólisis o alcoholisis (transesterificación), concentración y destilación mediante la que se aísla una fracción principal de la composición según la reivindicación 1, llevándose a cabo cada etapa de trabajo en condiciones que evitan la oxidación e isomerización de los ácidos grasos; después, si se desea, los ácidos obtenidos mediante hidrólisis se esterifican o los ésteres obtenidos mediante alcoholisis se hidrolizan en los ácidos grasos libres y, opcionalmente, se transforman en sales u otros derivados aceptables desde un punto de vista farmacéutico.

11. Proceso según la reivindicación 10, en el que el material aceitoso crudo de origen marino es aceite de pescado.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que el aceite de pescado tiene un contenido especialmente alto de EPA, preferiblemente > 12%, y de DHA, preferiblemente > 8%, y un contenido de otros ácidos grasos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} especialmente bajo, preferiblemente < 4% en total.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el aceite de pescado tiene un contenido en C_{22:5} \omega-3 < 2,5% y un contenido en C_{21:5}\omega-3 y C_{20:4} \omega-3 < 1% cada uno.

14. Proceso según la reivindicación 10, en el que la hidrólisis se lleva a cabo con álcalis en un medio principalmente acuoso y la alcoholisis (o transesterificación) se lleva a cabo mediante catálisis alcalina o ácida en un medio principalmente alcohólico, preferiblemente en etanol.

15. Proceso según la reivindicación 10, en el que la etapa de concentración se lleva a cabo mediante fraccionamiento con urea.

16. Proceso según las reivindicaciones 10 y 15, en el que el fraccionamiento con urea se lleva a cabo en varias etapas de trabajo, inicialmente complejando con urea principalmente los ácidos grasos saturados y monoinsaturados, y después principalmente los ácidos grasos menos insaturados, poliinsaturados.

17. Proceso según la reivindicación 10, en el que la destilación se lleva a cabo bajo presión normal, bajo flujo de vapor, bajo vacío, bajo vacío alto y preferiblemente con una técnica de destilación molecular, y preferiblemente con una destilación molecular de dos etapas.

18. Proceso según las reivindicaciones 10 y 17, en el que la destilación molecular se lleva a cabo con el fin de aislar una fracción de acuerdo con la composición de la reivindicación 1 y de desechar una fracción rica en otros ácidos \omega-3 C_{20}, C_{21} y C_{22} diferentes de EPA y DHA.

19. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la producción de una preparación farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis de múltiples factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y/o enfermedades cardiovasculares.

20. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 19 para la producción de una preparación farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis de múltiples factores de riesgo representados por hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, hipertensión e hiperactividad del factor VII de la coagulación sanguínea.

21. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 19 para la producción de una preparación farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades cardiovasculares que derivan de hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia familiar.

22. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 19 para la producción de una preparación farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades cardiovasculares representadas por arritmia atrial y/o ventricular, taquicardia y/o fibrilación, y/o defectos en la conducción eléctrica de las células del miocardio.

23. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 22 para la producción de una preparación farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención primaria o secundaria de enfermedades cardiovasculares que derivan de situaciones como las descritas en la reivindicación 22.

24. Utilización de una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 23 para la producción de una preparación farmacéutica para la prevención secundaria de enfermedades cardiovasculares que derivan de arritmia, taquicardia y/o fibrilación y/o defectos en la conducción eléctrica inducidas por infarto de miocardio.

25. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 24 para la producción de una preparación farmacéutica para la prevención de re-infarto de miocardio.

26. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 24 para la producción de una preparación farmacéutica para la prevención primaria y secundaria de "muerte súbita" derivada de arritmia, taquicardia y/o fibrilación y/o defectos en la conducción eléctrica de las células del miocardio.

27. Proceso para la producción de una preparación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19-26 que comprende la inclusión de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en un vehículo o excipiente o diluyente aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

28. Preparación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19-27, que contiene una composición de ácidos grasos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

29. Preparación farmacéutica según la reivindicación 28 para utilización oral y parenteral.

30. Preparación farmacéutica según la reivindicación 28, constituida por viales listos para utilizarse o por botellas para infusión lenta o por un liófilo para utilización improvisada, para utilizarse por vía i.m. o i.v., y que contiene una composición de ácidos grasos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y en la que el vehículo es acuoso, aceitoso o está constituido por una emulsión.

31. Preparación farmacéutica según la reivindicación 28, constituida por cápsulas de gelatina blanda.

32. Preparación farmacéutica según la reivindicación 31, en la que las cápsulas de gelatina blanda contienen de 250 a 1.500 mg de una composición de ácidos grasos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, preferiblemente 500-1.000 mg.

33. Utilización de una preparación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 28-32 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y tratamiento de aterosclerosis, defectos del metabolismo, enfermedades autoinmunes, colitis ulcerosa, enfermedades tumorales, defectos del aprendizaje o de la memoria y del sistema nervioso central (SNC), procesos de envejecimiento celular, retinopatía, defectos de la agregación plaquetaria y de la coagulación, infarto cerebral, estados isquémicos cardiacos y cerebrales y psoriasis.