KR101761959B1 - 다중 불포화 지방산을 정제하기 위한 시뮬레이션된 이동상 크로마토그래피 분리 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공급 혼합물을, 수성 알콜을 용리액으로서 함유한 다수의 결합된 크로마토그래피 칼럼을 갖는 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 장치는 적어도 제 1 존 및 제 2 존을 포함한 다수의 존을 갖고, 각각의 존은 추출물 흐름 및 라피네이트 흐름을 갖고, 각각의 존으로부터 상기 다수의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 액체를 수집할 수 있고, (a) 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 제 1 존에서 칼럼으로부터 수집하고 제 2 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하고, 및/또는 (b) 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추출물 흐름을 제 2 존에서 칼럼으로부터 수집하고 상기 제 1 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하고, 상기 PUFA 생성물은 각각의 존에서 공급 혼합물의 다른 성분으로부터 분리한, 공급 혼합물로부터 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법을 제공한다.

Description

다중 불포화 지방산을 정제하기 위한 시뮬레이션된 이동상 크로마토그래피 분리 방법{SIMULATED MOVING BED CHROMATOGRAPHIC SEPARATION PROCESS FOR THE PURIFICATION OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS}
본 발명은 다중 불포화 지방산(PUFA) 및 그 유도체를 정제하기 위한 개선된 크로마토그래피 분리 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PUFA 및 그 유도체를 정제하기 위해서 개선된 시뮬레이션 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 분리 방법에 관한 것이다.
지방산, 특히 PUFA 및 그 유도체는 생물학적으로 중요한 분자의 전구체이고, 이는 혈소판 응집, 염증 및 면역 반응과 같은 생물학적 기능 조절에서 중요한 역할을 한다. 따라서, PUFA 및 그 유도체는 CNS 질환; 당뇨병성 신경장애를 포함한 신경장애; 순환기 질환; 염증성 피부 질환을 포함한 일반적인 면역계 및 염증성 질환을 포함한 광범위한 병태의 치료에서 치료적으로 유용할 수 있다.
PUFA는 천연 원료, 예를 들면 식물성 오일 및 마린 오일(marine oil)에서 발견된다. 그러나, 이러한 PUFA는 포화지방산 및 그외의 수많은 불순물과의 혼합한 이러한 오일에 존재한다. PUFA는 영양 또는 제약 용도로 사용하기 전에 정제하는 것이 바람직하다.
불운하게, PUFA는 매우 쉽게 분해된다. 따라서, PUFA가 산소의 존재하에서 가열하면, 이성화, 과산화 및 이량화되기 쉽다. 순수한 지방산을 제조하기 위한 PUFA의 분리 및 정제가 곤란하다. 증류는, 진공하에서도 수용될 수 없는 제품 열화를 일으킬 수 있다.
시뮬레이션 및 실제의 이동상 크로마토그래피는 종래기술과 유사한 공지기술이다. 상기 조작의 원리는 액체 용리액 상 및 고체 흡착제 상의 역류 이동을 수반한다. 이러한 조작은 적은 용매를 이용하므로, 상기 공정을 경제적으로 실행할 수 있다. 이러한 분리 방법은 예를 들면 탄화수소, 공업용 화학약품, 오일, 당 및 API를 포함한 다양한 분야에서 여러 적용을 발견했다. 이러한 분리 방법을 적용해서 PUFA 및 그 유도체를 정제했다.
공지된 바와 같이, 종래의 정지상 크로마토그래피 시스템에서, 분리될 수 있는 성분의 혼합물을 컨테이너를 통해서 침투시킨다. 상기 컨테이너는 일반적으로 원통형이고, 일반적으로 칼럼이라고 한다. 상기 칼럼은 유체에 대해서 높은 투과율을 갖는 다공성 물질(일반적으로 정지상이라고 함)의 팩킹을 함유한다. 혼합물의 각각의 성분의 침투 속도는 그 성분의 물리적 특성에 의존하고, 그 성분이 연속적으로 선택적으로 칼럼으로부터 방출한다. 따라서, 상기 일부 성분은 정지상에 강하게 고정되어 서서히 침투하는 경향이 있는 반면, 그외의 것은 약하게 고정되어 칼럼으로부터 빠르게 방출하는 경향이 있다. 많은 다른 정지상 크로마토그래피 시스템이 제안되고 분석적 및 산업적 생산 목적에 따라서 사용되었다.
반면, 시뮬레이션된 이동상 시스템은 연속적으로 함께 결합된, 흡착제를 함유한 많은 산업적 칼럼으로 이루어진다. 용리액은 처음 방향으로 칼럼을 통과한다. 공급 원료 및 용리액의 주입 위치, 및 상기 시스템에서 분리된 성분의 수집 위치는 일련의 밸브에 의해서 주기적으로 이동된다. 전체의 작용은 고체 흡착제의 이동상을 함유한 하나의 칼럼의 조작을 시뮬레이션하는 것이다. 따라서, 시뮬레이션된 이동상 시스템은 종래의 정지상 시스템에서와 같이 용리액을 통과시키는 고체 흡착제의 정지상을 함유한 칼럼으로 이루어지지만, 상기 시뮬레이션된 이동상 시스템에서 조작은 예를 들면 연속적인 역류 이동상을 시뮬레이션하는 것이다.
시뮬레이션된 이동상 크로마토그래피의 공정 및 장치는, 여러 특허, 예를 들면 US 2,985,589, US 3,696,107, US 3,706,812, US 3,761,533, FR-A-2103302, FR-A-2651148 및 FR-A-2651149에 기재되어 있고, 이는 참조로 포함되어 있다. 주제는 Ganetsos and Barker, Marcel Dekker Inc, New York, 1993에 의한 "Preparative and Production Scale Chromatography"으로 상세하게 기재하고, 이는 참조로 포함되어 있다.
조작시에 실제의 이동상 시스템은 시뮬레이션된 이동상 시스템과 유사하다. 그러나, 공급 혼합물 및 용리액의 주입 위치 및 밸브 시스템에 의해서 분리된 성분의 수집 위치를 이동하기보다, 그 대신에 일련의 흡착 유닛(즉, 칼럼)을 공급 및 방출 위치에 대해서 물리적으로 이동시킨다. 다시, 조작은 예를 들면 연속적인 역류 이동상을 시뮬레이션하는 것이다.
실제의 이동상 크로마토그래피의 방법 및 장치는 여러 특허, 예를 들면 US 6,979,402, US 5,069,883 및 US 4,764,276에 기재되어 있고, 그 전체가 참조로 포함되어 있다.
시뮬레이션된 및 실제의 이동상 방법은 일반적으로 2성분 혼합물을 분리하는 데에만 적합하다. 따라서, 높은 극성 성분은 용리액에 의해서 이동하고 라피네이트 흐름으로서 수집되며, 낮은 극성 성분은 흡착제와 함께 이동하고 추출물 흐름으로서 수집될 것이다. 극성 및 비극성 불순물을 함유한 조 혼합물(crude mixture)로부터 소망의 생성물을 분리하기 위해서 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 방법을 사용하는 것은 곤란하다. 이것은 예를 들면 피시 오일로부터 PUFA 생성물을 정제할 때에 이러한 방법의 적용성을 제한한다.
따라서, 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 방법이 종래에 천연 오일로부터 PUFA를 분리하는 데에 사용하는 경우, 일반적으로 먼저 천연오일에 사전 분리 단계(예를 들면, 고정된 칼럼 크로마토그래피)를 실시한 후에, 얻어진 중간생성물을 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 방법을 사용하여 정제하는 것이 필요하다(예를 들면 EP-A-0697034 참조). 일반적으로, 초기의 정제 단계는 극성 또는 비극성 성분을 제거하므로, 기본적으로 2 성분 혼합물을 형성한 후 이동상 크로마토그래피를 실시한다.
이러한 2 성분 혼합물을 분리하는 방법은 도 1을 참조하여 설명한다. 시뮬레이트된 또는 실제의 연속적인 역류 크로마토그래피 분리 방법의 개념은 정지상 S를 함유한 수직 크로마토그래피 칼럼을 영역, 보다 구체적으로 칼럼의 하부로부터 상부로 4개의 다층 서브 존 I, II, III 및 IV로 분할한 것을 고려함으로써 설명한다. 상기 용리액은 펌프 P에 의해서 IE에서 하부에 도입된다. 분리될 수 있는 성분 A 및 B의 혼합물은 서브 존 II 및 서브 존 III 사이에의 IA+B에 도입한다. 주로 B를 함유한 추출물은 서브 존 I 및 서브 존 II 사이의 SB에서 수집되고, 주로 A를 함유한 라피네이트는 서브 존 III 과 서브 존 IV 사이의 SA에서 수집된다.
시뮬레이트된 이동상 시스템의 경우에, 시뮬레이트된 정지상 S의 하방 이동은 고체상에 대해서 도입 위치 및 수집 위치의 이동에 기인한다. 실제의 이동상 시스템의 경우에, 정지상 S의 하방 이동은 도입 및 수집 위치에 대한 다양한 크로마토그래피 칼럼의 이동에 기인한다. 도 1에서, 용리액이 하방으로 흐르고, 혼합물 A+B가 서브 존 II와 서브 존 III 사이에 주입된다. 성분은 정지상과 크로마토그래피 상호작용, 예를 들면 다공성 매체에 흡착에 따라서 이동할 것이다. 정지상(느린 이동 성분)에 대한 강한 친화성을 갖는 성분 B는 용리액에 서서히 함유되고, 따라서 지연될 것이다. 정지상에 대한 약한 친화성을 나타낸 성분 A(더 빠른 이동 성분)는 용리액에 쉽게 함유될 것이다. 오른쪽 세트의 변수, 특히 각각의 존에서 유속을 정확히 추정하고 조절하면, 정지상에 대해서 약한 친화성을 갖는 성분 A는 서브 존 III과 서븐 존 IV 사이에서 라피네이트로서 수집되고, 정지상에 대해서 강한 친화성을 갖는 성분 B는 서브 존 I와 서브 존 II 사이에서 추출물로서 수집될 것이다.
도 1에서 개략적으로 도시된 종래의 이동상 시스템은 2성분 분리로 한정되는 것을 알 수 있다.
따라서, 빠른 및 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 PUFA 또는 그 유도체를 분리하여 기본적으로 순수한 PUFA 또는 그 유도체를 제조할 수 있는 하나의 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 분리 방법에 대한 필요성이 있다. 상기 공정이 표준 온도 및 압력 조건하에서 조작한 저렴한 용리액을 포함하는 것이 바람직하다.
놀랍게도 수성 알콜 용리액을 사용한 하나의 시뮬레이된 또는 실제의 이동상 장치에 의해서 PUFA 생성물을 효율적으로 정제할 수 있는 것을 알 수 있다. 본 발명은 공급 혼합물로부터 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법을 제공하고, 수성 알콜을 용리액으로서 함유한 다수개 결합된 크로마토그래피 칼럼을 갖는 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치에 공급 혼합물을 도입하는 단계를 포함하고, 상기 장치는 적어도 제 1 존 및 제 2 존을 포함한 다수의 존을 갖고, 각각의 존은 추출물 흐름 및 라피네이트 흐름을 갖고, 각각의 존으로부터 상기 다수의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 액체를 수집할 수 있고, (a) 제 1 존에서 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 칼럼으로부터 수집하고, 제 2 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하며, 및/또는 (b) 제 2 존에서 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추출물 흐름을 칼럼으로부터 수집하고, 상기 제 1 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하고, 각각의 존에서 공급 혼합물의 다른 성분으로부터 상기 PUFA 생성물을 분리한다.
또한, 본 발명의 방법에 의해서 얻을 수 있는 PUFA 생성물이 제공된다.
본 발명의 방법에 의해서 생성된 PUFA 생성물은 높은 수율 제조되고, 높은 순도를 갖는다. 또한, 본 발명은 일반적으로 PUFA의 증류로부터 발생한 특정한 불순물 함량이 매우 낮다. 본원에 사용된 바와 같이, "이성체 불순물"을 사용해서 일반적으로 PUFA-함유 천연 오일의 증류중에서 생성된 불순물을 나타낸다. 이들은 PUFA 이성체, 과산화 및 올리고머화 제품을 포함한다.
본 발명은 공급 혼합물을, 수성 알콜을 용리액으로서 함유한 다수의 결합된 크로마토그래피 칼럼을 갖는 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 장치는 적어도 제 1 존 및 제 2 존을 포함한 다수의 존을 갖고, 각각의 존은 추출물 흐름 및 라피네이트 흐름을 갖고, 각각의 존으로부터 상기 다수의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 액체를 수집할 수 있고, (a) 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 제 1 존에서 칼럼으로부터 수집하고 제 2 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하고, 및/또는 (b) 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추출물 흐름을 제 2 존에서 칼럼으로부터 수집하고 상기 제 1 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하고, 상기 PUFA 생성물은 각각의 존에서 공급 혼합물의 다른 성분으로부터 분리한, 공급 혼합물로부터 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법을 제공한다.
도 1은 2 성분 혼합물을 분리하기 위한 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 방법의 기본 원리를 도시한다.
도 2는 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 EPA를 분리하는 데에 적합한 본 발명의 바람직한 제 1 실시형태를 도시한다.
도 3은 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 DHA를 분리하는 데에 적합한 본 발명의 바람직한 제 2 실시형태를 도시한다.
도 4는 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 EPA를 분리하는 데에 적합한 본 발명의 바람직한 제 1 실시형태를 상세하게 도시한다.
도 5는 더 빠른 및 덜 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)을 분리하는 데에 적합한 본 발명의 바람직한 제 2 실시형태를 상세하게 도시한다.
도 6은 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 EPA를 분리하는 데에 적합한 본 발명의 바람직한 제 1 실시형태의 또 다른 방법을 상세하게 도시한다.
도 7은 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 DHA를 분리하는 데에 적합한 본 발명의 바람직한 제 2 실시형태의 또 다른 방법을 상세하게 도시한다.
도 8은 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 EPA를 정제하기 위한 본 발명의 특히 바람직한 실시형태를 도시한다.
도 9는 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 EPA를 정제하기 위한 본 발명의 특히 바람직한 실시형태의 또 다른 방법을 도시한다.
도 10은 더 빠른 및 더 느린 이동 성분(즉, 높은 극성 및 낮은 극성 불순물)으로부터 EPA를 정제하기 위한 본 발명의 특히 바람직한 실시형태를 도시한다.
도 11은 본 발명에 따라서 제조된 EPA 생성물의 GC 분석을 도시한다.
도 12는 본 발명에 따라서 얻어진 제 1 추출물 및 라피네이트 흐름의 GC FAMES 추적을 도시한다.
도 13은 본 발명에 따라서 얻어진 제 2 추출물 및 라피네이트 흐름의 GC FAMES 추적을 도시한다.
도 14는 본 발명에 따라서 생성된 DHA의 GC FAMES 추적을 도시한다.
도 15는 증류에 의해서 생성된 DHA 생성물의 GC FAMES 추적을 도시한다.
"다중 불포화 지방산(PUFA)"는 하나를 초과한 이중 결합을 함유한 지방산을 의미한다. 이러한 PUFA는 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, PUFA 유도체는 모노-, 디-, 또는 트리-글리세라이드, 에스테르, 포스포리피드, 아미드, 락톤, 또는 염의 형태의 PUFA이다. 트리글리세라이드 및 에스테르가 바람직하다. 에스테르가 보다 바람직하다. 에스테르는 일반적으로 알킬 에스테르, 바람직하게 C1-C6 알킬 에스테르, 보다 바람직하게 C1-C4 알킬 에스테르이다. 에스테르로는 메틸 및 에틸 에스테르를 들 수 있다. 에틸 에스테르가 가장 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, "PUFA 생성물"은 하나 이상의 다중 불포화 지방산(PUFA) 및/또는 그 유도체를 포함하고, 일반적으로 영양학적 또는 약학적으로 중요한 생성물을 의미한다. 일반적으로, PUFA 생성물은 하나의 PUFA 또는 그 유도체이다. 또한, PUFA 생성물은 2개 이상의 PUFA 또는 그 유도체의 혼합물, 예를 들면 2개의 혼합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "존"은 용리액으로서 수성 알콜을 함유한 여러 개의 결합된 크로마토그래피 칼럼을 의미하고, 하나 이상의 공급 혼합물 흐름의 주입 위치, 하나 이상의 물 및/또는 알콜의 주입 위치, 상기 다수개의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 액체를 수집하는 라피네이트 방출 흐름, 및 상기 다수개의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 액체를 수집한 추출물 방출 흐름을 갖는다. 일반적으로, 각각의 존은 공급 혼합물의 하나의 주입 위치를 갖는다. 일 실시형태에서, 각각의 존은 수성 알콜 용리액의 하나의 주입 위치를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 존은 물 및/또는 알콜의 2개 이상의 주입 위치를 갖는다.
"라피네이트"는 당업자에게 공지되어 있다. 실제의 및 시뮬레이트된 이동상 크로마토그래피의 점에서, 고체 흡착제상에 비해서 액체 용리액상에 의해서 비교적 빠르게 이동하는 성분의 흐름을 의미한다. 따라서, 라피네이트 흐름은 일반적으로 공급 흐름에 비해서 높은 극성 성분이 많고, 낮은 극성 성분이 적다.
"추출물"은 당업자에게 공지되어 있다. 실제 및 시뮬레이트된 이동상 크로마토그래피는 액체 용리액 상에 비해서 고체 흡착제상에 의해서 더욱 빠르게 이동하는 성분 흐름을 의미한다. 따라서, 추출물 흐름은 일반적으로 공급 흐름에 비해서 낮은 극성 성분이 많고, 높은 극성 성분이 적다.
본원에 사용된 바와 같이, 동일한 장치에서 칼럼에 적용된 경우의 "인접하지 않은"은 하나 이상의 칼럼, 바람직하게 3개 이상의 칼럼, 보다 바람직하게 5개 이상의 칼럼, 가장 바람직하게 약 5개의 칼럼에 의해서 분리된 칼럼을 의미한다.
따라서, (a) 제 1 존에서 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 칼럼으로부터 수집하고 제 2 존의 인접하지 않은 칼럼에 도입하는 경우, 상기 제 1 존으로부터 수집된 라피네이트 흐름은 제 2 존에 대한 공급 혼합물이다. (b) 제 2 존에서 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추추물 흐름을 칼럼으로부터 수집하고 상기 제 1 존의 인접하지 않은 칼럼에 도입하는 경우, 상기 제 2 존으로부터 수집된 추출물 흐름은 상기 제 1 존에서 공급 혼합물이다.
일반적으로, PUFA 생성물은 하나 이상의 ω-3 또는 ω-6 PUFA, 바람직하게 하나 이상의 ω-3 PUFA를 포함한다. ω-3 PUFA로는 알파-리놀렌산(ALA), 스테아리돈산(SDA), 에이코사트리엔산(ETE), 에이코사테트라엔산(ETA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사펜타엔산(DPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)를 들 수 있다. SDA, EPA, DPA 및 DHA가 바람직하다. EPA 및 DHA이 보다 바람직하다. ω-6 PUFA는 리놀레산 (LA), 감마-리놀렌산(GLA), 에이코사디엔산, 디호모-감마-리놀렌산(DGLA), 아라키돈산(ARA), 도코사디엔산, 아드렌산 및 도코사펜타엔(ω-6)산을 들 수 있다. LA, ARA, GLA 및 DGLA이 바람직하다.
일 실시형태에서, PUFA 생성물은 EPA 및/또는 EPA 에틸 에스테르(EE)이다.
또 다른 실시형태에서, PUFA 생성물은 DHA 및/또는 EPA 에틸 에스테르(EE)이다.
또 다른 실시형태에서, PUFA 생성물은 EPA 및 DHA 및/또는 EPA EE 및 DHA EE의 혼합물이다.
본 발명의 방법에 의해서 분리하는 데에 적당한 공급 혼합물은 식물성 및 동물성 오일 및 지방을 포함한 천연 소스, 및 유전적으로 개질된 식물, 동물 및 이스트를 포함한 미생물로부터 얻어진 오일을 포함한 합성 소스로부터 얻어질 수 있다. 예를 들면, 피시 오일, 조류, 및 미세조류 오일 및 식물 오일, 예를 들면 보리지(borage) 오일, 에키움(Echium) 오일 및 달맞이꽃 종자오일을 들 수 있다. 일 실시형태에서, 공급 혼합물은 피시 오일이다. 또 다른 실시형태에서, 공급 혼합물은 조류 오일이다. 조류 오일은 원하는 PUFA 생성물이 EPA 및/또는 DHA인 경우에 적당하다. 유전적으로 개질된 홍화 오일은 원하는 PUFA 생성물이 GLA인 경우에 적당하다. 유전적으로 개질된 이스트는 원하는 PUFA 생성물이 EPA인 경우에 적당하다.
상기 공급 혼합물은 본 발명의 방법에 의해서 분리하기 전에 화학 처리를 실시할 수 있다. 예를 들면, 상기 공급 혼합물은 글리세라이드 에스테르 교환 또는 글리세라이드 가수분해를 실시한 후, 특정한 경우에 선택적인 방법, 예를 들면 결정화, 분자 증류, 우레아 분별, 실버 니트레이트 또는 그외의 금속염 용액에 의한 추출, 요오드락톤화 또는 초임계유체 분별을 실시할 수 있다.
일반적으로, 공급 혼합물은 PUFA 생성물 및 하나 이상의 높은 극성 성분 및 하나 이상의 낮은 극성 성분을 함유한다. 낮은 극성 성분은 PUFA 생성물보다 본 발명의 방법에서 사용된 흡착제에 더 강하게 흡착한다. 조작 중에 이러한 낮은 극성 성분은 일반적으로 액체 용리액 상보다 고체 흡착제상에 의해서 이동한다. 높은 극성 성분은 PUFA 생성물보다 본 발명의 방법에서 사용된 흡착제에 더 약하게 흡착한다. 조작 중에 이러한 높은 극성 성분은 일반적으로 고체 흡착제 상보다 액체 용리액 상에 의해서 이동한다. 일반적으로, 높은 극성 성분은 라피네이트 흐름으로 분리되고, 낮은 극성 성분은 추출물 흐름으로 분리될 것이다.
높은 극성 성분 및 낮은 극성 성분으로는 (1) 천연 오일(예를 들면 마린 오일 또는 식물성 오일)에서 발생한 그외의 화합물, (2) 보존, 정제 및 상기 농축 단계 중에 형성된 부산물, 및 (3) 상기 농축 또는 정제 단계 중에 이용된 용매 또는 시약으로부터 오염물을 들 수 있다.
(1)로는 그외의 바람직하지 않은 PUFA; 포화지방산; 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤; 비타민; 및 환경오염, 예를 들면 폴리클로로비페닐(PCB), 다환방향족 탄화수소(PAH) 살충제, 염소화 살충제, 다이옥신 및 중금속을 들 수 있다. PCB, PAH, 디옥신 및 염소화 살충제는 모두 매우 비극성 성분이다.
(2)로는 PUFA 생성물로부터 이성질체 및 산화 또는 분해 생성물, 예를 들면 지방산 또는 그 유도체의 자동 산화 중합물을 들 수 있다.
(3)으로는 공급 혼합물로부터 포화 또는 모노-불포화 지방산을 제거하기 위해서 첨가할 수 있는 우레아를 들 수 있다.
바람직하게, 공급 혼합물은 PUFA-함유 마린 오일, 보다 구체적으로 EPA 및/또는 DHA를 포함한 마린 오일이다.
본 발명의 방법에 의해서 농축된 EPA를 제조하기 위한 일반적인 공급 혼합물은 50-75% EPA, 0 내지 10% DHA 또는 그외의 기본적인 ω-3 및 ω-6 지방산을 포함한 그외의 성분을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해서 농축된 EPA를 제조하기 위한 바람직한 공급 혼합물은 55% EPA, 5% DHA, 및 그외의 기본적인 ω-3 및 ω-6 지방산을 포함한 그외의 성분을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해서 농축된 DHA를 제조하기 위한 일반적인 공급혼합물은 50-75% DHA, 0 내지 10% EPA 또는 그외의 기본적인 ω-3 및 ω-6 지방산을 포함한 성분을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해서 농축된 DHA를 제조하기 위한 바람직한 공급 혼합물은 75% DHA, 7% EPA, 및 그외의 기본적인 ω-3 및 ω-6 지방산을 포함한 그외의 성분을 포함한다. EPA는 DHA보다 높은 극성이다.
본 발명의 방법에 의해서 농축된 EPA 및 DHA 혼합물을 제조하기 위한 일반적인 공급 혼합물은 33% 초과한 EPA, 22%를 초과한 DHA 을 포함한다.
본 발명의 방법은 상기 크로마토그래피 장치에서 여러 존을 필요로 한다. 일반적으로, 2개 이상의 존이 사용된다. 존의 개수는 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 2 내지 5개의 존이 사용된다. 바람직하게, 2개 또는 3개의 존, 보다 바람직하게 2개의 존이 사용된다.
일반적으로, 본 발명의 방법에서 사용된 장치의 각각의 존에서 분리된 성분은 다른 극성을 갖는다.
일반적으로, a)각각의 존에서 존재한 수성 알콜 용리액은 다른 물:알콜 비율; 및/또는
(b) 각각의 존에서 추출물 및 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 동일한 존에서 재순환된 속도는 각각의 존에서 PUFA 생성물이 공급혼합물의 다른 성분으로부터 분리될 수 있도록 조절한다.
본 발명의 방법에서 사용된 장치가 2개의 존을 갖는 경우, 일반적으로 본 발명은 공급 혼합물로부터 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법을 제공하고, 이 방법은 공급 혼합물을 용리액으로서 수성 알콜을 함유한 여러 개 결합된 크로마토그래피 칼럼을 갖는 시뮬레이트 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 장치는 제 1 존 및 제 2 존을 갖고, 각각의 존은 상기 여러 개의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 액체를 수집할 수 있는 추출물 흐름 및 라피네이트 흐름을 갖고, (a) 상기 제 1 존에서 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 칼럼으로부터 수집하고, 상기 제 2 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하며, 및/또는 (b) 상기 제 2 존에서 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추출물 흐름을 칼럼으로부터 수집하고, 상기 제 1 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하며, 상기 제 1 존에서 공급 혼합물의 낮은 극성 성분으로부터 상기 PUFA 생성물을 분리하고, 상기 제 2 존에서 높은 극성의 공급 혼합물로부터 상기 PUFA 생성물을 분리한다.
일반적으로, 본 발명의 방법에서 사용된 장치가 2개의 존을 함유하는 경우, 상기 제 1 존에서 용리액은 상기 제 2 존에서 용리액보다 많은 알콜을 함유하며, 상기 제 2 존은 상기 시스템에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 존의 하류이다. 따라서, 상기 시스템에서 용리액은 일반적으로 제 1 존에서 제 2 존으로 이동한다. 반면, 상기 고체 흡착제상은 일반적으로 상기 제 2 존으로부터 제 1 존으로 이동한다. 일반적으로, 2개의 존은 겹쳐지지 않고, 즉 크로마토그래피 칼럼이 2개의 존에 존재하는 것은 아니다.
본 발명의 실시형태에서, 상기 장치가 제 1 존, 제 2 존, 제 3 존을 갖는다. 상기 제 1 존, 제 2 존, 및 제 3 존에서 존재한 수성 알콜 용리액의 물-알콜 비율이 일반적으로 다르다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이는 각각의 존에서 다른 극성을 갖는 불순물을 제거할 수 있다는 결론을 도출한다.
바람직하게, 상기 장치는 3개의 존을 갖고, 상기 제 1 존에서 용리액이 상기 제 2 존 및 제 3 존에서 용리액보다 많은 알콜을 함유하고, 상기 제 1 존은 상기 시스템에서 용리액의 흐름에 대해서 제 2 존 및 제 3 존의 상류이다. 일반적으로, 상기 제 2 존에서 용리액은 상기 제 3 존에서 용리액보다 많은 알콜을 함유하고, 상기 제 2 존은 상기 시스템에서 용리액의 흐름에 대해서 제 3 존의 상류이다. 일반적으로, 상기 제 1 존에서, PUFA 생성물보다 낮은 극성의 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리한다. 일반적으로, 제 2 존에서 PUFA 생성물보다 낮은 극성이지만 상기 제 1 존에서 분리된 성분보다 높은 극성의 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리한다. 일반적으로, 상기 제 3 존에서, PUFA 생성물보다 높은 극성의 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리한다.
다른 실시형태에서, 제 1 존에서 PUFA 생성물보다 낮은 극성의 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리하고, 제 2 존에서 PUFA 생성물보다 높은 극성의 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리하며, 제 3 존에서 PUFA 생성물보다 높은 극성이고 제 2 존에서 분리된 성분보다 높은 극성의 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리한다.
3개의 존을 갖는 이러한 셋업은 DHA 및 EPA보다 낮은 극성의 불순물을 함유하고 EPA 보다 높은 극성의 불순물을 함유한 혼합물로부터 EPA 및 DHA를 분리하는 데에 적당할 수 있다. 제 1 존에서, DHA 및 EPA보다 낮은 극성 성분을, DHA, EPA를 포함한 추출 및 라피네이트 흐름으로서 제거하고, EPA보다 높은 극성 성분을 수집하고 제 2 존에 도입한다. 제 2 존에서, DHA를 EPA를 포함한 추출 및 라피네이트 흐름으로서 제거하고, EPA보다 높은 극성 성분을 수집하고 제 3 존에 도입한다. 제 3 존에서, EPA보다 높은 극성 성분을 라피네이트 흐름으로서 제거하고, 정제된 EPA를 추출물 흐름으로서 수집한다. 이 실시형태에서, 정제된 EPA는 정제된 PUFA 생성물이다. 이러한 셋업은 부수적인 PUFA 도 회수할 수 있는 이점이 있다. 이 경우에, 부수적인 PUFA는 제 2 존으로부터 추출물 흐름으로서 수집된 DHA이다.
일반적으로, 상기 PUFA 생성물 이외에, 추가의 부수적인 PUFA 생성물을 본 발명의 크로마토그래피 분리 방법에 의해서 수집한다. 바람직하게, PUFA 생성물은 EPA이고 추가의 부수적인 PUFA 생성물은 DHA이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 장치는 EPA 및 DHA의 농축된 혼합물인 PUFA 생성물을 수집하도록 구성한다. 따라서, 공급 혼합물은 EPA, DHA; EPA 및 DHA 보다 높은 극성 성분; 및 EPA 및 DHA 보다 낮은 극성 성분을 함유한 것을 사용한다. 제 1 존에서, EPA 및 DHA보다 낮은 극성 물질을 제거한다. 제 2 존에서, EPA 및 DHA보다 높은 극성 물질을 제거하고, EPA 및 DHA의 농축된 혼합물을 PUFA 생성물로서 수집한다.
임의의 공지의 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치는 본 발명의 방법을 특징으로 하는, 여러개, 특히 2개의 존으로 구성된 것이면 본 발명의 방법의 목적에 대해서 이용할 수 있다. US 2,985,589, US 3,696,107, US 3,706,812, US 3,761,533, FR-A-2103302, FR-A-2651148, FR-A-2651149, US 6,979,402, US 5,069,883 및 US 4,764,276에 기재된 장치가, 본 발명의 방법에 따라서 구성된 것이면 모두 사용될 수 있다.
장치에서 사용된 칼럼의 수는 특별히 한정되지 않는다. 당업자는 사용에 적당한 칼럼의 수를 쉽게 결정할 수 있다. 칼럼의 수는 일반적으로, 8개 이상, 바람직하게 15개 이상이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 15 또는 16개의 칼럼이 사용된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 19 또는 20 칼럼이 사용된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 30 이상의 칼럼이 사용된다. 일반적으로, 50개 이하의 칼럼, 바람직하게 40 개 이하의 칼럼이다.
각각의 존은 칼럼의 총수와 대략 동일한 개수로 이루어진다. 따라서, 2개의 존으로 구성된 장치의 경우에, 각각의 존은 일반적으로 시스템에서 크로마토그래피 칼럼 총수의 대략 절반으로 이루어진다. 따라서, 제 1 존은 일반적으로 4개 이상, 바람직하게 8개 이상, 보다 바람직하게 약 8개의 칼럼이다. 제 2 존은 일반적으로 4개 이상, 바람직하게 7개 이상, 보다 바람직하게 7개 또는 8개 칼럼을 포함한다.
장치에 사용된 칼럼의 치수는 특별히 한정되지 않고, 정제될 공급 혼합물의 양에 의존할 것이다. 당업자는 사용할 적당한 크기의 칼럼을 쉽게 결정할 수 있다. 각각의 칼럼의 직경은 10 내지 500 mm이고, 바람직하게 25 내지 250 mm, 보다 바람직하게 50 내지 100 mm, 가장 바람직하게 70 내지 80 mm이다. 각각의 칼럼의 길이는 10 내지 200 cm, 바람직하게 25 내지 150 cm, 보다 바람직하게 70 내지 110 cm, 가장 바람직하게 80 내지 100 cm이다.
각각의 존에서 칼럼은 일반적으로 동일한 치수를 갖지만 특정한 적용에 대해서 다른 치수를 가질 수 있다.
칼럼의 유속은 연속적인 칼럼의 최대 압력으로 한정되고, 칼럼 치수 및 고체 상의 입자크기에 의존할 것이다. 당업자는 쉽게 효율적으로 탈착하는 것을 보장하기 위해서 각각의 칼럼 치수에 필요한 유속을 쉽게 설정할 수 있다. 더 큰 치수의 칼럼은 칼럼을 통해서 선형 흐름을 유지하기 위해서 일반적으로 더 빠른 흐름을 필요로 할 것이다.
상기 일반적인 칼럼 크기 및 2개의 존을 갖는 장치에 대해서, 일반적으로 제 1 존으로 용리액의 유속은 1 내지 4.5 L/min, 바람직하게 1.5 내지 2.5 L/min이다. 일반적으로, 제 1 존으로부터 추출물의 유속은 0.1 내지 2.5 L/min, 바람직하게 0.5 내지 2.25L/min이다. 제 1 존으로부터 추출물의 일부가 제 1 존으로 재순환된 실시형태에서, 재순환 유속은 0.7 내지 1.4 L/min, 바람직하게 약 1L/min이다. 일반적으로, 제 1 존으로부터 라피네이트의 유속은 0.2 내지 2.5 L/min, 바람직하게 0.3 내지 2.0 L/min이다. 제 1 존으로부터 라피네이트의 일부가 제 1 존으로 재순환된 실시형태에서, 재순환의 유속은 0.3 내지 1.0 L/min, 바람직하게 약 0.5 L/min이다. 일반적으로, 공급 혼합물을 제 1 존에 도입하는 유속은 5 내지 150 mL/min, 바람직하게 10 내지 100 mL/min, 보다 바람직하게 20 내지 60 mL/min이다.
상기의 일반적인 칼럼의 크기 및 2개의 존을 갖는 장치에 대해서, 일반적으로 제 2 존으로 용리액의 유속은 1 내지 4 L/min, 바람직하게 1.5 내지 3.5 L/min이다. 일반적으로, 제 2 존으로부터 추출물의 유속은 0.5 내지 2 L/min, 바람직하게 0.7 내지 1.9 L/min 이다. 상기 제 2 존으로부터 추출물의 일부가 제 2 존으로 재순환된 실시형태에서, 재순환의 유속은 0.6 내지 1.4 L/min, 바람직하게 0.7 내지 1.1 L/min, 보다 바람직하게 약 0.9 L/min이다. 일반적으로, 상기 제 2 존으로부터 라피네이트의 유속은 0.5 내지 2.5 L/min, 바람직하게 0.7 내지 1.8 L/min, 보다 바람직하게 약 1.4 L/min이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 다양한 추출물 및 라피네이트 흐름을 통해서 액체를 수집하거나 제거하는 속도는 시간에 따라서 제거된 액체의 부피를 의미하고, 일반적으로 L/min이다. 마찬가지로, 동일한 존으로 액체를 재순환한 속도는 시간에 따라서 재순환된 액체의 부피를 의미하고, 일반적으로, L/min이다.
일반적으로, 제 1 존으로부터 추출물 흐름, 제 1 존으로부터 라피네이트 흐름, 제 2 존으로부터 추출물 흐름, 및 제 2 존으로부터 라피네이트 흐름 중 하나 이상의 일부가 동일한 존으로 재순환되고, 일반적으로 동일한 존에 인접한 칼럼으로 재순환된다.
이러한 재순환은 추출물 또는 라피네이트 흐름을 또 다른 존에 인접하지 않은 칼럼으로 공급하는 단계와 다르다. 오히려, 상기 재순환은 존의 외부의 추출물 또는 라피네이트 흐름의 일부를 동일한 존으로 공급하는 단계, 일반적으로 동일한 존에 인접한 칼럼으로 공급하는 단계를 수반한다.
제 1 또는 제 2 존으로부터 추출물 또는 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 동일한 존으로 재순환된 속도는 그 흐름을 통해서 수집된 액체가 동일한 존으로 공급된 속도이고, 일반적으로 동일한 존에 인접한 칼럼으로 공급된 속도이다. 이것은 도 9에서 표시될 수 있다. 제 1 존에서 추출물의 재순환 속도는 칼럼 2의 하부로부터 수집된 추출물을 칼럼 3의 상부로 공급하는 속도이고, 즉 칼럼 3의 상부로 액체의 유속이다. 제 2 존에서 추출물의 재순환 속도는 칼럼 10의 하부에서 수집된 추출물이 칼럼 11의 상부로 공급된 속도, 즉 칼럼 11의 상부로 액체의 유속이다.
추출물 및/또는 라피네이트 흐름의 재순환은 일반적으로 그 흐름을 통해서 수집된 유체를 컨테이너에 공급된 후, 그 컨테이너로부터 그 액체의 양을 동일한 존으로 다시 주입함으로써 실시한다. 이 경우에, 일반적으로 동일한 존에서 입자 추출물 또는 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체를 인접한 칼럼으로 재순환하는 속도는 컨테이너의 외부에서 액체를 동일한 존으로, 일반적으로 인접한 칼럼으로 액체를 주입하는 속도이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 용리액 및 공급 흐름을 통해서 존에 도입된 액체의 양은 존으로부터 제거되고 동일한 존으로 재순환된 액체의 양과 밸런스를 이룬다. 따라서, 도 9를 참조하면, 추출물 흐름에 대해서, 제 1 또는 제 2 존(D)으로 용리액(탈착제)의 유속은 그 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 컨테이너에서 축적되는 속도(E1/E2)와, 추출물을 동일한 존으로 재순환하는 속도(D-E1/D-E2)를 합한 속도와 동일하다. 존에서 라피네이트 흐름에 대해서, 공급 원료를 존에 도입한 속도(F/Rl)와 추출물을 존으로 재순환하는 속도(D-E1/D-E2)를 합한 속도는 그 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 컨테이너에서 축적되는 속도(R1/R2)와, 라피네이트를 동일한 존으로 재순환하는 속도(D+F-E1-R1/D+R1-E2-R2)를 합한 속도와 동일하다.
존으로부터 입자 추출물 또는 라피네이트 흐름으로부터 수집된 액체가 컨테이너에서 축적하는 속도는 그 존으로부터 추출물 또는 라피네이트 흐름의 순 제거 속도로서 생각될 수 있다.
일반적으로서, 제 1 존 외부에서 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환되는 속도는 제 2 존 외부에서 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환되는 속도와 다르고, 및/또는 제 1 존 외부에서 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환되는 속도는 제 2 존의 외부에서 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환되는 속도와 다르다.
각각의 존에서 추출물 및/또는 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체는 그외의 추출물 및 라피네이트 흐름에서 높은 극성 및 낮은 극성 성분의 양을 변화시키는 작용을 갖는다. 따라서, 예를 들면, 낮은 추출물 재순환 속도는 그 존에서 라피네이트 흐름으로 이동하는 낮은 극성 성분이 감소한다. 높은 추출물 재순환 속도는 그 존에서 라피네이트 흐름으로 이동하는 낮은 극성 성분을 증가시킨다. 이것은, 예를 들면 도 6에서 도시된 본 발명의 특정한 실시형태에서 표시될 수 있다. 제 1 존에서 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 동일한 존(D-E1)에서 재순환된 속도는 제 1 존(R1)에서 임의의 성분 A가 라피네이트 흐름으로 이동되는 데에 어느 정도로 영향을 미칠 것이다.
일반적으로, 제 1 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환하는 속도는 제 2 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환하는 속도보다 빠르다. 바람직하게, 제 1 존에서 칼럼으로부터 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 수집하고 제 2 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하며, 제 1 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로부터 재순환된 속도는 제 2 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환되는 속도보다 빠르다.
또한, 제 1 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환된 속도는 제 2 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환된 속도보다 느리다.
일반적으로, 제 2 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로부터 재순환된 속도는 제 1 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환된 속도보다 빠르다. 바람직하게, 제 2 존에서 칼럼으로부터 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추출물 흐름을 수집하고, 제 1 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하며, 제 2 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환된 속도는 제 1 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환된 속도보다 빠르다.
또한, 제 2 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환된 속도는 제 1 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환된 속도보다 느리다.
단계 시간, 즉 공급 혼합물 및 용리액의 주입 위치를 이동하는 단계와 수집된 분획의 다양한 방출 위치 사이의 시간은 특별히 한정되지 않지만, 사용된 칼럼의 수 및 치수, 및 장치를 통과한 유속에 의존할 것이다. 당업자는 본 발명의 방법에서 사용하는 적당한 단계 시간을 쉽게 결정할 수 있다. 단계 시간은 일반적으로 100 내지 1000초, 바람직하게 200 내지 800초, 보다 바람직하게, 250 내지 750초이다. 일부 실시형태에서, 100 내지 400초의 단계 시간, 바람직하게 200 내지 300초, 보다 바람직하게 약 250초가 적당하다. 다른 실시형태에서, 600 내지 900초, 바람직하게 700 내지 800초, 보다 바람직하게 약 750초의 단계 시간이 적당하다.
본 발명의 방법에서, 실제의 이동상 크로마토그래피가 바람직하다.
실제 및 시뮬레이트 이동상 시스템에 대한 종래에 공지된 흡착제는 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 각각의 크로마토그래피 칼럼은 동일한 또는 다른 흡착제를 함유할 수 있다. 일반적으로, 각각의 칼럼은 동일한 흡착제를 함유한다. 이러한 일반적으로 사용된 물질로는 중합 비즈, 바람직하게 DVB(디비닐벤젠)으로 레티큘화된 폴리스티렌; 및 실리카겔, 바람직하게 C8 또는 C18 알칸, 특히 C18과 결합된 역상 실리카겔이다. C18과 결합된 역상 실리카겔이 바람직하다. 본 발명의 방법에서 사용된 흡착제는 바람직하게 비극성이다.
흡착제 정지상 물질의 형상은, 예를 들면 구상 또는 비구상 비즈, 바람직하게 실질적으로 구상 비즈일 수 있다. 이러한 비즈는 일반적으로 40 내지 500 마이크론, 바람직하게 100 내지 500 마이크론, 보다 바람직하게 250 내지 500 마이크론, 더욱 더 바람직하게 250 내지 400 마이크론, 가장 바람직하게 250 내지 350 마이크론의 직경을 갖는다. 이들의 바람직한 입자 크기는 시뮬레이트된 및 실제의 이동상 공정에서 종래에 사용된 비즈의 입자크기에 비해서 다소 크다. 더 큰 입자의 사용에 의해서 시스템에서 더 낮은 압력의 용리액을 사용할 수 있다. 이것은, 이어서 장치의 비용 절약, 효율 및 수명의 점에서 바람직하다. 큰 입자 크기의 흡착제 비즈는 임의의 해상도 손실없이 본 발명의 방법에서 (그 수반된 이점과 함께)사용될 수 있다.
일반적으로 흡착제는 10 내지 50 nm, 바람직하게 15 내지 45 nm, 보다 바람직하게 20 내지 40 nm, 가장 바람직하게 25 내지 35 nm의 기공 크기를 갖는다.
본 발명의 방법에서 사용된 용리액은 수성 알콜이다. 일반적으로 수성 알콜은 물 및 하나 이상의 단쇄 알콜을 포함한다. 단쇄 알콜은 일반적으로 1 내지 6의 탄소원자를 갖는다. 적당한 알콜로는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, i-프로판올, n-부탄올, i-부탄올, s-부탄올 및 t-부탄올을 들 수 있다. 메탄올 및 에탄올이 바람직하다. 메탄올이 가장 바람직하다.
일반적으로, 용리액이 초임계 상태인 것은 아니다. 일반적으로, 용리액은 액체이다.
일반적으로, 전체의 장치에서 용리액 중 물-알콜의 평균 비율은 0.1:99.9 내지 9:91 체적부, 바람직하게 0.25:99.75 내지 7:93 체적부, 보다 바람직하게 0.5:99.5 내지 6:94 체적부이다.
각각의 존에서 용리액 중 용리하는 분말은 일반적으로 다르다. 바람직하게, 제 1 존에서 용리액 중 용리하는 분말은 제 2 존 및 그 다음 존에서 용리액 중 용리하는 분말보다 많다. 실제로, 이것은 각각의 존에서 물과 알콜의 상대적인 양을 변화시킴으로써 달성된다. 알콜은 일반적으로 물보다 보다 강력한 탈착제이다. 따라서, 제 1 존에서 용리액에서 알콜의 양은 일반적으로 제 2 존 및 그 다음 존의 용리액에서 알콜의 양보다 많다.
각각의 존에서 수성 알콜이 다른 물-알콜 함량을 갖는 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비는 일반적으로 0: 100 내지 5:95 체적부, 바람직하게0.1 :99.9 내지 2.5:97.5 체적부, 보다 바람직하게 0.25:99.75 내지 2:98 체적부, 및 가장 바람직하게 0.5:99.5 내지 1.5:98.5 체적부이다. 이들 실시형태에서, 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비는 일반적으로 3:97 내지 7:93 체적부, 바람직하게 4:96 내지 6:94 체적부, 보다 바람직하게 4.5:95.5 내지 5.5:94.5 체적부이다.
각각의 존에서 존재한 수성 알콜이 다른 물 알콜 함량을 갖는 바람직한 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 0.5:99.5 내지 1.5:98.5 체적부, 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 4.5:95:5 내지 5.5:94.5 체적부이다.
각각의 존에서 추출물 및 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체가 동일한 존으로 재순환된 속도는, 각각의 존에서 다른 공급 혼합물 성분으로부터 PUFA 생성물을 분리하도록 조절한 실시형태에서, 각각의 존에서 용리액의 물:알콜 비는 동일하거나 다를 수 있다. 일반적으로, 각각의 존에서 용리액의 물:알콜 비율이 0.5:99.5 내지 5.5:94.5 체적부이다. 일 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비율보다 낮다. 또 다른 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비율보다 높다. 또 다른 실시형태에서, 제 1 존에서 용래액의 물:알콜 비율은 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비율과 동일하다.
상기 기재된 각각의 존에서 물과 알콜의 비율이 전체 영역에서 평균 비율인 것을 알 수 있다.
일반적으로, 각각의 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 그 존에서 물 및/또는 알콜을 하나 이상의 칼럼에 도입함으로써 조절한다. 따라서, 예를 들면 제 1 존에서 제 2 존에서보다 낮은 물:알콜 비율을 달성하기 위해서, 물은 일반적으로 제 2 존에 비해서 제 1 존으로 더 느리게 도입된다. 일부 실시형태에서, 기본적으로 각각의 존에서 다른 위치에서 순수한 알콜 및 필수적으로 순수한 물을 도입할 수 있다. 이들 2개의 흐름의 상대적인 유속은 존에서 전체의 용매의 프로파일을 결정할 것이다. 다른 실시형태에서, 다른 알콜/물 혼합물은 각각의 존 내의 다른 위치에서 도입할 수 있다. 이는 2개 이상의 다른 알콜/물 혼합물을 존에 도입하는 단계를 수반하고, 각각의 알콜/물 혼합물은 다른 알콜:물 비율을 갖는다. 이 실시형태에서 알콜/물 혼합물의 상대 유속 및 상대 농도는 존에서 전체의 용매 프로파일을 결정할 것이다. 각각의 존에서 용리액의 물:알콜 비율이 동일한 그외의 실시형태에서, 동일한 알콜/물 혼합물을 각각의 존에 도입한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 15 내지 55℃, 바람직하게 20 내지 40℃, 보다 바람직하게 약 30℃에서 실시한다. 따라서, 상기 방법은 실온에서 실시하는 것이 일반적이지만, 상승된 온도에서 실시할 수 있다.
본 발명의 방법은 공급 흐름을 하나의 존(예를 들면, 제 1 존)에 도입하는 단계, PUFA 생성물이 풍부한 제 1 중간 흐름을 수집하고 제 1 중간 흐름을 또 다른 존(예를 들면, 제 2 존)에 도입하는 단계를 포함한다. 따라서, 상기 장치가 2개의 존을 갖는 경우, 상기 방법은 (a) 제 1 존으로부터 제 1 의 중간 흐름을 수집하고 제 2 존에 도입하는 단계, 또는 (b) 제 2 존으로부터 제 1 중간 흐름을 수집하고 제 1 존에 도입하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, PUFA 생성물은 하나의 방법에서 높은 극성 성분 및 낮은 극성 성분으로부터 분리할 수 있다.
(a) 제 1 존에서 칼럼으로부터 높은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 라피네이트 흐름을 수집하고 제 2 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입하는 단계, 또는 (b) 제 2 존에서 칼럼으로부터 낮은 극성 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유한 추출물 흐름을 수집하고 제 1 존에 인접하지 않은 칼럼에 도입한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 장치는 2개의 존을 갖고, 본 발명의 방법은 다음을 포함한다:
(i) 공급혼합물을 제 1 존에 도입하고, PUFA 생성물이 풍부한 제 1 라피네이트 흐름 및 PUFA 생성물이 적은 제 1 추출물 흐름을 제거하는 단계, 및
(ii) 제 1 라피네이트 흐름을 제 2 존에 도입하고, PUFA 생성물이 적은 제 2 라피네이트 흐름을 제거하고, 제 2 추출물 흐름을 수집하여 PUFA 생성물을 얻는 단계.
이 특히 바람직한 실시형태는 공급 혼합물로부터 EPA 를 정제하는 데에 적당하다.
이 특히 바람직한 실시형태는 도 2에서 도시된다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성(C) 및 낮은 극성(A)의 성분을 포함한 공급 혼합물 F를 제 1 존에 도입한다. 제 1 존에서, 낮은 극성 성분(A)을 추출물 흐름 E1으로서 제거한다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성의 성분(C)을 라피네이트 흐름 R1로서 제거한다. 라피네이트 흐름 R1을 제 2 존에 도입한다. 제 2 존에서, 높은 극성의 성분(C)을 라피네이트 흐름 R2로서 제거한다. PUFA 생성물(B)을 추출물 흐름 E2로서 수집한다.
이러한 실시형태는 도 4에서 상세하게 도시한다. 도 4는 알콜 탈착체(D) 및 물(W)을 각각의 존에 도입하는 도입 위치가 도시된 것을 제외하고 도 2와 동일하다. 알콜 탈착제(D) 및 물(W)은 함께 용리액을 구성한다. (D) 상은 기본적으로 순수한 알콜인 것이 일반적이지만, 특정한 실시형태에서 주로 알콜을 포함한 물/알콜 혼합물일 수 있다. (W)상은 기본적으로 순수한 물인 것이 일반적이지만, 특정한 실시형태에서 주로 물을 포함한 알콜/물 혼합물일 수 있고, 예를 들면 98% 물/2% 메탄올 혼합물일 수 있다.
이 특히 바람직한 실시형태는 도 6에 도시되어 있다. 별도의 물의 주입 위치가 없는 대신에 (D)에서 수성 알콜 탈착제를 주입한다.
각각 존 내에서 용리액 중 탈착하는 분말을 변화시킴으로써 라피네이트와 추출물 흐름으로 분리를 도울 수 있다. 이것은 각각의 존에서 용리액의 알콜(또는 알콜 풍부) 및 물(또는 물 풍부) 성분을 다른 위치에서 도입함으로써 달성할 수 있다. 따라서, 일반적으로, 알콜은 시스템에서 용리액의 유속에 대해서, 추출물의 방출 위치의 상류에 도입하고, 물은 추출물의 방출 위치와 존으로 공급물의 도입 위치 사이에 도입한다. 이것은 도 4에 도시한다.
또한, 2개의 존으로부터 추출물 및 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체를 동일한 존으로 재순환하는 속도를 변화시킴으로써 분리를 도울 수 있다.
일반적으로, 특히 바람직한 실시형태에서, 제 1 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체를 제 1 존으로 재순환하는 속도는 제 2 존으로부터 추출물을 통해서 수집된 액체를 제 2 존으로 재순환하는 속도보다 빠르고; 또는 제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비율이 제 2 존에서보다 낮다.
이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 일반적으로 공급 혼합물을 제 1 존에 도입하는 위치의 하류에서 제 1 존에서 제 1 라피네이트 흐름을 제거한다.
이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 공급 혼합물을 제 1 존에 도입하는 위치의 상류에서 제 1 존에서 제 1 추출물 흐름을 제거한다.
이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 일반적으로 제 1 라피네이트 흐름을 제 2 존에 도입하는 위치의 하류에서 제 2 존에서 제 2 라피네이트 흐름을 제거한다.
이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 라피네이트 흐름을 제 2 존에 도입하는 위치의 상류에서 제 2 존에서 제 2 추출물 흐름을 수집한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 추출물 흐름을 제거하는 위치의 상류에서 알콜 또는 수성 알콜을 제 1 존에 도입한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 물을 제 1 존에 도입하는 경우, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 공급 혼합물의 도입 위치의 상류이지만, 제 1 추출물 흐름의 제거 위치의 하류에서 물을 제 1 존에 도입한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 제 2존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 2 추출물 흐름을 제거하는 위치 상류에서 알콜 또는 수성 알콜을 제 2 존에 도입한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 실시형태에서, 물을 제 2 존에 도입하는 경우, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 라피네이트 흐름의 도입 위치의 상류이지만, 제 2 추출물 흐름 제거 위치의 하류에서 물을 제 2 존에 도입한다.
또 다른 특히 바람직한 실시형태에서, 장치는 2개의 존을 갖고, 본 발명의 방법은 다음을 포함한다:
(i) 공급혼합물을 제 2 존에 도입하고, PUFA 생성물이 적은 제 1 라피네이트 흐름 및 PUFA 생성물이 풍부한 제 1 추출물 흐름을 제거하는 단계, 및
(ii) 제 1 추출물 흐름을 제 1 존에 도입하고, PUFA 생성물이 적은 제 2 추출물 흐름을 제거하고, 제 2 라피네이트 흐름을 수집하여 PUFA 생성물을 얻는 단계.
이 특히 바람직한 실시형태는 공급 혼합물로부터 DHA 를 정제하는 데에 적당하다.
이 실시형태는 도 3에서 도시된다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성(C) 및 낮은 극성(A)의 성분을 포함한 공급 혼합물 F은 제 2 존에 도입한다. 제 2 존에서, 높은 극성의 성분(C)을 라피네이트 흐름 R1으로서 제거한다. PUFA 생성물(B) 및 낮은 극성 성분(A)을 추출물 흐름 E1로서 수집한다. 추출물 흐름 E1을 제 1 존에 도입한다. 제 1 존에서, 낮은 극성 성분(A)을 추출물 흐름 E2로서 제거한다. PUFA 생성물(B)을 라피네이트 흐름 R2로서 수집한다.
이러한 실시형태는 도 5에서 상세하게 도시한다. 도5는 단쇄 알콜 탈착체(D) 및 물(W)을 각각의 존에 도입하는 도입 위치가 도시된 것을 제외하고 도 3과 동일하다. 상기 기재된 바와 같이, (D)상은 기본적으로 순수한 알콜인 것이 일반적이지만, 특정한 실시형태에서 주로 알콜을 포함한 물/알콜 혼합물일 수 있다. (W)상은 기본적으로 순수한 물인 것이 일반적이지만, 주로 물을 포함한 알콜/물 혼합물일 수 있고, 예를 들면 98% 물/2% 메탄올 혼합물일 수 있다.
이러한 특히 바람직한 실시형태는 도 7에서 도시된다. 별도의 물의 주입 위치가 없는 대신에 (D)에서 수성 알콜 탈착제를 주입한다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 제 2 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체를 제 2 존으로 재순환하는 속도는 제 1 존으로부터 라피네이트 흐름을 통해서 수집된 액체를 제 1 존으로 재도입하는 속도보다 빠르고; 또는 제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비율이 제 2 존에서보다 낮다.
이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 제 2 존에서 제 1 라피네이트 흐름을, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 일반적으로 공급 혼합물을 제 2 존에 도입하는 위치의 하류에서 제거한다.
이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 제 2 존에서 제 1 추출물 흐름을, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 공급 혼합물을 제 2 존에 도입하는 위치의 상류에서 수집한다.
이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 제 1 존에서 제 2 라피네이트 흐름을, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 일반적으로 제 1 추출물 흐름을 제 1 존에 도입하는 위치의 하류에서 수집한다.
이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 제 1 존에서 제 2 추출물 흐름을, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 추출물 흐름을 제 1 존에 도입하는 위치의 상류에서 제거한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 알콜 또는 수성 알콜을, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 추출물 흐름의 제거 위치 상류에서 제 2 존에 도입한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 물을 제 2 존에 도입하는 경우, 제 2 존에서 용리액의 흐름에 대해서 물을 공급 혼합물의 도입 위치의 상류이지만, 제 1 추출물 흐름 제거 위치의 하류에서 제 2 존에 도입한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 알콜 또는 수성 알콜을, 제 1존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 2 추출물 흐름의 제거 위치 상류에서 제 1 존에 도입한다.
일반적으로 이러한 특히 바람직한 제 2 실시형태에서, 물을 제 1 존에 도입하는 경우, 물을, 제 1 존에서 용리액의 흐름에 대해서 제 1 라피네이트 흐름의 도입 위치의 상류이지만, 제 2 추출물 흐름 제거 위치의 하류에서 제 1 존에 도입한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 시뮬레이트 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치는 15개의 크로마토그래피 칼럼으로 이루어진다. 이들은 칼럼 1 내지 15라고 한다. 15개의 칼럼은 칼럼 1의 하부가 칼럼 2의 상부에 연결되고, 칼럼 2의 하부가 칼럼 3의 상부에 연결되는 등과 같이 연속적으로 배열한다. 이것은 선택적으로 홀딩 컨테이너를 통해서 재순환 흐름에 의해서 다음의 칼럼에 존재할 수 있다. 이 시스템을 통한 용리액의 흐름은 칼럼 1로부터 칼럼 2 내지 3 등으로의 흐름이다. 이 시스템을 통과한 흡착제의 흐름은 칼럼 15로부터 칼럼 14 내지 칼럼 13 등으로의 흐름이다.
가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 존은 일반적으로 8개의 인접한 칼럼, 칼럼 1 내지 8로 이루어지고, 이는 상기 기재된 바와 같이 연결된다. 이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 제 2 존은 일반적으로 7개의 칼럼, 칼럼 9 내지 15로 이루어지고, 이는 상기 기재된 바와 같이 연결된다. 의심의 여지를 없애기 위해서, 제 1 존에서 칼럼 8의 하부는 제 2 존에서 칼럼 9의 상부에 연결된다.
가장 바람직한 실시형태는 도 8에서 도시된다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성(C) 및 낮은 극성(A)의 성분을 포함한 공급 혼합물 F은 제 1 존에서 칼럼 5의 상부에 도입한다. 알콜 흡착제를 제 1 존에서 칼럼 1의 상부에 도입한다. 물을 제 1 존에서 칼럼 4의 상부에 도입한다. 제 1 존에서, 낮은 극성 성분(A)을 칼럼 2의 하부로부터 추출물 흐름 E1로서 제거한다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성의 성분(C)을 칼럼 7의 하부로부터 라피네이트 흐름 R1로서 제거한다. 라피네이트 흐름 R1을 제 2 존에서 칼럼 13의 상부에 도입한다. 알콜 흡착제를 제 2 존에서 칼럼 9의 상부로 도입한다. 물을 제 2 존에서 칼럼 12의 상부에 도입한다. 제 2 존에서, 높은 극성 성분(C)을 칼럼 15의 하부에서 라피네이트 흐름 R2로서 제거한다. PUFA 생성물(B)을 칼럼 10의 하부에서 추출물 흐름 E2로서 수집한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 알콜을 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 1의 상부에 도입한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 물을 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 4의 상부로 도입한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 알콜을 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 9의 상부에 도입된다.
가장 바람직한 실시형태에서, 알콜을 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 12의 상부에 도입한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 공급 흐름을 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 5의 상부에 도입한다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 7의 하부로부터 제 1 라피네이트 흐름을 수집하고 제 2 존에서 칼럼 13의 상부에 도입한다. 제 1 라피네이트 흐름을 칼럼 13에 도입하기 전에 선택적으로 컨테이너에서 수집할 수 있다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 2의 하부로부터 제 1 추출물 흐름을 수집한다. 제 1 추출물 흐름을 선택적으로 컨테이너에서 수집하고 제 1 존에서 칼럼 3의 상부로 재도입한다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 15의 하부로부터 제 2 라피네이트 흐름을 제거한다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 10의 하부로부터 제 2 추출물 흐름을 수집한다. 이러한 제 2 추출물 흐름은 일반적으로 정제된 PUFA 생성물을 함유한다. 제 2 추출물 흐름을 선택적으로 컨테이너에서 수집하고 제 2 존에서 칼럼 11의 상부로 재도입할 수 있다.
일반적으로, 가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 존에서 물:알콜 비율은 제 2 존에서 물:알콜 비율보다 낮다.
보다 바람직한 실시형태는 도 9에 도시된다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성(C) 및 낮은 극성(A)의 성분을 포함한 공급 혼합물 F은 제 1 존에서 칼럼 5의 상부로 도입한다. 수성 알콜 흡착제는 제 1 존에서 칼럼 1의 상부에 도입한다. 제 1 존에서, 낮은 극성 성분(A)은 칼럼 2의 하부로부터 추출물 흐름 E1로서 제거한다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성의 성분(C)는 칼럼 7의 하부로부터 라피네이트 흐름 R1로서 제거한다. 라피네이트 흐름 R1을 칼럼 12의 상부에서 제 2 존에 도입한다. 수성 알콜 탈착제는 제 2 존에서 칼럼 9의 상부로 도입한다. 제 2 존에서, 높은 극성 성분(C)은 칼럼 14의 하부에서 라피네이트 흐름 R2로서 제거한다. PUFA 생성물(B)은 칼럼 10의 하부에서 추출물 흐름 E2로서 수집한다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 수성 알콜은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 1의 상부에 도입한다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 수성 알콜은 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 9의 상부에 도입한다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 공급 흐름은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 5의 상부에 도입한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 라피네이트 흐름은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 7의 하부로부터 수집하고 제 2 존에서 칼럼 12의 상부에 도입한다. 제 1 라피네이트 흐름은 칼럼 12로 도입하기 전에 선택적으로 컨테이너에서 수집할 수 있다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 추출물 흐름은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 2의 하부로부터 제거한다. 제 1 추출물 흐름은 선택적으로 컨테이너에서 수집하고 제 1 존에서 칼럼 3의 상부로 재도입된 부분일 수 있다. 제 1 존으로부터 다시 제 1 존으로 추출물 흐름을 통해서 수집한 액체의 재순환 속도는 컨테이너로부터 칼럼 3의 상부로 액체를 주입하는 속도이다.
가장 바람직한 실시형태에서, 제 2 라피네이트 흐름은 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 14의 하부로부터 제거한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 제 2 추출물 흐름은 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 10의 하부로부터 수집한다. 이러한 제 2 추출물 흐름은 일반적으로 정제된 PUFA 생성물을 함유한다. 제 2 추출물 흐름은 컨테이너에서 수집하고 제 2 존에서 칼럼 11의 상부로 재도입된 부분일 수 있다. 제 2 존으로부터 다시 제 2 존으로 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체의 재순환 속도는 컨테이너로부터 칼럼 11의 상부로 액체를 주입하는 속도이다.
이러한 가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환하는 속도는 제 2 존으로부터 추출물 흐름을 통해서 수집된 액체를 제 2 존으로 재순환하는 속도보다 빠르다.
가장 바람직한 실시형태에서, 수성 알콜 용리액은 각각의 존에서 실질적으로 동일하다.
본 발명의 가장 바람직한 실시형태에서, 시뮬레이트 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치는 19개의 크로마토그래피 칼럼으로 이루어진다. 이들은 칼럼 1 내지 19라고 한다. 15개의 칼럼은 칼럼 1의 하부가 칼럼 2의 상부에 연결되고, 칼럼 2의 하부가 칼럼 3의 상부에 연결하는 등과 같이 배열한다. 시스템을 통한 용리액의 흐름은 칼럼 1로부터 칼럼 2 내지 칼럼 3등으로의 흐름이다. 이 시스템을 통과한 흡착제의 흐름은 칼럼 19로부터 칼럼 18 내지 17로의 흐름이다.
이 실시형태에서, 제 1 존은 10개의 인접한 칼럼, 칼럼 1 내지 10으로 이루어지고, 이는 상기 기재된 바와 같이 연결된다. 제 2 존은 일반적으로 8개의 칼럼, 칼럼 11 내지 19로 이루어지고, 이들은 상기 기재된 바와 같이 연결된다.
이러한 바람직한 실시형태는 도 10에서 도시된다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성(C) 및 낮은 극성(A 및 A')의 성분을 포함한 공급 혼합물 F은 제 1 존에서 칼럼 7의 상부로 도입한다. 100% 알콜을 포함한 제 1 탈착제(D1)은 제 1 존에서 칼럼 1의 상부에 도입한다. 물/알콜 혼합물(바람직하게 2% 메탄올 및 98% 물)을 포함한 제 2 탈착제(D2)를 제 1 존에서 칼럼 5의 상부에 도입한다. 제 1 존에서, 낮은 극성 성분(A 및 A')은 칼럼 1 및 4의 하부로부터 추출물 흐름 E1' 및 E1로서 제거한다. PUFA 생성물(B) 및 높은 극성의 성분(C)는 칼럼 10의 하부로부터 라피네이트 흐름 R1로서 제거한다. 라피네이트 흐름 R1을 제 2 존에서 칼럼 17의 상부에서 도입한다. 물/ 알콜 혼합물(바람직하게 2% 메탄올 및 98% 물)을 포함한 제 2 탈착제(D2)는 제 2 존에서 칼럼 11의 상부로 도입한다. 제 2 존에서, 높은 극성 성분(C)은 칼럼 19의 하부에서 라피네이트 흐름 R2로서 제거한다. PUFA 생성물(B)은 칼럼 14의 하부에서 추출물 흐름 E2로서 수집한다.
바람직한 실시형태에서, 알콜은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 1의 상부로 도입한다.
이 바람직한 실시형태에서, 2% MeOH/98% 물 혼합물은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 5의 상부에 도입한다.
이 바람직한 실시형태에서, 2% MeOH/98% 물 혼합물은 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 11의 상부에 도입한다.
이 바람직한 실시형태에서, 공급 혼합물을 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 7의 상부에 도입한다.
가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 라피네이트 흐름은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 10의 하부로부터 수집하고 제 2 존에서 칼럼 17의 상부에 도입한다. 제 1 라피네이트 흐름은 칼럼 17로 도입하기 전에 선택적으로 컨테이너에서 수집할 수 있다.
이러한 바람직한 실시형태에서, 추출물 흐름은 일반적으로 제 1 존에서 칼럼 1 및 4의 하부로부터 제거한다. 칼럼 4의 하부로부터 수집된 추출물 흐름은 선택적으로 컨테이너에서 수집하고 제 1 존에서 칼럼 5의 상부로 재도입할 수 있다.
이러한 바람직한 실시형태에서, 제 2 라피네이트 흐름은 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 19의 하부로부터 제거한다.
이러한 바람직한 실시형태에서, 제 2 추출물 흐름은 일반적으로 제 2 존에서 칼럼 14의 하부로부터 수집된다. 이러한 제2 추출물 흐름은 일반적으로 정제된 PUFA 생성물을 함유한다. 제 2 추출물 흐름은 선택적으로 컨테이너에서 수집되고 제 2 존에서 칼럼 15의 상부로 재도입할 수 있다.
일반적으로, 가장 바람직한 실시형태에서, 제 1 존에서 물:알콜 비율은 제 2 존에서 물:알콜 비율보다 낮다.
본 발명의 방법은 종래의 크로마토그래피 방법에 의해서 가능한 것에 비해서 훨씬 높은 순도의 PUFA 생성물을 달성할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해서 제조된 PUFA 생성물은 특히 바람직한 불순물 프로파일을 갖고, 이는 공지의 방법에 의해서 제조된 오일에서 관찰된 것과 매우 다르다. 본 발명은 예를 들면 본 발명의 방법에 의해서 얻을 수 있는 PUFA 생성물을 포함한 조성물에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 PUFA 생성물을 포함한 조성물을 제공하고, PUFA 생성물은 EPA이고, PUFA 생성물은 93 wt%를 초과한 양으로 존재하고, ω-6 다중 불포화 지방산의 총함량은 0.40 wt% 이하이다.
본원에 사용된 바와 같이, 성분의 wt%는 조성물의 총중량에 대한 것이다.
PUFA 생성물 및 ω-6 PUFA는 선택적으로 이들의 알킬 에스테르, 일반적으로 에틸 에스테르의 형태이다. 바람직하게, EPA PUFA 생성물은 그 에틸 에스테르 형태이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, EPA PUFA 생성물이 94%를 초과한 양으로 존재하고, 바람직하게 95%를 초과한 양, 보다 바람직하게 96%를 초과한 양, 더욱 더 바람직하게 97%를 초과한 양, 및 가장 바람직하게 98%를 초과한 양으로 존재한다.
이 실시형태에서 ω-6 다중불포화 지방산의 총함량은 0.40 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 조성은 ω-6 다중 불포화 지방산의 양을 이 양까지 포함한다. 일반적으로 총함량의 ω-6 다중 불포화 지방산의 총함량은 0.35wt% 이하이고, 바람직하게 0.3wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25 wt% 이하, 가장 바람직하게 0.22wt% 이하이다. 일반적으로, ω-6 다중불포화 지방산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 아라키돈산의 함량은 0.25 wt% 이하, 바람직하게 0.24 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.23 wt% 이하, 및 가장 바람직하게 0.22 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성물은 아라키돈산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 아라키돈산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, ω-3 다중 불포화 지방산의 총함량은 97wt%를 초과하고, 바람직하게 97.5 wt%를 초과하며, 보다 바람직하게 97.9wt% 를 초과한다. 특정한 실시형태에서, ω-3 다중 불포화 지방산의 총함량은 99wt%를 초과한다.
일반적으로, 본 실시형태에서, DHA 의 총함량은 1 wt% 이하, 바람직하게 0.6 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.3 wt% 이하, 가장 바람직하게 0.2 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 DHA를 이들의 양 이하까지 포함한다. 일반적으로, DHA 의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서 DHA의 총함량은 0.2 wt% 이하, 바람직하게 0.175 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.16 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 DHA를 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, DHA의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, α-리놀렌산의 총함량은 1wt% 이하, 바람직하게 0.6 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.3 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성은 α-리놀렌산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, α-리놀렌산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서 α-리놀렌산의 총함량은 0.35wt% 이하, 바람직하게 0.3 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.29wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 α-리놀렌산의 양을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, α-리놀렌산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 스테아리돈산의 총함량은 1wt% 이하, 바람직하게 0.6 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.3 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 스테아리돈산의 양을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 스테아리돈산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서 스테아리돈산의 총함량은 0.4 wt% 이하, 바람직하게 0.35 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.34 wt% 이하이다. 따라서,일반적으로 상기 조성은 스테아리돈산의 양을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 스테아리돈산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 에이코사테트라엔산의 총함량은 1wt% 이하, 바람직하게 0.75wt% 이하, 보다 바람직하게 0.5 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 에이코사테트라엔산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 에이코사테트라엔산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 에이코사테트라엔산의 총함량은 0.5wt% 이하, 바람직하게 0.475 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.46 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 에이코사테트라엔산의 양을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 에이코tkxpxmfkdpstks산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 도코사펜타엔산의 총함량은 1wt% 이하, 바람직하게 0.6wt% 이하, 보다 바람직하게 0.3 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 도코사펜타엔산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 도코사펜타엔산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 도코사펜타엔산의 총함량은 0.4wt% 이하, 바람직하게 0.35 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.33 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 도코사펜타엔산의 양을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 도코사펜타엔산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 96.5 wt% 를 초과한 EPA, 1 wt% 이하의 DHA, 1 wt% 이하의 α-리놀렌산, 1 wt% 이하의 스테아리돈산, 1 wt% 이하의 에이코사테트라엔산, 1 wt% 이하의 도코사펜타엔산, 및 0.25 wt% 이하의 아라키돈산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 96.5 wt% 를 초과한 EPA, 0.2 wt% 이하의 DHA, 0.3 wt% 이하의 α-리놀렌산, 0.4 wt% 이하의 스테아리돈산, 0.5 wt% 이하의 에이코사테트라엔산, 0.35 wt% 이하의 도코사펜타엔산, 및 0.25 wt% 이하의 아라키돈산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 96.5 wt% 내지 99wt%의 EPA, 0.6 wt% 이하의 DHA, 0.6 wt% 이하의 α-리놀렌산, 0.15 wt% 내지 0.6wt%의 스테아리돈산, 0.1 wt% 내지 0.75wt%의 에이코사테트라엔산, 0.6 wt% 이하의 도코사펜타엔산, 및 0.6 wt% 이하의 아라키돈산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 96.5 wt% 내지 99wt%의 EPA, 0.2 wt% 이하의 DHA, 0.3 wt% 이하의 α-리놀렌산, 0.15 wt% 내지 0.4wt%의 스테아리돈산, 0.1 wt% 내지 0.5wt%의 에이코사테트라엔산, 0.35 wt% 이하의 도코사펜타엔산, 및 0.25 wt% 이하의 아라키돈산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 98 wt% 내지 99wt%의 EPA, 0.1 wt% 내지 0.3wt%의 DHA, 0.3 wt% 내지 0.35 wt%의 스테아리돈산, 0.1 wt% 내지 0.3wt%의 에이코사테트라엔산, 0.3 wt% 내지 0.35 wt%의 도코사펜타엔산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 96.5 wt% 내지 99wt%의 EPA, 0.1 wt% 내지 0.5wt%의 DHA, 0.1 wt% 내지 0.5wt%의 스테아리돈산, 0.1 wt% 내지 0.5wt%의 에이코사테트라엔산, 0.1 wt% 내지 0.5wt%의 도코사펜타엔산, 및 0.1 wt% 내지 0.3wt%의 아라키돈산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 98 wt% 내지 99wt%의 EPA, 0.1 wt% 내지 0.2wt%의 DHA, 0.3 wt% 내지 0.35wt%의 스테아리돈산, 0.1 wt% 내지 0.2wt%의 에이코사테트라엔산, 및 0.3 wt% 내지 0.35wt%의 도코사펜타엔산을 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 조성은 96.5 wt% 내지 97.5wt%의 EPA, 0.2 wt% 내지 0.35wt%의 α-리놀렌산, 0.18 wt% 내지 0.24wt%의 스테아리돈산, 0.4 wt% 내지 0.46wt%의 에이코사테트라엔산, 0.15 wt% 내지 0.25wt%의 아라키돈산을 포함한다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 이성체 불순물의 함량은 1.5 wt% 이하이다. 일반적으로, 이성체 불순물의 함량은 1 wt% 이하, 바람직하게 0.5 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25 wt% 이하, 더욱 바람직하게 0.25 wt% 이하, 및 가장 바람직하게 0.1 wt% 이하이다.
또한 실시형태에서, 본 발명은 PUFA 생성물을 포함한 조성물을 제공하고, PUFA 생성물은 EPA 및 DHA의 혼합물이고, (i) EPA 및 DHA의 총함량은 80 wt% 이상, (ii) EPA의 함량은 41 내지 60 wt%이고, DHA의 함량은 16 내지 48wt%이며, (iii)ω-3 다중불포화 지방산의 총함량은 94 wt% 이상 및/또는 ω-6 다중불포화 지방산의 총함량은 4wt% 이하이다.
PUFA 생성물, ω-3 및 ω-6 PUFA는 선택적으로 그 알킬 에스테르의 형태, 일반적으로 에틸 에스테르이다. 바람직하게, EPA/DHA PUFA 생성물은 에틸 에스테르의 형태이다.
따라서, 이러한 실시형태에서, 상기 조성물은 PUFA 생성물을 포함한 조성물이고, PUFA 생성물은 EPA 및 DHA의 혼합물이며, (i) EPA와 DHA의 총함량은 80 wt% 이상, (ii) EPA의 함량은 41 내지 60 wt%이고, DHA의 함량은 16 내지 48 wt%이고, (iii) ω-3 다중 불포화 지방산의 총함량은 94 wt% 이상이다.
또한, 이 실시형태에서 상기 조성물은 PUFA 생성물을 포함한 조성물이고, PUFA 생성물은 EPA 및 DHA의 혼합물이고, (i) EPA 및 DHA의 총함량은 80 wt% 이상, (ii) EPA의 함량은 41 내지 60 wt%이고, DHA의 함량은 16 내지 48wt%이며, (iii) ω-3 다중불포화 지방산의 총함량은 4 wt% 이하이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, EPA 및 DHA의 총함량은 82 wt% 이상, 바람직하게 83wt% 이상, 보다 바람직하게 84wt% 이상, 보다 바람직하게 85 wt% 이상, 가장 바람직하게 86wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, EPA의 함량은 41 wt% 내지 60 wt%, 바람직하게 45wt% 내지 60 wt%, 보다 바람직하게 47 wt% 내지 60 wt%, 보다 바람직하게 47 wt% 내지 57 wt%, 가장 바람직하게 50 wt% 내지 55 wt%이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, DHA의 함량은 16 wt% 내지 48 wt%, 바람직하게 20wt% 내지 45 wt%, 보다 바람직하게 25 wt% 내지 42 wt%, 보다 바람직하게 28 wt% 내지 38 wt%, 가장 바람직하게 30 wt% 내지 35 wt%이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, ω-3 다중 불포화 지방산의 총함량은 94wt% 이상, 바람직하게 95 wt% 이상, 보다 바람직하게 96wt% 이상, 가장 바람직하게 97 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, α-리놀렌산의 총함량은 0.4wt% 이하, 바람직하게 0.35 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.31wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성은 α-리놀렌산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, α-리놀렌산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상, 보다 바람직하게 0.2wt% 이상, 더욱 바람직하게 0.2 wt% 내지 0.4 wt%이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 스테아리돈산의 총함량은 1.9wt% 이하, 바람직하게 1.5 wt% 이하, 보다 바람직하게 1.25wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 스테아리돈산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 스테아리돈산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 에이코사테트라엔산의 총함량은 2.0wt% 이하, 바람직하게 1.9 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성은 에이코사테트라엔산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 에이코사테트라엔산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상, 보다 바람직하게 1.0 wt% 이상, 더욱 바람직하게 1.0 wt% 내지 1.9 wt%이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 에이코사펜타엔산의 총함량은 3.0wt% 이하, 바람직하게 2.75 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 에이코사펜타엔산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 에이코사펜타엔산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상, 보다 바람직하게 2.0 wt% 이상, 더욱 바람직하게 2 wt% 내지 2.75 wt%이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 도코사펜타엔산의 총함량은 6 wt% 이하, 바람직하게 5.5 wt% 이하, 보다 바람직하게 5.25 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 도코사펜타엔산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 도코사펜타엔산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상, 보다 바람직하게 4.0 wt% 이상, 더욱 바람직하게 4 wt% 내지 5.25 wt%이다.
이 실시형태에서 ω-6 다중 불포화 지방산의 총함량은 4 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 ω-6 다중 불포화 지방산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, ω-6 다중 불포화 지방산의 총함량은 3.75wt% 이하, 바람직하게 3.5 wt% 이하, 보다 바람직하게 3.25 wt% 이하, 더욱 바람직하게 3 wt% 이하, 가장 바람직하게 2.85 wt% 이하이다. 일반적으로, ω-6 다중 불포화 지방산의 총함량은 0.05 wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 리놀레산의 총함량은 0.5 wt% 이하, 바람직하게 0.4 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 리놀레산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 리놀레산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상, 보다 바람직하게 0.15 wt% 이상, 더욱 바람직하게 0.15 wt% 내지 0.25 wt%이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 감마-리놀렌산의 총함량은 0.19 wt% 이하, 바람직하게 0.15 wt% 이하이다, 보다 바람직하게 0.1 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 감마-리놀렌산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 감마-리놀렌산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 디호모-감마-리놀렌산의 총함량은 0.1 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 디호모-감마-리놀렌산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 디호모-감마-리놀렌산의 총함량은 0.05wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 아라키돈산의 총함량은 2.5 wt% 이하, 바람직하게 2.25 wt% 이하, 보다 바람직하게 2.1 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 아라키돈산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 아라키돈산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1 wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 아드렌산의 총함량은 0.1 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 아드렌산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 아드렌산의 총함량은 0.05wt% 이상이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 도코사펜타엔 (ω-6)산의 총함량은 0.9 wt% 이하, 바람직하게 0.75wt% 이하, 보다 바람직하게 0.65 wt% 이하이다. 따라서, 일반적으로 상기 조성물은 도코사펜타엔 (ω-6)산을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 도코사펜타엔 (ω-6)산의 총함량은 0.05wt% 이상, 바람직하게 0.1wt% 이상이다.
이 실시형태에서, 상기 조성물은 50 wt% 내지 55 wt% EPA, 30 내지 35 wt% DHA, 0.4 wt% 이하의 α-리놀렌산, 1.25 wt% 이하의 스테아리돈산, 1.9 wt% 이하의 에이코사테트라엔산, 2.75 wt% 이하의 에이코사펜타엔산, 5.25 wt% 이하의 도코사펜타엔산, 0.25 wt% 이하의 리놀레산, 0.1 wt% 이하의 감마-리놀렌산, 0.1 wt% 이하의 디호모-감마-리놀렌산, 2.1 wt% 이하의 아라키돈산, 0.1 wt% 이하의 아드렌산, 및 0.75 wt% 이하의 도코사펜타엔(ω-6)산을 포함하는 것이 바람직하다.
이 실시형태에서, 상기 조성물은 50 wt% 내지 55 wt% EPA, 30 내지 35 wt% DHA, 0.2 내지 0.4 wt%의 α-리놀렌산, 1.25 wt% 이하의 스테아리돈산, 1.0 내지 1.9 wt%의 에이코사테트라엔산, 2 내지 2.75 wt%의 에이코사펜타엔산, 4 내지 5.25 wt% 의 도코사펜엔산, 0.15 내지 0.25 wt% 이하의 리놀레산, 0.1 wt% 이하의 감마-리놀렌산, 0.1 wt% 이하의 디호모-감마-리놀렌산, 2.1 wt% 이하의 아라키돈산, 0.1 wt% 이하의 아드렌산, 및 0.75 wt% 이하의 도코사펜타엔(ω-6)산을 포함하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 이 실시형태에서 이성체의 함량은 1.5 wt% 이하이다. 일반적으로, 이성체 불순물의 함량은 1 wt % 이하, 바람직하게 0.5 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25 wt% 이하, 더욱 바람직하게 0.25 wt% 이하, 가장 바람직하게 0.1 wt% 이하이다.
본 발명자들은 놀랍게도 공지된 오일에 비해서 환경 오염을 감소시키면서 제조될 수 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같이 PUFA 생성물을 포함한 조성물을 제공하고,(a) 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.89 μg/kg 이하이고, (b) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총량은 0.35 pg/g 이하, (c) 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.0035 mg/kg 이하, 및/또는 (d) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신, 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐은 1 pg/g 이하이다.
일반적으로, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같이, PUFA 생성물을 포함한 조성물을 제공하고, (a) 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.89 μg/kg 이하이고, (b) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총량은 0.35 pg/g 이하, 및/또는 (d) 디옥신, 푸란, 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량은 1 pg/g 이하이다.
상기 조성물에서 이 실시형태에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.89 μg/kg이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성물은 다환방향족 탄화수소를 상기 양까지 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.85μg/kg 이하, 바람직하게 0.8μg/kg 이하, 보다 바람직하게 0.7 μg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.6 μg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.5 μg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.4 μg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.3μg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.2μg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.1 μg/kg 이하, 가장 바람직하게 0.05 μg/kg 이하이다.
일반적인 다환방향족 탄화수소는 당업자에게 공지되어 있고, 아세나프텐, 아세나프틸렌, 안트라센, 벤즈[a] 안트라센, 벤조[a] 피렌, 벤조[e] 피렌, 벤조[b] 플루오란텐, 벤조[ghi]페릴렌, 벤조[j]플루오란텐, 벤조[k]플루오란텐, 크리센, 디벤즈(ah)안트라센, 플루오란텐, 플루오린, 인데노(1,2,3-cd)피렌, 페난트렌, 피렌, 코로넨, 코라눌렌, 테트라센, 나프탈렌, 펜타센, 트리페닐렌, 및 오발렌을 들 수 있다. 일반적으로, 상기 기재된 양은 벤조[a] 피렌의 함량을 의미한다.
이 실시형태에서 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총함량은 0.35 pg/g 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성은 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란을 이들 양까지 포함한다. 일반적으로, 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총량은 0.325 pg/g 이하, 바람직하게 0.3 pg/g 이하, 보다 바람직하게 0.275 pg/g 이하, 더욱 바람직하게 0.25 pg/g 이하, 더욱 바람직하게 0.225pg/g 이하, 더욱 바람직하게 0.2 pg/g 이하, 가장 바람직하게 0.185 pg/g 이하이다. 이들 양은 WHO-독소 당량 요소(TEF)를 사용한 세계 보건 기구(WHO) 독소 당량 내에서 표시된다. WHO-독소 당량 요소는 당업자에게 공지된다.
디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신(PCDD) 및 폴리클로린화 디벤조푸란(PCDF)는 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 이것은 공동체 규칙(EC) No. 1881/2006 및 1883/2006 에 정의되고, 본원에 참조로 포함되어 있다.
공동체 규칙(EC) No. 1881/2006 및 1883/2006 에서 정의된 PCDD, PCDF 및 디옥신류 PCB은 그 TEF값과 함께 다음에 기재된다.
Figure 112012061050010-pct00001
일반적으로, PCDD, PCDF 및 디옥신류 PCB의 품질은 공동체 규체(EC) No. 1881/2006 및 1883/2006에서 셋팅된 방법에 따라서 결정된다.
이 실시형태에서 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.0035 mg/kg 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성물은 폴리클로린화 비페닐을 이 양까지 포함한다. 일반적으로, 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.003 mg/kg 이하, 바람직하게 0.0025 mg/kg 이하, 보다 바람직하게 0.002 mg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.0015 mg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.001 mg/kg 이하, 더욱 바람직하게 0.00075 mg/kg 이하, 가장 바람직하게 0.0007 mg kg 이하이다.
폴리클로로비페닐(PCB)는 당업자에게 공지되어 있고, 비페닐, 모노클로로비페닐, 디클로로비페닐, 트리클로로비페닐, 테트라클로로비페닐, 펜타클로로비페닐, 헥사클로로비페닐, 헵타클로로비페닐, 옥타클로로비페닐, 노나클로로비페닐, 및 데카클로로비페닐을 들 수 있다.
또 다른 실시형태에서 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신, 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량을 1 pg/g 이하이다. 따라서, 일반적으로, 상기 조성물은 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신, 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐을 상기 양까지 포함한다. 일반적으로, 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신, 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.75 pg/g 이하, 바람직하게 0.5 pg/g 이하, 보다 바람직하게 0.45 pg/g 이하, 더욱 바람직하게 0.4 pg/g 이하, 더욱 바람직하게 0.35 pg/g 이하, 및 가장 바람직하게 0.3 pg/g 이하이다.
디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신(PCDD), 폴리클로린화 디벤조푸란(PCDF) 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐은 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 이것은 공동체 규칙 (EC) No. 1881/2006 및 1883/2006 에서 정의되고, 그 전체는 참조로 포함되어 있다.
공동체 규체(EC) No. 1881/2006 및 1883/2006에 정의된 PCDD, PCDF 및 디옥신류 PCB는 TEF 와 함께 상기에 기재되어 있다.
이 실시형태에서, 바람직하게 (a) 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.05 μg/kg 이하, (b) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총함량은 0.2 pg/g 이하이고, (c) 폴리클로린화 베페닐의 총량은 0.0015 mg/kg 이하, 및/또는 (d) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.3 pg/g 이하이다.
이 실시형태에서, 바람직하게 (a) 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.05 μg/kg 이하, (b) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총함량은 0.2 pg/g 이하이고, 및/또는 (d)디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.3 pg/g 이하이다.
이 실시형태에서, 보다 바람직하게 (a) 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.05 μg/kg 이하, (b) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총량은 0.2 pg/g 이하이고, 및/또는 (c) 폴리클로린화 베페닐의 총량은 0.0015 mg/kg 이하, 및 (d)디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.3 pg/g 이하이다.
이 실시형태에서, 보다 바람직하게 (a) 상기 조성물에서 다환방향족 탄화수소의 총량은 0.05 μg/kg 이하, (b) 디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란의 총량은 0.2 pg/g 이하이고, 및 (d)디옥신, 푸란, 디벤제노-파라-디옥신 및 폴리클로린화 디벤조푸란 및 디옥신류 폴리클로린화 비페닐의 총량은 0.3 pg/g 이하이다.
일반적으로, 이 실시형태에서, 이성체 불순물의 함량은 1.5 wt% 이하이다. 일반적으로, 이성체 불순물의 함량은 1 wt% 이하, 바람직하게 0.5 wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25 wt% 이하, 더욱 바람직하게 0.25 wt% 이하, 및 가장 바람직하게 0.1 wt% 이하이다.
본 발명자들은 증류된 오일에 수반된 이성질화, 과산화 및 올리고머화의 문제를 피한 고순도 오일을 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다. 본 발명의 PUFA 생성물에서 존재한 이성체 불순물의 양은 공급 혼합물에서 존재한 이성체 불순물의 양에 의존할 것이다. 중요한 것으로, 이성체 불순물의 양은 증류에 관계없이 본 발명의 방법에 의해서 증가하지 않는다. 따라서, PUFA 생성물에서 이성체의 함량의 제한은 출발물질의 이성체 함량이다. 출발물질에 이성체가 존재하지 않는다면, 얻어진 PUFA 생성물도 실질적으로 이성체가 존재하지 않을 것이다. 이러한 이점은 증류에서 관찰되지 않는다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 크로마토그래피 분리 방법은 공급 혼합물에서 존재한 이성체 불순물의 양에 대해서 PUFA 생성물 내에서 이성체 불순물의 양을 실질적으로 증가시키지 않는다. "실질적으로 증가"는 일반적으로 10 wt% 이하, 바람직하게 5wt% 이하, 보다 바람직하게 3wt% 이하, 더욱 바람직하게 1 wt% 이하, 더욱 바람직하게 0.5wt% 이하, 가장 바람직하게 0.1 wt% 이하 정도의 증가를 의미하는 것으로 이해된다.
따라서, 더욱 실시형태에서, 본 발명은 PUFA 생성물을 포함한 조성물을 제공하고, 이성체 불순물의 함량은 1.5 wt% 이하이다. 일반적으로, 상기 조성물은 이성체 불순물을 상기 양까지 포함한다. 일반적으로, 이성체 불순물의 함량은 1wt% 이하, 바람직하게 0.5wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25wt% 이하, 가장 바람직하게 0.1wt% 이하이다. 이성질화는 특히 분리에 필요한 높은 온도에 기인한 증류에 의해서 고순도 DHA의 제조에서 특히 문제를 일으킨다. 일반적으로, PUFA 생성물은 DHA, 선택적으로 에틸 에스테르 형태이다. 일반적으로 상기 조성물은 85 wt%를 초과한 PUFA 생성물, 바람직하게 90wt%를 초과, 보다 바람직하게 92.5wt%를 초과, 가장 바람직하게 95wt%를 초과한다. 바람직하게, 상기 조성물은 85wt%를 초과한 DHA, 선택적으로 에틸 에스테르의 형태이고, 바람직하게 90wt% 초과, 보다 바람직하게 92.5wt% 초과, 가장 바람직하게 95wt% 초과한 양이다. 이 실시형태에서, 상기 조성물은 일반적으로, PUFA 생성물로서 DHA, 선택적으로 그 에틸 에스테르 형태의, 95wt% 초과한 양을 포함하고, 이성체 불순물의 함량은 1 wt% 이하, 바람직하게 0.5wt% 이하, 보다 바람직하게 0.25wt% 이하, 및 0.1 wt% 이하이다.
개선된 본 발명의 방법은 높은 및 낮은 극성의 불순물을 하나의 방법에서 제거할 수 있기 때문에 매우 고순도 PUFA 생성물을 효율적으로 달성할 수 있다.
본 발명의 PUFA 생성물은 80wt%를 초과한 순도, 바람직하게 85 wt% 초과, 보다 바람직하게 90wt% 초과, 더욱 바람직하게 95wt% 초과, 더욱 바람직하게 97wt% 초과, 가장 바람직하게 99wt% 초과한 순도를 갖는다. PUFA 생성물이 하나의 PUFA 또는 그 유도체인 경우, 상기 농도는 PUFA 또는 유도체의 농도를 의미한다. PUFA 생성물이 2개 이상의 PUFA 또는 그 유도체의 혼합물, 예를 들면 2개의 혼합물인 경우, 상기 농도는 PUFA, 또는 그 유도체의 결합된 농도를 의미한다.
본 발명의 방법은 증류된 오일에 수반된 이성체화, 과산화, 및 올리고머화의 문제를 피한다. 본 발명의 PUFA 생성물은 5 wt% 미만의 이성체 불순물, 바람직하게 3wt% 미만, 보다 바람직하게 1wt% 미만의 함량을 갖는다. 상기 기재된 바와 같이, 이성체 불순물은 PUFA 이성체, 과산화 및 올리고머화 생성물을 포함한다. PUFA 이성체는 위치 및/또는 기하 이성질체를 포함한다. EPA의 위치 및/또는 기하 이성체로는 17E-EPA, 5E-EPA, 5E,8E-EPA, 8E,11E-EPA, 5E,14E-EPA, 및 5E,8E,11E, 17E-EPA를 들 수 있다. 이러한 이성체는 Wijesundera, R.C., et al, Journal of the American Oil Chemists Society, 1989, vol. 66, no. 12, 1822-1830에 상세하게 기재되어 있고, 그 전체 내용은 참조로 본원에 포함되어 있다.
실제로, 본 발명의 방법은 일반적으로 컴퓨터에 의해서 제어될 것이다. 본 발명은 본원에 기재된 크로마토그래피 장치를 조절하기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하고, 상기 컴퓨터 프로그램은 실행할 때 장치에 대해서 본 발명의 공정의 실시를 지시하는 코드 수단을 포함한다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.
실시예
실시예 1
피시 오일-유도 공급 원료(55wt% EPA EE, 5 wt% DHA EE)는, 도 8에 개략적으로 도시된 시스템에 따라서 용리액으로서 수성 메탄올 및 정지상으로서 결합된 C18 실리카겔(입자 크기 300㎛)을 사용한, 실제의 이동상 크로마토그래피 시스템을 사용해서 분리한다. 15개의 칼럼(직경:76.29mm, 길이: 914.40mm)은 도 8에서 도시된 바와 같이 연속적으로 연결한다.
조작 변수 및 유속은 8개의 다른 경우에 대해서 다음과 같다. 하기 조건에 대해서, EPA EE는 고순도(GC FAMES에 의해서 85 내지 98%)로 생성된다. 존 1 추출물 및 라피네이트의 GC FAME 추적, 및 존 2 추출물 및 라피네이트의 GC FAME 추적은 도 11 및 도 12에 각각 도시된다.
실시예 1a
단계 시간: 750 초
사이클 시간: 200 mins
공급 원료(F) 유속: 70 ml/min
탈착제 (D) 유속: 850 ml/min
추출물 속도: 425 ml/min
라피네이트 속도: 495 ml/min
실시예 1b
단계 시간: 250 초
사이클 시간: 66.67 mins
공급 원료(F) 유속: 210 ml/min
탈착제 (D) 유속: 2550ml/min
추출물 속도: 1275 ml/min
라피네이트 속도: 1485 ml/min
실시예 1c
단계 시간: 500 초
사이클 시간: 133.33 mins
공급 원료(F) 유속: 25 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1) : 2050 ml/min
제 1 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도 (E1): 1125 ml/min
제 1 존에서 추출물 재순환 속도 (D1-E1) : 925 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1) : 950 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2) : 1700 ml/min
제 2 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도 (E2) : 900 ml/min
제 2 존에서 추출물 재순환 속도 (D2-E2) : 800 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 800 ml/min
실시예 1d
단계 시간: 250 초
사이클 시간: 66.67 mins
공급 원료(F) 유속: 50 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1) : 4125 ml/min
제 1 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도(E1): 2250 ml/min
제 1 존에서 추출물 재순환 속도(D1-E1): 1875 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1) : 1925 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2) : 3375 ml/min
제 2 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도(E2): 1800 ml/min
제 2 존에서 추출물 재순환 속도 (D2-E2) : 1575 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 1575 ml/min
실시예 1e
단계 시간: 500 초
사이클 시간: 133.33 mins
공급 원료(F) 유속: 50 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1) : 4000 ml/min
제 1 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도(E1): 2250 ml/min
제 1 존에서 추출물 재순환 속도(D1-E1): 1750 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1) : 1800 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2): 3200 ml/min
제 2 존에서 순 추출물 축적 속도 (E2) : 1750 ml/min
제 2 존에서 추출물 재순환 속도 (D2-E2) : 1450 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 1450 ml/min
실시예 1 f
단계 시간: 250 초
사이클 시간: 66.67 mins
공급 원료(F) 유속: 100 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1) : 4050 ml/min
제 1 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도(E1): 2100 ml/min
제 1 존에서 추출물 재순환 속도(D1-E1): 1950 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1): 2050 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2) : 3300 ml/min
제 2 존에서 순 추출물 축적 속도 (E2) : 1700 ml/min
제 2 존에서 추출물 재순환 속도 (D2-E2) : 1600 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 1600 ml/min
실시예 1g
단계 시간: 500 초
사이클 시간: 133.33 mins
공급 원료(F) 유속: 25 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1) : 1275 ml/min
제 1 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도(E1): 750 ml/min
제 1 존에서 추출물 재순환 속도(D1-E1): 550 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1): 575 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2) : 1275 ml/min
제 2 존에서 순 추출물 축적 속도 (E2) : 950 ml/min
제 2 존에서 추출물 재순환 속도 (D2-E2) : 325 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 325 ml/min
실시예 1h
단계 시간: 250 초
사이클 시간: 66.67 mins
공급 원료(F) 유속: 50 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1) : 2550 ml/min
제 1 존에서 추출물 컨테이너 축적 속도(E1): 1500 ml/min
제 1 존에서 추출물 재순환 속도(D1-E1): 950 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1): 1000 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2) : 2000 ml/min
제 2 존에서 순 추출물 축적 속도 (E2) : 900 ml/min
제 2 존에서 추출물 재순환 속도 (D2-E2) : 600 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 600 ml/min
실시예 2
에이코사테트라엔산 에틸 에스테르(ETA EE), EPA EE, 그 이성질체 및 DHA EE를 포함한 피시 오일-유도 공급 원료는 도 10에 개략적으로 도시된 시스템에 따라서 용리액으로서 수성 메탄올 및 정지상으로서 결합된 C18 실리카겔(입자 크기 40-60㎛)을 사용한, 실제의 이동상 크로마토그래피 시스템을 사용해서 분리한다. 19개의 칼럼(직경:10mm, 길이: 250mm)은 도 10에서 도시된 바와 같이 연속적으로 연결한다.
조작 변수 및 유속은 다음과 같다.
사이클 시간: 600 초
공급 원료 (F) 유속: 0.5 ml/min
제 1 존으로 탈착제 (D1, 100% 메탄올) 유속 : 6 ml/min
제 1 존으로 탈착제 (D2, 99% 메탄올/1% 물)의 유속: 6 ml min
제 1 존으로부터 추출물(E1') 속도 : 3 ml/min
제 1 존으로부터 추출물(E1) 속도 : 1.9 ml/min
제 1 존으로부터 라피네이트(R1) 속도: 4.6 ml/min
제 2 존으로 탈착제 (D2, 97% 메탄올/3% 물) 유속: 6 ml/min
제 2 존으로부터 추출물 (E2) 속도: 2.4 ml/min
제 2 존으로부터 라피네이트 (R2) 속도: 4.6 ml/min
다시, EPA EE를 고순도(90 wt% 초과, 95 wt% 초과, 98 wt% 초과)로 생성했다.
실시예 3
피시 오일-유도 공급 원료(55wt% EPA EE, 5 wt% DHA EE)는 도 8에 개략적으로 도시된 시스템에 따라서 용리액으로서 수성 메탄올 및 정지상으로서 결합된 C18 실리카겔(입자 크기 300㎛, 입자 기공도 150옹스트롱)을 사용한, 실제의 이동상 크로마토그래피 시스템을 사용해서 분리한다. 15개의 칼럼(직경:10mm, 길이: 250mm)은 도 8에서 도시된 바와 같이 연속적으로 연결한다.
조작 변수 및 유속은 다음과 같다.
사이클 시간: 380 초
공급 원료 (F) 유속: 0.5 ml/min
제 1 존으로 탈착제 (D, 98.5% 메탄올/1.5% 물) 유속: 9 ml/min
제 1 존으로 물이 풍부한 상 (W, 85% 메탄올/ 15% 물)의 유속: 3.1 ml/min
제 1 존으로부터 추출물 (E1) 속도: 4 ml/min
제 1 존으로부터 라피네이트 (R1) 속도: 8.6 ml/min
제 2 존으로 탈착제 (D, 97% 메탄올/3% 물) 유속 : 10.8 ml/min
제 2 존으로 물이 풍부한 상 (W, 85% 메탄올/15% 물) 유속 : 3.1 ml/min
제 2 존으로부터 추출물 (E2) 속도 : 4.1 ml/min
제 2 존으로부터 라피네이트 (R2) 속도: 10.3 ml/min
EPA EE를 고순도(95% 초과한 순도)로 생성했다. 상기 생성물의 GC 추적은 도 13에 도시한다.
실시예 4
피시 오일-유도 공급 원료(70wt% DHA EE, 7 wt% EPA EE)는, 도 8에 개략적으로 도시된 시스템에 따라서 용리액으로서 수성 메탄올 및 정지상으로서 결합된 C18 실리카겔(입자 크기 300㎛)을 사용한, 실제의 이동상 크로마토그래피 시스템을 사용해서 분리한다. 15개의 칼럼(직경:76.29mm, 길이: 914.40mm)은 도 8에서 도시된 바와 같이 연속적으로 연결한다.
조작 변수 및 유속은 다음과 같다.
단계 시간: 600 초
사이클 시간: 160 mins
공급 원료 (F) 유속: 25 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1): 2062.5 ml/min
제 1 존에서 추출물 속도 (E1) : 900 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1): 1187.5 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2) : 1500 ml/min
제 2 존에서 추출물 속도 (E2): 450 ml/min
제 2 존에서 라피네이트 속도 (R2) : 1050 ml/min
DHA EE를 고순도(GC FAMES에 의해서 97% 초과)로 생성했다. 존 2 추출물의 GC FAMES 추적은 도 14로 도시한다.
실시예 5
피시 오일-유도 공급 원료(33 wt% EPA EE, 22 wt% DHA EE)는 도 8에 개략적으로 도시된 시스템에 따라서 용리액으로서 수성 메탄올 및 정지상으로서 결합된 C18 실리카겔(입자 크기 300㎛)을 사용한, 실제의 이동상 크로마토그래피 시스템을 사용해서 분리한다. 15개의 칼럼(직경:76.29mm, 길이: 914.40mm)은 도 8에서 도시된 바와 같이 연속적으로 연결한다.
조작 변수 및 유속은 다음과 같다.
단계 시간: 380 초
사이클 시간: 101.33 mins
공급 원료 (F) 유속: 40 ml/min
제 1 존에서 탈착제 유속 (D1): 1950 ml/min
제 1 존에서 추출물 속도 (E1): 825 ml/min
제 1 존에서 라피네이트 속도 (R1): 1165 ml/min
제 2 존에서 탈착제 유속 (D2): 1425 ml/min
제 2 존에서 추출물 속도 (E2) : 787.5 ml/min
제2 존에서 라피네이트 속도 (R2 in second zone): 637.5 ml/min
EPA EE 및 DHA EE의 혼합물을 고순도(80% 초과한 총 EPA EE and DHA EE ) 로 생성했다.
실시예 6
본 발명에 따른 2개의 PUFA 생성물에서 존재한 환경오염물의 양과 증류에 의해서 제조된 유사한 오일을 비교하기 위한 실험을 실시했다. 오일의 오염 프로파일은 하기 표 2에 표시한다.
Figure 112012061050010-pct00002
Figure 112012061050010-pct00003
실시예 7
증류에 의해서 제조된 상당한 오일에 비해서 본 발명에 따라서 제조된 오일에서 존재하는 이량체 불순물의 양을 결정하기 위한 실험을 실시했다.
본 발명에 따라서 제조된 DHA-풍부 오일의 GC 추적은 도 14에서 도시된다. GC 추적에서 이성체 불순물이 존재하지 않는다.
증류에 의해서 제조된 오일의 GC 추적은 도 15에서 도시된다. DHA 피크보다 긴 용리액 시간을 갖는 4개의 피크는 DHA 이성체에 상응한다. GC 추적으로부터, 증류에 의해서 제조된 오일은 약 1.5 wt%의 이성체 불순물을 함유하는 것을 알 수 있다.
실시예 8
본 발명의 방법의 2개의 EPA-풍부 생성물은 증류에 의해서 제조된 EPA-풍부 오일과 비교했다. 그 성분 PUFA의 wt% 분석은 하기에 표시된다.
Figure 112012061050010-pct00004
실시예 9
본 발명의 방법의 EPA/DHA-풍부 생성물을 증류에 의해서 제조된 EPA/DHA_풍부 오일과 비교했다. 상기 성분 PUFA의 wt% 분석은 하기에 표시된다.
Figure 112012061050010-pct00005

Claims (34)

  1. 공급 혼합물로부터 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법으로서,
    상기 공급 혼합물을, 수성 알콜을 용리액으로서 함유한 다수개의 결합된 크로마토그래피 칼럼을 갖는 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치에 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 장치는 적어도 제 1 존 및 제 2 존을 포함하는 다수의 존을 갖고, 각각의 존은 추출물 흐름 및 라피네이트 흐름을 가지며, 여기서 추출물 흐름 및 라피네이트 흐름의 액체는 상기 다수의 결합된 크로마토그래피 칼럼으로부터 수집될 수 있고,
    (a) PUFA 생성물보다 극성이 높은 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유하는 라피네이트 흐름은 제 1 존의 하나의 칼럼으로부터 수집되어, 상기 라피네이트 흐름이 수집되는 제 1 존의 칼럼과 인접하지 않는 제 2 존의 하나의 칼럼으로 도입되거나;
    (b) PUFA 생성물보다 극성이 낮은 성분과 함께 PUFA 생성물을 함유하는 추출물 흐름은 제 2 존의 하나의 칼럼으로부터 수집되어, 상기 추출물 흐름이 수집되는 제 2 존의 칼럼과 인접하지 않는 제 1 존의 하나의 칼럼으로 도입되거나; 또는
    상기 (a) 및 (b)의 조합이며;
    상기 PUFA 생성물은 각각의 존에서 공급 혼합물의 다른 성분으로부터 분리되는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    제 1 존으로부터의 추출물 흐름, 제 1 존으로부터의 라피네이트 흐름, 제 2 존으로부터의 추출물 흐름, 및 제 2 존으로부터의 라피네이트 흐름 중 하나 또는 다수의 일부가 각자 동일한 존으로 재순환되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    (a) 각각의 존에 존재하는 수성 알콜 용리액은 다른 물:알콜 비율을 가지거나;
    (b) 각각의 존에서 추출물 흐름을 통해 수집된 액체 및 라피네이트 흐름을 통해 수집된 액체가 각자 동일한 존으로 재순환되는 속도는, 상기 PUFA 생성물이 각 존의 공급 혼합물의 다른 성분으로부터 분리될 수 있도록 조절되거나; 또는
    상기 (a) 및 (b)의 조합;인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    (a) 제 1 존으로부터의 추출물 흐름을 통해 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환되는 속도는 제 2 존으로부터의 추출물 흐름을 통해 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환되는 속도와 다르거나;
    (b) 제 1 존으로부터의 라피네이트 흐름을 통해 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환되는 속도는 제 2 존으로부터의 라피네이트 흐름을 통해 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환되는 속도와 다르거나; 또는
    상기 (a) 및 (b)의 조합;인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 장치는 제 1 존 및 제 2 존을 갖고,
    상기 PUFA 생성물은 제 1 존에서 PUFA 생성물보다 극성이 낮은 공급 혼합물의 성분으로부터 분리되며,
    상기 PUFA 생성물은 제 2 존에서 PUFA 생성물보다 극성이 높은 공급 혼합물의 성분으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 PUFA 생성물은 하나 이상의 ω-3 PUFA를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 PUFA 생성물은 EPA, DHA, 또는 상기 EPA 및 DHA의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 PUFA 생성물 이외에, 추가의 부수적인 PUFA 생성물이 크로마토그래피 분리 방법에서 회수되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 PUFA 생성물은 EPA이고, 상기 추가의 부수적인 PUFA 생성물은 DHA인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 크로마토그래피 칼럼은 흡착제로서 구상 비즈를 함유하는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 비즈는 C18 결합된 실리카겔로부터 형성된 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서,
    상기 구상 비즈는 250 내지 500㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 용리액은 물 및 C1-C6 알콜의 혼합물인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 C1-C6 알콜은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    제 1 존의 용리액은 제 2 존의 용리액보다 많은 알콜을 함유하고, 상기 제 2 존은 상기 크로마토그래피 장치의 용리액 흐름에 대해서 제 1 존의 하류에 있는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  16. 청구항 1에 있어서,
    제 1 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 0.5:99.5 내지 1.5:98.5 체적부이고, 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비율이 4.5:95.5 내지 5.5:94.5 체적부인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  17. 청구항 1에 있어서,
    제 1 존 및 제 2 존에서 용리액의 물:알콜 비율은 물, 알콜, 또는 상기 물 및 알콜의 조합을 제 1 존 및 제 2 존의 하나 이상의 칼럼에 도입함으로써 조절되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  18. 청구항 2에 있어서,
    제 1 존으로부터의 추출물 흐름을 통해 수집된 액체가 제 1 존으로 재순환되는 속도는 제 2 존으로부터의 추출물 흐름을 통해 수집된 액체가 제 2 존으로 재순환되는 속도보다 빠른 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  19. 청구항 5에 있어서,
    (i) 공급 혼합물을 제 1 존에 도입하고, PUFA 생성물이 풍부한 제 1 라피네이트 흐름 및 PUFA 생성물이 적은 제 1 추출물 흐름을 제거하는 단계; 및
    (ii) 제 1 라피네이트 흐름을 제 2 존에 도입하고, PUFA 생성물이 적은 제 2 라피네이트 흐름을 제거하고, 제 2 추출물 흐름을 수집하여 PUFA 생성물을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  20. 청구항 5에 있어서,
    (i) 공급 혼합물을 제 2 존에 도입하고, PUFA 생성물이 적은 제 1 라피네이트 흐름 및 PUFA 생성물이 많은 제 1 추출물 흐름을 제거하는 단계; 및
    (ii) 제 1 추출물 흐름을 제 1 존에 도입하고, PUFA 생성물이 적은 제 2 추출물 흐름을 제거하고, 제 2 라피네이트 흐름을 수집하여 PUFA 생성물을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  21. 청구항 1에 있어서,
    상기 시뮬레이트된 또는 실제의 이동상 크로마토그래피 장치는 15개의 크로마토그래피 칼럼 1 내지 15를 갖는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  22. 청구항 5에 있어서,
    상기 제 1 존이 8개의 인접한 칼럼 1 내지 8로 구성된 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  23. 청구항 5에 있어서,
    상기 제 2 존은 7개의 인접한 칼럼 9 내지 15로 구성된 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  24. 청구항 21에 있어서,
    (a) 알콜이 칼럼 1에 도입되거나; (b) 알콜이 칼럼 9에 도입되거나; (c) 물이 칼럼 4에 도입되거나; (d) 물이 칼럼 12에 도입되거나; 또는 (a), (b), (c), 및 (d)의 임의의 조합;인 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  25. 청구항 21에 있어서,
    수성 알콜이 칼럼 1, 칼럼 9, 또는 칼럼 1 및 칼럼 9의 조합에 도입되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  26. 청구항 21에 있어서,
    제 1 라피네이트 흐름은 칼럼 7로부터 수집되고, 칼럼 13으로 도입되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
  27. 청구항 1에 있어서,
    상기 장치가 제 1 존, 제 2 존, 및 제 3 존을 갖고,
    (a) 제 1 존의 용리액은 제 2 존 및 제 3 존의 용리액보다 많은 알콜을 함유하고, 제 1 존은 상기 크로마토그래피 장치의 용리액 흐름에 대해서 제 2 존 및 제 3 존의 상류이며;
    (b) 제 2 존의 용리액은 제 3 존의 용리액보다 많은 알콜을 함유하고, 제 2 존은 상기 크로마토그래피 장치의 용리액 흐름에 대해서 제 3 존의 상류이며;
    상기 PUFA 생성물은 제 1 존에서 그 PUFA 생성물보다 극성이 낮은 공급 혼합물의 성분으로부터 분리되고,
    상기 PUFA 생성물은 제 2 존에서 그 PUFA 생성물보다 극성이 낮지만 제 1 존에서 분리된 성분보다 극성이 높은 공급 혼합물의 성분으로부터 분리되며,
    상기 PUFA 생성물은 제 3 존에서 그 PUFA 생성물보다 극성이 높은 공급 혼합물의 성분으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 다중불포화 지방산(PUFA) 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 방법.
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