CN109589644B - 一种缩小模型的层析柱及其制备方法 - Google Patents

一种缩小模型的层析柱及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种缩小模型的层析柱及其制备方法。所述缩小模型的层析柱，包括层析柱体和填充于层析柱体内的层析填料，装柱液为乙醇的水溶液。采用乙醇的水溶液为装柱液，将层析填料装填于层析柱体。本发明采用乙醇的水溶液作为装柱液，能够有效缓解柱壁效应，经柱效测试合格，可得到适用于抗体纯化缩小模型的层析柱。本发明的层析柱的制备方法，操作简单，易于填装，无需缓冲液置换等繁琐步骤。

Description

一种缩小模型的层析柱及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种缩小模型的层析柱及其制备方法。
背景技术
抗体生产工艺验证的目标是，证明其在已确定限度内操作时，能够生产出质量适当并持续稳定的抗体产品。由于抗体和其生产工艺的复杂性，只通过成品检验不能充分保证生产的持续稳定性。所以，必须对抗体生产工艺进行设计和验证，证明某工艺具有有效性和可重复性，并且其生产出的成品符合已确立的放行标准的要求。
在工艺验证中，建立一个使用实验室规模的模型来模拟商业化生产规模的缩小模型是非常有价值的。首先，在商业化规模下进行工艺验证研究是非常困难并且昂贵的，所以可以利用缩小模型进行工艺表征研究，开展重复使用的层析填料的寿命研究和执行探索性清洁验证研究。同时，小规模研究可以防止商业化生产系统受到清除研究中所用危险物质(杂质和病毒等)的污染。缩小规模实验可以被设计用于单个单元操作或用于整个工艺链，用以评价工艺步骤的稳健性。在缩小规模模型的建立中，从商业化规模到缩小规模模型的倍数非常关键，因为缩小模型太大则无法提供足够的物料，而缩小模型太小则无法反映实际的工艺性能。所以必须建立合适的缩小规模模型以满足工艺验证的使用需求。
在层析工艺缩小规模模型的建立中，缩小模型的层析介质应与商业化生产规模的层析介质相同，此外，所有重要的工艺参数应当保持不变，缩小模型的纯化水平应当尽可能代表商业化规模的工艺水平。对于层析设备、柱床高度、线性流速、保留时间、缓冲液、操作温度和上样的样品，都应当证明其能够代表商业化规模。为了保证有效性，规模缩小色谱柱中得到的产品回收率和纯度，应与实际生产色谱柱中获得的产品回收率和纯度一致。用于验证的指定的分离色谱柱的规模缩小程度，依赖于实际生产规模和能够可靠重复生产的最小规模。
对于层析工艺缩小模型，所采用缩小模型层析柱十分关键，一般有两种选择。一是采用预装柱，主要产品为Repligen公司的OPUS ValiChrom Column，一般可选择5、8和11.3mm直径的预装柱。预装柱使用方便，但是价格昂贵。另一种是采用空柱自己填装，主要产品为Millipore公司的Vantage系列层析柱(最小直径为11mm)，GE公司的Tricorn系列层析柱(最小直径为5mm)和XK或Hiscale系列层析柱(最小直径为16mm)。以上常用的实验室规模空层析柱，价格也很贵，且规格选择的余地不大，很难满足各层析工艺缩小模型的需要。传统的10mm及以下的层析柱的柱壁效应非常严重，普通的装柱液(纯化水或盐溶液)容易造成填料挂壁现象、导致装柱失败。同时，由于柱壁效应，正常的层析工艺流速很难将整根柱子压实，会导致柱头压的过紧而柱尾压的过松，导致装柱失败。
以上的这些不足限制了层析工艺缩小模型的建立及其在在特定的工艺验证中的应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种缩小模型的层析柱，以解决现有技术中存在的柱壁效应严重、成本高的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种缩小模型的层析柱的制备方法，易于填装，无需缓冲液置换等繁琐步骤。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种缩小模型的层析柱，包括层析柱体和填充于层析柱体内的层析填料，装柱液为乙醇的水溶液。
本发明采用乙醇的水溶液作为装柱液，能够有效缓解柱壁效应，经柱效测试合格，可得到适用于抗体纯化缩小模型的层析柱。
优选的，装柱液为质量分数为10-30％的乙醇的水溶液。更优选的，装柱液为质量分数为15-25％的乙醇的水溶液。
优选的，层析柱的理论塔板高度≤0.05cm。
优选的，层析柱的对称性为0.8-1.8。
优选的，层析柱体的直径为5-10mm。更优选的，层析柱体的直径为5mm、6.6mm或10mm。
优选的，层析柱体的长度为100-330mm。更优选的，层析柱体的长度为100mm、150mm、250mm和330mm。
优选的，层析填料包括蛋白A亲和填料、阳离子交换填料、阴离子交换填料和疏水作用填料中的任一种。
如在不同实施方式中，层析填料可以选自MabSelect Sure、MabSelect LX、Amsphere A3、Praesto Jetted A50、Fractogel EMD COO、Eshmuno CPX、Eshmuno Q、POROS50HQ、POROS 50HS、POROS 50XS、POROS 50XQ、Q Sepharose FF、Capto Q、Capto S、CaptoButyl ImpRes等。
优选的，层析柱体为Omnifit系列层析柱。更优选的，层析柱体包括Omnifit EZColumn和Omnifit EZ SOLVENTPLUS Column中的任一种。
本发明还提供了一种缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
采用乙醇的水溶液为装柱液，将层析填料装填于层析柱体。
本发明的层析柱的制备方法，操作简单，易于填装，无需缓冲液置换等繁琐步骤。
优选的，以800-2000cm/h流速装柱。更优选的，以1000-1500cm/h流速装柱。
优选的，层析柱体竖直固定，将层析填料匀浆重悬后置于层析柱体，采用装柱液加满层析柱体，安装柱头，采用装柱液冲洗层析柱，直至柱床高度稳定。
在实际操作中，可采用装柱器进行装柱。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用乙醇的水溶液作为装柱液，能够有效缓解柱壁效应，经柱效测试合格，可得到适用于抗体纯化缩小模型的层析柱；
(2)本发明的层析柱柱效好，能满足缩小模型的使用需求；
(3)本发明的层析柱的制备方法，操作简单，易于填装，无需缓冲液置换等繁琐步骤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的缩小模型的层析柱的柱效测试图；
图2为本发明实施例2提供的缩小模型的层析柱的柱效测试图；
图3为本发明实施例3提供的缩小模型的层析柱的柱效测试图；
图4为本发明实施例4提供的缩小模型的层析柱的层析图谱；
图5为本发明实施例5提供的缩小模型的层析柱的层析图谱。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(MabSelect SuRe LX)重悬后倒入层析柱体，采用质量分数为20％的乙醇的水溶液为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在1000cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度212mm，体积7.25ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定，柱效测定结果见图1。
实施例2
本实施例提供了一种缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(POROS 50HQ)重悬后倒入层析柱体，采用质量分数为25％的乙醇的水溶液为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在1200cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度210mm，体积7.18ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定，柱效测定结果见图2。
实施例3
本实施例提供了一种缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(POROS 50HQ)重悬后倒入层析柱体，采用质量分数为30％的乙醇的水溶液为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在800cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度205mm，体积7.01ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定，柱效测定结果见图3。
实施例4
采用本发明实施例1的层析柱作为缩小模型，对抗体进行纯化。操作流速为190cm/h，样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用2CV的消毒缓冲液(0.2M NaOH+0.5M NaCl)冲洗层析柱；用5CV的平衡液(25mM Tris-HCl+100mM NaCl，pH7.4)冲洗层析柱；将细胞培养收获液经深层过滤澄清后(HCCF)上样到层析柱，上样载量为40g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的清洗缓冲液II(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床；用3CV的清洗缓冲液III(50mM NaAc-HAc，pH5.5)洗涤柱床；再用3.5CV的洗脱液(100mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；用2CV的0.1M磷酸溶液冲洗柱床；用2CV的平衡液清洗柱床；再用2CV的消毒缓冲液冲洗层析柱；用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液(0.2M NaAc-HAc,pH5.0+2％Benzyl alcohol)保存层析柱。
采用上述方法纯化抗体后，目标抗体的回收率为95.6％，纯度为94.6％，层析图谱见附图4。
实施例5
采用本发明实施例2的层析柱作为缩小模型，对抗体进行纯化。操作流速为240cm/h，样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的消毒缓冲液(0.5M NaOH)冲洗层析柱；用6CV的平衡液(50mM Tris-HCl+50mM NaCl，pH7.5)冲洗层析柱；将样品(AEX Load)上样到层析柱，上样载量为120g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的消毒缓冲液冲洗层析柱；最后用3CV的保存液(0.1M NaOH)保存层析柱。
采用上述方法纯化抗体后，目标抗体的回收率为97.0％，纯度为99.1％，层析图谱见附图5。
比较例1
比较例1的缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(MabSelect SuReLX)重悬后倒入层析柱体，采用纯化水为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在300cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度205mm，体积7.01ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定。
比较例2
比较例2的缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(POROS 50HQ)重悬后倒入层析柱体，采用纯化水为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在300cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度210mm，体积7.18ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定。
比较例3
比较例2的缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(MabSelect SuReLX)重悬后倒入层析柱体，采用纯化水为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在1000cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度200mm，体积6.84ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定。
比较例4
比较例2的缩小模型的层析柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一根Omnifit EZ Column，直径6.6mm，高度250mm的层析柱体，同时准备一根对应的空柱管和装柱器，清洗干净；拆下Omnifit层析柱体可以伸缩的一端柱头，然后将Omnifit层析柱体通过装柱器与空柱管连接；
(2)将层析柱体竖直固定，将计算体积后的填料匀浆(POROS 50HQ)重悬后倒入层析柱体，采用纯化水为装柱液，迅速用装柱液加满层析柱，安装柱头，用装柱液在1200cm/h的流速冲洗层析柱，待柱床高度稳定后，记录柱床高度，拆下装柱器和空柱管，移除多余填料，安装可伸缩的一端柱头至标记的柱床高度(直径6.6mm，高度215mm，体积7.36ml)，避免引入气泡。最后进行柱效测定。
实验例1
为了对比说明本发明各实施例和比较例的缩小模型的层析柱的柱效，对本发明实施例1-2和比较例1-4的缩小模型的层析柱的对称性(As)和理论塔板高度(HETP)进行测试，测试结果见表1。
表1不同层析柱的柱效和理论塔板数
Figure BDA0001920846450000091
Figure BDA0001920846450000101
根据上述测试结果可知，本发明的缩小模型的层析柱，能够有效缓解柱壁效应，经柱效测试合格。而比较例的层析柱柱效测定不合格。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种缩小模型的层析柱，其特征在于，所述层析柱应用于抗体纯化；
层析柱体和填充于层析柱体内的层析填料，装柱液为质量分数为10-30%的乙醇的水溶液，以800-2000cm/h流速装柱；
所述层析柱体的直径为5-10mm；
所述层析柱体的长度为100-330mm；
所述层析填料包括阳离子交换填料、阴离子交换填料中的任一种；
所述层析柱体包括Omnifit EZ Column和Omnifit EZ SOLVENTPLUS Column中的任一种；
所述层析柱的理论塔板高度≤0.05cm；
所述层析柱的对称性为0.8-1.8。
2.根据权利要求1所述的缩小模型的层析柱，其特征在于，所述装柱液为质量分数为15-25%的乙醇的水溶液。
3.根据权利要求1所述的缩小模型的层析柱，其特征在于，所述层析柱体的直径为5mm、6.6mm或10mm。
4.根据权利要求1所述的缩小模型的层析柱，其特征在于，所述层析柱体的长度为100mm、150mm、250mm和330mm。
5.权利要求1-4任一项所述的缩小模型的层析柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用乙醇的水溶液为装柱液，将层析填料装填于层析柱体。
6.根据权利要求5所述的缩小模型的层析柱的制备方法，其特征在于，以1000-1500cm/h流速装柱。
7.根据权利要求5所述的缩小模型的层析柱的制备方法，其特征在于，层析柱体竖直固定，将层析填料匀浆重悬后置于层析柱体，采用装柱液加满层析柱体，安装柱头，采用装柱液冲洗层析柱。
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