CN105272844B

CN105272844B - 一种提纯高纯鱼油epa乙酯和dha乙酯的方法

Info

Publication number: CN105272844B
Application number: CN201410253579.2A
Authority: CN
Inventors: 崔万臣; 沈志刚; 李隆; 刘燃
Original assignee: Hebei Hyde Biological Technology Co ltd
Current assignee: Hebei Haide Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2034-06-09
Also published as: CN105272844A

Abstract

本发明公开了一种提纯高纯鱼油EPA乙酯和DHA乙酯的方法，包括1)一次纯化：将鱼油粗品配成制备溶液，并使用反相色谱柱进行分离，得到EPA‑EE和DHA‑EE纯化液；2)二次纯化：将一次纯化中收集到纯度接近的纯化液合并，并加入溶剂稀释，经反相色谱柱分离，收集到不同纯度级别的EPA‑EE和DHA‑EE溶液；3)浓缩：将二次纯化中得到的EPA‑EE或DHA‑EE溶液合并，并使用溶剂稀释，该稀释后的样品进入反相色谱柱，并给以第四溶剂，所述第四溶剂能使反相色谱柱中的EPA‑EE或DHA‑EE被洗脱，并收集被洗脱的样品溶液进行浓缩。该方法仅通过液相制备色谱就可完成对样品的分离纯化，再配合旋转蒸发仪就可实现对样品的浓缩，操作简单，易于实现高纯鱼油EPA‑EE及DHA‑EE的工业化生产。

Description

一种提纯高纯鱼油EPA乙酯和DHA乙酯的方法

技术领域

本发明涉及一种高纯EPA-EE及DHA-EE的制备方法，具体涉及一种工业化液相制备色谱纯化鱼油粗品制备高纯EPA-EE及DHA-EE的工艺方法。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)属于ω-3型多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)，是人体不能合成的必需脂肪酸，具有独特的生理活性和保健功能。两者均具有降血压、降血脂、降胆固醇，治疗糖尿病，预防老年痴呆等作用，临床上两者已被用于治疗动脉硬化和高血脂。DHA还具有抗炎、提高视力、提高记忆力等独特功效。由于EPA和DHA的生理功能并不完全相同，因而开发高纯度的EPA和DHA单体具有重要意义和广阔的市场前景。

EPA、DHA主要存在于海洋动植物中，海洋鱼油是其加工生产的主要来源，而天然来源的海洋鱼油中两者总含量一般在20％-30％之间，其中还含有大量有害成分、杂质和饱和及单不饱和脂肪酸，其医疗和保健效果不理想。因此，开发利用海洋鱼油资源的关键是如何有效纯化浓缩鱼油中的PUFA，提高鱼油的经济利用价值。市售EPA、DHA产品通常为它们的乙酯化合物，即EPA乙酯(EPA-EE)、DHA乙酯(DHA-EE)。

目前，现有技术报道的鱼油分离纯化方法主要有：分子蒸馏法、低温结晶法、尿素包合法，脂肪酶法、超临界流体萃取法、银树脂层析法、硝酸银络合法和高效液相色谱法。其中，分子蒸馏法、低温结晶法、尿素包合法，脂肪酶法、超临界流体萃取法通常制得的为EPA-EE和DHA-EE的混合物，单体纯度较低，很难达到80％以上。分离纯化高纯度EPA-EE和DHA-EE多采用银树脂层析法、硝酸银络合法和高效液相色谱法，而银树脂层析法和硝酸银络合法需要使用大量昂贵的硝酸银，不仅生产成本相对较高，而且硝酸银难以回收，污染严重，倘若操作控制不当，硝酸银还有进入产品的风险。常规的高效液相色谱法很难直接分离纯化低纯度的鱼油粗品，制得高纯度的EPA-EE和DHA-EE，并且由于样品在纯化过程中被高度稀释，给后处理带来很大负担。

专利文献CN102285880A公开了一种制备EPA乙酯和DHA乙酯的方法，该方法实现了在实验室内分离200～600mg的鱼油粗品，但是其利用了高效制备色谱，对于小样品量尚可，而对于工业应用则受到了局限，并且其提纯得到的样品需要进行萃取，才可以进行下一步的浓缩，而该过程在工业放大时极容易引起产品变质，导致纯度下降。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术纯化EPA-EE和DHA-EE所存在的不足，提供一种适于工业化生产、收率高、并能同步分离得到高纯度EPA-EE和DHA-EE的纯化方法。

本发明的方法包括以下工序：

1)一次纯化：将含有EPA-EE、DHA-EE的鱼油粗品使用第一溶剂配成制备溶液，并使用反相色谱柱进行分离，得到EPA-EE和DHA-EE纯化液，并将其按照纯度分组；

优选的，所述制备溶液中鱼油粗品的浓度为50～500mg/mL。

优选的，将含有EPA-EE、DHA-EE的鱼油粗品用有机溶剂加以调配，配制成可供分离纯化的制备溶液，储存于样品储罐中。比如，使用可反控的制备液相色谱系统，以C18为固定相，以甲醇水溶液或乙醇水溶液或甲醇和乙腈水溶液或乙醇和乙腈水溶液为流动相，运行制备液相色谱系统，初始平衡色谱柱，以一定流速自动进样，分离纯化EPA-EE和DHA-EE，通过UV检测信号分别收集EPA-EE和DHA-EE纯化液。

优选的，分离时采用紫外检测器检测210nm处吸收。

优选的，所述第一溶剂至少包括水、DMF、DMSO、甲醇、乙醇和乙腈中的一种。

2)二次纯化：将一次纯化收集到纯度接近的EPA-EE或DHA-EE组分合并，并加入第二溶剂稀释，该稀释后的样品经反相色谱柱分离，并收集到不同纯度级别的EPA-EE和DHA-EE溶液；

优选的，步骤1)和步骤2)使用的流动相为水和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂至少包括甲醇或乙醇，所述水和有机溶剂的体积比为5～50：50～95。更优选的，所述有机溶剂还包括乙腈，所述有机溶剂中甲醇或乙醇与乙腈的体积比为20～80：20～80。因此，其可以为甲醇/水溶液，或乙醇/水溶液，或甲醇和乙腈/水溶液，或乙醇和乙腈水溶液。

更优选的，所述流动相的组成为80％～95％甲醇/5～20％水，或70％～95％乙醇/5～30％水，或[5％～85％甲醇/5～85％乙腈]/5％～20％水，或[5％～85％乙醇/5％～85％乙腈]/5％～20％水.

优选的，所述待分离制备液进样量为50～50000mL/次；进样流速可为10～50000mL/min，流动相的流速可为50～50000mL/min。

优选的，稀释后的样品的浓度为0.5mg/L～5mg/L。

3)浓缩：将二次纯化中收集到纯度级别相同的EPA-EE或DHA-EE组分合并，经过第三溶剂稀释，该稀释后的样品进入反相色谱柱；后给以第四洗脱剂，所述第四洗脱剂能使反相色谱柱中的EPA-EE或DHA-EE被洗脱，并收集被洗脱的样品溶液进行浓缩。

优选的，步骤2)和步骤3)所述溶剂为水，水的加入比例为5％～50％。

优选的，步骤1)、步骤2)和步骤3)中所述色谱柱的固定相为C8、聚合物基质或者C18。

优选的，步骤1)和步骤2)所述色谱柱的直径为50～1000mm，长度可为250～450mm。

所述浓缩优选进行真空旋蒸浓缩，最终可得到三种不同纯度级别的EPA-EE和DHA-EE，级别1：98％～99％，级别2：93％～97％，级别3：86％～90％，其中级别1的比例可达到40％～55％。

优选的，真空浓缩时真空度为-0.96atm。

更优选的，浓缩样品溶液时，向样品溶液中加入抗氧化剂，所述抗氧化剂包括Vc和茶多酚中的一种或多种。

优选的，稀释后的样品的浓度为0.5mg/L～5mg/L。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)经过一次制备即可同步分离纯化制得高纯度的EPA-EE及DHA-EE两种目标组分；鱼油粗品一次纯化及二次纯化的配合可显著提高产品产能及高纯目标产品的回收率；

2)鱼油浓缩工序先经柱脱水浓缩再进行高真空旋蒸浓缩不但能极大地提高浓缩的效率，而且能够降低旋蒸浓缩的温度，在一定程度上降低了产品被高温氧化的风险；

3)该方法仅通过液相制备色谱就可完成对样品的分离纯化，再配合旋转蒸发仪就可实现对样品的浓缩，操作简单，易于实现高纯鱼油EPA-EE及DHA-EE的工业化生产。

附图说明

图1为原料鱼油粗品的HPLC检测谱图，其中保留时间34min对应的色谱峰为EPA-EE峰，保留时间45min对应的色谱峰为DHA-EE峰；

图2为级别1的EPA-EE经浓缩后的HPLC检测谱图，表明实施例1获得99.05％的EPA-EE产品；

图3为级别1的DHA-EE经浓缩后的HPLC检测谱图，表明实施例1获得99.19％的DHA-EE产品。

具体实施方式

如下为本发明的一些优选实施例，其仅用作对本申请的解释而不是限制。

本发明使用的原料鱼油的组成如表1所示，下表中序号1～21依次对应于图1谱图中各保留时间处所示峰，其中保留时间34min对应的色谱峰为EPA-EE峰，保留时间45min对应的色谱峰为DHA-EE峰。

表1、原料鱼油粗品的HPLC检测谱图

实施例1：

一次纯化

将EPA-EE和DHA-EE总含量为29％的鱼油粗品，配制成180mg/mL的待分离制备液，使用CXTH-LC6000制备系统和CXTH-DAC100色谱柱进行纯化，柱床高度300mm，使用C18作为固定相；流动相：甲醇/乙腈/水70:20:10(v/v/v)；进样500mL制备液；进样流速：300mL/min，运行流速：480mL/min；检测波长：210nm，并根据紫外检测信号EPA-EE及DHA-EE进行分段收集。

此处的分段收集为收集含有不同组分的洗脱液，其具体各段组成参见表2：

表2、各段洗脱液的组成

二次纯化

二次纯化的条件为：流动相：甲醇/水90:10(v/v)；进样流速及运行流速同前。

将4批一纯工序中收集到纯度接近的EPA-EE、DHA-EE组分合并，加水稀释，使其浓度变为2.5mg/L，进入色谱柱，进行二次纯化精制分段收集，得到不同纯度级别的EPA-EE和DHA-EE。此处不同的纯度级别可以依据产品的目标级别而确定。

浓缩

收集不同级别的二次纯化制得的EPA-EE及DHA-EE，并分别加水进行稀释，水的加入量为溶液体积的10％，使其浓度为1.5mg/L，后分别使用溶剂50％的乙醇水溶液和乙醇进行洗脱(后文简称为脱水浓缩)，再将收集液添加茶多酚进行旋蒸浓缩，旋蒸温度为55℃。

最终得到三种不同级别的EPA-EE和DHA-EE，级别1：98％～99％，级别2：93％～97％，级别3：86％～90％。其中EPA-EE的回收率为82％，三种级别所占比例为55％:40％:5％；DHA-EE的回收率为80％，三种级别所占比例为50％:42％:8％。图2为级别1的EPA-EE经浓缩后的HPLC检测谱图，EPA-EE的纯度为99.05％，其组分列表如表3；图3为级别1的DHA-EE经浓缩后的HPLC检测谱图，DHA-EE产品的纯度99.19％，其组分列表参见表4。

表3、级别1的EPA-EE经浓缩后的HPLC检测谱图中各组分含量

表4、高纯DHA-EE洗脱液HPLC检测谱图

实施例2

一次纯化

制备样品：同实施例1

仪器设备：同实施例1一次纯化使用CXTH-DAC100色谱柱：柱床高度300mm，使用C18作为固定相；流动相选择甲醇/乙腈/水50:40:10(v/v/v)；进样量为500mL制备液；进样流速为300mL/min，运行流速：480mL/min；检测波长：210nm，并根据紫外检测信号EPA-EE及DHA-EE进行分段收集。

二次纯化

二次纯化选用甲醇/水95:5(v/v)作为淋洗液，进样流速及运行流速同前。分别将4批一次纯化工序中收集到纯度接近的EPA-EE、DHA-EE组分合并，经加分散剂调配，进入色谱柱，进行二次纯化精制，分段收集，得到不同纯度级别的EPA-EE和DHA-EE。

浓缩

分别将4批二次纯化工序中收集到纯度级别相同的EPA-EE和DHA-EE加分散剂稀释，通过色谱柱进行脱水浓缩，再将收集液添加茶多酚进行旋蒸浓缩，旋蒸温度为55℃。

最终得到三种不同级别的EPA-EE和DHA-EE，级别1：98％～99％，级别2：93％～97％，级别3：86％～90％。其中EPA-EE的回收率为78％，三种级别所占比例为40％:45％:15％，DHA-EE的回收率为76％，三种级别所占比例为43％:46％:11％。

实施例3

一次纯化

将EPA-EE和DHA-EE总含量为29％的鱼油粗品，配制成220mg/mL的待分离制备液，其余同实施例1。

二次纯化

二次纯化所选用的制备条件同实施例1。

浓缩

分别将4批二纯工序中收集到的级别相同的EPA-EE和DHA-EE加分散剂调配，过色谱柱进行脱水浓缩，再将收集液添加茶多酚进行旋蒸浓缩，旋蒸温度为60℃。

最终得到三种不同级别的EPA-EE和DHA-EE，级别1：98％～99％，级别2：93％～97％，级别3：86％～90％。其中EPA-EE的回收率为80％，三种级别所占比例为55％:40％:5％；DHA-EE的回收率为80％，三种级别所占比例为48％:45％:7％。

实施例4

一次纯化

色谱条件：CXTH-DAC100：柱床高度300mm C18固定相；流动相：甲醇/乙腈/水70:20:10(v/v/v)；进样量：500mL制备液；进样流速：250mL/min，运行流速：450mL/min；检测波长：210nm，其余条件同实施例1，并根据紫外检测信号EPA-EE及DHA-EE进行分段收集。

二次纯化

色谱条件：流动相：甲醇/水90:10(v/v)；进样流速及运行流速同前。分别将4批二次纯化工序中收集到纯度接近的EPA-EE、DHA-EE组分合并，经加分散剂调配，进入色谱柱，进行二次纯化精制，进行分段收集，得到不同纯度级别的EPA-EE和DHA-EE。

浓缩

分别将4批二次纯化工序中收集到纯度级别相同的EPA-EE和DHA-EE加分散剂调配，过色谱柱进行脱水浓缩，再将收集液添加Vc进行旋蒸浓缩，旋蒸温度为60℃。

最终得到三种不同级别的EPA-EE和DHA-EE，级别1：98％～99％，级别2：93％～97％，级别3：86％～90％。其中EPA-EE的回收率为85％，三种级别所占比例为49％:42％:9％；DHA-EE的回收率为81％，三种级别所占比例为46％:44％:10％。

对比实施例1

本实施例条件基本同实施例1，但是在二次纯化时，不加入第二溶剂进行稀释，最终得到的产品分布如下：EPA-EE的回收率为73％，三种级别所占比例为10％:36％:54％；DHA-EE的回收率为70％，三种级别所占比例为5％:42％:53％。该对比实施例表明，当不加入第二溶剂进行稀释时，不纯产品的含量会大幅上升。

对比实施例2

本实施例条件基本同实施例1，但是在浓缩步骤不加入第三溶剂进行稀释，最终得到的产品分布如下：EPA-EE的回收率为81％，三种级别所占比例为50％:42％:8％；DHA-EE的回收率为80％，三种级别所占比例为46％:45％:9％。。该对比实施例表明，当不加入第三溶剂进行稀释时，部分样品会在上样时直接被洗脱，导致洗脱液中的水含量较大，对后续的浓缩工序产生直接的影响，并且导致不纯产品的含量会上升。

对比实施例3

本实施例条件基本同实施例1，但是去除浓缩步骤，并且加入抗氧剂Vc，由于未进行浓缩步骤，产品中的水难以除尽，并且浓缩的时间大大延长。

Claims

1.一种提纯高纯鱼油EPA乙酯和DHA乙酯的方法，包括：

2)二次纯化：将一次纯化中收集到纯度接近的纯化液合并，并加入第二溶剂稀释，该稀释后的样品经反相色谱柱分离，收集到不同纯度级别的EPA-EE和DHA-EE溶液；

3)浓缩：将二次纯化中收集到纯度级别相同的EPA-EE或DHA-EE溶液合并，并使用第三溶剂稀释，该稀释后的样品进入反相色谱柱；并给以第四溶剂，所述第四溶剂能使反相色谱柱中的EPA-EE或DHA-EE被洗脱，并收集被洗脱的样品溶液进行浓缩；

所述制备溶液中鱼油粗品的浓度为50～500mg/mL；

所述步骤1)和步骤2)使用的流动相为水和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂至少包括甲醇或乙醇，所述水和有机溶剂的体积比为5～50：50～95；

步骤1)、步骤2)和步骤3)中待分离的制备液进样量为50～50000mL/次；进样流速为10～50000mL/min，流动相的流速为50～50000mL/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂还包括乙腈，所述有机溶剂中甲醇或乙醇与乙腈的体积比为20～80：20～80。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂均至少包括水、DMF、DMSO、甲醇、乙醇和乙腈中的一种。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述第二溶剂的加入比例为合并后纯化液体积的5％～50％，所述第三溶剂的加入比例为合并后EPA-EE或DHA-EE溶液体积的5％～50％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)和步骤3)中所述色谱柱的固定相为C8、聚合物基质或者C18。

6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)所述色谱柱的直径为50～1000mm，长度为250～450mm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，浓缩样品溶液时，向样品溶液中加入抗氧化剂，所述抗氧化剂包括Vc和茶多酚中的一种或两种。