CN112939761A - 一种神经酸的提取方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了神经酸的提取方法。该神经酸的提取方法包括步骤：1)获得包含神经酸甘油酯的元宝枫籽油；2)将元宝枫籽油与碱性醇溶液加热反应后，再加入水继续反应得到皂化液，调节皂化液至酸性，收集油层并水洗除杂得到油层分离物；3)将油层分离物进行柱层析分离，柱层析分离的吸附剂包括聚酰胺树脂，洗脱剂包括乙醇，以乙醇浓度增加的方式梯度洗脱，收集含目标成分的洗脱液，去除洗脱剂得到粗品神经酸。提取方法还包括继续进行4)工业色谱提纯包括：将目标浓度的粗品神经酸样品进入工业色谱进样系统，工业色谱柱的固定相为C30，以含70％～100％甲醇的甲醇/水流动相进行等浓度洗脱，将收集的目标段的分离液脱去流动相溶剂即制得神经酸。

Description

一种神经酸的提取方法

技术领域

本申请涉及一种神经酸的提取方法，属于药用植物提取工艺领域。

背景技术

神经酸是一种长链的单不饱和脂肪酸(化学名为顺～15～二十四碳烯酸)，是各国科学家公认的大脑神经纤维和神经细胞的核心天然成分，也是唯一的一个能修复疏通受损大脑神经并促进神经细胞再生的双效神奇物质。神经酸最早发现于哺乳动物的神经组织，故命名为神经酸。神经酸对神经元与胶质细胞活跃，对髓鞘的形成有显著促进作用，能够促进大脑发育，改善记忆和提高视力，医治多化性硬化症等髓鞘疾病，并有显著的抗疲劳、抗衰老、降血脂功效。神经酸的缺乏将会引起脑中风后遗症、脑瘫、脑萎缩、记忆力衰退、失眠健忘等脑疾病。

人体自身不能合成神经酸，只有从自然界中鲨鱼脑及少数几种植物提取，是昂贵的医药和保健品原料。目前从元宝枫中提取分离神经酸涉及的论文或专利方法主要有：金属盐沉淀法、低温结晶法、尿素包合法及分子蒸馏法。

候镜德，袁晓悟，胡伟，竹百均.金属盐沉淀法分离神经酸[J]生物技术，1996，1.49-51中采用金属盐沉淀法提取神经酸，同时研究了水和丙酮用量的影响，得到的神经酸含量不高。

徐文晖，王俊儒，梁倩.元宝枫籽油中神经酸的初步分离[J].中国油脂,2007,32(11).49-51公开了对元宝枫籽油所得的混合脂肪酸甲酯进行尿素包合分离，选用脂肪酸甲酯/尿素/甲醇＝1：3：9、包合温度为～10℃、包合时间为20h的条件，但通过两次尿素包合，神经酸甲酯的质量分数从5.48％只能提高到17.10％，而且在尿素包合过程中存在时间长、残留的问题。

中国专利申请CN101092344A公开了一种用分子蒸馏技术从元宝枫籽油中提取神经酸的方法，该专利中将分子蒸馏技术用于神经酸乙酯的分离研究，首先使元宝枫籽油脱酸，除去油脚，并脱除水分，然后对其进行乙酯化反应，水洗、分离得到混合脂肪酸乙酯，之后选用不同的真空度及蒸馏温度对其进行了六级分子蒸馏，但最后也得到质量分数在50％以上的神经酸乙酯，再酯交换才能得到神经酸，而且多次反复的高温蒸馏，会使产物异构化，生产周期长。

中国专利申请CN1775732A公开了从元宝枫籽油中提取神经酸的方法，该专利中通过皂化与低温尿素包埋、常温真空蒸馏、低温冷冻分步结晶等方法从元宝枫籽油中提取神经酸，虽然能得到高含量的神经酸，工艺复杂、收率较低、工艺稳定性差。元宝枫籽油的超临界CO₂萃取虽然有不少报道，但由于萃取压力基本在35MPa以下，或者要采用乙醇做夹带剂，或者收油率较低，而且简单的超临界CO₂萃取得到的元宝枫籽油，其神经酸尚绝大部分以脂肪酸甘油酯的形式存在，更得不到高含量的神经酸。

总之，现有的这些方法有的工艺繁琐、生产周期长，有的收率低、且存在残留等问题。因此需要一种工艺路线简单、生产周期短、溶剂毒性小的能够富集纯化神经酸的方法。

发明内容

为了解决上述问题，提供了一种神经酸的提取方法，该方法的提取率高、提取成本低和提取的神经酸纯度高；提取方法新颖、操作简单、稳定性及重复性好；所用溶剂单一、毒性小、便于回收重复利用，该方法适用于工业化生产。

该神经酸的提取方法包括下述步骤：

1)获得包含神经酸甘油酯的元宝枫籽油；

2)将所述元宝枫籽油与碱性醇溶液加热反应后，再加入水继续反应得到皂化液，调节皂化液至酸性，以使得皂化液分层明显，收集油层并水洗除杂得到油层分离物；

3)将所述油层分离物进行柱层析分离，所述柱层析分离的吸附剂包括聚酰胺树脂，洗脱剂包括乙醇，以乙醇浓度增加的方式梯度洗脱，收集含目标成分的洗脱液并去除洗脱剂得到粗品神经酸。

具体的，步骤2)中的皂化液调节至酸性比碱性有利于提高皂化液的分层，使得皂化液分层更明显，不仅更多的神经酸转移至油层分离率高，并且油层和水层的分界更明显，取上层油层，从而提高神经酸的提取率。可选地，所述调节皂化液为酸性的pH为1.5～3.5。进一步地，所述调节皂化液为酸性的pH为2～3。

具体的，本申请中使用聚酰胺树脂作为吸附剂有利于将神经酸从元宝枫又中分离出来，神经酸的分离率高，提高了神经酸的收率和纯度。比使用硅胶作为吸附剂的神经酸的选择性高、分离率高和收率高。进一步的，以聚酰胺树脂为吸附剂和包括乙醇的洗脱剂的配合有利于提高神经酸的收率和纯度。

其中，步骤3)中使用的洗脱剂为乙醇和水的混合物。

可选地，所述步骤3)中的梯度洗脱方法包括步骤：以5～9倍吸附剂体积的30～60％乙醇洗脱，再以6～9倍吸附剂体积的65～85％乙醇洗脱并收集该段中包含目标成分的洗脱液。优选地，所述步骤3)中的梯度洗脱方法包括步骤：以6～8倍吸附剂体积的50～60％乙醇洗脱，再以7～8倍吸附剂体积的70～80％乙醇洗脱并收集该段中包含目标成分的洗脱液。使用该洗脱方式的神经酸的分离率高和收率高；并且乙醇作为洗脱剂毒性小，乙醇可以回收利用，适合工业化生产。

可选地，所述步骤3)还包括最后用6～7倍柱体积的90～95％乙醇洗脱以回收利用聚酰胺树脂。此步骤处理的聚酰胺树脂可以重复利用。

可选地，所述步骤3)中的所述聚酰胺树脂的粒径为80-120目。使用该孔径的聚酰胺树脂能够提高神经酸的分离率和收率，如果孔径过大，神经酸的分离率和收率会降低；如果孔径过小，分离纯化的过程中容易出现堵塞，从而无法达到分离的目的。

具体的，步骤2)中所述元宝枫籽油包含的神经酸甘油酯与碱性醇溶液加热反应生成游离的神经酸，再加入水使得油层和水层分离，该处理过程有利于皂化反应的充分进行。

可选地，所述步骤2)中：

所述碱性醇中的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱性醇中的醇为甲醇或乙醇；

所述加热反应的反应温度为50℃～90℃；和/或

所述调节皂化液为酸性的pH为1.5～3.5。

进一步地，碱性醇为氢氧化钠乙醇溶液。所述加热反应的反应温度为70℃～90℃。

优选地，所述步骤2)中：所述碱性醇中的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱性醇中的醇为甲醇或乙醇；所述加热反应的反应温度为50℃～90℃；和所述调节皂化液为酸性的pH为1.5～3.5。进一步地，碱性醇为氢氧化钠乙醇溶液。所述加热反应的反应温度为70℃～90℃。该处理方式更有利于步骤2)中所述元宝枫籽油与碱性醇溶液加热反应生成游离的神经酸，再加入水使得油层和水层分离，该处理过程有利于提高神经酸的收率。

可选地，所述步骤2)具体包括：

A)在反应温度为60℃～90℃下配置浓度为0.8M～1.2M的氢氧化钠乙醇溶液后，加入所述元宝枫籽油在所述反应温度下反应至少40min；

B)向步骤A)制得的混合物中加入水，进行皂化反应至少5min；

C)使用稀硫酸调节皂化液的pH为1.5～3.5，分离油层，用水洗涤至洗涤液为中性即得到所述油层分离物。

进一步地，所述氢氧化钠乙醇溶液的浓度为0.9M～1.1M。

进一步地，所述步骤A)在反应温度为60℃～90℃下氢氧化钠乙醇溶液和所述元宝枫籽油在下反应50～80min。该条件使得皂化反应进行充分进行，皂化反应的产率高。

进一步地，所述步骤B)向步骤A)制得的混合物中加入水，进行皂化反应5～15min，优选为10min。该条件能够保证皂化反应充分进行。

进一步地，所述步骤A)中的元宝枫籽油与氢氧化钠乙醇溶液的料液的质量比为1:3～11。更进一步的，所述步骤A)中的元宝枫籽油与氢氧化钠乙醇溶液的料液的质量比的上限选自1:5、1:7、1:9或1:10，下限选自1:5、1:7、1:9或1:10，优选为1:5～10。该条件使得充分皂化。

可选地，步骤B)中加入水的体积与步骤A)中的氢氧化钠乙醇溶液体积比为1:0.8-1.2，优选为1:1等体积，使得油层和水层能够更好的分离。

可选地，所述步骤C)中的稀硫酸的浓度为10％-30％，优选为20％。其中稀硫酸的浓度为体积浓度，为硫酸和水的混合物。

可选地，所述步骤1)中获得元宝枫籽油的步骤包括：将粉碎后的元宝枫籽在CO₂流量150～250L/h进行CO₂超临界萃取，萃取压力为38～45MPa，萃取温度35～50℃，随后进行一级分离，一级分离后的产物即为所述元宝枫籽油；

其中，所述两级分离中的一级分离压力4～10MPa和一级分离温度40～50℃。该超临界萃取为高压萃取，萃取率高，并且该两级分离解析步骤，有利于提高获得的神经酸的纯度。

可选地，所述萃取后分离还包括二级分离，所述二级分离压力4～6MPa和二级分离温度40～50℃，以分离游离脂肪酸等杂质

优选地，超临界萃取的CO₂流量为190～220L/h，所述萃取压力为42MPa-45MPa，所述萃取温度为38～50℃；和所述两级分离中的一级分离压力8.5～9.5MPa和一级分离温度45～50℃。

优选地，所述二级分离压力5～6MPa和二级分离温度45～50℃。

具体的，粗品神经酸需要再经过进一步的提纯才能制得所述神经酸，进一步的提纯方式可以为重结晶，优选为：所述神经酸的提取方法还包括将所述粗品神经酸进行4)工业色谱提纯，所述工业色谱提纯步骤包括：将目标浓度的粗品神经酸样品进入工业色谱进样系统，工业色谱柱的固定相为C30，以含70％～100％甲醇的甲醇/水流动相进行等浓度洗脱，将收集的目标段的分离液脱去溶剂即制得所述神经酸。

其中，固定相C30是指：色谱填料的一种，三十烷基键合硅胶。

可选地，所述步骤4)中：所述粗品神经酸样品中的粗品神经酸的浓度为90～110mg/mL；工业色谱提纯使用的流动相为含85％～100％甲醇的甲醇/水流动；将收集的目标段分离液在50-70℃减压浓缩回收溶剂脱去溶剂；和/或所述神经酸的检测波长为210nm。优选地，所述步骤4)中：所述粗品神经酸样品中的粗品神经酸的浓度为90～110mg/mL；工业色谱提纯使用的流动相为含85％～100％甲醇的甲醇/水流动；将收集的目标段分离液在50-70℃减压浓缩回收溶剂脱去流动相溶剂；和所述神经酸的检测波长为210nm。本申请使用特定浓度的甲醇和水为流动相以C30为固定相，即可以实现将神经酸的纯度达到90％以上，并且使用的流动相的毒性低，沸点低容易回收利用，并C30反复使用，适用工业化生产。

本申请中的工业色谱包括固定相和流动相，固定相作为填料填充在色谱柱中，进入色谱柱的样品经过在固定相和流动相中的吸附分离而获得目标物质。工业色谱的目标物质可以选择性的进行检测。

本申请中，乙醇的浓度为体积浓度。

作为一种实施方式，一种神经酸的提取方法包括以下步骤：

1)元宝枫籽油的超临界CO₂萃取：元宝枫种子(元宝枫籽)粉碎成20～60目，在萃取压力38～45MPa、萃取温度35～40℃、一级分离压力4～10MPa、一级分离温度40～50℃、二级分离压力4～6MPa、二级分离温度40～50℃、CO₂流量150-250L/h的组合条件下，进行超临界CO₂萃取，得到元宝枫籽油；

2)元宝枫籽油预处理：取一定量的元宝枫籽油，加入一定浓度的氢氧化钠乙醇溶液，元宝枫籽油的质量与氢氧化钠乙醇溶液料液比为1:3～1:11；

在一定温度下回流加热皂化一定时间，再向皂化液中与加入氢氧化钠乙醇溶液等体积的水溶液，皂化液澄清透明后继续皂化10min；

取出皂化液，用20％的硫酸溶液调至PH至酸性，不断搅拌至溶液分层明显，收集上层油层，并用水洗至洗涤液为中性；

3)聚酰胺吸附柱层析分离：将步骤2)中所得的油层，以聚酰胺树脂为填料，进行柱层析；

选择一定粒径的聚酰胺作为吸附剂，用5～9倍聚酰胺树脂体积的30～60％乙醇洗脱；再用6-9倍聚酰胺树脂体积的65～85％乙醇洗脱，按照每个柱体积接一次洗脱液，合并收集目标成分主要集中的洗脱液；

最后用6～7倍柱体积的90～95％乙醇洗脱以回收聚酰胺树脂；

4)工业色谱纯化：将步骤3)中收集的含有目标成分的洗脱液回收乙醇、过滤后，配制成一定浓的样品溶液，注入工业色谱进样系统，以C30为填料，以70～100％的甲醇溶液、0～30％的水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，收集神经酸的分离液，在50-70℃减压浓缩回收溶剂，即得神经酸样品；

神经酸的检测波长为210nm。

该元宝枫中分离富集神经酸的组合技术方法，该方法采用超临界CO₂萃取-聚酰胺吸附柱层析-工业色谱纯化成套新技术从元宝枫籽中提取及分离富集神经酸。元宝枫籽经超临界CO₂萃取获得优质元宝枫籽油，元宝枫籽油通过皂化预处理，得到游离态的神经酸等脂肪酸；其次采用聚酰胺吸附柱层析分离方法，通过聚酰胺吸附性能的差异及合适的洗脱剂除去杂质和富集目标成分；最后采用工业色谱分离法选择性纯化目标成分，最终保证目标成分的收率及纯度，所得神经酸纯度在90％以上。

本申请的有益效果包括但不限于：

1、根据本申请的神经酸的提取方法，具有提取率高、提取成本低和提取的神经酸纯度高。

2.根据本申请的提取方法，具有提取方法新颖、操作简单、稳定性及重复性好。

3.根据本申请的提取方法，所用溶剂单一、毒性低、便于回收重复利用，方法适用于工业化生产。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请实施例1的元宝枫油预处理后的高压液相色谱图；

图2为本申请实施例1中聚酰胺吸附柱层析分离纯化后的高压液相色谱图；

图3为本申请实施例1中工业色谱分离色谱图；

图4为本申请实施例1工业色谱分离纯化后的高压液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。聚酰胺的孔径为80-120目。

本申请的实施例中分析方法如下：

利用赛默飞世尔科技公司UltiMate 3000高效液相色谱仪(包括梯度泵SR-3000、自动进样器WPS-3000、柱恒温系统TCC-3000、蒸发光检测器、色谱工作站变色龙7.2)进行高压液相色谱分析

利用赛默飞世尔科技公司公司UltiMate 3000高效液相色谱仪器进行工业色谱分离。

本申请的实施例中，收率基于重量进行计算：

收率＝元宝枫籽油质量/元宝枫籽投料量×100％。

元宝枫籽的产地元宝枫产地贵州，原料经烘干去除水分，再经脱壳、脱皮处理。

实施例1

一种神经酸1#的提取方法，具体从元宝枫籽油中分离富集高含量神经酸的方法包括以下步骤：

(1)元宝枫籽油的超临界CO₂萃取：元宝枫籽1#(种子)粉碎成20目，在萃取压力38MPa、萃取温度35℃、一级分离压力4MPa、一级分离温度40℃、二级分离压力6MPa、二级分离温度40℃、CO₂流量150L/h的组合条件下，进行超临界CO₂萃取，得到元宝枫籽油1#。

(2)元宝枫籽油1#预处理：称取一定量的氢氧化钠，溶于无水乙醇中，配成浓度分别为0.9mol/L的氢氧化钠乙醇溶液，于80℃水浴锅中回流加热，氢氧化钠溶解完全后，加入一定量步骤(1)中的元宝枫籽油1#。加入的元宝枫籽油1#的质量与氢氧化钠乙醇溶液料液比为1:5。皂化温度为70℃下皂化55min，向皂化液中加入氢氧化钠乙醇溶液等体积的水溶液，皂化液澄清透明后继续皂化10min。取出皂化液，用20％硫酸溶液进行酸解，调至PH为2～3，不断搅拌至溶液分层明显，转移至分液漏斗中，用水反复洗上层油层至洗涤液为中性，收集上层油层得到油层分离物1#。图1为元宝枫油预处理后的油层分离物1#的高压液相色谱图，其中1为神经酸。

(3)聚酰胺吸附柱层析分离：将步骤(2)中所得的油层分离物1#，采用聚酰胺树脂为填料，进行柱层析。选择一定粒径的聚酰胺作为吸附剂，用6倍聚酰胺树脂体积的50％乙醇洗脱；再用7倍聚酰胺树脂体积的70％乙醇洗脱，按照每个柱体积接一次洗脱液，合并收集目标成分主要集中的洗脱液，蒸发去除洗脱剂得到粗品神经酸1#。最后用6倍柱体积的90％乙醇洗脱(主要目的是为了吸附剂的重复利用)。图2为聚酰胺吸附柱层析分离纯化后的粗品神经酸1#的高压液相色谱图，其中1为神经酸。

(4)工业色谱纯化：将步骤(3)中收集的含有目标成分的洗脱液回收乙醇、过滤后的粗品神经酸1#，注入工业色谱进样系统，以85％的甲醇溶液，15％的水溶液作为洗脱剂进行洗脱，收集神经酸的分离液，在60℃减压浓缩干燥，既得神经酸样品1#。图3为粗品神经酸1#的工业色谱分离色谱图，其中1为神经酸；图4为工业色谱分离纯化后的神经酸样品1#高压液相色谱图，通过高压液相色谱分析测试得到的神经酸样品1#中神经酸的纯度为90.21％，其中1为神经酸。

实施例2

一种神经酸2#的提取方法，具体从元宝枫籽油中分离富集高含量神经酸的方法包括以下步骤：

(1)元宝枫籽油2#的超临界CO₂萃取：元宝枫籽2#(种子)粉碎成40目，在萃取压力42MPa、萃取温度50℃、一级分离压力9MPa、一级分离温度45℃、二级分离压力6MPa、二级分离温度50℃、CO₂流量200L/h的组合条件下，进行超临界CO₂萃取，得到元宝枫籽油2#。

(2)元宝枫籽油2#预处理：称取一定量的氢氧化钠，溶于无水乙醇中，配成浓度分别为1.0mol/L的氢氧化钠乙醇溶液，于80℃水浴锅中回流加热，氢氧化钠溶解完全后，加入一定量的元宝枫籽油2#。加入的元宝枫籽油2#的质量与氢氧化钠乙醇溶液料液比为1:7。皂化温度为70℃下皂化65min，向皂化液中加入氢氧化钠乙醇溶液等体积的水溶液，皂化液澄清透明后继续皂化10min。取出皂化液，加入20％硫酸溶液进行酸解，调至PH为2～3，不断搅拌至溶液分层明显，转移至分液漏斗中，用水反复洗上层油层至洗涤液为中性，收集上层油层得到油层分离物2#。对油层分离物2#进行高压液相色谱测试分析。

(3)聚酰胺吸附柱层析分离：将步骤(2)中所得的油层分离物2#，采用聚酰胺树脂为填料，进行柱层析。选择一定粒径的聚酰胺作为吸附剂，用7倍聚酰胺树脂体积的55％乙醇洗脱；再用8倍聚酰胺树脂体积的80％乙醇洗脱，按照每个柱体积接一次洗脱液，合并收集目标成分主要集中的洗脱液脱去洗脱剂得到粗品神经酸2#。最后用7倍柱体积的90％乙醇洗脱(主要目的是为了吸附剂的重复利用)。对粗品神经酸2#进行高压液相色谱测试分析。

(4)工业色谱纯化：将步骤(3)中收集的含有目标成分的洗脱液回收乙醇、过滤后的粗品神经酸2#，注入工业色谱进样系统，以90％的甲醇溶液，10％的水溶液作为洗脱剂进行洗脱，收集神经酸的分离液，在65℃减压浓缩干燥，既得神经酸样品2#。对粗品神经酸2#的进行工业色谱分离和高压液相色谱分析，通过高压液相色谱测试得到的神经酸样品2#纯度为91.01％。

实施例3

一种神经酸3#的提取方法，具体从元宝枫籽油中分离富集高含量神经酸的方法包括以下步骤：

(1)元宝枫籽油3#的超临界CO₂萃取：元宝枫籽3#(种子)粉碎成60目，在萃取压力45MPa、萃取温度38℃、一级分离压力9MPa、一级分离温度50℃、二级分离压力5MPa、二级分离温度45℃和CO₂流量200L/h的组合条件下，进行超临界CO₂萃取，得到元宝枫籽油3#。

(2)元宝枫籽油3#预处理：称取一定量的氢氧化钠，溶于无水乙醇中，配成浓度分别为1.0mol/L的氢氧化钠乙醇溶液，于80℃水浴锅中回流加热，氢氧化钠溶解完全后，加入一定量的元宝枫籽油3#。加入的元宝枫籽油3#的质量与氢氧化钠乙醇溶液料液比为1:10。皂化温度为90℃下皂化80min，向皂化液中加入氢氧化钠乙醇溶液等体积的水溶液，皂化液澄清透明后继续皂化10min。取出皂化液，进行酸解，调至PH为2～3，不断搅拌至溶液分层明显，转移至分液漏斗中，用水反复洗上层油层至洗涤液为中性，收集上层油层得到油层分离物3#。对油层分离物3#进行高压液相色谱测试分析。

(3)聚酰胺吸附柱层析分离：将步骤(2)中所得的油层分离物3#，采用聚酰胺树脂为填料，进行柱层析。选择一定粒径的聚酰胺作为吸附剂，用7倍聚酰胺树脂体积的60％乙醇洗脱；再用8倍聚酰胺树脂体积的70％乙醇洗脱，按照每个柱体积接一次洗脱液，合并收集目标成分主要集中的洗脱液脱除洗脱剂得到粗品神经酸3#。最后用6倍柱体积的95％乙醇洗脱(主要目的是为了吸附剂的重复利用)。对粗品神经酸3#进行高压液相色谱测试分析。

(4)工业色谱纯化：将步骤(3)中收集的含有目标成分的洗脱液回收乙醇、过滤后的粗品神经酸3#，注入工业色谱进样系统，以95％的甲醇溶液，5％的水溶液作为洗脱剂进行洗脱，收集神经酸的分离液，在65℃减压浓缩回收溶剂，既得神经酸样品3#。对粗品神经酸3#的进行工业色谱分离和高压液相色谱分析，通过高压液相色谱测试得到的神经酸样品3#纯度为90.89％。

对比例1

与实施例1不同之处在于，步骤(1)中萃取压力30MPa、萃取温度35℃得到对比元宝枫籽油D1#。

实施例4

与实施例1不同之处在于，步骤(1)中只使用一级分离，一级分离压力4MPa、一级分离温度40℃，得到元宝枫籽油4#。

对比例3

与实施例1不同之处在于，步骤(1)中的一级分离压力12MPa、一级分离温度40℃，得到对比元宝枫籽油D3#。

对比例4

与实施例1不同之处在于，步骤(2)中的皂化液不经过加入硫酸的步骤即制得对比油层分离物D1#。

对比例5

与实施例1不同之处在于，步骤(2)中的皂化液加入硫酸调节至pH为4，制得对比油层分离物D2#。

对比例6

与实施例1不同之处在于，步骤(3)中使用与聚酰胺等孔径、等重量的硅胶作为吸附剂，即制得对比粗品神经酸D1#。

对比例7

与实施例1不同之处在于，所述步骤(3)中的梯度洗脱方法中使用相同的方法但将乙醇置换成乙腈，制得对比粗品神经酸D2#。

对比例8

与实施例1不同之处在于，所述步骤(3)聚酰胺吸附柱层析分离：将步骤(2)中所得的油层分离物1#，采用聚酰胺树脂为填料，进行柱层析。选择一定粒径的聚酰胺作为吸附剂，用6倍聚酰胺树脂体积的70％乙醇洗脱；再用7倍聚酰胺树脂体积的50％乙醇洗脱，按照每个柱体积接一次洗脱液，合并收集目标成分主要集中的洗脱液得到对比粗品神经酸D3#。

对比例9

与实施例1不同之处在于，所述步骤(4)以60％的甲醇溶液，40％的水溶液作为洗脱剂进行洗脱，制得神经酸样品D1#。

实验例1

实施例1、实施例2、实施例3中由元宝枫籽1#、元宝枫籽2#、元宝枫籽3#分别制得的元宝枫籽油1#、元宝枫籽油2#和元宝枫籽油3#的收率进行测试，结果见表1。

对比例1、实施例4和对比例3中由元宝枫籽1#分别制得的对比元宝枫籽油D1#、和元宝枫籽油4#和对比元宝枫籽油D3#的收率进行测试，结果见表1。

表1超临界萃取元宝枫籽油的收率

由表1可知，实施例中的元宝枫籽油的收率高，可以高达49.5％，其中由元宝枫籽3#制得元宝枫油3#的收率最高。由对比元宝枫籽油D1#、对比元宝枫籽油D2#和元宝枫籽油4#的收率可知，本申请的萃取压力、采用两级分离的方式和具体的分离参数有利于提高元宝枫籽油的收率。

实验例2

对实施例1、实施例2、实施例3中的宝枫籽油1#、元宝枫籽油2#、元宝枫籽油3#经过预处理得到的油层分离物1#、油层分离物2#、油层分离物3#进行高压液相色谱分析，分别测试得到油层分离物1#、油层分离物2#、油层分离物3#中的神经酸的纯度，结果见表2。

对对比例4和对比例5中的宝枫籽油1#经过预处理得到的对比油层分离物D1#和对比油层分离物D2#进行高压液相色谱分析，分别测试得到对比油层分离物D1#和对比油层分离物D2#中的神经酸的纯度，结果见表2。

高压液相色谱分析条件：色谱柱：Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)；色谱条件：流动相：1％乙酸水(A)－甲醇(B)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；漂移管温度：60℃，柱温25℃。

表2元宝枫籽油预处理后油层分离物检测结果

由表2可知，测试油层分离物1#、油层分离物2#和油层分离物3#中的神经酸的纯度接近6％，其中油层分离物3#的纯度最高。由对比油层分离物D1#和对比油层分离物D2#的神经酸的纯度可知，皂化液酸化后有利于提高神经酸的提取率和分离率，且特定的pH有利于进一步提高神经酸的提取率和分离率。

实验例3

对实施例1、实施例2和实施例3中的油层分离物1#、油层分离物2#和油层分离物3#进行柱层析分离后制得的粗品神经酸1#、粗品神经酸2#和粗品神经酸3#进行高压液相色谱分析，分别测得粗品神经酸1#、粗品神经酸2#和粗品神经酸3#的神经酸的纯度(wt％)和收集段神经酸收率(wt％)，结果见表3。

收集段神经酸即洗脱液去除洗脱剂后的粗品神经酸。收集段神经酸纯度是指收集段中的神经酸的质量百分含量，收集段神经酸收率是指收集段中的神经酸的质量与加入吸附柱的油层分离物的质量百分比。

对对比例6、对比例7和对比例8中的油层分离物1#进行柱层析分离后制得的对比粗品神经酸D1#、对比粗品神经酸D2#和对比粗品神经酸D3#进行高压液相色谱分析，分别测得对比粗品神经酸D1#、对比粗品神经酸D2#和对比粗品神经酸D3#的神经酸的纯度，结果见表3。

高压液相色谱分析条件：色谱柱：Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)；色谱条件：流动相：1％乙酸水(A)－甲醇(B)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；漂移管温度：60℃，柱温25℃。

表3元宝枫籽油经聚酰胺吸附柱层析分离后检测结果

由表3可知，测试粗品神经酸1#、粗品神经酸2#和粗品神经酸3#中的神经酸的收率接近9％，神经酸的纯度高达38.2％，其中粗品神经酸3#的收率最高，粗品神经酸1#的纯度最高。由对比粗品神经酸D1#中的神经酸的纯度和收率可知，聚酰胺作为吸附剂有利于提高神经酸的纯度和收率；由对比粗品神经酸D2#、D3#的纯度和收率可知，洗脱液种类和洗脱方式有利于提高神经酸的纯度和收率。

实验例4

对实施例1、实施例2和实施例3中的粗品神经酸样品1#、粗品神经酸样品2#和粗品神经酸样品3#进行工业色谱纯化后制得的神经酸样品1#、神经酸样品2#和神经酸样品3#进行高压液相色谱分析，分别测得神经酸样品1#、神经酸样品2#和神经酸样品3#中神经酸的纯度和神经酸的转移率，结果见表4。

其中，收集段神经酸纯度是指神经酸样品中的神经酸的纯度，神经酸转移率是指神经酸样品中的神经酸质量与加入工业色谱中的粗品神经酸样品中的神经酸的质量比。

对比例9使用实施例1的粗品神经酸样品1#进行工业色谱纯化后制得对比神经酸样品D1#进行高压液相色谱分析，测得对比神经酸样品D1#中神经酸纯度和转移率，结果见表4。

高压液相色谱分析条件：色谱柱：Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)；色谱条件：流动相：1％乙酸水(A)－甲醇(B)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；漂移管温度：60℃，柱温25℃

表4经工业色谱纯化后检测结果

由表4可知，测试神经酸样品1#、神经酸样品2#和神经酸样品3#中的神经酸的纯度高达92.50％，其中神经酸样品1#的纯度最高。由对比神经酸样品D1#中的神经酸的纯度和收率可知，洗脱液种类和洗脱方式有利于提高神经酸的纯度和收率。

进一步地，从表1、表2、表3和表4中的数据可以看出，实施例中采用超临界CO₂萃取～聚酰胺吸附柱层析～工业色谱纯化成套新技术，能够从元宝枫籽中提取分离大于90％的神经酸，该工艺具有先进、稳定、效率高等优点。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种神经酸的提取方法，其特征在于，其包括下述步骤：

1)获得包含神经酸甘油酯的元宝枫籽油；

2)将所述元宝枫籽油与碱性醇溶液加热反应后，再加入水继续反应得到皂化液，调节皂化液至酸性，收集油层并水洗除杂得到油层分离物；

3)将所述油层分离物进行柱层析分离，所述柱层析分离的吸附剂包括聚酰胺树脂，洗脱剂包括乙醇，以乙醇浓度增加的方式梯度洗脱，收集含目标成分的洗脱液，去除洗脱剂得到粗品神经酸。

2.根据权利要求1所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤3)中的梯度洗脱方法包括步骤：以5～9倍吸附剂体积的30～60％乙醇洗脱，再以6～9倍吸附剂体积的65～85％乙醇洗脱并收集该段中包含目标成分的洗脱液；

优选地，所述步骤3)中的梯度洗脱方法包括步骤：以6～8倍吸附剂体积的50～60％乙醇洗脱，再以7～8倍吸附剂体积的70～80％乙醇洗脱并收集该段中包含目标成分的洗脱液。

3.根据权利要求2所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤3)还包括最后用6～7倍柱体积的90～95％乙醇洗脱以回收利用聚酰胺树脂。

4.根据权利要求1所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤3)中的所述聚酰胺树脂的粒径为80-120目。

5.根据权利要求1所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中：

所述碱性醇中的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱性醇中的醇为甲醇或乙醇；

所述加热反应的反应温度为50℃～90℃；和/或

所述调节皂化液为酸性的pH为1.5～3.5。

6.根据权利要求1所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：

A)在反应温度为60℃～90℃下配置浓度为0.8M～1.2M的氢氧化钠乙醇溶液后，加入所述元宝枫籽油在所述反应温度下反应至少40min；

B)向步骤A)制得的混合物中加入水，进行皂化反应至少5min；

C)使用稀硫酸调节皂化液的pH为1.5～3.5，分离油层，用水洗涤至洗涤液为中性即得到所述油层分离物。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中获得元宝枫籽油的步骤包括：将粉碎后的元宝枫籽在CO₂流量150～250L/h进行CO₂超临界萃取，萃取压力为38～45MPa，萃取温度35～50℃，随后进行一级分离，一级分离后的产物即为所述元宝枫籽油；

其中，所述一级分离压力4～10MPa和一级分离温度40～50℃。

8.根据权利要求7所述的神经酸的提取方法，其特征在于，超临界萃取的CO₂流量为190～220L/h，所述萃取压力为42MPa-45MPa，所述萃取温度为38～40℃；和

所述两级分离中的一级分离压力8.5～9.5MPa和一级分离温度40～45℃。

9.根据权利要求1～6中任一项所述的神经酸的提取方法，其特征在于，其还包括将所述粗品神经酸进行4)工业色谱提纯，所述工业色谱提纯步骤包括：将目标浓度的粗品神经酸样品进入工业色谱进样系统，工业色谱柱的固定相为C30，以含70％～100％甲醇的甲醇/水流动相进行等浓度洗脱，将收集的目标段的分离液脱去流动相溶剂即制得所述神经酸。

10.根据权利要求9所述的神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤4)中：

所述粗品神经酸样品中的粗品神经酸的浓度为90～110mg/mL；

工业色谱提纯使用的流动相为含85％～100％甲醇的甲醇/水流动；

将收集的目标段分离液在50-70℃减压浓缩回收溶剂脱去溶剂；和/或

所述神经酸的检测波长为210nm。

Images