CN115368353B

CN115368353B - 一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法

Info

Publication number: CN115368353B
Application number: CN202211064226.9A
Authority: CN
Inventors: 柏国清; 周军辉; 陈尘; 刘国宇; 鬲晓敏
Original assignee: XI'AN BOTANICAL GARDEN OF SHAANXI PROVINCE
Current assignee: XI'AN BOTANICAL GARDEN OF SHAANXI PROVINCE
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2042-08-31
Also published as: CN115368353A

Abstract

本发明提供一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，包括：将氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合物进行重结晶处理，得到氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶；将氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶以反相硅胶为固定相进行柱层析分离，以乙腈‑氨水为流动相进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，得到氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品；将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品进行重结晶，得到氧化苦参碱单体和/或氧化槐果碱单体。本发明方法可操作性好，重复性好，且不使用高危化学试剂，即可同时得到两种高纯度的产品。

Description

一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法

技术领域

本发明属于植物化学分离技术领域，涉及一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法。

背景技术

苦参为豆科植物苦参SophoraflavescensAit.的干燥根，始载于《神农本草经》，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效。

研究表明，苦参中的有效成分以喹诺里西啶类生物碱为主，主要有氧化苦参碱(Oxymatrine)、氧化槐果碱(Oxysophocarpine)、槐定碱(Sophoridine)、苦参碱(Matrine)和槐果碱(Sophocarpine)等，占总生物碱的90％左右。

氧化苦参碱分子式C₁₅H₂₄N₂O₂，分子量为264.36。研究表明氧化苦参碱具有广泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗心律失常等作用，还有升高白细胞、平喘、抗溃疡、抗纤维化以及镇静、催眠、镇痛等中枢神经药理作用。

氧化槐果碱分子式为C₁₅H₂₂N₂O₂，分子量为262.35。氧化槐果碱具有升高白细胞数，加强机体免疫力，起抗痢疾杆菌、皮肤真菌、阿米巴原虫、滴虫等感染以及利尿、平喘、催眠、抗心律失常等作用。

由于氧化苦参碱和氧化槐果碱的化学结构差异极小(结构式如下所示)，导致两者物化性质非常相似，因此氧化苦参碱和氧化槐果碱的分离纯化一直是苦参、苦豆子植物化学研究中的难点之一；尤其是当两者的混合物中含量接近时，更加难以分离和纯化。

传统上，氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离具有一定可行性的方法为：以正相硅胶G为分离载体，乙醚/氯仿-甲醇-氨水等正相溶剂系统洗脱，分部收集，可获得少量氧化苦参碱和氧化槐果碱单体成分。

上述方法存在的问题显而易见：1、洗脱溶剂中乙醚等溶剂具有高度危险性，且使用的混合溶剂和硅胶难以重复利用，洗脱周期长，工艺不易放大；2、由于采用正相分离的难度极高，所以上样量与硅胶用量的比例很大才能获得必要的分离效果，限制了每次分离得到的目标产物的产量不适合大量制备目标成分，成本较高；3、对操作者的要求较高，适用性较差，难以推广和利用。

发明内容

为了解决上述现有技术问题，本发明提供一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，本发明方法可操作性好，重复性好，且不使用高危化学试剂，即可同时得到两种高纯度的产品。

本发明通过以下技术方案实现：

一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，包括：

(1)混合物重结晶

将氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合物进行重结晶处理，得到氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶；

(2)反相柱层析分离

将氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶以反相硅胶为固定相进行柱层析分离，以乙腈-氨水为流动相进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，得到氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品；

(3)纯化

将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品进行重结晶，得到氧化苦参碱单体和/或氧化槐果碱单体。

优选的，步骤(1)中，所述重结晶处理具体是：将氧化苦参碱和/或氧化槐果碱的混合物溶于乙醇，分离，所得乙醇溶液进行浓缩，再加入丙酮，结晶，得到氧化苦参碱和/或氧化槐果碱的混合结晶。

优选的，步骤(2)中，乙腈-氨水具体为乙腈-0.01％氨水。

优选的，步骤(2)中，分部收集洗脱液后得到含氧化苦参碱的洗脱液和/或含氧化槐果碱的洗脱液，将含氧化苦参碱的洗脱液和/或含氧化槐果碱的洗脱液进行浓缩处理，再采用丙酮进行重结晶，分离所得结晶，得到氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品。

进一步的，步骤(2)中，分离所得结晶后剩余的母液再次进行重结晶，得到二次重结晶的氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品。

进一步的，步骤(2)中，将含氧化苦参碱的洗脱液和/或含氧化槐果碱的洗脱液进行浓缩处理具体是：洗脱液先真空浓缩后，再以非极性大孔树脂为吸附载体进行吸附，以乙醇为洗脱剂进行洗脱，所得洗脱液再进行真空浓缩。

优选的，步骤(3)中，将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品进行重结晶具体是：将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品用乙醇溶解后，过滤，所得乙醇溶液浓缩，采用丙酮进行重结晶，分离所得结晶，得到氧化苦参碱和/或氧化槐果碱。

进一步的，步骤(3)中，分离所得结晶后剩余的母液再次进行重结晶，得到二次重结晶的氧化苦参碱和/或氧化槐果碱。

进一步的，步骤(3)中，重结晶的温度控制在20℃-35℃，结晶时间为1-4小时。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，首先将氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物进行重结晶处理，得到氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶，可以去掉混合物中的其他杂质，使后续纯化处理的起始原料的化学组成具有一致性，保证了本发明方法在实际应用中具有良好的可重复性；其次，基于发明人的大量实验研究，首次建立了以反相硅胶为固定相，以乙腈-氨水为流动相的可大量分离氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的反相层析方法，充分利用了上述两种生物碱成分的物化性质和反向层析系统的特点，在一定的适用范围(即本发明优选的流动相和固定相系统下)，具有相对较高的上样量和分离度，所用分离载体和有机溶剂可回收后重复使用，不使用高危化学试剂，降低了生产成本和废弃物的产生及对操作环境的潜在危害，即可获得较高的回收率，并且操作简便快捷，适合目标成分单体的批量制备；再次，本发明通过重结晶进行纯化，可以将粗品经过重结晶得到纯度98％以上的氧化苦参碱和氧化槐果碱单体。本发明工艺流程短，操作可控性好，所得产品得率高，质量好，目标成分含量可达98％以上。

进一步的，本发明对分离结晶后剩余的母液再次进行重结晶，能提高产物收率，提高原料利用率。

进一步的，本发明利用目标成分在大孔树脂上具有一定的吸附能力，以非极性大孔树脂为吸附载体进行浓缩，可以有效提高浓缩效率，降低目标成分尤其是氧化槐果碱长时间加热过程可能导致的变化。

附图说明

图1为实施例1氧化苦参碱和氧化槐果碱混合结晶HPLC色谱图；

图2为实施例1反相层析所得氧化苦参碱粗品HPLC色谱图；

图3为实施例1反相层析所得氧化槐果碱粗品HPLC色谱图；

图4为实施例1纯化得到的氧化苦参碱HPLC色谱图；

图5为实施例1纯化所得氧化槐果碱HPLC色谱图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。

目前尚未见到采用反相硅胶系统分离纯化氧化苦参碱和氧化槐果碱的报道。

本发明氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)混合物重结晶

将来源于如苦豆子或苦参等的氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物，采用常规溶剂重结晶处理，得到氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶，所得混合物结晶采用高效液相色谱法检测，氧化苦参碱和氧化槐果碱的含量比例为55％～50％：45％～50％。

本步骤的目的是采用常规方法进行重结晶处理后，可以进一步去掉混合物中的其他杂质，使后续纯化处理的起始原料的化学组成具有一致性，保证了本发明方法在实际应用中具有良好的可重复性。由于上述两种成分溶解性基本相同，均易溶解于乙醇等极性溶剂，在丙酮中溶解度较小，因此重结晶溶剂优选丙酮。

重结晶过程为：逐步加入少量乙醇，同时加热，直至加入乙醇后固体物不再明显减少为止，趁热过滤，滤液真空浓缩至小体积后，再加入3～5倍量丙酮，间断搅拌，即可得到上述两种生物碱的混合结晶产物，产物为类白色。

(2)反相柱层析分离

将上述混合结晶用10％乙腈-水溶解，过滤，得到上样液，以C₁₈反相填料为固定相进行柱层析分离，优选10-50μm耐纯水反相硅胶为分离载体；再以乙腈和氨水为流动相进行梯度洗脱，同时进行HPLC检测并分部收集洗脱液，分别得到含氧化苦参碱的洗脱液和氧化槐果碱的洗脱液；优选乙腈(A相)-0.01％氨水(B相)，0-10min A相为10％，收集主要含氧化苦参碱的洗脱液，10min-20minA相从10％→15％，收集主要含氧化槐果碱的洗脱液，至氧化槐果碱洗脱基本完毕后恢复A相至10％；流动相梯度为线性变化；在线检测采用紫外检测器，优选紫外检测参考波长为220nm和254nm；含氧化苦参碱的洗脱液和氧化槐果碱的洗脱液先真空浓缩回收乙腈后再分别进行浓缩，浓缩处理优选以非极性大孔树脂为吸附载体，以乙醇等极性溶剂洗脱，洗脱液分别浓缩，参考步骤(1)重结晶方法采用丙酮重结晶，分别得到氧化苦参碱粗品和氧化槐果碱粗品，重结晶分离后的母液可以分别再次重结晶。

(3)纯化

将上述氧化苦参碱粗品和氧化槐果碱粗品分别用乙醇溶解后，过滤，乙醇溶液浓缩，分别采用丙酮进行重结晶处理，重结晶温度控制在20℃-35℃，结晶时间为1-4小时，优选重结晶温度20℃，结晶时间3小时。抽滤结晶，烘干，即得到纯度在98％以上的氧化苦参碱和氧化槐果碱并进行HPLC检测，母液浓缩后又可得到少量目标产物，如纯度未达到要求，可再行重结晶处理。

本发明中氧化苦参碱和氧化槐果碱的分离纯化过程中的HPLC检测条件如下：

HPLC色谱仪为Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪，配备LC-20AT双泵，SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器，LabSolution工作站等；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.01％氨水溶液；检测波长分别为220nm；体积流量为1mL/min；柱温35℃；进样量10μL。

实施例1

1、混合物重结晶：取主要含氧化苦参碱和氧化槐果碱的原料100g，粉碎成10～60目的粗粉，加入适量乙醇溶解，抽滤，滤液真空浓缩去除乙醇后，逐步加入丙酮，至有少量结晶析出为止，静置过夜析晶，抽滤，烘干，得类白色氧化苦参碱和氧化槐果碱混合结晶，HPLC检测结果如图1。

2、反相柱层析分离：取上述混合结晶60g，用10％乙腈-水溶液溶解至250mL，抽滤，得到上样液。每次吸取约40mL上样液进DAC-HB 80动态轴向压缩柱纯化系统进行制备性分离，制备色谱条件为：固定相为20μm粒径C₁₈反相硅胶，梯度洗脱；流动相的组成为乙腈(A相)-0.01％氨水(B相)，0-10min，10％A相，10min-20min A相从10％→15％，至氧化槐果碱洗脱基本完毕后恢复A相至10％，流动相梯度为线性变化；紫外检测器采用220nm和254nm双波长检测。分部收集，合并纯度85％以上部分，以非极性大孔树脂为吸附载体进行脱盐处理，以乙醇溶剂洗脱，洗脱液真空浓缩并进行丙酮重结晶处理，共得到纯度为96.1％的氧化苦参碱粗品和95.3％的氧化槐果碱粗品各20.8g和22.0g，氧化苦参碱粗品的HPLC检测结果如图2，氧化槐果碱粗品的HPLC检测结果如图3，重结晶分离后的母液分别再次重结晶，又可得到纯度分别为93.2％和92.5％的氧化苦参碱粗品3.6g和氧化槐果碱粗品2.8g。

3、纯化：将上述氧化苦参碱粗品和氧化槐果碱粗品分别溶于适量乙醇中，60℃水浴加热促溶，过滤，乙醇溶液真空浓缩后，逐步加入5倍量丙酮并加热使其溶解，待溶液澄清后，将盛有溶液的容器超声1min左右至溶液稍显浑浊，取出容器并室温静置2h，间断搅拌，抽滤，烘干，分别得到18.5g氧化苦参碱单体成分和20.5g氧化槐果碱单体成分，氧化苦参碱单体成分的HPLC检测结果如图4，氧化槐果碱单体成分的HPLC检测结果如图5。

采用所述HPLC色谱条件检测，氧化苦参碱单体成分和氧化槐果碱单体成分纯度分别为98.6％和99.2％。

本实施例所得HPLC典型色谱图见附图1、2、3、4、5，其中保留时间为10.7min左右的峰为氧化苦参碱的色谱峰，保留时间11.3左右的峰为氧化槐果碱的色谱峰。

实施例2

1、混合物重结晶：取主要含氧化苦参碱和氧化槐果碱的原料100g，粉碎成10～60目的粗粉，加入适量乙醇溶解，抽滤，滤液真空浓缩去除乙醇后，逐步加入丙酮，至有少量结晶析出为止，静置过夜析晶，抽滤，烘干，得类白色氧化苦参碱和氧化槐果碱混合结晶。

2、反相柱层析分离：取上述混合结晶60g，用10％乙腈-水溶液溶解至250mL，抽滤，得到上样液。每次吸取约30mL上样液进DAC-HB 80动态轴向压缩柱纯化系统进行制备性分离，制备色谱条件为：固定相为20μm粒径C₁₈反相硅胶，梯度洗脱；流动相的组成为乙腈(A相)-0.01％氨水(B相)，0-10min，10％A相，10min-20min A相从10％→15％，至氧化槐果碱洗脱基本完毕后恢复A相至10％，流动相梯度为线性变化；紫外检测器采用220nm和254nm双波长检测。分部收集，合并纯度90％以上部分，以非极性大孔树脂为吸附载体进行脱盐处理，以乙醇溶剂洗脱，洗脱液真空浓缩并进行丙酮重结晶处理，共得到纯度为97.2％的氧化苦参碱粗品和96.4％的氧化槐果碱粗品各19.8g和21.5g。

3、纯化：将上述氧化苦参碱粗品和氧化槐果碱粗品分别溶于适量乙醇中，60℃水浴加热促溶，过滤，乙醇溶液真空浓缩后，逐步加入7倍量丙酮并加热使其溶解，待溶液澄清后，将盛有溶液的容器超声1min至溶液稍显浑浊，取出容器并室温静置4h，间断搅拌，抽滤，烘干，分别得到18.2g氧化苦参碱单体成分和20.1g氧化槐果碱单体成分。

采用所述HPLC色谱条件检测，氧化苦参碱单体成分和氧化槐果碱单体成分纯度分别为98.1％和98.3％。

实施例3

2、反相柱层析分离：取上述混合结晶80g，用10％乙腈-水溶液溶解至300mL，抽滤，得到上样液。每次吸取约60mL上样液进DAC-HB 80动态轴向压缩柱纯化系统进行制备性分离，制备色谱条件为：固定相为20μm粒径C₁₈反相硅胶，梯度洗脱；流动相的组成为乙腈(A相)-0.01％氨水(B相)，0-10min，10％A相，10min-20min A相从10％→15％，至氧化槐果碱洗脱基本完毕后恢复A相至10％，流动相梯度为线性变化；紫外检测器采用220nm和254nm双波长检测。分部收集，合并纯度85％以上部分，以非极性大孔树脂为吸附载体进行脱盐处理，以乙醇溶剂洗脱，洗脱液真空浓缩并进行丙酮重结晶处理，共得到纯度为96.5％的氧化苦参碱粗品和95.1％的氧化槐果碱粗品各20.4g和21.9g。

3、纯化：将上述氧化苦参碱粗品和氧化槐果碱粗品分别溶于适量乙醇中，70℃水浴加热促溶，过滤，乙醇溶液真空浓缩后，逐步加入5倍量丙酮并加热使其溶解，待溶液澄清后，将盛有溶液的容器超声1min至溶液稍显浑浊，取出容器并室温静置1h，间断搅拌，抽滤，烘干，分别得到17.2g氧化苦参碱单体成分和19.0g氧化槐果碱单体成分。

本发明方法使用可重复利用的反相硅胶和有机溶剂，将物化性质相似的氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合物进行分离，再通过重结晶进一步纯化，获得98％以上的氧化苦参碱和氧化槐果碱，可操作性好，所得产品纯度高，经济性好。

Claims

1.一种氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，其特征在于，包括：

（1）将氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合物进行重结晶处理，得到氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶；

（2）将氧化苦参碱和氧化槐果碱的混合结晶以反相硅胶为固定相进行柱层析分离，以乙腈-氨水为流动相进行梯度洗脱，在线检测采用紫外检测器，紫外检测器采用220nm和254nm双波长检测，分部收集洗脱液，得到氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品；

（3）将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品进行重结晶，得到氧化苦参碱单体和/或氧化槐果碱单体；

步骤（1）中，所述重结晶处理具体是：将氧化苦参碱和/或氧化槐果碱的混合物溶于乙醇，分离，所得乙醇溶液进行浓缩，再加入丙酮，结晶，得到氧化苦参碱和/或氧化槐果碱的混合结晶；

步骤（2）中，乙腈-氨水具体为乙腈-0.01%氨水；

步骤（3）中，将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品进行重结晶具体是：将氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品用乙醇溶解后，过滤，所得乙醇溶液浓缩，采用丙酮进行重结晶，分离所得结晶，得到氧化苦参碱和/或氧化槐果碱。

2.根据权利要求1所述的氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，分部收集洗脱液后得到含氧化苦参碱的洗脱液和/或含氧化槐果碱的洗脱液，将含氧化苦参碱的洗脱液和/或含氧化槐果碱的洗脱液进行浓缩处理，再采用丙酮进行重结晶，分离所得结晶，得到氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品。

3.根据权利要求2所述的氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，分离所得结晶后剩余的母液再次进行重结晶，得到二次重结晶的氧化苦参碱粗品和/或氧化槐果碱粗品。

4.根据权利要求2所述的氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，将含氧化苦参碱的洗脱液和/或含氧化槐果碱的洗脱液进行浓缩处理具体是：洗脱液先真空浓缩后，再以非极性大孔树脂为吸附载体进行吸附，以乙醇为洗脱剂进行洗脱，所得洗脱液再进行真空浓缩。

5.根据权利要求1所述的氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，分离所得结晶后剩余的母液再次进行重结晶，得到二次重结晶的氧化苦参碱和/或氧化槐果碱。

6.根据权利要求1所述的氧化苦参碱和氧化槐果碱混合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，重结晶的温度控制在20℃-35℃，结晶时间为1-4小时。