CN111450574B - 一种用于纯化他克莫司的层析柱及他克莫司的纯化方法 - Google Patents

Abstract

发明人提供了两种用于纯化他克莫司的层析柱及其纯化方法，在层析柱中，由于上层的层析介质中混杂了石墨烯，石墨烯中具有的共轭π电子，可以吸附他克莫司侧链上的存在不饱和π键的烯烃结构，而他克莫司的两个主要类似物杂质：二氢他克莫司和子囊霉素，在并没有烯烃或其他不饱和π键结构，可被层析柱分离。同时还能通过本发明的纯化方法在层析柱上分离色素以及他克莫司另外一个微量同系杂质8‑epi tacrolimus，该杂质的结构和他克莫司一样，有同样的侧链，但侧链上是手性翻转的，解决了行业内的技术难题。

Description

一种用于纯化他克莫司的层析柱及他克莫司的纯化方法

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种用于纯化他克莫司的层析柱及他克莫司的纯化方法。

背景技术

他克莫司是一种新型强效的大环内酯类免疫抑制剂，最早由日本藤泽药品工业公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分离到的筑波霉菌的发酵液中提取得到；1989年他克莫司首次应用于临床肝脏移植；1991年日本开发的名为普乐可复(Prograf)他克莫司胶囊剂和注射剂正式上市，用于原发性肝移植和肾移植的排斥反应治疗，后又被批准用于骨髓移植。目前他克莫司制剂已在日本、美国、英国、德国、加拿大、丹麦、法国、意大利、西班牙、爱尔兰等80多个国家上市，广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏和肺等实体器官移植后的抗排异治疗。1999年他克莫司软膏投放日本市场，用于治疗成人的特应性皮炎。此外，他克莫司对牛皮癣、银屑病、鱼鳞病、糖尿病、白塞氏病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及多发性硬化病等自身免疫病有疗效。

他克莫司粗品主要来源于发酵产品，发酵过程同时也产生了多个他克莫司类似物，包括二氢他克莫司和子囊霉素。目前主要使用硝酸银的银离子或者大孔吸附树脂结构对这三个主要物质进行分离层析，已有多份专利对此进行了报道和研究，但这两种方法纯化效率不高，需要多步分离纯化，耗材昂贵其需消耗大量溶剂且操作步骤繁琐、价格相对昂贵。

同时，他克莫司还有一种杂质(8-epi tacrolimus)，该杂质结构和他克莫司有同样结构，只是在侧链的不饱和烯烃上是手性翻转的，用常规层析法也难以分离，一直是他克莫司纯化的难点所在。此外发酵提取过程产生的不稳定的同系物杂质，也需要通过层析或者结晶进行分离纯化，但结晶对于一些同系物杂质去除能力有限。

发明内容

为此，需要提供一种他克莫司粗品的纯化方法，不仅能够获得高纯度的他克莫司，且具有较高的纯化收率，从而可降低他克莫司的纯化成本。

为实现上述目的，发明人提供了一种用于纯化他克莫司的层析柱以及使用该层析柱的他克莫司的纯化方法。具体为：

一种用于纯化他克莫司的层析柱，所述层析柱的上部填充第一石墨烯混合介质填料，所述层析柱的下部填充第一层析介质填料；所述层析柱的下部高度占层析柱高的5-10％，所述层析柱的直径与高度比为1:5-25；

所述第一石墨烯混合介质填料为1-50重量份石墨烯粉末和100重量份的第一层析介质填料混合制备，所述石墨烯粉末的粒度为500-5000目，所述第一层析介质填料为层析硅胶或氧化铝。

一种他克莫司的纯化方法，包括以下步骤：

第一待分离液的制备：将他克莫司粗品溶解于乙酸乙酯后，加入非极性烷烃或石油醚，制成第一待分离液；

上样：将第一待分离液上样上述的层析柱，形成含有他克莫司的第一层析柱；

洗脱：用第一洗脱溶剂对第一层析柱进行梯度洗脱，所述第一洗脱溶剂由非极性烷烃或石油醚与乙酸乙酯混合配制，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

进一步地，所述第一待分离液的制备步骤中，所述他克莫司粗品和乙酸乙酯的质量比为1:4-8；加入非极性烷烃或石油醚的体积为乙酸乙酯体积的15-25％。

进一步地，上样步骤中，所述第一待分离液的添加量为10-40g/L层析柱体积。

进一步地，洗脱步骤中，所述第一洗脱溶剂中，非极性烷烃或石油醚与乙酸乙酯的质量比为1-5:1；洗脱流速为每小时1-6个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测。

发明人还提供了另一种用于纯化他克莫司的层析柱以及使用该层析柱的他克莫司的纯化方法。具体为：

一种用于纯化他克莫司的层析柱，所述层析柱的上部填充第二石墨烯混合介质填料，所述层析柱的下部填充第二层析介质填料；所述层析柱的下部高度占层析柱高的5-10％，所述层析柱的直径与高度比为1:10-25；

所述第二石墨烯混合介质填料包括1-50重量份石墨烯粉末和100重量份的第二层析介质填料，所述石墨烯粉末的粒度为500-5000目，所述第二层析介质填料为十八烷基键合硅胶、辛烷键合硅胶或苯基键合硅胶。

一种他克莫司的纯化方法，包括以下步骤：

第二待分离液的制备：将他克莫司粗品溶解于乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液，再加入水进行搅拌稀释，制成第二待分离液；

上样：将第二待分离液上样上述的层析柱，形成含有他克莫司的第二层析柱；

洗脱：用第二洗脱溶剂对第二层析柱进行梯度洗脱，所述第二洗脱溶剂由水与乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液混合配制，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

进一步地，第二待分离液的制备步骤中，所述他克莫司粗品与乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液的质量比为1:4-8；加入水的体积为乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液体积的15-25％。

进一步地，上样步骤中，所述第二待分离液的添加量为10-40g/L层析柱体积。

进一步地，洗脱步骤中，所述第二洗脱溶剂中，水与乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液的质量比为10-11:9-20；洗脱流速为每小时1-6个柱体积，跟踪监测纯度。

区别于现有技术，上述技术方案中提供了两种他克莫司纯化方法及用于纯化他克莫司的层析柱。在层析柱中，由于上层的层析介质中混杂了石墨烯，石墨烯中具有的共轭π电子，可以吸附他克莫司侧链上的存在不饱和π键的烯烃结构，而他克莫司的两个主要类似物杂质：二氢他克莫司和子囊霉素，在并没有烯烃或其他不饱和π键结构，可被层析柱分离。同时还能通过本发明的纯化方法在层析柱上分离色素以及他克莫司另外一个微量同系杂质8-epi tacrolimus，该杂质的结构和他克莫司一样，有同样的侧链，但是在那侧链上是手性翻转的，解决了行业内的技术难题。

附图说明

图1为具体实施方式技术所述纯化前他克莫司粗品的HPLC图；

图2为实施例1氧化铝正向洗脱法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图3为实施例2硅胶正向洗脱法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图4为实施例3十八烷基键合硅胶反向洗脱法纯化所得的他可莫司HPLC图；

图5为背景技术所述的硝酸银法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图6为背景技术所述的大孔树脂吸附法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图7为他克莫司粗品在安捷伦色谱柱条件进行纯度分析检测的HPLC图；

图8为实施例1中纯化的他克莫司样品进一步结晶后在安捷伦色谱柱条件进行纯度检测，晶体的HPLC。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

本发明具体实施方式中，所用的他克莫司粗品为他克莫司发酵菌丝醇提取物萃取浓缩后粗结晶样品，其HPLC图如图1所示。其中RTFK506＝18.5min,RTAC＝16.5min，RT2HFK506＝20.5min。色谱柱条件：Kromsil CN 4.6*250mm，5μm，流动相35％乙腈：0.1％磷酸水，流速1.5ml/min，柱温40℃；RT＝13.5min和RT＝15min是异构体峰，在溶液里样品互变异构出来的成分。

对比实施例1：

背景技术所述的硝酸银法纯化他克莫司粗品，其HPLC图如图5所示。由图中可见，RT＝21.5min洗脱液中含有较多，8epi-tacrolimus杂质。对比实施例2

背景技术所述的大孔吸附树脂纯化他克莫司粗品时，其中含有他克莫司交叉部分杂质较多的样品，HPLC图如图6所述。由图中可见，该方法对他克莫司的纯化收率效果较差，目标物损失比较大。

实施例1：层析柱制备及他克莫司粗品纯化

1、层析柱制备

将25重量份粒度为3000-5000目石墨烯粉末加水搅拌均匀制成石墨烯悬浮液；

将石墨烯悬浮液加入100重量份粒度为200-500目氧化铝，混合均匀后在90℃下烘干制得石墨烯混合介质填料；

在层析柱的下部填充粒度为200-500目氧化铝，层析柱的下部高度占层析柱高的8％，在层析柱的上部填充石墨烯混合介质填料，所述层析柱的直径与高度比为1:15。

2、他克莫司粗品纯化

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于6质量份的乙酸乙酯得到含他克莫司的溶液，再加入20％乙酸乙酯体积的己烷溶剂，搅拌稀释后制成待分离液；

上样：将待分离液上样实施例1制备的层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为30g/L柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由己烷和乙酸乙酯按照3:1的质量比配制，洗脱流速为每小时3个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。所述洗脱溶剂由己烷和乙酸乙酯按照4:1和3:1的质量比配制，其中4:1的配比的洗脱溶剂洗脱5个柱体积后，改为3:1的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时3个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例1制备的层析柱进行他克莫司纯化后的HPLC图见图2。

实施例2：层析柱制备及他克莫司粗品纯化

1、层析柱制备：

将10重量份粒度为1000-3000目石墨烯粉末加浓度为50wt％乙醇水溶液搅拌均匀制成石墨烯悬浮液；

将石墨烯悬浮液加入粒度为200-500目的硅胶，混合均匀后在100℃下烘干2-5小时制得石墨烯混合介质填料；

在层析柱的下部填充粒度为200-500目硅胶，层析柱的下部高度占层析柱高的5％，在层析柱的上部填充石墨烯混合介质填料，所述层析柱的直径与高度比为1:25。

2、粗品纯化

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于4质量份的乙酸乙酯得到含他克莫司的溶液，再加入15％乙酸乙酯体积的石油醚溶剂，搅拌稀释后制成待分离液；

上样：将待分离液上样制备的层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为10g/L柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由石油醚和乙酸乙酯按照4:1和3:1的质量比配制，其中4:1的配比的洗脱溶剂洗脱4个柱体积后，改为3:1的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时4个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例2制备的层析柱进行他克莫司纯化后的HPLC图见图3。

实施例3层析柱制备及他克莫司粗品纯化

1、层析柱制备

将30重量份粒度为3000-5000目石墨烯粉末加入100重量份粒度为200-500目十八烷基键合硅胶混合均匀得到石墨烯混合介质填料；

在层析柱的下部填充十八烷基键合硅胶，层析柱的下部高度占层析柱高的8％，在层析柱的上部填充石墨烯混合介质填料，所述层析柱的直径与高度比为1:15。

2、他克莫司粗品的纯化

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于5质量份的乙醇得到含他克莫司的溶液，加入20％乙醇体积的水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样实施例3的层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为30g/L层析柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由水和乙醇按照1:1和2：3的质量比配制，其中1:1的配比的洗脱溶剂洗脱8个柱体积后，改为2：3的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时3个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例3制备的层析柱进行克莫司纯化后的HPLC图见图4。

实施例4层析柱制备及他克莫司粗品纯化

1、层析柱的制备：

粒度为1000-2000目的石墨烯材料加入粒度为300-500目苯基键合硅胶，混合均匀后制得石墨烯混合填料；所述混合填料中的石墨烯和苯基键合硅胶的重量比为10:100；

层析柱的下部填充苯基键合硅胶,所述层析柱的上部填充石墨烯混合苯基键合硅胶填料，所述层析柱下部高度为层析柱总高的5％，层析柱的直径与高度比例为1:25。

2、他克莫司的纯化

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于8质量份的丙酮得到含他克莫司的溶液，加入25％丙酮体积的水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为40g/L层析柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由水和丙酮按照1:1、2：3的质量比配制，其中1：1的配比的洗脱溶剂洗脱10个柱体积后，改为2：3的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时6个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例7层析柱制备及他克莫司粗品纯化

1、层析柱的制备：

粒度为3000-5000目的石墨烯材料加入粒度为300-500目辛烷基键合硅胶，混合均匀后制得石墨烯混合填料；所述混合填料中的石墨烯和辛烷基键合硅胶的重量比为40:100；

层析柱的下部填充辛烷基键合硅胶,所述层析柱的上部填充石墨烯混合辛烷基键合硅胶填料，所述层析柱下部高度为层析柱总高的10％，层析柱的直径与高度比例为1:5。

2、他克莫司的纯化

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于4质量份的甲醇得到含他克莫司的溶液，加入15％甲醇体积的水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为10g/L层析柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由水和甲醇按照55：45和45：55的质量比配制，其中55：45的配比的洗脱溶剂洗脱6个柱体积后，改为45：55的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时2个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

本发明具体实施方式中，所用的他克莫司粗品的另一色谱柱进行纯度检测的HPLC图如图7所示。其中色谱柱条件为：Agilent ZORBAX SB CN 4.6*250mm，5μm，流动相35％乙腈：65％(0.1％磷酸)水，流速1.8ml/min，柱温：40℃；检测结果：RTFK506＝34.1min,RTAC＝30.0min，RT2H＝41.9min，Rt8epi＝44.1min，Rtiso1＝21.8min，Rtiso2＝25.5min。

将实施例1中纯化的他克莫司样品进一步结晶后再进行纯度检测，晶体的HPLC图如图8所示，异构体基本已被去除，得到可应用于医药工业的99％以上纯度的他克莫司晶体。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (2)

1.一种他克莫司的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一待分离液的制备：将他克莫司粗品溶解于乙酸乙酯后，加入非极性烷烃或石油醚，制成第一待分离液；

上样：将第一待分离液上样层析柱，形成含有他克莫司的第一层析柱；

洗脱：用第一洗脱溶剂对第一层析柱进行梯度洗脱，所述第一洗脱溶剂由非极性烷烃或石油醚与乙酸乙酯混合配制，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液；

所述第一待分离液的制备步骤中，所述他克莫司粗品和乙酸乙酯的质量比为1:4-8；加入非极性烷烃或石油醚的体积为乙酸乙酯体积的15-25％；

上样步骤中，所述第一待分离液的添加量为10-40g/L层析柱体积；

洗脱步骤中，所述第一洗脱溶剂中，非极性烷烃或石油醚与乙酸乙酯的质量比为1-5:1；洗脱流速为每小时1-6个柱体积，跟踪监测纯度；

所述层析柱分为上部和下部，所述层析柱的下部填充第一层析介质填料，所述层析柱的上部填充第一混合填料，所述层析柱下部第一层析介质填料高度占层析柱总填料高的5-10％，所述层析柱的直径与高度比为1:5-25；

所述第一层析介质填料为粒度为200-500目的层析硅胶或氧化铝；所述第一混合填料为1-50重量份石墨烯粉末与100重量份的第一层析介质填料混合制备；所述石墨烯粉末的粒度为500-5000目；

所述他克莫司粗品为他克莫司发酵菌丝醇提取物萃取浓缩后粗结晶样品；样品组分包括他克莫司、二氢他克莫司、子囊霉素和8-epi tacrolimus。

2.一种他克莫司的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

第二待分离液的制备：将他克莫司粗品溶解于乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液，再加入水进行搅拌稀释，制成第二待分离液；

上样：将第二待分离液上样层析柱，形成含有他克莫司的第二层析柱；

洗脱：用第二洗脱溶剂对第二层析柱进行梯度洗脱，第二洗脱溶剂由水与乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液混合配制，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液；

第二待分离液的制备步骤中，所述他克莫司粗品与乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液的质量比为1:4-8；加入水的体积为乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液体积的15-25％；

上样步骤中，所述第二待分离液的添加量为10-40g/L层析柱体积；

洗脱步骤中，所述第二洗脱溶剂中，水与乙醇、丙酮、甲醇或乙腈溶液的质量比为10-11:9-20；洗脱流速为每小时1-6个柱体积，跟踪监测纯度；

所述层析柱分为上部和下部，所述层析柱的下部填充第二层析介质填料，所述层析柱的上部填充第二混合填料；所述层析柱下部第二层析介质填料高度占层析柱填料总高的5-10％，所述层析柱的直径与高度比为1:10-25；

所述第二层析介质填料为粒度为200-500目的十八烷基键合硅胶、辛烷键合硅胶、氰基键合硅胶或苯基键合硅胶，所述第二混合填料包括1-50重量份石墨烯粉末和100重量份的第二层析介质填料，所述石墨烯粉末的粒度为500-5000目；

所述他克莫司粗品为他克莫司发酵菌丝醇提取物萃取浓缩后粗结晶样品；样品组分包括他克莫司、二氢他克莫司、子囊霉素和8-epi tacrolimus。

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