CN102936253A

CN102936253A - 一种高纯度他克莫司的制备方法

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Publication number: CN102936253A
Application number: CN2012104474775A
Authority: CN
Inventors: 张雪霞; 段宝玲; 任风芝; 李宁; 陈书红; 刘进怀; 李晓露; 李丽红; 成晓迅; 林毅; 王海燕; 张艳立; 朱秀良; 董爱华
Original assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-11-12
Also published as: CN102936253B

Abstract

本发明公开了一种高纯度他克莫司的制备方法。该方法包括将他克莫司菌丝浸提液通过大孔脱色树脂脱色，然后将他克莫司脱色液导入大孔吸附树脂柱进行吸附、解吸，浓缩解吸液后得到含有他克莫司的粗提物，粗提物用极性溶剂溶解，使用聚合物纳米微球对其进行层析分离，再浓缩结晶干燥即得到高纯度的他克莫司产品。本发明的制备高纯度他克莫司的方法工艺简单、质量可靠，收率高，可以达到70%以上，溶剂消耗少，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料的生产。

Description

一种高纯度他克莫司的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及药品原料的制备方法，具体涉及到一种从发酵菌丝体中分离纯化他克莫司的制备方法。

背景技术

他克莫司（tacrolimus），又名FK506，是一种从筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）产生的23元环的大环内酯类的免疫抑制剂，分子式为C₄₄H₆₉NO₁₂，分子量为804.02，结构式如下：

Figure 2012104474775100002DEST_PATH_IMAGE001

他克莫司为白色结晶，熔点127～129℃，旋光度-84.4°(c=1.02，三氯甲烷)。溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚，难溶于己烷或石油醚，不溶于水。

他克莫司具有抑制抗体的产生和移植物的排斥作用及白细胞介素IL-2、IL-3和干扰素IFN-r的产生（海峡药学，2010，22(11)：148～150）。他克莫司的免疫抑制作用比环孢素A(CsA)强50～100倍（中华器官移植杂志，2000，21(4)：245～247），因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治疗费用1/3～1/2，同时不良反应也明显降低，用于心脏、肺脏移植有很好效果。

美国专利US2006142565报道了一种纯化他克莫司的方法，该方法将他克莫司的提取液通过XAD1180树脂三次纯化后，收集他克莫司纯度高的部分，用乙酸乙酯萃取后浓缩，加入乙酸乙酯、环己烷和水进行结晶，并重复结晶2～3次，得到HPLC纯度为99.84%的他克莫司产品，收率仅为32.6%。该方法步骤繁琐，需用树脂进行3次纯化后，再用溶剂结晶2～3次，收率很低。

Lee等（Lee S Y, et al. J Microbinl.Bintechnol. 1997，7，278～281）报道了他克莫司发酵液用二氯甲烷萃取，萃取液浓缩后再用乙酸乙酯结晶。该方法的缺点是萃取剂二氯甲烷不但毒性大，而且沸点低，萃取剂回收率低，造成生产成本较高。Arai（ ARAI M.. J. Antibint. Ser.A 1959，13，46～56）描述了一种他克莫司的制备方法，用丙酮萃取发酵液后将萃取液浓缩，得到他克莫司的粗晶体，然后再用甲醇对他克莫司的粗晶体的溶液结晶。该方法的缺点是他克莫司在甲醇溶液中非常容易生成11,11’-二甲氧基他克莫司，造成结晶收率低，杂质含量高。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种高纯度的他克莫司的制备工艺，该方法工艺简单、质量可靠，收率高，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料的生产。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种高纯度他克莫司的制备方法，包括以下步骤

1）用体积百分浓度为80～95%的极性溶液对他克莫司发酵液分离所得的菌丝体进行浸泡，然后再对浸泡液进行固液分离得到他克莫司浸提液，

2）再将此他克莫司浸提液用水稀释至极性溶液体积百分浓度为25%～40%，然后将稀释后的浸提液通过大孔脱色树脂柱进行脱色处理，得他克莫司脱色液；

3）将他克莫司脱色液导入大孔吸附树脂柱进行吸附，然后用极性溶剂与水的混合溶液对大孔吸附树脂柱进行梯度解吸，得到他克莫司一次解吸液；

4）浓缩一次解吸液，并用乙酸乙酯或者乙酸丁酯萃取，然后分液并浓缩乙酸乙酯相或者乙酸丁酯相，得到他克莫司粗提物；

5）将他克莫司粗提物用极性溶剂溶解，注入纳米聚合物微球层析柱；

6）使用极性溶剂与水的混合液对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸，并分段收集他克莫司解吸液，将浓度大于98.5%的他克莫司解吸液合并，得他克莫司二次解吸液；

7）将上述二次解吸液浓缩并加入有机溶剂结晶，然后固液分离干燥后即得到他克莫司精粉。

本发明的进一步改进在于：所述步骤1）的浸泡过程中每千克菌丝体加入2～4升85～95%的极性溶液。

本发明的进一步改进在于：所述步骤2）脱色处理中所使用的大孔脱色树脂柱为LX-900或者LSA-700大孔脱色树脂柱；所述步骤3）中大孔吸附树脂柱为XF-800或者D101大孔吸附树脂柱。

本发明的进一步改进在于：所述步骤3）中对大孔吸附树脂柱进行梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的体积百分浓度分别为40～50%和80%～90%

本发明的进一步改进在于：所述步骤6）中对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的体积百分浓度分别为45～55%和80%～85%。

本发明所述极性溶剂的进一步限定在于：所述极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇的其中一种。

本发明的进一步改进在于：所述纳米聚合物微球层析柱中的纳米聚合物微球是纳米聚苯乙烯微球或者纳米聚苯乙烯衍生物微球。

本发明的上述技术方案的进一步改进在于：所述聚合物纳米微球为PS-30型纳米聚合物微球或PSA-30型纳米聚合物微球。

本发明的进一步改进在于：所述步骤7）中的有机溶剂为丙酮或乙酸丁酯，丙酮或乙酸丁酯的加入量为浓缩后的二次解吸液体积的2～8倍。

本发明的进一步改进在于：所述步骤7）中的二次解吸液浓缩后的他克莫司浓度为120mg/mL～150mg/mL。

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：

本发明的制备高纯度他克莫司的方法工艺简单、质量可靠，收率高，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料。本发明的方法中通过使用大孔脱色树脂对他克莫司浸提液进行脱色，可以有效去除他克莫司浸提液中大部分的色素，提高浸提液的澄清度和质量。通过再次使用大孔吸附树脂对他克莫司进行富集和纯化，进一步摒弃了发酵过程中所产生的次级代谢产物的干扰，提高目的产物的质量。再通过使用纳米聚合物微球分离纯化他克莫司，可大幅度提高产品的纯度。大孔吸附树脂与纳米聚合物微球解吸过程均采用非连续的梯度解吸法，低浓度的解吸剂可除去大部分色素和强极性杂质，之后采用高浓度的解吸剂解吸，使解吸液的质量得到大幅的提高。利用本发明的方法所得的他克莫司纯度可达99.5%以上，全程总收率大于70%。

本发明的方法通过使用定量的高浓度的极性溶液对他克莫司菌丝体进行浸泡，使菌丝体中所带有的他克莫司发酵液的色素及其它杂质与菌丝体充分分离，便于后续的脱色及去杂处理。本发明解吸所用的极性溶剂以及结晶用的有机溶剂均可以使用常规溶剂，它们毒性小，适宜于工业化生产。

附图说明

图1：他克莫司的液相色谱图；

图2：他克莫司的¹³C-NMR图谱；

图3：他克莫司的¹H-NMR图谱；

图4：他克莫司的质谱图。

具体实施方式

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。除非特别言明，本发明中所有百分比均为体积百分比。

本发明所使用的他克莫司发酵液为华北制药集团新药研究开发有限责任公司用微生物培养手段得到的。乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯等试剂均为市售。XF-800、D101型大孔吸附树脂，山东东大化学工业公司。LX-900，LSA-700型脱色树脂，西安蓝晓科技有限公司。聚合物纳米微球为苏州纳微科技公司生产。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵（Waters公司）。

实施例1

首先是取发酵单位为487μg/mL的他克莫司发酵液10L，将他克莫司发酵液进行真空抽滤，使他克莫司发酵液固液分离，得到3.1kg菌丝体。在此菌丝体中加入95%的乙醇溶液6.2L，浸泡、搅拌1小时后对此溶液进行真空抽滤，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀释上述他克莫司浸提液至乙醇体积百分浓度为30%，将此经稀释的浸提液通过装量为500mL的LX-900大孔脱色树脂柱进行脱色，所得的脱色液再导入XF-800大孔吸附树脂柱进行吸附，所用大孔吸附树脂柱的树脂装量为500mL，导入的流速750mL/h。然后将吸附有他克莫司的XF-800树脂柱先用750mL 体积浓度为40%（V/V）的乙醇水溶液作为流动相进行洗涤，然后再用浓度为85%的乙醇水溶液作为流动相洗涤至他克莫司洗脱完毕，洗涤过程中控制乙醇水溶液的流速为750mL/h，这样即得到他克莫司的一次解吸液。

将上述他克莫司一次解吸液进行减压浓缩，然后再用乙酸乙酯萃取、分液，然后再将所得的乙酸乙酯相浓缩，得到他克莫司粗提物6.8g。将他克莫司粗提物用34mL乙醇溶解，将溶液注入至500mL 的PS-30型纳米聚合物微球层析柱中，然后首先用500mL体积浓度为45%的乙醇水溶液作为流动相洗涤，再用体积浓度为80%的乙醇水溶液作为流动相洗涤，直至他克莫司解吸完毕；解吸过程中分段收集PS-30柱下解吸液，并分段对PS-30型柱下液进行HPLC检测，将他克莫司浓度大于等于98.5%的解吸液合并，即得二次解吸液。将所得的二次解吸液减压浓缩成30mL，此时溶液中的他克莫司浓度为138mg/mL，然后向此浓缩液中加入240mL乙酸丁酯，混匀后，静置结晶8h，然后经过滤、干燥，即得他克莫司精粉3.55g。他克莫司精粉HPLC纯度为99.58%，生产过程中的总收率未72.59%。

实施例2

本实施例首先是取发酵单位为491μg/mL的他克莫司发酵液30L，将他克莫司发酵液进行真空抽滤，使他克莫司发酵液固液分离，得到9.4kg菌丝体。在上述菌丝体中加入85%的异丙酮28.2L，浸泡、搅拌1小时后对此溶液进行真空抽滤，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀释上述他克莫司浸提液至异丙酮体积百分浓度为25%，将此经稀释的浸提液通过装量为2000mL的LSA-700大孔脱色树脂柱进行脱色，所得的脱色液再导入D101大孔吸附树脂柱进行吸附，所用大孔吸附树脂柱的树脂装量为2000mL，脱色液导入的流速3000mL/h。然后将吸附有他克莫司的D101树脂柱用3000mL 体积浓度为45%（V/V）的异丙醇水溶液作为流动相进行洗涤，然后再用浓度为90%的异丙醇作为流动相洗涤至他克莫司洗脱完毕，洗涤过程中控制异丙醇流速为2000mL/h，这样即得到他克莫司的一次解吸液。

将上述他克莫司一次解吸液进行浓缩，然后再用乙酸丁酯萃取、分液，然后再将所得的乙酸丁酯相浓缩，得到他克莫司粗提物29.46g。将他克莫司粗提物用150mL异丙醇溶解，将溶液注入至2000mL 的PSA-30型纳米聚苯乙烯衍生物微球层析柱中，然后首先用2000mL浓度为50%的异丙醇作为流动相洗涤，再用85%浓度的异丙醇作为流动相洗涤直至他克莫司解吸完毕；解吸过程中分段收集PSA-30型柱下解吸液，并分段对PSA-30型柱下液进行HPLC检测，将他克莫司纯度大于等于98.5%的解吸液合并，即得二次解吸液。将二次解吸液减压浓缩至85mL，使溶液中他克莫司浓度为146mg/mL，然后向此浓缩液中加入170mL丙酮，混匀后，静置结晶8h，然后经过滤，干燥，即得他克莫司精粉10.59g。他克莫司精粉HPLC纯度为99.61%，总收率达到71.61%。

实施例3

本实施例首先是取发酵单位为476μg/mL的他克莫司发酵液50L，将他克莫司发酵液进行真空抽滤，使他克莫司发酵液固液分离，得到15.2kg菌丝体。在上述菌丝体中加入90%的甲醇60.8L，浸泡、搅拌1小时后对此溶液进行真空抽滤，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀释上述他克莫司浸提液至甲醇体积百分含量为40%，将此经稀释的浸提液通过装量为2500mL的LX-900大孔脱色树脂柱进行脱色，所得的脱色液再导入D101大孔吸附树脂柱进行吸附，所用大孔吸附树脂柱的树脂装量为2500mL，脱色液导入的流速3750mL/h。然后将吸附有他克莫司的D101树脂柱先用2500mL 体积浓度为50%（V/V）的甲醇水溶液作为流动相进行洗涤，再用浓度为80%的甲醇作为流动相洗涤至他克莫司洗脱完毕，洗涤过程中控制甲醇流速为2500mL/h，这样即得到他克莫司的一次解吸液。

将上述他克莫司一次解吸液进行浓缩，然后再用乙酸乙酯萃取、分液，然后再将所得的乙酸乙酯相浓缩，得到他克莫司粗提物31.2g。将他克莫司粗提物用156mL甲醇溶解，将溶液注入至2500mL 的PS-30型纳米聚苯乙烯微球层析柱中，然后首先用2500mL浓度为55%的甲醇作为流动相洗涤，再用82%浓度的甲醇作为流动相洗涤直至他克莫司解吸完毕；解吸过程中分段收集PS-30型柱下解吸液，并分段对PS-30型柱下液进行HPLC检测，将他克莫司纯度大于98.5%的解吸液合并，即得二次解吸液。将二次解吸液减压浓缩至170mL，使溶液中他克莫司浓度为123mg/mL，然后向此浓缩液中加入1020mL乙酸丁酯，混匀后，静置结晶8h，然后经过滤，干燥，即得他克莫司精粉17.09g。他克莫司精粉HPLC纯度为99.64%，总收率达到71.55%。

实施例1～3得到的菌丝体、他克莫司粗品及精粉的重量、HPLC纯度及收率见表1。

本发明的具体实施方式中，对菌丝体的浸泡过程中极性溶液可以是85～95%的任意浓度的极性溶液，浸提后再将浸提液稀释到25%～40%的任意浓度范围；乙醇使用量可以是每千克菌丝体加入2～4升的任意数值；对大孔吸附树脂柱进行第一梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的极性溶剂浓度可以是40～50%（体积浓度）的任意浓度，对大孔吸附树脂柱进行第二梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的极性溶剂浓度可以是80%～90%（体积浓度）的任意浓度；对纳米聚合物微球层析柱进行第一梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的浓度可以是45～55%（体积百分浓度）的任意浓度，对纳米聚合物微球层析柱进行第一梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的浓度可以是80%～85%（体积百分浓度）的任意浓度；二次解吸液浓缩后的他克莫司浓度还可以是120mg/mL～150mg/mL的任意数值；有机溶剂丙酮或乙酸丁酯的使用量可以是浓缩后的二次解吸液体积的2～8倍的任意数值。

Claims

1.一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：包括以下步骤

1）用体积百分浓度为80～95%的极性溶液对他克莫司发酵液分离所得的菌丝体进行浸泡，然后再对浸泡液进行固液分离得到他克莫司浸提液；

6）使用极性溶剂与水的混合液对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸，并分段收集他克莫司解吸液，将浓度大于等于98.5%的他克莫司解吸液合并，得他克莫司二次解吸液；

2.根据权利要求1所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述步骤1）的浸泡过程中每千克菌丝体加入2～4升85～95%的极性溶液。

3.根据权利要求1 所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述步骤2）脱色处理中所使用的大孔脱色树脂柱为LX-900或者LSA-700大孔脱色树脂柱；所述步骤3）中大孔吸附树脂柱为XF-800或者D101大孔吸附树脂柱。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中对大孔吸附树脂柱进行梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的体积百分浓度分别为40～50%和80%～90%。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的体积百分浓度分别为45～55%和80%～85%。

6.根据权利要求1、2、4或5任一项所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇的其中一种。

7.根据权利要求1或者5任一项所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述纳米聚合物微球层析柱中的纳米聚合物微球是纳米聚苯乙烯微球或者纳米聚苯乙烯衍生物微球。

8.根据权利要求7所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述聚合物纳米微球为PS-30型纳米聚合物微球或PSA-30型纳米聚合物微球。

9.根据权利要求1所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：所述步骤7）中的有机溶剂为丙酮或乙酸丁酯，丙酮或乙酸丁酯的加入量为浓缩后的二次解吸液体积的2～8倍。

10.根据权利要求1或者9任一项所述的一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：步骤7）中的二次解吸液浓缩后的他克莫司浓度为120mg/mL～150mg/mL。