CN106032547B - 一种麦角固醇类化合物的制备方法和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如式I所示的5,8‑(14),22‑三烯‑7‑酮,3‑羟基,(3β,22E)麦角固醇的制备方法，其包括下列步骤：将镰刀菌(Fusarium)的种子液接种进行发酵培养，得发酵液；其中，发酵培养的时间为144～240h；发酵培养基包括20～40g/L葡萄糖、10～30g/L(NH₄)SO₄、5～15g/L酵母提取物、0.5～2g/LMgSO₄·7H₂O和0～1g/LFeSO₄·7H₂O。本发明的制备方法和纯化方法均工艺简单、条件温和环境友好、成本低、生产周期短、可在人工控制的条件下实现大规模生产、利于工业化。本发明的纯化方法能够获得HPLC纯度在90％以上的目标化合物，纯度高。

Description

一种麦角固醇类化合物的制备方法和纯化方法

技术领域

本发明涉及一种麦角固醇类化合物的制备方法和纯化方法。

背景技术

麦角固醇及其衍生物具有抗病毒与抗心律不齐等药理功效。5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇又名H1-A，是冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Brek)Sacc，Cs)特有的麦角固醇衍生物，能够抑制已活化的人肾丝球肾膈细胞，并能改善A型免疫球蛋白肾病(US005582828A)。

冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体的复合体，是我国传统的名贵中药材之一。目前，H1-A的制备主要是先从Cs子实体中分离其无性世代菌株，接种培养基进行菌种培养每隔4～6个月移植至新鲜PDA斜面试管中培养，以此进行菌种的培养与保存。H1-A的固体发酵同样需要对菌种进行活化、摇瓶预培养、放大培养等，操作繁琐(具体参见美国专利US006558943B1)。H1-A液体发酵过程则需低转速80r/min，低温15℃下，摇瓶振荡培养2个月后，这样一种制备方法菌株的培养条件苛刻，周期长，生产效率慢，成本高，具体可参见文献[高效液相色谱与液相色谱-质谱分析冬虫夏草相关产品之麦角固醇及其衍生物，陈林琤等，分析化学研究报告，第9期第39卷，第1380-1386页，公开日2011年9月]。

微生物能够产生结构新颖、活性多样的次级代谢产物，是药物先导化合物的重要来源。微生物次级代谢产物历来是天然药物的重要来源，天然产物具有独特的生物活性机制，同时天然产物具有立体构型的优势微生物药物来源丰富、化学结构独特，因此筛选新的菌株合成生物体原本难以合成的化合物机率较大，并且微生物发酵及代谢产物分离纯化过程具有条件温和、环境友好、成本低、可在人工控制的条件下实现大规模生产等优点，但是微生物代谢产物通常较为复杂，想要利用微生物来制备天然药物，需要付出很多的劳动。

因此，发展一种利用工艺简单、条件温和环境友好、成本低、生产周期短、可在人工控制的条件下实现大规模生产、利于工业化的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的制备方法、纯化方法是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的制备工艺复杂、操作繁琐、生产周期长、条件苛刻、生产效率慢、原材料昂贵、成本高、过程可控性差等缺陷，而提供了一种麦角固醇类化合物的制备方法和纯化方法。本发明的制备方法和纯化方法均工艺简单、条件温和环境友好、成本低、生产周期短、可在人工控制的条件下实现大规模生产、利于工业化。本发明的纯化方法能够获得HPLC纯度在90％以上的目标化合物，纯度高。

本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术难题的。

本发明提供了一种如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的制备方法，其包括下列步骤：

将镰刀菌(Fusarium)的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得含式I化合物的发酵液，即可；其中，所述的发酵培养的时间为144～240h；所述的发酵培养基包括20～40g/L葡萄糖、10～30g/L(NH₄)SO₄、5～15g/L酵母提取物、0.5～2g/L MgSO₄·7H₂O和0～1g/L FeSO₄·7H₂O；每升发酵培养基用水进行定容；g/L是指各组分与发酵培养基的质量体积比。

所述的镰刀菌可为本领域各种常规镰刀菌，较佳地为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。所述的尖孢镰刀菌较佳地购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏的菌株编号为CICC41029的尖孢镰孢或中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏的菌株编号为3.3638，分离号为M138-N470的尖孢镰孢。按照本领域常识，所述尖孢镰孢和本发明中所述尖孢镰刀菌含义相同，所指菌种一致。上述镰刀菌均可在上述保藏中心购买得到，其网上购买相关的网页说明和信息具体见附件1和附件2。

较佳地，所述的发酵培养的时间为150h～220h；更佳地为168h～216h。

较佳地，所述的葡萄糖的用量为25～30g/L。较佳地，所述的(NH₄)SO₄的用量为15～20g/L。较佳地，所述的酵母提取物的用量为8～10g/L。较佳地，所述的MgSO₄·7H₂O的用量为0.8～1g/L。较佳地，所述的FeSO₄·7H₂O的用量为0.05～0.08g/L。

所述的发酵培养基的pH值可为本领域发酵培养基常规的pH值，较佳地为5～7.5，更佳地为5.5～6.5。

所述发酵培养的温度可为本领域常规培养温度，较佳地为25～37℃；更佳地为30～35℃。较佳地，所述发酵培养的振荡速度为150～250r/min；更佳地为220～240r/min。较佳地，所述的种子液与所述的发酵培养基的体积比为1:100～1:250；更佳地为1:200～1:220。

所述镰刀菌的种子液的制备方法可为本领域常规制备方法，比如，将所述的镰刀菌接种至种子培养基中进行种子培养，制得所述镰刀菌的种子液。

所述的镰刀菌可以镰刀菌孢子粉的形式或以镰刀菌甘油水溶液的形式接种到种子培养基中，本发明优选以镰刀菌甘油水溶液形式添加到种子培养基中。所述的镰刀菌甘油水溶液中，所述的甘油水溶液的浓度可为本领域常规的浓度，较佳地为15％～50％，更佳地为20％～40％，所述的百分比(％)是指甘油的体积占甘油水溶液的总体积的体积百分比，即20％的甘油水溶液一般是指100mL甘油水溶液中含有20mL甘油。所述的镰刀菌甘油水溶液中，所述的镰刀菌的活菌数较佳地为1×10⁸～5×10⁹/mL。所述的镰刀菌甘油水溶液与种子培养基的体积比可为本领域常规的体积比，较佳地为1:50～1:250；更佳地为1:100。所述的种子培养的温度较佳地为30℃。所述的种子培养的振荡速度较佳地为200～250r/min，更佳地为220r/min。所述的种子培养的时间较佳地为48h。

所述种子培养基可为本领域常规种子培养基。较佳地，所述种子培养基包括5～15g/L酵母提取物(更佳地为5g/L)、10～30g/L葡萄糖(更佳地为20g/L)、5～15g/L蛋白胨(更佳地为10g/L)；g/L是指各组分与种子培养基的质量体积比。每升种子培养基用水进行定容。所述种子培养基的pH值为本领域常规的pH值，较佳地为5～7.5，更佳地为pH 5.5。

所述的得含式I化合物的发酵液后，还可进一步包括后处理的操作。所述的后处理的方法和条件可为本领域常规的方法和条件，较佳地包括下列步骤：将得到的含式I化合物的发酵液进行离心处理，得到的沉淀与溶剂混合，超声，再进行离心处理，得到上清液，除去溶剂，即得式I化合物粗品；所述的溶剂为酮类溶剂和/或醇类溶剂。其中，所述的离心的速度较佳地为3500～5000r/min；更佳地为4000r/min。所述的离心的时间较佳地为20～40min；更佳地为30min。所述的超声的方法和条件可为本领域常规的方法和条件，较佳地为在40～70kHZ(优选42kHZ)处理10～60min(优选40min)。所述的超声的次数不作具体限定，一般为2～3次。所述的酮类溶剂可为本领域常规的酮类溶剂，较佳地为丙酮。所述的醇类溶剂可为本领域常规的醇类溶剂，较佳地为甲醇和/或乙醇。所述的溶剂的用量不作具体限定，所述的溶剂与含式I化合物的发酵液的体积比较佳地为1:1～1:3，更佳地为1:2。所述的除去溶剂的方法可为本领域常规的方法，较佳地为减压浓缩。所述的减压浓缩的温度较佳地为40～55℃。所述的减压浓缩的真空度较佳地为700～800mmHg更佳地为758mmHg。

所述的后处理结束后，还可进一步包含纯化的操作。所述的纯化的方法和条件可为本领域常规的方法和条件，本发明优选包含如下步骤：

(1)将所述的式I化合物粗品采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；洗脱的方法为梯度洗脱；洗脱液为0～100％的甲醇-水混合液，所述的百分比(％)是指甲醇的体积占甲醇-水混合液总体积的体积百分比；收集100％的甲醇-水混合液的洗脱液，浓缩，得浓缩物A；

(2)将所述的浓缩物A采用正相硅胶柱层析进行分离纯化；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得浓缩物B；

(3)将所述的浓缩物B采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；流动相为90％的甲醇-水混合液，所述的百分比(％)是指甲醇的体积占甲醇-水混合液总体积的体积百分比；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得式I化合物产品。

步骤(1)中，所述的反相硅胶柱层析中的层析柱可为本领域常规的层析柱，一般根据含式I化合物的粗品的极性和质量进行常规选择。其中，所述的层析柱的填充剂较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶(ODS-C₁₈)。所述的十八烷基硅烷键合硅胶市售可得，较佳地为YMC公司生产的ODS-C₁₈。所述的层析柱的填充剂与所述的式I化合物的粗品的质量比可按照本领域常规进行选择，较佳地为1.5:1～3.5:1；更佳地为2.85:1。较佳地，所述的反相硅胶柱层析为制备级别。较佳地，所述的制备为中低压制备。较佳地，所述的梯度洗脱中所述的洗脱液依次为0％、20％、40％、60％、80％或100％的甲醇-水混合液。较佳地，所述的0％、20％、40％、60％、80％或100％的甲醇-水混合液与所述的含式I化合物的粗品的体积质量比分别为35mL/g～80ml/g；更佳地为70ml/g。较佳地，所述的反相硅胶柱层析在上样前，所述的含式I化合物的粗品用甲醇溶解，得样品上样液。所述样品上样液中，所述甲醇与所述的含式I化合物的粗品的体积质量比为2:1～10:7毫升/克。较佳地，所述的反相硅胶柱层析中洗脱液流速为10～40ml/min；更佳地为10ml/min。较佳地，所述的浓缩物A在4℃保存。

步骤(2)中，所述的正相硅胶柱层析中的层析柱可为本领域常规的层析柱，一般根据浓缩物A的极性和质量进行常规选择。其中，所述的层析柱的填充剂优选200～300目硅胶。所述的200～300目硅胶市售可得，较佳地为国药集团化学试剂有限公司生产的200～300目硅胶。所述的层析柱的填充剂与所述的浓缩物A的质量比可按照本领域常规进行选择，较佳地为1:10～1:30；更佳地为1:20。较佳地，所述的正相硅胶柱层析中的洗脱液为石油醚-乙酸乙酯混合液、氯仿-甲醇混合液或石油醚-丙酮混合液，更佳地为氯仿-甲醇混合液。较佳地，所述的氯仿-甲醇混合液中氯仿和甲醇的体积比为100:1～1:10；更佳地为50:1。较佳地，所述的正相硅胶柱层析中的洗脱速度为5～15ml/min；较佳地为8ml/min。所述的正相硅胶柱层析在上样前，所述的浓缩物A用无水乙醇溶解，并用硅胶拌样，得上样样品。较佳地，所述的上样样品中的硅胶为200～300目硅胶。所述的上样样品中，所述的200～300目硅胶市售可得，较佳地为国药集团化学试剂有限公司生产的200～300目硅胶。

步骤(3)中，所述的反相硅胶柱层析中的层析柱可为本领域常规的层析柱，一般根据浓缩物B的极性和质量进行常规选择。较佳地，所述的反相硅胶柱层析为制备柱级别。其中，所述的层析柱较佳地为AQ-C₁₈反相层析柱。所述的层析柱市售可得，较佳地为YMC公司生产的批号为9955的AQ-C₁₈反相层析柱。较佳地，所述的AQ-C₁₈反相层析柱的填充剂的粒径为10μm。较佳地，所述的AQ-C₁₈反相层析柱的直径为14mm。较佳地，所述的AQ-C₁₈反相层析柱的长度为150～250mm；更佳地为250mm。较佳地，所述的流动相与所述的浓缩物B的体积质量比为0.05～0.5ml/g；更佳地为0.1ml/g。较佳地，所述的流动相的流速为2～4ml/min；更佳地为4ml/min。较佳地，检测波长为210nm。较佳地，所述的反相硅胶柱层析在上样前，所述的浓缩物B用甲醇溶解，得样品上样液。较佳地，所述的反相硅胶柱层析中洗脱液流速为4ml/min。较佳地，所述的反相硅胶柱层析中柱温为40℃。

步骤(1)～(3)中，所述的浓缩的方法和条件可为本领域浓缩常规的方法和条件，只要能除去相应地洗脱液，即可，较佳地为减压浓缩。所述的减压浓缩的温度较佳地为40℃～55℃。所述的减压浓缩的真空度较佳地为700～800mmHg，更佳地为758mmHg。

本发明还提供了一种如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的纯化方法，其包括如下步骤：

(1)将式I化合物粗品采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；洗脱的方法为梯度洗脱；洗脱液为0～100％的甲醇-水混合液，所述的百分比(％)是指甲醇的体积占甲醇-水混合液总体积的体积百分比；收集100％的甲醇-水混合液的洗脱液，浓缩，得浓缩物A；

(2)将所述的浓缩物A采用正相硅胶柱层析进行分离纯化；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得浓缩物B；

(3)将所述的浓缩物B采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；流动相为90％的甲醇-水混合液，所述的百分比(％)是指甲醇的体积占甲醇-水混合液总体积的体积百分比；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得式I化合物产品。

所述的如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的纯化方法的条件同前所述；其中，所述式I化合物粗品可为前述任一式I化合物粗品或本领域其他制备方法所制得的式I化合物粗品。

本发明中，所述的水是指纯水，即去离子水。

本发明中，室温是指10～30℃。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的制备方法和纯化方法均工艺简单、条件温和环境友好、成本低、生产周期短、可在人工控制的条件下实现大规模生产、利于工业化。本发明的纯化方法能够获得HPLC纯度在90％以上的目标化合物，纯度高。

附图说明

图1为实施例1中含式I化合物制备的流程图

图2为实施例2对含式I化合物的粗品进行分离纯化的流程图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例1及对比实施例1中的尖孢镰刀菌的来源：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏的菌株编号为3.3638，分离号为M138-N470的尖孢镰孢。

实施例1真菌的发酵：

将保藏在甘油管(20％的甘油)中的尖孢镰刀菌菌种接种至含50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃，220r/min振荡培养24h，作为种子液。

种子培养基：酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，实验用水，pH5.5。

接种1ml的种子液至750ml的三角摇瓶(含200ml发酵培养基)中，30℃，220r/min的条件下培养168h。共富集30L真菌发酵液。

发酵培养基为：葡萄糖30g/L，(NH₄)SO₄20g/L，酵母提取物10g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，实验用水，pH 5.5。

制备发酵粗产物：

富集得到30L真菌发酵液后，4000r/min离心30min，弃去上清，加入15L丙酮浸泡菌体，辅以超声(42kHz)处理40min。反复三次超声处理。4000r/min离心30min，取上清，旋转蒸发(40-45℃，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌体的丙酮萃取组分4004-E，共28g，真菌发酵液预处理过程如图1所示。

实施例2制备5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇

1、产物分离纯化：

将实施例1所得的丙酮萃取组分4004-E用40ml甲醇溶解，采用反相硅胶柱层析(80g，ODS-C₁₈)(YMC公司，批号：9955)依次用0％、20％、40％、60％、80％、100％甲醇-水混合液洗脱，流速10ml/min，每个梯度用1L洗脱液洗脱，将100％甲醇洗脱液减压浓缩至干，低温(4℃)保存，备用，所述分离纯化过程如图2所示。产物的HPLC的色谱分析条件如下：色谱柱：Ultimate AQ-C₁₈(5μm)(14×150mm)，检测波长：210nm，流动相：A)甲醇B)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：10μl，洗脱浓度：90％甲醇。所得产物的出峰时间：11.45min。

2.4004-E 100％甲醇洗脱组分的分离纯化

将所得4004-E 100％洗脱组分0.5g用5-10ml无水乙醇溶解，3g硅胶(200～300目，国药集团化学试剂有限公司)拌样，采用正相硅胶柱层析(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913)(200～300目，50g)，用400ml氯仿：甲醇＝50:1(体积比)的洗脱液洗脱。试管收集，流速8ml/min，每管收集15ml，TLC(薄层色谱法)检测，收集R_f＝0.35的组分合并，合并液减压浓缩至干得化合物粗品4004-8。

3.4004-8化合物粗品的分离纯化

将所得组分4004-8化合物粗品用10ml甲醇溶解，采用反相硅胶柱层析(10μm，AQ-C₁₈)，制备用反相硅胶柱分离条件如下：层析柱：Ultimate公司，型号AQ-C₁₈(10μm)(14×250mm)，检测波长：210nm，流动相：A)甲醇B)水，流速：4ml/min，柱温：40℃，进样：400μl。洗脱浓度：90％甲醇。所得产物出峰时间：18.5min。收集18.5min出峰产物，合并液减压浓缩至干得单一化合物4004-8-3共6mg(是10ml甲醇溶解样品后400μl*25次进样所得)，HPLC纯度为94.3％；其理化性质及核磁共振波谱数据如下：

白色粉末，可溶于二甲基亚砜、甲醇等有机溶剂。ESI-MS m/z:411.20[M+H]⁺

¹H-NMR(400MHz,CDCl3)(δ):6.06(s,1H),5.19-5.29(m,2H),3.64-3.71(m,1H),2.38-2.64(m,5H),2.26-2.37(m,1H),2.06-2.13(m,3H),1.97-2.00(m,1H),1.81-1.91(m,2H),1.71-1.80(m,3H),1.40-1.56(m,4H),1.37-1.41(m,4H),1.22-1.35(m,3H),1.06-1.08(m,3H)0.93-0.95(d,3H),0.84-0.87(m,6H),0.67(s,3H)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)(δ):12.02,17.63,19.66,19.93,21.11,23.69,24.61,24.76,29.44,30.75,33.14,34.75,35.65,40.24,41.83,42.43,42.90,48.51,53.55,71.92,126.81,132.22,134.10,135.49,160.84,161.48,186.17。通过查阅文献，其质谱和核磁数据与专利(US005582828A)中的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇对比基本一致，故化合物4004-8-3鉴定为5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇。

流程图见图2所示。

实施例3

将实施例1中的发酵培养基改为：葡萄糖20g/L，(NH4)SO410g/L，酵母提取物5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L实验用水定容至1升，pH 5.5。，其余培养条件与实施例1一致，按照实施例2的分离步骤进行分离，最终获得单一化合物2.8mg，HPLC纯度为93.5％，其理化性质及核磁共振波谱同实施例2。

实施例4

将实施例1中的发酵培养基改为：葡萄糖40g/L，(NH4)SO430g/L，酵母提取物15g/L,MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO₄·7H₂O 1g/L实验用水定容至1升，pH 5.5。，其余培养条件与实施例1一致，按照实施例2的分离步骤进行分离，最终获得单一化合物5.3mg，HPLC纯度为94.3％，其理化性质及核磁共振波谱同实施例2。

实施例5

将实施例1中的培养时间缩短为144h，其余培养条件与实施例1一致，按照实施例2的分离步骤进行分离，最终获得单一化合物3.2mg，HPLC纯度为92.1％，其理化性质及核磁共振波谱同实施例2。

实施例6

将实施例1中的培养时间延长为216h，其余培养条件与实施例1一致，按照实施例2分离步骤进行分离，最终获得单一化合物10mg，HPLC纯度为92.7％，其理化性质及核磁共振波谱同实施例4。

实施例5和6说明，在本发明限定的发酵培养时间范围内，培养时间对产物的最终收率影响较大，培养时间增加有利于产物的收率提高。

对比实施例1

将保藏在甘油管(20％的甘油)中的尖孢镰刀菌菌种接种至含50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃，220r/min振荡培养24h，作为种子液。

种子培养基：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L。

接种1ml的种子液至750ml的三角摇瓶(含200ml发酵培养基)中，30℃，220r/min的条件下培养168h。共富集30L真菌发酵液。

发酵培养基：NaCl 1g/L，K₂HPO₄1g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨2g/L，CaCO₃2g/L，(NH₄)SO₄，无机盐溶液1mL/L，MgSO₄·7H₂O 2g，水，pH 7.2。

无机盐溶液配方为：FeSO₄·7H₂O 1g/L，ZnSO₄·7H₂O 1g/L，MgCl₂·6H₂O1g/L，水，pH 7.2。

富集得到10L真菌发酵液后，4000r/min离心30min，弃去上清，加入5L丙酮浸泡菌体，辅以超声(42kHz)处理40min。反复三次超声处理。4000r/min离心30min，取上清，旋转蒸发(40-45℃，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌体的丙酮萃取组分，共5.8g。HPLC的色谱分析条件如下：色谱柱：Ultimate AQ-C₁₈(5μm)(14×150mm)，检测波长：210nm，流动相：A)甲醇B)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：10μl，洗脱浓度：90％甲醇。液相检测时在目标峰产物出峰时间11.45min未检测到任何物质。

由本例可以看出，将尖孢镰刀菌采用本发明以外的发酵培养方法，不能代谢出式I化合物。

对比实施例2

链霉菌的发酵：

将保藏在甘油管(20％的甘油)中的链霉菌菌种灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)LMG 19891接种至含50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃，220r/min振荡培养24h，作为种子液。

种子培养基：酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，实验用水，pH5.5。

接种1ml的种子液至750ml的三角摇瓶(含200ml发酵培养基)中，30℃，220r/min的条件下培养168h。共富集30L真菌发酵液。

发酵培养基为：葡萄糖30g/L，(NH₄)SO₄20g/L，酵母提取物10g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，实验用水，pH 5.5。

富集得到10L真菌发酵液后，4000r/min离心30min，弃去上清，加入5L丙酮浸泡菌体，辅以超声(42kHz)处理40min。反复三次超声处理。4000r/min离心30min，取上清，旋转蒸发(40-45℃，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌体的丙酮萃取组分，共8g。HPLC的色谱分析条件如下：色谱柱：Ultimate AQ-C₁₈(5μm)(14×150mm)，检测波长：210nm，流动相：A)甲醇B)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：10μl，洗脱浓度：90％甲醇。液相检测时在目标峰产物出峰时间11.45min未检测到任何物质。

由本例可以看出，将链霉菌菌种灰产色链霉菌采用本发明的发酵培养方法，不能代谢出式I化合物。

对比实施例3

链霉菌的发酵：

将保藏在甘油管(20％的甘油)中的链霉菌菌种灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)LMG 19891接种至含50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃，220r/min振荡培养24h，作为种子液。

种子培养基：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L。

接种1ml的种子液至750ml的三角摇瓶(含200ml发酵培养基)中，30℃，220r/min的条件下培养168h。共富集30L真菌发酵液。

发酵培养基：NaCl 1g/L，K₂HPO₄1g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨2g/L，CaCO₃2g/L，(NH₄)SO₄，无机盐溶液1mL/L，MgSO₄·7H₂O 2g，水，pH 7.2。

无机盐溶液配方为：FeSO₄·7H₂O 1g/L，ZnSO₄·7H₂O 1g/L，MgCl₂·6H₂O1g/L，水，pH 7.2。

富集得到10L真菌发酵液后，4000r/min离心30min，弃去上清，加入5L丙酮浸泡菌体，辅以超声(42kHz)处理40min。反复三次超声处理。4000r/min离心30min，取上清，旋转蒸发(40-45℃，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌体的丙酮萃取组分，共5.8g。HPLC的色谱分析条件如下：色谱柱：Ultimate AQ-C₁₈(5μm)(14×150mm)，检测波长：210nm，流动相：A)甲醇B)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：10μl，洗脱浓度：90％甲醇。液相检测时在目标峰产物出峰时间11.45min未检测到任何物质。

由本例可以看出，将链霉菌菌种灰产色链霉菌采用本发明以外的发酵培养方法，也不能代谢出式I化合物。

Claims (8)

1.一种如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的制备方法，其特征在于，其包括下列步骤：

将镰刀菌(Fusarium)的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得含式I化合物的发酵液，即可；其中，所述的发酵培养的时间为144～240h；所述的发酵培养基为：20～40g/L葡萄糖、10～30g/L(NH₄)₂SO₄、5～15g/L酵母提取物、0.5～2g/L MgSO₄·7H₂O和0～1g/LFeSO₄·7H₂O；每升发酵培养基用水进行定容；g/L是指各组分与发酵培养基的质量体积比；所述的尖孢镰刀菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的菌株编号为3.3638，分离号为M138-N470的尖孢镰孢。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养的时间为150h～220h；和/或，所述的葡萄糖的用量为25～30g/L；和/或，所述的(NH₄)₂SO₄的用量为15～20g/L；和/或，所述的酵母提取物的用量为8～10g/L；和/或，所述的MgSO₄·7H₂O的用量为0.8～1g/L；和/或，所述的FeSO₄·7H₂O的用量为0.05～0.08g/L。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基的pH值为5～7.5；和/或，所述发酵培养的温度为25～37℃；和/或，所述发酵培养的振荡速度为150～250r/min；和/或，所述的种子液与所述的发酵培养基的体积比为1:100～1:250；和/或，所述镰刀菌的种子液的制备方法为将所述的镰刀菌接种至种子培养基中进行种子培养，制得所述镰刀菌的种子液。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述的镰刀菌以镰刀菌孢子粉的形式或以镰刀菌甘油水溶液的形式接种到种子培养基中；和/或，所述的种子培养的温度为30℃；和/或，所述的种子培养的振荡速度为200～250r/min；和/或，所述的种子培养的时间为48h；和/或，所述种子培养基包括5～15g/L酵母提取物、10～30g/L葡萄糖、5～15g/L蛋白胨；g/L是指各组分与种子培养基的质量体积比；每升种子培养基用水进行定容；所述种子培养基的pH值为5～7.5；

当所述的镰刀菌以镰刀菌甘油水溶液的形式接种到种子培养基中时，所述的镰刀菌甘油水溶液中，所述的甘油水溶液的浓度为15％～50％，所述的百分比是指甘油的体积占甘油水溶液的总体积的体积百分比，即20％的甘油水溶液是指100mL甘油水溶液中含有20mL甘油；和/或，所述的镰刀菌甘油水溶液中，所述的镰刀菌的活菌数为1×10⁸～5×10⁹/mL；和/或，所述的镰刀菌甘油水溶液与种子培养基的体积比为1:50～1:250。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的得含式I化合物的发酵液后，还进一步包括后处理的操作；所述的后处理包括下列步骤：将得到的含式I化合物的发酵液进行离心处理，得到的沉淀与溶剂混合，超声，再进行离心处理，得到上清液，除去溶剂，即得式I化合物粗品；所述的溶剂为酮类溶剂和/或醇类溶剂。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的后处理结束后，还进一步包含纯化的操作；所述的纯化的方法包含如下步骤：

(1)将所述的式I化合物粗品采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；洗脱的方法为梯度洗脱；洗脱液为0～100％的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的体积占甲醇-水混合液的总体积的体积百分比；收集100％的甲醇-水混合液的洗脱液，浓缩，得浓缩物A；

(2)将所述的浓缩物A采用正相硅胶柱层析进行分离纯化；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得浓缩物B；

(3)将所述的浓缩物B采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；流动相为90％的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的体积占甲醇-水混合液的总体积的体积百分比；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得式I化合物产品。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述的反相硅胶柱层析中的层析柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；和/或，所述的反相硅胶柱层析中的层析柱的填充剂与所述的式I化合物的粗品的质量比为1.5:1～3.5:1；和/或，所述的反相硅胶柱层析为制备级别；和/或，所述的梯度洗脱中所述的洗脱液依次为0％、20％、40％、60％、80％或100％的甲醇-水混合液，所述的0％、20％、40％、60％、80％或100％的甲醇-水混合液与所述的含式I化合物的粗品的体积质量比分别为35mL/g～80ml/g；和/或，所述的反相硅胶柱层析在上样前，所述的含式I化合物的粗品用甲醇溶解，得样品上样液；和/或，所述的反相硅胶柱层析中洗脱液流速为10～40ml/min；和/或，所述的浓缩物A在4℃保存；

和/或，步骤(2)中，所述的正相硅胶柱层析中的层析柱的填充剂为200～300目硅胶；和/或，所述的正相硅胶柱层析中的层析柱的填充剂与所述的浓缩物A的质量比为1:10～1:30；和/或，所述的正相硅胶柱层析中的洗脱液为石油醚-乙酸乙酯混合液、氯仿-甲醇混合液或石油醚-丙酮混合液；和/或，所述的正相硅胶柱层析中的洗脱速度为5～15ml/min；和/或，所述的正相硅胶柱层析在上样前，所述的浓缩物A用无水乙醇溶解，并用硅胶拌样，得上样样品；

和/或，步骤(3)中，所述的反相硅胶柱层析中的层析柱为制备柱级别；和/或，所述的反相硅胶柱层析中的层析柱为AQ-C₁₈反相层析柱；和/或，所述的流动相与所述的浓缩物B的体积质量比为0.05～0.5ml/g；和/或，所述的流动相的流速为2～4ml/min；和/或，检测波长为210nm；和/或，所述的反相硅胶柱层析在上样前，所述的浓缩物B用甲醇溶解，得样品上样液；和/或，所述的反相硅胶柱层析中洗脱液流速为4ml/min；和/或，所述的反相硅胶柱层析中柱温为40℃；

和/或，步骤(1)～(3)中，所述的浓缩的方法为减压浓缩。

8.一种如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的纯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)将式I化合物粗品采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；洗脱的方法为梯度洗脱；洗脱液为0～100％的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的体积占甲醇-水混合液的总体积的体积百分比；收集100％的甲醇-水混合液的洗脱液，浓缩，得浓缩物A；

(2)将所述的浓缩物A采用正相硅胶柱层析进行分离纯化；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得浓缩物B；

(3)将所述的浓缩物B采用反相硅胶柱层析进行分离纯化；流动相为90％的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的体积占甲醇-水混合液的总体积的体积百分比；收集含式I化合物的洗脱液，浓缩，得式I化合物产品；

所述的如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇的纯化方法的条件同权利要求6或7所述；其中，所述式I化合物粗品为权利要求6或7中所述式I化合物粗品。

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