KR20200131224A - 단백질 정제 공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질을 정제하는 방법을 개시하고, 상기 단백질은 공급물에 존재하며, 상기 방법은 다중 모드 크로마토그래피 단계를 포함하고, 상기 공급물은 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함하는 다중 모드 이온 교환기와 접촉하며, 상기 관심 단백질의 상기 교환기에 대한 결합은 높은 전도도 조건 하에서 일어난다.

Description

단백질 정제 공정

본 발명은 단백질 정제 방법에 관한 것이다.

단백질 치료 후보물질의 수가 증가하고, 특히 단클론 항체 (mAb)가 다양한 개발 단계에 진입함에 따라, 바이오 제약 회사는 이러한 파이프라인을 제공할 혁신적인 솔루션을 찾고 있다. 항체 제조 공정 개발의 경우, 원하는 품질 속성을 유지하면서 출시 시간을 단축하고, 비용 효율성을 유지하며, 제조 유연성을 제공하는 것이 오늘날의 경쟁 시장에서 핵심적인 문제이다. 항체 요법은 장기간에 걸쳐 대량으로 요구될 수 있기 때문에, 약물 물질은 임상 요건을 충족시키면서 상업화를 위해, 비용 및 시간에 있어 효율적으로 대량 생산되어야한다. 이것은 또한 단클론 항체 이외의, 융합 단백질, 치료 효소 및 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 재조합 치료 단백질에도 해당된다.

일반적으로, 단백질은 세포주, 박테리아 세포주 또는 관심 단백질을 생성하도록 조작된 바이러스를 사용한 세포 배양에 의해 생산된다. 세포주에는 당, 아미노산 및 성장 인자를 포함하는 복합 성장 배지가 공급된다. 인간 치료제로 사용하기 위해, 배양된 세포에서 발현된 표적 분자 또는 표적 단백질은 높은 수준의 순도에 도달하도록 처리되어야한다. 원하는 최종 순도를 얻기 위해 초기 정제 후, 보통 폴리싱라고 불리는 최종 정제 단계가 사용된다.

높은 수준의 순도를 달성하기 위해 필요하긴 하지만, 폴리싱은 상당한 단백질 손실을 초래할 수 있다. 현재까지 알려진 폴리싱 방법의 대부분은 여러 번의 하위 폴리싱 단계를 포함하여, 원하는 물질의 손실을 다시 유발한다.

본 발명의 목적은 단백질 손실을 최소화하고 단백질 품질을 보장하면서 단백질 공급물을 폴리싱 하는 방법을 제공하는 것이다. 둘째로, 또한, 여전히 높은 수율의 단백질을 제공하고 운영 비용(OPEX)의 상당한 감소를 제공하는 제한된 수의 작동 단계를 가진 방법론을 제공하는 것을 목적으로 한다.

소수성 모이어티를 포함하고, 높은 전도도 조건 하에서 로딩되는 다중 모드 이온 교환기를 사용하는 방법이 본 발명에 개시된다. 이들 조건은 코스모 트로픽(Kosmotropic) 효과를 유발하며, 여기서 관심 단백질은 교환기의 소수성 모이어티에 더 노출되거나 후자에 더 높은 친화성을 가져, 상기 단백질과 교환기 사이의 소수성 상호 작용을 허용한다. 높은 전도도 조건 하에서 상기 방법을 수행하는 것은 관심 단백질의 단량체 형태로의 선택성을 증진시킨다. 또한, 이러한 조건 하에서는 단백질 응집체(protein aggregate)가 적게 형성된다. 동시에 이온 교환의 다른 모든 주요 속성이 거의 보존될 수 있다: 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA의 감소, 및 바이러스 입자의 감소. 이 유형의 다중 모드 이온 교환기를 사용하면 공급물 컨디셔닝에 필요한 중간 단계가 감소된다.

본 발명은 분자를 정제하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 단백질, 펩티드, 아미노산 또는 핵산이다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 공급물에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 다중 모드 크로마토그래피 단계를 포함하고, 상기 공급물은 다중 모드 이온 교환기와 접촉한다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 이온 교환기는 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 단백질과 교환기의 결합은 높은 전도도 조건 하에서 일어난다. 일부 구현예에서, 공급물은 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에 적당한 양의 염 또는 염의 조합이 보충된다. 일부 구현예에서, 상기 공급물은 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에 적당한 양의 황산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 인산암모늄, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 혼합물이 보충된다. 일부 구현예에서, 결합하는 동안 상기 공급물의 상기 염 농도는 0.5 M 내지 3 M이다. 일부 구현예에서, 결합하는 동안 상기 공급물의 상기 염 농도는 1 M 내지 2 M이다. 일부 구현예에서, 상기 하전된 모이어티는 양 또는 음으로 하전된다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 교환기는 양 및 음으로 하전된 모이어티를 모두 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 공급물은 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에 적당한 양의 산성 용액 또는 적당한 양의 알칼리 용액이 보충된다. 일부 구현예에서, 상기 결합은 약 7 내지 9의 pH에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 폴리싱 단계로 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 단독 폴리싱 단계이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리싱 단계는 세포 배양액 수확의 정화 단계 및/또는 크로마토그래피 단계에 후행한다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 구배용리되는 단계, 용리 완충액의 pH를 7 이하로 점차적으로 감소시키는 단계, 및/또는 용리 완충액의 염 농도를 0.5M 이하로 점차적으로 감소시키는 단계에 의해, 상기 다중 모드 교환기에서 용리된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 용리 완충액을 사용한 등용매 용리에 의해 상기 다중 모드 교환기로부터 용리되고, 상기 용리 완충액은 10mM 내지 500mM의 염 농도 및/또는 5.5 내지 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 공급물은 불활성화된 바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 크로마토그래피용 공급물은 크로마토그래피 단계의 통과 분획(flow-through fraction) 또는 이의 유래 분획이다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 회분식 모드(batch mode) 또는 연속 크로마토그래피 모드로 수행된다.

본 발명은 키트를 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 다중 모드 크로마토그래피 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 수지는 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 0.5 내지 3M의 염 농도 및/또는 75 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 완충액을 포함한다.

본 발명은 다중 모드 이온 교환기를 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 이온 교환기는 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자는 단백질이 상기 소수성 모이어티에 결합한 단백질이다. 일부 구현예에서, 로딩 전 단백질은 0.5 내지 3 M의 염 농도 및/또는 75 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 완충액에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 완충액은 0.5 내지 3 M의 염 농도 및/또는 75 mS/cm 이상의 전도도를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 완충액은 약 7 내지 9의 pH를 포함한다.

본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구 범위에 구체적으로 기재되어있다. 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예 및 첨부 도면을 동반한 다음의 상세한 설명을 참조하여 달성될 것이다.

도 1은 단백질 생산 및 정제의 대규모 상업적 공정의 개요를 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명에 개시된 구현예에 따른 단백질 정제 방법의 개요를 나타낸 흐름도이다.
도 3은 실시예 2에서 수행한 실험에 수반되는 크로마토그램을 나타낸 도이다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 발명에 개시된 내용을 보다 잘 이해하기 위한, 추가적인 가이드라인에 의해 용어 정의가 포함된다.

본 발명에 사용된 다음의 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다 :

본 발명에서 사용 된 "하나(A)", "하나(an)"및 "그(the)"는 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 지칭한다. 예로서, "하나의 구획물(a compartment)"은 하나 이상의 구획(compartment)을 지칭한다.

본 발명에서 사용된 파라미터, 양, 시간 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급하는 "약(about)"은 특정 수치로부터 +/- 20 % 이하, 바람직하게는 +/- 10 % 이하의 변동을 포함하고, 보다 바람직하게는 +/- 5 % 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/- 1 % 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/- 0.1 % 이하를 포함한다. 이러한 변형은 본 발명에서 수행되기에 적합하다. 그러나, 수식어 "약"이 참조하는 값 자체도 구체적으로 개시되어 있음을 이해해야 한다.

본 발명에 사용 된 "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising)" 및 "포함하는(comprises)" 및 "포함하는(comprised of)"은 "포함(include)", "포함하는(including)", "포함하는(includes)" 또는 "포함하는(contain)", "포함하는(containing)", "포함하는(contains)"과 동의어이며, 뒤따라 존재하는 것, 예컨대 구성을 명시하고, 당업계에 공지되어 있거나 본 발명에 개시된 추가적으로 언급되지 않은 구성 요소, 특징, 요소, 멤버, 단계의 존재를 배제하거나 배제하지 않는, 포괄적 또는 개방형 용어이다.

종말점(endpoint)에 의한 수치 범위의 인용은 인용된 종말점 뿐만 아니라 그 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분수를 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서 및 설명 전체에 걸쳐 "중량 % (% by weight)”라는 표현은 제제의 전체 중량을 기준으로 각 성분의 상대 중량을 지칭한다. "1 % w/w"라는 표현은 제제 100 g 당 각각의 성분 1g으로 이해될 수 있고, "1 % w/v"라는 표현은 100 ml 당 각각의 성분 1g으로 이해 될 수 있다. 제제의 "1 % v/v"라는 표현은 제제 100 ml 당 각각의 성분 1 ml로 이해 될 수 있다.

"세포 배양액 수확물(Cell culture harvest)", "배양액 수확물(culture harvest)" 및 "수확물 (harvest)"은 동의어로 사용되며, 생물 반응기(bioreactor)에서 세포를 배양하여 얻은 정화되지 않은 세포 배양물을 지칭한다. 배양된 세포 또는 성장한 세포 또한 숙주 세포로 지칭된다.

"생물 반응기"는 예를 들어 생물학적 산물의 생산을 위한 세포 또는 유기체의 배양과 같은 생물학적 활성 환경을 지원하는 임의의 장치 또는 시스템을 지칭한다. 여기에는 셀 스택(cell stacks), 롤러 병, 쉐이크, 플라스크, 교반 탱크 서스펜션 생물 반응기(stirred tank suspension bioreactor), 고 세포 밀도 고정층 관류 생물 반응기(high cell density fixed bed perfusion bioreactors) 등이 포함된다.

"정제"는 관심 단백질과 같은 관심 분자의 농도 대비 하나 이상의 표적 불순물 또는 오염물의 농도가 실질적으로 감소되는 것을 지칭한다.

"단백질"은 하나 이상의 아미노산 사슬로 구성된 큰 분자를 갖는 임의 부류(class)의 질소성 유기 화합물(nitrogenous organic compounds)을 지칭한다. "단백질"은 임의의 종류의 단백질, 예컨대 (단클론) 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 효소, 재조합 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 또는 세포에 의해 발현된 다른 생체 분자(biomolecules) 일 수 있다.

"항체"는 인간화(humanized), 인간(human), 키메라(chimeric), 합성(synthetic), 재조합(recombinant), 하이브리드(hybrid), 변이(mutated), 이식(graft) 및 시험관 내(in vitro) 생성 항체와 같은 자연적 또는 유전적으로 변형된 형태를 포함하는, 인간 또는 다른 동물 세포주로부터 유래된 임의의 면역글로불린 분자, 항원-결합 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 융합 단백질, 단클론 또는 다클론 항체를 지칭한다. 일반적으로 알려진 자연 면역글로불린 항체는 IgA (이량체), IgG, IgE, IgG 및 IgM (오량체)을 포함한다.

본원에 사용 된 "항체 전하 변이체"는 항체 또는 이의 단편의 전하가 변경되는 것과 같이, 항체 또는 이의 단편이 그의 본래 상태로부터 변형된 항체 또는 이의 단편이다. 항체 전하 변이체는 종종 산성, 중성 및/또는 염기성 항체 종(species)으로 지칭된다.

"단백질 응집체(protein aggregate)" 또는 "단백질의 응집체(aggregate of protein)"는 2 개 이상의 단백질 분자의 회합(association)을 의미한다. 회합은 단백질 분자가 회합되는 메커니즘에 관계없이 공유 또는 비공유 일 수 있다. 회합은 단백질 분자 사이에서 직접적으로 회합될 수 있으며, 단백질 분자를 서로 연결하는 다른 분자를 통해 간접적으로 회합될 수 있다. 후자의 예로는 다른 단백질과의 이황화 결합, 지질과의 소수성 회합(hydrophobic associations), DNA와의 전하 회합(charge associations), 여과된(leached) 단백질 A와의 친화도 회합(affinity associations), 또는 다중 구성으로 된 혼합된 형태의 회합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

“바이러스 불활성화"는 관심 단백질을 포함하는 공급물이 생물 반응기에서 이전에 활성 형태로 존재한 불활성화된 바이러스 또는 바이러스 입자를 추가로 포함하는 것을 의미한다.

여기서 "통과 분획"이란 용리 유체와 실질적으로 동일한 속도로 크로마토 그래피 컬럼을 떠나는 로딩된 단백질 함유 분획의 적어도 일부를 의미한다. 이 분획은 용리 중에 컬럼에 실질적으로 유지되지 않는다. 따라서 항체가 아니라 불순물이 각각의 크로마토그래피 물질에 결합되도록 조건이 선택된다.

"응집(flocculation)"은 적절한 응집제를 현탁액에 첨가함으로써 나타나는 가용성 (예를 들어, 염색질 성분) 및/또는 불용성 (예를 들어, 세포) 입자의 응집(aggregation), 침전(precipitation) 및/또는 집적(agglomeration)을 의미한다. 현탁액에 존재하는 불용성 성분의 입자 크기를 증가시킴으로써 여과(filtration) 또는 원심 분리(centrifugation)와 같은 고체/액체 분리의 효율성이 향상된다. 세포 배양액의 응집(flocculation)은 예컨대, 세포 및 세포 이물 또는 숙주 세포 단백질, DNA 또는 그 안에 존재하는 다른 성분을 포함하는 세포 물질인, 숙주 세포 불순물을 포함하는 "응집체(floccules)"의 형성을 유도한다.

본 발명에서 사용된 “폴리싱(polishing)"은 공급물로부터 잔류 숙주 세포 불순물, 산물(product)-관련 불순물 (산물 단편 및/또는 응집된(aggregated) 종(species) 또는 전하 변이체(charge variants)) 및 바이러스 오염물을 제거하여 (추가적으로) 관심 단백질을 정제하는데 사용되는 단계, 바람직하게 크로마토그래피 단계인 것을 지칭한다. 폴리싱은 종종 단백질 포획 단계에 후행한다.

"혼합 모드(mixed-mode)"및 "다중 모드(multimodal)" 크로마토그래피는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되며, 이동상에서 성분의 분리가 고정상과 이동상의 성분 사이의 하나 이상의 상호 작용 유형에 기초하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 예컨대, 다중 모드 크로마토그래피는 소수성 또는 비-소수성의 동시 상호 작용 및 이동상과 고정상 간의 정전기 상호 작용을 기반으로 한다.

"다중 모드 이온 교환기"는 다중 모드 크로마토그래피에 사용하기 적합하고, 하전된 모이어티를 갖는 고체상의 구성을 지칭한다. 용어 "다중 모드 이온 교환기", "혼합 모드 이온 교환기", "다중 모드 이온 교환 리간드" 및 "혼합 모드 이온 교환 리간드"는 본 발명에서 동의어로 사용된다.

본 발명에서 사용된 용어 "코스모트로픽" 또는 "코스모트로프"는 이론에 구속되지 않고 물(water)-물(water) 상호 작용의 안정성 및 구조에 기여하는 것으로 생각되는 물질을 광범위하게 지칭한다. 코스모트로프는 일반적으로 물 분자가 알맞게 상호 작용하도록 하여 거대 분자의 분자간 상호 작용을 안정화시킨다. 코스모트로프는 이온성 및/또는 비-이온성일 수 있다.

“높은 전도도 조건"은 이러한 공급물의 공급물 또는 완충액을 로딩하고 이러한 공급물의 공급물 또는 완충액을 수지에 결합시키는 동안 존재하는 조건 또는 조치로서 이해되어야하며, 이에 따라 상기 공급물의 공급물 또는 완충액의 전도도는 75 mS/cm 이상일 수 있고, 더 바람직하게는 85 mS / cm 이상일 수 있다. 종종 높은 전도도는 공급물 완충액의 염 농도를, 예컨대 1 M NaCl 이상으로, 증가시켜 얻을 수 있다. 통상의 기술자는 상이한 염이 전도도에 대해 상이한 영향을 나타내는 것을 인식한다.

용어 "고체상"은 하나 이상의 리간드가 부착 될 수 있는 임의의 비-수성 매트릭스를 의미하거나, 또는 대안적으로 크기 배제 크로마토그래피의 경우에서, 수지의 겔 구조를 지칭 할 수 있다. 상기 고체상은 이러한 방식으로 리간드를 부착 할 수 있는 임의의 매트릭스일 수 있으며, 예컨대, 정제 컬럼, 단립자의 불연속상, 멤브레인, 필터, 겔 등 일 수 있다. 고체상을 형성하는 데 사용할 수 있는 물질의 예로는 다당류 (예 : 아가로스 및 셀룰로오스) 및 예컨대, 실리카 (예 : 제어된 기공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 이들 중 임의의 유도체인 기타 기계적으로 안정한 매트릭스를 포함한다.

"완충 화합물(buffering compound)"은 특정 범위 내에서 수용액의 pH를 안정화하기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 인산염은 완충 화합물의 한 예이다. 다른 일반적인 예는 아세테이트, 시트레이트, 보레이트, MES, 트리스, 및 HEPES, 인산염 완충 식염수 (PBS)와 같은 화합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"완충액"은 크로마토그래피 방법의 제어를 매개하기위한 특정 조건 세트를 확립하는데 필요한 완충 화합물 및 기타 성분을 포함하는 수성 제제를 지칭한다. 용어 "평형 완충액"은 초기 작동 조건을 만들기 위해 제제화된 완충액을 지칭한다. "세척 완충액"은 크로마토그래피 지지체로부터 결합되지 않은 오염물을 제거하기 위해 제제화된 완충액을 지칭한다. "용리 완충액"은 크로마토그래피 매트릭스로부터 하나 이상의 성분을 제거하도록 제제화된 완충액을 의미한다.

용액의 "적당한 양"은 공급물 또는 크로마토그래피 수지와 혼합될 때, 관심 단백질의 대부분이 수지에 결합 또는 흡착하는 것을 촉진하지만, 불순물의 수지에 대한 결합은 촉진하지 않는 용액인 것으로 설명하는데 사용된다. 각 정제 공정에 대한 최적의 pH, 염 시스템의 선호되는 유형 및 조정 용액의 최적의 양이 설정될 수 있다.

상세한 설명

첫 번째 측면에서, 단백질을 정제하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 단백질은 공급물에 존재하고, 상기 방법은 다중 모드 크로마토그래피 단계를 포함하며, 상기 공급물은 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함하는 다중 모드 이온 교환기와 접촉하여, 상기 단밸질의 상기 교환기에 대한 결합을 가능하게 하고, 상기 결합은 높은 전도도 조건 하에서 일어난다.

다중 모드 또는 혼합 모드 크로마토그래피는 이온 상호 작용, 수소 결합 및 소수성 상호 작용과 같은 상이한 유형의 상호 작용과 결합하여 혼합물(즉, 관심 단백질을 포함하는 공급물)에서 성분의 분리를 가능하게 한다. 리간드의 분리 특성은 상기 공급물의 성분과 상기 리간드 간의 상호 작용이 발생하는 조건을 조정하여 조절된다. 현재 개시된 방법에서, 다중 모드 리간드에 대한 관심 단백질의 결합 및 용리를 위한 추진력은 성분의 크로마토그래피 분리를 개선하기 위해, 크로마토그래피 조건을 조정함으로써 구체적으로 조정되며, 따라서, 특정 관심 단백질과 상기 관심 단백질의 특정 형태(예 : 항체의 단량체 형태)에 대해서 더 정확하고 더 선택적으로 수행될 수 있다.

본 발명에 개시된 단백질 정제 방법에 따르면, 상기 사용되는 다중 모드 크로마토그래피 단계는 하전된 모이어티 뿐만 아니라 소수성 모이어티를 갖는 리간드를 기반으로하며, 따라서 소수성 상호 작용 능력 뿐만 아니라 이온 교환 능력도 모두 갖는다. 상기 하전된 모이어티는 양으로 하전된 모이어티 (음이온성) 또는 음으로 하전된 모이어티 (양이온성) 일 수 있다.

다양한 혼합 모드 크로마토그래피 리간드는 시판 중 이다. 당업계에 잘 알려져 있고, 현재 기술된 방법론과 양립할 수 있는 리간드는 Capto-Adhere™ 또는 Capto-Adhere™ ImpRes, Capto MMC HiScreen, Nuvia™ aPrime이다. 일 구현예에서 상기 다중 모드 이온 교환기는 음으로 하전된 기(group)를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 다중 모드 이온 교환기는 양으로 하전된 기 (바람직하게는 아민 또는 4 차 암모늄 이온) 및 방향족 고리 구조를 포함한다.

이러한 작용기는 리간드의 다소 확률적 혼합물로서 별개의 치환기/리간드에 수용되거나, 동일한 치환기/리간드에 함께 수용될 수 있다.

특히 유용한 것은 하기 공식으로 정의되는 리간드이다.

R₁-R₂-N(R₃)-R₄-R₅

여기서

R₁은 치환 또는 비-치환된 페닐기이고;

R₂는 0-4 개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 사슬이고;

R₃은 1-3 개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 사슬이고;

R₄는 1-5 개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 사슬이고; 및

R₅는 OH 또는 H 이다.

이러한 리간드의 예는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민 또는 N,N-디메틸벤질 아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 또는 추가 구현예에서, 상기 다중 모드 수지의 상기 리간드는 사용된 결합 조건에 따라 관심 단백질과의 추가적인 상호 작용을 허용하는 수소 모이어티(hydrogen moiety)와 같은 소수성 및 비 소수성 모이어티를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 상기 다중 모드 교환기는 양 및 음으로 하전된 모이어티를 모두 가질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 다중 모드 교환기는 상기 컬럼의 이온 교환 이외의 추가적인 상호 작용 기능을 허용하는, 예컨대 소수성 상호 작용 가능 모이어티 또는 수소 결합 가능 모이어티 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 것인, 추가적인 모이어티를 포함한다.

어떤 이론에 얽매이지 않고, 본 발명에서 사용된 높은 전도도 조건은 코스모트로픽 효과를 초래하는 것으로 나타났으며, 상기 관심 단백질은 교환기의 소수성 모이어티에 더 많이 노출되어, 상기 단백질과 교환기 사이의 소수성 상호작용을 허용한다. 따라서, 높은 전도도 조건에서 상기 단백질 공급물을 다중 모드 이온 교환기에 로딩하고 결합시키면, 다중 모드 교환기의 소수성 특성로의 전환(shift)이 나타나며, 이에 따라 관심 단백질과 다중 모드 이온 교환기의 상호 작용은 상기 단백질의 소수성 특성과 다중 모드 이온 교환 리간드의 소수성 모이어티에 기초하여 나타난다.

위에서 언급한 크로마토그래피 모드의 전환(shift)은 다중 모드 크로마토그래피 수지의 분리 특성, 예컨대, 단백질의 단량체 형태, 예컨대 항체, 에 대한 선택성을 성공적으로 조절할 수 있게 한다. 또한 상기 크로마토그래피 모드의 전환은 항체 전하 변이체들을 각각 선택적으로 분리 할 수 있도록 한다. 이러한 항체 전하 변이체는 종종 산성, 중성 또는 염기성 항체 종(species)으로 지칭된다. 동시에, 숙주 세포 단백질 및 DNA의 감소는 물론 바이러스 입자의 감소와 같은 이온 교환 크로마토그래피의 모든 주요 속성도 보존된다. 따라서, 상기 방법에 의하면, 고품질의 고순도 단백질 샘플을 얻을 수 있다.

일 구현예에서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 수지를 포함하는 고전적인 충전층(packed bed) 컬럼, 단일한 물질(monolith material)을 포함하는 컬럼, 적합한 크로마토그래피 매질을 포함하는 방사형 컬럼, 흡착 막 유닛, 또는 개시된 바와 같이 적절한 매질 및 리간드와 함께 당업계에 공지된 임의의 다른 다중 모드 크로마토그래피 장치를 포함한다. 크로마토그래피 컬럼에서 크로마토그래피 물질은 본 발명에 따른 리간드가 부착된 미립자 지지체 물질(particulate support material)로서 존재할 수 있다. 본 발명은 수지를 함유하는 컬럼을 포함하는 크로마토그래피 단계와 관련하여 제공하지만, 본 발명에 개시된 내용이 흡착막(absorption membrane)을 함유하는 컬럼을 포함하는 크로마토그래피 단계와 관련하여 동일하게 적용될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

다중 모드 크로마토그래피 수지는 충전층(packed bed) 컬럼, 유동화/팽창 층(fluidized/expanded bed) 컬럼, 및/또는 다중 모드 수지가 특정 시간 동안 단백질 공급물과 혼합되는 회분식(batch) 작업에서 실시되는 것일 수 있다. 고체상 크로마토그래피 지지체는 다공성 입자, 비 다공성 입자, 막 또는 단일체(monolith) 일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 다중 모드 리간드를 포함하는 상기 고체상 지지체는 5mm 이상의 내부 직경 및 25mm 이상의 높이의 컬럼에 패킹된다. 이러한 구현예는 예컨대, 특정 단백질 (예 : 항체)에 대한 다양한 조건의 영향을 평가하기 위한 용도로 유용하다. 또 다른 구현예는 응용(application) 및 추가 규모 확대(scale up) 작업 지원에 필요한, 임의의 치수의 컬럼에 패킹된 다중 모드 리간드를 포함하는 고체상 지지체를 사용한다. 컬럼 직경은 1cm 이하에서 1m 이상의 범위 일 수 있고, 컬럼 높이는 특정 응용 분야의 요구 사항에 따라 1cm 이하에서 30cm이상의 범위 일 수 있다. 상업적 스케일에서의 응용은 일반적으로 컬럼 직경(ID)이 20cm 이상이고, 높이가 20cm 이상이다. 적절한 컬럼 치수는 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 막-타입(membrane-type) 크로마토그래피 컬럼은 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티 (양 또는 음)를 갖는 리간드가 부착된 하나 이상의 시트 형태의 지지체 물질을 포함한다. 상기 지지체 물질은 유기 물질 또는 무기 물질 또는 유기 및 무기 물질의 혼합물로 구성될 수 있다. 적합한 유기 물질은 아가로스 기반 물질과 메타크릴레이트이다. 적합한 무기 물질은 실리카, 세라믹 및 금속이다.

본 발명에 따른 높은 전도도의 조건은 전도도가 75 mS/cm 초과, 보다 바람직하게는 85 mS/cm 초과, 훨씬 더 바람직하게는 85 내지 120 mS/cm 인 조건을 지칭한다. 높은 전도도는 예컨대 1 M 및 그 이상 농도의 NaCl인, 증가된 염 농도에서 종종 나타날 수 있다. 염의 음이온은 바람직하게는 인산염, 설페이트, 클로라이드, 아세테이트, 브로마이드, 질산염, 염소산염, 요오드화물 및 티오시아네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 이온 일 수 있다. 염의 양이온은 바람직하게는 암모늄, 칼륨, 나트륨, 루비듐, 리튬, 마그네슘, 칼슘 및 바륨 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 이온 일 수 있다.

바람직한 염은 황산 암모늄, 황산나트륨, 황산 칼륨, 인산 암모늄, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 염화칼륨 및 염화나트륨 또는 이들의 혼합물이다. 당업자는 상이한 염이 상이한 정도로 전도도에 영향을 미칠 것이라는 것을 인식한다. 바람직한 구현예에서, 상기 염은 염화나트륨, 황산 암모늄 및 인산 칼륨을 포함하는 군으로부터 선택된다. 염의 이러한 그룹은 소수성 상호 작용을 강하게 촉진하는 이온을 생성하기 때문에 본 발명에 특히 적합하다. 대부분의 크로마토그래피 장치는 크로마토그래피 중에 사용되는 이동상 또는 완충액의 전도도 뿐만 아니라, 이의 상기 염 농도 및/또는 온도를 모니터링하는 장비에 맞추어 조정된 것 일 수 있다. 높은 전도도에서 관심 단백질을 포함하는 공급물을 로딩하면, 높은 전도도 조건 또는 높은 염 농도에서 관심 단백질이 수지에 결합한다.

일 구현예에서, 공급물의 로딩 및 관심 단백질의 다중 모드 크로마토그래피 수지에 대한 결합은 약 7 내지 9의 pH 및 0.5M 내지 3M의 염 농도 또는 75 mS/cm 이상, 바람직하게는 80 mS/cm 이상, 바람직하게는 85 mS/cm 이상, 바람직하게는 80 내지 120 mS/cm의 전도도에 상응하는 염 농도에서 발생한다. 추가 구현예에서, 상기 염 농도는 각각 1 M 내지 2 M의 NaCl 또는 0.5 M 내지 1 M 인산 칼륨이고, 또는 75mS/cm 이상, 더 바람직하게는 85 mS/cm, 바람직하게는 80 내지 120 mS/cm의 전도도에 상응하는 염 농도이다. 1M NaCl 미만에서의 결합은 음이온 교환 (AEX)에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)로 상호 작용 모드를 전환하기에는 너무 낮을 수 있는 반면, 2M NaCl 이상에서는 염석 효과(salting out effect)가 관찰 될 수 있고 완충액의 비용 효율성이 낮아질 수 있다. 7보다 낮은 pH는 수지에 대한 결합을 제한할 수 있는 반면, pH가 9를 초과하면 관심 단백질의 의도되지 않는 변형인 단백질 탈 아미드화(protein deamidation)가 초래될 수 있다. 전형적인 조건은 단계 (b)의 용리액 또는 pH 7 내지 8의 (20 내지 100mM) HEPES 또는 Tris 완충액의 1M 내지 2M NaCl 농도에서 유래한 용리액일 수 있다.

일부 구현예에서, 크로마토그래피 이동상 (즉, 상기 공급물) 및 고체상 (즉, 크로마토그래피 수지)의 조건은 다중 모드 크로마토그래피 단계를 수행하기 전에 상기 기재된 조건으로의 컨디셔닝 또는 평형화(equilibration)에 의해 조정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 크로마토그래피 이동상 (즉, 상기 공급물) 및 고체상 (즉, 상기 크로마토그래피 수지)의 조건은 이미 필요한 조건이 충족 되었을 수 있으므로, 컨디셔닝 또는 평형화에 대한 필요성을 생략 할 수 있다. 바람직하게는, 현재 개시된 본 발명의 다중 모드 크로마토그래피 단계 이전에 공급물로 이어지는 업스트림 공정 단계에서 사용되는 조건을 다중 모드 크로마토그래피 단계와 양립할 수 있도록 선택하여, 관심 단백질의 정제 전에 공급물의 컨디셔닝을 포함하는 하위 단계를 불필요하게 함으로써, 단백질 생산 공정의 일부로 상기 방법을 수행할 때 시간과 자원을 절약 할 수 있다.

상기 공급물의 조정 또는 컨디셔닝은 희석, 완충액 교환, 적정 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있음이 이해될 수 있다.

상기 공급물의 전도도 감소를 목표로 하는 컨디셔닝은 초순수(ultrapure) 또는 저염(low-salt) 완충 용액으로 상기 공급물을 희석하여 달성할 수 있다.

상기 공급물의 전도도 증가를 목표로 하는 컨디셔닝은, 예컨대 적당한 양의 5M 염화나트륨 용액인, 적당한 양의 염, 이들의 염 또는 용액의 조합으로 공급물을 원하는 전도도에 도달할 때까지 적정하여 달성 할 수 있다.

상기 공급물의 pH를 낮추는 것을 목표로 하는 컨디셔닝은, 예컨대 (0.2 M 내지 1.0 M) 염산 용액 또는 (1 M) 아세트산 용액인, 적당한 양의 산성 용액을 공급물에 보충함으로써 달성할 수 있다.

상기 공급물의 pH를 높이는 것을 목표로 하는 컨디셔닝은, 예컨대 (0.2M 내지 1.0M) 수산화나트륨 용액 또는 2M TRIS 염기성 pH 9.50 용액인, 적당한 양의 알칼리 용액을 공급물에 보충함으로써 달성할 수 있다.

상기 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에 공급물을 컨디셔닝하는 데 사용될 수 있는 다른 화합물은 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 상기 다중 모드 크로마토그래피에 대한 관심 단백질의 선택적 결합을 추가로 자극하는 당업계에 알려진 임의의 다른 화합물이다.

일부 구현예에서, 대규모(large scale) 단백질 정제 공정 중에, 상기 공급물은 종종 이미 본 발명에 적합한 조건으로 제공되지만, 선행 기술에 따른 방법에서는 사용하기에 부적합하므로, 선행 기술의 방법에 의한 추가 정제를 수행하기 전에 추가적인 컨디셔닝 단계를 필요로 할 수 있다. 따라서 본 발명은 이러한 중간 단계가 제거되도록 하여 단백질 생산 공정의 단계 수를 감소시켜 효율성 및 수행력(performance)을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 상기 공급물을 상기 다중 모드 교환기와 접촉시키기 위한 준비(preparation)에서, 공급물의 로딩 및 교환기에 대한 관심 단백질의 결합을 위해 양립 가능한 조건을 달성하기 위해 다중 모드 교환기를 평형화하는 것이 당업계에서 통상적인 관행이다.

상기 교환기의 평형화(equilibration)는 적절한 pH, 전도도, 염의 농도 등을 설정하기 위해 평형 완충액을 교환기를 통해 흘려보냄으로써 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 평형 완충액은 특정 단백질의 결합 요건에 따라 임의의 광범위한 옵션을 포함 할 수 있다. 상기 평형 완충액은 일반적으로 적당한 pH 조절을 제공하기 위해 완충(buffering) 화합물을 포함한다. 완충 화합물은 MES, HEPES, BICINE, 이미다졸, Tris, PBS와 같은 인산염, 시트레이트 또는 아세테이트, 또는 상기 또는 다른 완충액의 일부 혼합물을 포함 할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 평형 완충액에서 완충 화합물의 농도는 일반적으로 관심 단백질에 따라 20 내지 100mM 범위이다. 평형 완충액의 pH는 약 pH 4.0 내지 pH 9.5, 보다 바람직하게는 6 내지 8 범위일 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 6 미만의 pH는 일반적으로 결합을 손상시키고, 9를 초과하는 pH는 단백질의 의도하지 않은 변형을 초래할 것이다. 상기 평형 완충액은 또한 필요에 따라 용액의 이온성 강도 또는 전도도를 조정하기 위해 염을 포함 할 수 있다. 예컨대, 적합한 염은 황산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 인산암모늄, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

다중 모드 교환기에서 관심 단백질의 용리는 용리 완충액의 도움으로 수행 될 수 있다. 구배 용리(gradient elution)와 등용매 용리 모두 용리 옵션에 속한다. 등용매 용리되는 동안, 이동상의 조성은 공정 전반에 걸쳐 일정하게 유지된다. 대조적으로, 구배 용리되는 동안, 이동상의 조성은 용리 과정에서 변경된다.

구배 용리를 선택하는 경우, 용리 완충액의 pH를 점진적으로 감소시키는 단계 또는, 용리 완충액의 염 농도(예컨대, NaCl)를 점진적으로 감소시키는 단계 또는 두가지 모두에 의해 용리될 수 있다.

일 구현예에서, 용리는 상기 용리 완충액의 pH를 7 미만으로 점진적으로 및 단계적으로 감소시킴으로써 발생한다. 추가 구현예에서, 상기 용리 완충액의 pH는 pH 8에서 적어도 약 5.5 이하의 pH로 단계적으로 감소된다. 또 다른 구현예에서, 용리는 용리 완충액의 염 농도를 0.5M 이하의 염 농도로 점진적으로 및 단계적으로 감소시킴으로써 발생한다. 추가 구현예에서, 상기 염 농도는 예컨대 2M 또는 1M인 사용된 로딩 조건으로부터, 0.5M 이하로 갈 것이다 (완충액 농도는 동일하게 유지). 바람직하게는 NaCl, (NH4)₂S0₄ 또는 KP0₄ 용액이 사용된다. 추가 구현예에서, 상기 기술한 조건을 따라, 용리 완충액의 pH 감소 및 염 농도 감소에 의해 용리가 달성될 수 있다.

상기 염 구배의 구배 용리 뿐만 아니라 상기 pH 구배의 구배 용리에서 필요한 단계의 양은 정제될 단백질의 특성 의존적이다.

대안적으로, 등용매 용리가 사용되며, 상기 용리 완충액은 일정한 염 농도 또는 일정한 pH를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 용리 완충액은 5mM 내지 500mM, 보다 바람직하게는 10mM 내지 450mM의 염 농도를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는 NaCl, (NH₄)₂S0₄ 또는 KP0₄가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 상기 용리 완충액의 pH는 약 5.5 내지 7 일 수 있고, 예컨대 6 일 수 있다. 일 실시예로 pH 6의 MES 완충액일 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이 pH 및 염 농도의 조합이 관심 단백질 용리에 모두 사용될 수 있다. 일 실시예로 pH 6의 50mM MES 및 350mM NaCl 완충액일 수 있다.

용리는 일반적으로 약 3 내지 20 컬럼 부피에 걸쳐 발생한다. 사용 후, 다중 모드 수지는 선택적으로 클린(cleaned), 박리(stripped), 살균(sanitized) 및 적절한 제제 내에 보관된 수 있으며, 선택적으로 재사용 할 수 있다. 수지의 박리를 위한 절차는 예컨대, 50mM 내지 150mM인, 아세트산으로 수지를 처리하는 것을 포함한다.

단백질의 로딩/결합과 용리 사이에, 하나 이상의 세척(wash) 단계가 수행 될 수 있다. 세척은 컬럼을 재 평형화하고 용리 전에 약하게 결합된 불순물을 제거하는 데 유리할 수 있다. 세척 완충액은 다중 모드 교환기를 평형화하는 데 사용되는 완충액과 동일하거나 크로마토그래피 다중 모드 교환기로부터 표적 화합물의 탈착없이, 약하게 결합된 불순물이 탈착되는 pH 및 전도도를 갖도록 조절된다. 세척 완충액은 예컨대, Tris, HEPES, 인산염, BICINE, MES 트리에탄올아민, 염화나트륨, 인산암모늄, 황산나트륨 및/또는 인산칼륨을 함유 할 수 있다. 일부 구현예에서, 세척 조건은 일반적으로 다양하며, 수지/ 관심 단백질 각각의 조합에 대해 실험적으로 선택되어야 한다.

상기 완충 물질(buffering agent)과 상기 염이 동일한 화학 물질인 경우, 시료를 재조정할 필요없이 용리 중에 전도도 또는 염 농도와 같은 조건을 변경할 수 있다는 추가적인 이점이 있다. 따라서 일 구현예에서, 사용되는 완충 화학 물질(buffering chemical)은 수지에서 용리를 유도하는 데 사용되는 염과 동일하다. 예컨대, 인산염이 완충 물질로 사용되는 경우, 바람직하게는 인산칼륨이 수지로부터의 용리에 관여하는 염으로 사용될 수 있다. 이는 정제 절차 중에 필요한 화학 물질/완충액의 수와 단계의 수를 줄임으로써, 보다 빠르고 효율적인 정제 공정을 구현하고, 결국 공정 비용을 절감 할 수 있다.

상기 공급물은 예컨대, 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 효소, 재조합 단백질 또는 세포에 의해 발현되는 기타 단백질인, 하나 이상의 관심 단백질을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 관심 단백질은 항체, 바람직하게는, 예컨대 단일 클론 항-TNFa 항체인, 단일 클론 항체이다. 다른 구현예에서, 상기 관심 단백질은 항체 단편이다.

일부 구현예에서, 본 방법에 따라 정제 될 수 있는 항체는 등전점(isoelectric point)이 6.0 이상, 바람직하게는 7.0 이상, 더욱 바람직하게는 7.5 이상인 항체이다. 이러한 항체는 G, A 또는 M 클래스의 면역 글로불린 일 수 있다. 상기 항체는 인간, 비-인간 (예컨대, 설치류) 또는 키메라 (예컨대, "인간화된") 항체 일 수 있거나, 상기 언급된 면역 글로불린의 서브 유닛일 수 있거나, 또는 면역 글로불린의 부분 및 다른 (비-면역 글로불린) 단백질로부터 유래하거나 동일한 부분으로 구성된 하이브리드 단백질 일 수 있다. 본 발명에 기술된 방법에 의한 항체 물질은 일반적으로 98 % 이상, 바람직하게는 99 % 이상, 더욱 바람직하게는 99.9 % 이상, 가장 바람직하게는 99.99 % 이상의 매우 높은 순도 (단백질 함량 참조)를 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 단백질 생산 및 후속 정제의 대규모 상업적 공정은 초기 정제 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 종종 폴리싱으로 지칭되는 최종 정제 단계를 포함 할 수 있다. 높은 수준의 단백질 순도를 달성하기 위해 필요하나, 폴리싱은 상당한 단백질 수율 손실을 초래할 수 있으며, 이는 상업적 관점에서 피해야한다. 일 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 단백질 정제 방법은 단백질 생산 및 정제 공정 동안 오직 최종 정제 단계만을 수행한다. 본 발명의 상기 방법의 향상된 효율성으로 인해, 하나의 단일 정제 또는 크로마토그래피 단계는 선행 기술의 연속적인 정제 또는 크로마토그래피 단계의 복잡한 작업을 수행하기에 충분하다. 따라서 본 발명의 방법은 단백질 생산 및 정제 공정 동안 필요한 단계의 수를 감소시킬 수 있다. 단계의 수를 감소시키면 단백질 품질, 순도 또는 수율의 감소없이 공정에 필요한 장비, 소모품의 수, 정제 및 OPEX를 수행하는 데 필요한 시간을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 방법은 예컨대, 재조합 단백질, 특히 단일 클론 항체인, 정제된 단백질의 산업적 수준의 생산에 대해 현저한 이점을 제공한다. 따라서, 또 다른 또는 추가 구현예에서 본 발명에 기술된 상기 단백질 정제 방법은 폴리싱 단계, 바람직하게는, 대규모 단백질 생산 공정 동안의 폴리싱 단계로서 사용된다. 본 발명의 상기 폴리싱 단계는 생산 공정의 수율을 손상시키지 않으면서 고순도의 정제된 단백질 산물을 얻는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 단백질 정제 방법은 폴리싱 단계로서 사용되며, 상기 폴리싱 단계는 하나 이상의 이전 단계에 후행하며, 상기 단계는 세포 배양액 수확물의 정화 또는 크로마토그래피 단계 또는 둘 모두 일 수 있다. 단백질 생산 공정 동안, 상기 세포 배양액 수확물에 수행되는 정화 단계는 크루드(crude)한 세포 배양액 수확물에서 세포 이물질 및 기타 오염 물질을 제거한다. 세포 배양액 수확물은 일반적으로 생물 반응기에서 세포를 배양하여 얻는다. 정화의 결과로, 다운스트림 공정 단계에 적합한 관심 단백질을 포함하는 공급물이 얻어진다. 바람직하게는, 상기 방법은 PCT/EP2018/058366 및 US62/670,220에 따른 정화 단계를 사용할 수 있으며, 그 내용은 그 전체로써 본 발명에 참조로 포함된다. 즉, 상기 정화 단계는 세포 배양액 수확물에서 응집체(floccules)의 형성을 기반으로하고, 뒤이어 상기 응집체를 효율적으로 제거하여, 관심 단백질을 포함하는 공급물을 형성한다.

본 발명에 있어서, 상기 방법의 정화 단계는 음이온 교환 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 음이온 교환 단계는 액체 음이온 교환 단계이다. 일 구현예에서, 상기 액체 음이온 교환 단계는 전기적 양성 화합물(electropositive compound)을 세포 배양액 수확물에 첨가함으로써 수행된다. 전기적 양성 화합물은 예컨대, 숙주 세포 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산 및 숙주 세포 바이러스인, 숙주 세포 유래의 음으로 하전된 성분에 결합하는 것일 수 있으며, 상기 예시에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 세포 정화 동안 음이온 교환 단계를 포함하는 것의 한 가지 이점은 세포 배양액 수확물 내 바이러스 성분의 감소에 대한 전기적 양성 화합물의 잠재적인 기여이다. 전기적 양성 화합물은 예컨대, 비드(bead) 또는 심층 필터에 결합된 것과 같은 고체상 또는 용해성 화합물로 상기 정화 동안에 제공되어, 액체 음이온 교환 단계를 수행한다.

적합한 전기적 양성 화합물은 예컨대, 전기적 양성 다당류, 전기적 양성 폴리머, 키토산, 예컨대 탈 아세틸화된 키토산인 키토산 유도체, 예컨대 폴리-디-알릴 디-메틸암모늄 클로라이드(pDADMAC 또는 polyDDA)인 합성 폴리머, 벤질화된 폴리(알릴아민) 및 폴리에틸렌이민, 예컨대 TREN (BioWorks, WorkBeads TREN, high)인 상업적으로 이용가능한 입자 또는 예컨대 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB로 알려짐)인 양이온성 계면 활성제, 또는 이들의 임의의 조합인, 임의의 전기적 양성으로 하전된 화합물일 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 전기적 양성 폴리머는 응집제(flocculation agent) 역할을 하는 것일 수 있으며, 이는 숙주 세포 DNA 및 RNA와 같은 음으로 하전된 여러 오염물과 동시에 결합하여 플로(floe)를 형성 할 수 있기 때문이다. 상기 언급된 전기적 양성 화합물은 본 발명의 상기 방법에 따라 DE를 사용한 여과와 조합되었을 때 매우 잘 수행되는 것(플로 형성 및 플로의 크기)을 확인하였다.

또 다른 구현예에서, 7 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 지방산 및 그의 유도체 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물 또는 우레이드(ureide)가 (a) 단계 동안 세포 배양액 수확물에 추가로 첨가될 수 있다. (a) 단계의 상기 상이한 화합물은 상기 세포 배양액에 동시에 첨가되기 전에 혼합될 수 있다. 이는 정화된 세포 배양액을 얻기 위해 필요한 단계의 수를 감소시키기 때문에 유리하다. 또한, (a) 단계의 상기 화합물은 세포 배양액에 별도로, 순차적으로 및/또는 교차적으로 첨가 될 수 있다.

상기 우레이드 및 지방산은 특히 본 발명에 따른 방법의 (a) 단계에서 숙주 세포 배양 관련 불순물의 침전 및 응집(flocculation)을 (추가로) 유도하는데 적합하다. 한편, 탄소 원자가 7 내지 10 개인 지방산은 소수성 숙주 세포 유래 불순물과 소수성 상호 작용을 하여 집적(agglomeration)을 일으키는 것일 수 있다. 적합한 지방산은 에난트산 (헵탄산), 카프릴산 (옥탄산), 펠라르곤산 (노난산), 카프르산 (데칸산) 또는 이들의 임의 조합 일 수 있다.

상기 지방산은 지방산 유도체, 예컨대 지방산 염, 예컨대 나트륨염, 예컨대 나트륨카프릴레이트와 같은 형태로 첨가되는 것 일 수 있다. 반면에, 우레이드는 예컨대, 수소 결합을 통해 용액의 불순물과 상호 작용하여 결합제로 작용하는 것일 수 있다. 우레이드는 요소에서 유래한 유기 화합물이며, 고리형 또는 비고리형 구조를 가질 수 있다. 우레이드는 알란토인 및 알란토산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

세포 배양물에 첨가되는 상기 화합물은 수확물에 존재하는 불순물의 침전 및/또는 불순물, 침전물 또는 미립자의 응집(aggregation) 또는 집적(agglomeration)을 자극하는 것 일 수 있다. 특히, 침전된 분획은 예컨대 숙주 세포, 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA인, 숙주 세포 불순물을 포함한다. 숙주 세포 불순물의 응집(flocculation)은 첨가된 화합물이 세포 배양액 수확물에 존재하는 숙주세포 관련 불순물과의 소수성 상호 작용, 이온성 상호 작용 및/또는 수소 결합 또는 상호 작용의 다른 메커니즘을 발휘하는 능력에 의해 달성된다. 침전된 분획은 숙주 세포에 존재하는 바이러스 성분을 추가로 포함할 수 있다. (a) 단계의 상기 세포 정화는 여러 가지 방식으로 공급물의 바이러스 제거에 기여한다. 첫째, 중간 사슬 지방산(medium chain fatty acid)은 항 바이러스 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이전에 바이러스 입자의 침전을 유발하는 것으로 나타났다. 마지막으로, (a) 단계에서 사용되는 전기적 양성 화합물은 바이러스 입자와의 정전기적 상호 작용을 기반으로 바이러스 입자와 결합 할 수 있다. 따라서 (a) 단계는 공급물의 바이러스 제거에 크게 기여한다.

상기 기재된 화합물의 첨가와 동시에 또는 후속 단계에서, DE를 세포 배양액 수확물에 첨가하고 표면, 바람직하게는 필터 표면을 갖는 지지 필터 (DE에 불투과성)에 DE 층 또는 케이크가 형성되도록 하고, 여기에서 상기 필터 표면은 수평(horizontal), 편평(flat) 또는 디스크 형(disc-shaped) 표면일 필요는 없으며, 예컨대 양초 모양 일 수 있다. 특정 필터의 구현예는 US62/670,220에 개시되어 있으며, 그 전체가 여기에 참조로 포함된다. 즉, 이러한 베슬(vessel)은 플렉서블(flexible) 라이너(liner) 및 백플러시 소스를 포함하고, 상기 여과 베슬은 표면 위에 동적 필터 매체(dynamic filter media)가 케이크로 축적된 하나 이상의 필터를 포함하고, 상기 케이크 및 하나 이상의 필터는 여과 작동 중에 표적 분자를 포함하는 여과액이 통과할 수 있도록 조정(adapted)되며, 상기 케이크는 여과 작동 중에 원하지 않는 고형 물질이 통과하는 것을 예방하도록 조정된 것이다; 상기 백플러시 소스는 백플러시 유체를 포함하며, 하나 이상의 필터를 통해 여과 베슬에 유체적(fluidly)으로 연결되고, 상기 백플러시 소스는 백플러시 작동 중에 필터에 형성된 케이크를 제거하기 위해 하나 이상의 필터를 통해 백플러시 유체를 다시 공급하도록 조정된 것이다. 일 구현예에서, 상기 여과 베슬은 표면 위에 동적 필터 매체가 케이크로 축적된, 하나 이상의 양초 필터를 포함하고, 상기 케이크 및 하나 이상의 필터는 정상 작동 중에 표적 분자를 포함하는 여과액이 통과할 수 있도록 조정되며, 상기 케이크는 정상 작동 중에 상기 원하지 않는 고형 물질이 통과하는 것을 예방하도록 조정되고, 상기 여과 베슬은 세포 배양액 수확물 용액을 수용(receive)하고, 하나 이상의 양초 필터와 유체 소통(fluid communication)하는 플렉서블 라이너를 포함한다. 일 구현예에서, 여과 베슬은 플렉서블 라이너를 수용하기 위한 강성(rigid) 또는 반 강성(semi rigid) 외부 용기를 포함한다. 일 구현예에서, 플렉서블 라이너를 접기 위한 작동기가 존재한다. 상기 플렉서블 라이너는 배수구(drain) 또는 교반기(agitator)를 포함 할 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 양초 필터가 플렉서블 라이너 내에 매달려있는 것 일 수 있다.

이러한 DE 케이크는 복수의 채널 또는 경로를 포함하는 구조를 포함한다. DE 층 또는 케이크를 통해 응집체(floccule)를 포함하는 세포 배양액 수확물을 여과하는 경우, 예컨대 세포, 세포 이물질 및 상기 수득된 용액의 다른 큰 비-표적 화합물과 같은 큰 물질은 DE 케이크 구조에 의해 유지되는 반면, 크기가 작은 표적 단백질은 DE 케이크 구조의 채널을 통해 흐른다. 이러한 흐름을 원활하게 하기 위해, 펌프 또는 다른 압력 분배 보조 장치(pressure dispense aid) 또는 다른 유체 구동 메커니즘이 하기 구현예에서 더 설명되는 바와 같이 사용될 수 있다.

여과를 원활하게 하기위한 DE의 사용은 통상적인(routine) 정화를 복잡하게 만드는 경향이 있는 응집(flocculation) 후 세포 배양액의 물리적 변화에 의한 한계를 극복한다. 예컨대, 심층 여과(depth filtration)의 경우 형성된 침전물을 포함하는 첫번째 용액을 정화하기 위해 심층 필터의 매우 중요한 표면이 필요하다. DE를 사용하는 것은 세포 정화 단계의 품질을 손상시키지 않으면서 공정 시간 단축, 공정 단계 감소, 공정 재료 감소, 장비 및 용액 절감 등 상당한 운영상의 이점을 얻을 수 있다. 마지막으로, 응집된 세포 배양액 수확물의 여과는 관심 단백질을 포함하는 공급물을 생성한다.

본 발명의 방법의 상기 언급된 구현예에 따른, 상기 폴리싱 단계에 선행하는 크로마토그래피 단계는 예컨대, 정화 공정의 일부로서 수행되는 액체 이온 교환 크로마토그래피를 지칭하는 것 일 수 있다. 추가 구현예에서, 폴리싱 단계에 선행하는 상기 크로마토그래피 단계는 폴리싱 단계 전에 정화된 세포 배양액 수확물에 수행되는 이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 친화성 크로마토그래피 단계에 기초한 단백질 포획 단계를 지칭 하는 것 일 수 있다. 다른 또는 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 다중 모드 크로마토그래피 폴리싱용 공급물은 크로마토그래피 단계의 통과 분획 또는 이의 유래 분획이다. 본 발명에 따른 폴리싱 단계에 선행하는 단계에서 주요 불순물을 제거하는 것은 폴리싱 단계에서의 개선된 성능을 나타낸다.

단백질 공정 중에, 관심 단백질 및 바이러스를 포함하는 공급물은 일반적으로 바이러스 불활성화 단계 또는 공정을 거치게 된다. 바이러스 비활성화 후에도 상기 바이러스 또는 바이러스 입자는 여전히 공급물에 존재하며, 이를 효율적인 방식으로 제거하는 것이 필요하고, 이는 높은 단백질 수율과 순도를 보장한다. 바이러스 불활성화는 낮은 pH를 사용하여, 본 발명에 따른 폴리싱 단계에 선행하는 단계에서 달성될 수 있고, 이에 따라 공급물에서 바이러스를 불활성화시킬 수 있으며, 따라서 공급물은 불활성화 된 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 것 일 수 있다. 바이러스 불활성화 후 본 발명의 단백질 정제 방법을 수행함으로써 고수율의 매우 순수한 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 방법에 따른 크로마토그래피 단계는 회분식 모드에서 수행되는 것 일 수 있다. 대안적으로, 상기 크로마토그래피 단계는 연속 모드에서 수행된다. 회분식 모드에서 수행될 때, 모든 공급물이 로드되고 후속적으로 용리될 때까지, 상기 크로마토그래피 단계는 하나의 컬럼 (단일 컬럼 회분) 또는 다중 컬럼 (병렬적 회분)에 걸쳐 반복된다. 상기 용리액 또는 풀링된(pooled) 용리액은 각각 다음 정제 단계로 진행하기 전에 선택적으로 풀링된다. 대안적으로, 상기 크로마토그래피 단계는 정제 방법의 각 단계가 동시에 수행되고, 연속적으로 단일 컬럼 또는 다중 컬럼에 로드되고 용리되는, 연속 공정으로써 수행되는 것 일 수 있다. 고전적인 회분식-작업 순서는 장비의 특정 조정이 필요하지 않고, 종종 고순도의 단백질을 생성하지만, 상기 방법은 병렬 컬럼 연속 모드 공정에서 수행하는 데 적합하다. 연속 모드는 단백질 정제 공정의 효율성이 증가함에 따라 더 높은 생산성을 달성할 수 있는 추가적인 이점을 제공한다. 또한 연속 모드는 대규모의 정제 규모에 필요한 소모품의 양을 줄여 단백질 정제 비용을 줄이는 데 도움을 준다. 예컨대, 연속 모드 크로마토그래피를 사용하면 정제 단계의 생산성을 저하시키지 않고 크로마토그래피 컬럼 크기를 줄일 수 있다.

본 발명은 전술한 어떠한 형태의 실시에도 제한되지 않으며, 첨부된 청구 범위의 재평가없이 일부 수정이 추가 될 수 있음을 가정한다.

도면의 상세한 설명

도 1은 단백질 생산 및 정제의 대규모 상업적 공정의 개요를 나타낸 흐름도이다.

단백질 생산 및 후속 정제의 대규모 상업적 공정은 종종 초기 정제 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 종종 폴리싱으로 지칭되는 최종 정제 단계를 포함한다. 높은 수준의 단백질 순도를 달성하기 위해 필요하나, 폴리싱은 상당한 단백질 수율 손실을 초래할 수 있으며, 이는 상업적 관점에서 피해야한다.

상기 정화 단계 (1)은 세포 배양액 수확물에서 수행되며 크루드(crude)한 세포 배양액 수확물에서 세포 이물질 및 기타 오염 물질을 제거한다. 세포 배양액 수확물은 일반적으로 생물 반응기에서 세포를 배양하여 얻는다. 정화의 결과로, 다운스트림 공정 단계에 적합한 관심 단백질을 포함하는 공급물이 얻어진다.

상기 방법의 구현예에 따른 폴리싱 단계에 선행하는 첫번째 단백질 정제 단계 (2)는 정화된 세포 배양액 수확물에 수행되는 이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 친화성 크로마토그래피 단계에 기초한 단백질 포획 단계를 포함하는 것 일 수 있다.

단백질 공정 중에, 관심 단백질 및 바이러스를 포함하는 공급물은 일반적으로 바이러스 불활성화 단계 (3)을 거치게 된다. 바이러스 불활성화는 낮은 pH를 사용하여, 본 발명에 따른 폴리싱 단계에 선행하는 단계에서 달성될 수 있고, 이에 따라 따라서 공급물에서 바이러스를 불활성화시킬 수 있으며, 따라서 상기 공급물은 여전히 불활성화된 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 것 일 수 있다.

종래 기술의 방법은 정제된 관심 단백질의 높은 순도를 달성하기 위해, 여러 폴리싱 단계와 중간 한외 여과 또는 심층 여과 단계를 결합한다. 본 발명의 상기 단백질 정제 방법으로 상기 폴리싱 단계 (4)를 사용하는 경우, 다중 모드 이온 교환 크로마토그래피 단계의 사용에 기초하여, 종래 기술 방법의 여러 단계가 단일 단계로 감소된다. 도 1에서는 음이온 교환이 예로서 도시되어 있지만, 당업자는 양이온 교환에도 상기 옵션에 똑같이 적용되는 것을 이해할 것이다.

다중 모드 이온 교환기을 사용하면 정제 공정을 마치고 단백질 순도를 손실하지 않으면서 정제 공정 시간, 공간 및 소모품을 절감할 수 있다. 폴리싱 단계 (4)는 관심 단백질의 정제를 유도하는 것 일 수 있다.

선택적으로, 상기 정제 공정은 추가적인 바이러스 여과 단계 (5) 및 제형 단계 (6)을 포함하는 것 일 수 있다.

도 2는 본 발명에 개시된 구현예에 따른 단백질 정제 방법의 개요를 나타낸 흐름도이다.

관심 단백질의 정제를 위한 본 발명 방법의 상기 구현예는 다중 모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용한다. 이 구현예에 따른 다중 모드 크로마토그래피 수지에 대한 관심 단백질의 로딩 및 결합 (9)는 pH 약 7 내지 9 및 75 mS/cm 이상의 높은 전도도에서 발생한다. 높은 전도도 조건은 다중 모드 교환기의 소수성 특성으로의 전환이 나타나고, 이에 따라 관심 단백질과 다중 모드 이온 교환기의 상호 작용은 상기 단백질의 소수성 특성과 다중 모드 이온 교환 리간드의 소수성 모이어티에 기초하여 나타난다. 이러한 전환은 다중 모드 크로마토그래피 수지의 분리 특성(예컨대, 단백질의 단량체 형태(예컨대 항체)에 대한 선택성)을 성공적으로 조절할 수 있게 한다. 또한, 크로마토그래피의 상기 전환은 항체 전하 변이체들을 각각 선택적으로 분리 할 수 있다. 동시에, 숙주 세포 단백질 및 DNA의 감소는 물론 바이러스 입자의 감소와 같은 음이온 교환 크로마토그래피의 모든 주요 속성도 보존된다. 따라서 상기 방법에 의하면, 고품질의 고순도 단백질 샘플을 얻을 수 있다.

상기 크로마토그래피 수지 뿐만 아니라 관심 단백질을 포함하는 공급물의 조건은 다중 모드 크로마토그래피 단계를 수행하기 전에 컨디셔닝 (7) 및 평형화 (8)에 의해 상기 기술된 조건으로 조정되거나, 상기 기술된 조건을 충족한 것 일 수 있다. 상기 공급물의 높은 전도도로의 컨디셔닝 (7)은 적당한 양의 염 또는 염의 조합을 공급물에 보충하여 수행될 수 있다. 관심 단백질의 다중 모드 이온 교환 수지에 대한 로딩 및 결합 (9) 후에, 상기 수지를 컬럼 부피의 3 내지 20 배의 부피로 2 회 세척 (10) 한다. 이는 컬럼에서 결합되지 않거나 약하게 결합된 오염 물질을 제거할 수 있다.

상기 정제된 단백질은 등용매 또는 구배 용리를 사용하여 다중 모드 교환 크로마토그래피 수지로부터 용리된다. 본 발명의 구현예에서, 등용매 용리는 250mM 내지 500mM의 염 농도 및 pH 5.5 내지 6.6의 용리 완충액으로 수행된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 내용을 추가로 명확하게 하기위한 것이지, 청구범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1. 항체의 정제

관심 항체를 함유하는 단백질 용액을, AKTA 150 크로마토그래피 시스템을 사용하여 결합-용리(bind-elute) 모드에서 다중 모드 크로마토그래피 매트릭스인 Capto Adhere Impres(GE Lifesciences)에 통과시켰다. 컬럼을 50mM HEPES 완충액, 2M NaCl, pH 7.0으로 평형화(equilibrate)시켰다. 30 g/l에서 컬럼 매트릭스에 결합시킨 후, 컬럼을 50mM HEPES 완충액, 1.5M NaCl, pH 7.0으로 세척하였다. 관심 단백질을 50mM HEPES 완충액, 35 M NaCl, pH 7.0으로 등용매 용리하여 컬럼으로부터 용리시켰다. SEC-HPLC로 평가된 바와 같이, 상기 컬럼 단계 후에 관심 항체 순도가 98 % 이상 달성되었다.

실시예 2.

10L 세포 배양액에서 유래한 농도 7mg/ml의 친화성 정제된 아달리무맙(Adalimumab) 항체 약 10ml가 본 실시예에 사용되었다.

pH 9.4의 2M 트리스-베이스 용액을 사용하여 중화를 수행하였으며, 중화 후 용액의 pH는 7.0이었다. 이 용액의 사용에 의해, 친화성 용리된 단백질의 pH는 pH 3.5에서 pH 7.7로 상승하였다. 중화 후, 친화성 크로마토그래피의 용리된 주요 분획의 전도도는 5.4 mS/cm였다. 상기 크로마토그래피의 용리된 주요 분획은 농축된 5 M NaCl 용액을 사용하여 약 92 mS/cm의 전도도로 재 조절하였다. 이 염의 농도는 그의 결합 완충액 전도도에 매칭되는 것이다. 또한, 용액의 pH는 15O㎕의 5M NaOH를 사용하여 pH 7.0로 조정하였다.

재조정 단계 후, AKTA 15O 크로마토그래피 시스템 (GE Lifesciences)에 맞추어 베드 부피를 4.7ml로 하여, 상기 단백질을 혼합 모드 양이온 교환기 Capto MMC HiScreen (0.8x10cm) 컬럼에 200 cm/hr로 로딩하였다. 로딩 전에, 컬럼을 pH 7.0의 1M KP0₄ 완충액으로 평형화(equilibrate)시켰다. 로딩은 14 mg/ml의 매트릭스 및 3 분 체류 시간(residence time)으로 수행하였고, 컬럼은 동일한 완충액으로 세척되었다(제 1 세척). 제 1 세척 단계 후, 상기 단백질을 pH 7.0의 10mM KP0₄ 완충액으로 컬럼으로부터 용리시켰다. 상기 크로마토그램에 의한 관심 단백질의 우수한 수율을 확인하였다(도 3 참조). 본 개시에 따른 구현 예들의 추가적인 실시예들을 표 1에 나타내었다.

표 1. 개시된 방법의 구현예에 따른 다중 모드 크로마토그래피의 조건

본 발명의 바람직한 구현예가 여기에 도시되고 설명되었지만, 이러한 구현예는 단지 예시로서 제공되는 것이 당업자에게 명백하다. 다수의 변형, 변경 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에 의해 일어날 수 있다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위, 이들 청구범위에 속하는 방법 및 구조, 및 그것들에 속하는 등가물을 정의하는 것으로 의도된다.

Claims (27)

1. 관심 단백질을 정제하는 방법으로, 상기 단백질은 공급물에 존재하고, 상기 방법은 다중 모드 크로마토그래피 단계를 포함하며, 상기 공급물은 소수성 모이어티 및 하전된(charged) 모이어티를 갖는 리간드를 포함하는 다중 모드 이온 교환기와 접촉하며, 상기 관심 단백질의 상기 교환기로의 결합(binding)은 높은 전도도(conductivity) 조건 하에서 일어나는 것인, 관심 단백질을 정제하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 공급물은 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에 적당한 양의 염 또는 염의 조합이 보충되는 것인, 방법.
   
3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급물은 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에 적당한 양의 황산 암모늄(ammonium sulfate), 황산나트륨(sodium sulfate), 황산 칼륨(potassium sulfate), 인산 암모늄(ammonium phosphate), 인산 나트륨(sodium phosphate), 인산 칼륨(potassium phosphate), 염화칼륨(potassium chloride), 염화나트륨(sodium chloride) 또는 이들의 혼합물이 보충되는 것인, 방법.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합(binding)하는 동안 상기 공급물의 상기 염의 농도는 0.5M 내지 3M인, 방법.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결합(binding)하는 동안 상기 공급물의 상기 염의 농도는 1M 내지 2M인, 방법.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하전된 모이어티가 양 또는 음으로 하전된 것인 방법.
   
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 모드 교환기는 양 및 음으로 하전된 모이어티를 모두 갖는 것인, 방법.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 모드 교환기는 상기 컬럼의 이온 교환 이외의 추가적인 상호 작용 기능을 허용하는, 예컨대 소수성 상호 작용 가능 모이어티 또는 수소 결합 가능 모이어티와 같은, 추가 모이어티를 포함하는 것인, 방법.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급물은 다중 모드 크로마토그래피 단계 전에, 적당한 양의 산성 용액 또는 적당한 양의 알칼리 용액이 보충되는 것인, 방법.
   
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합은 약 7 내지 9의 pH에서 나타나는 것인, 방법.
    
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 폴리싱(polishing) 단계로 사용되는 것인, 방법.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 단독 폴리싱 단계인, 방법.
    
13. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리싱 단계는 세포 배양액 수확물의 정화(clarification) 단계 및 크로마토그래피 단계에 후행하는 것인, 방법.
    
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 구배용리되는 단계, 용리 완충액의 pH를 7 이하로 점차적으로 감소시키는 단계, 및/또는 용리 완충액의 염 농도를 0.5M 이하로 점차적으로 감소시키는 단계에 의해, 상기 다중 모드 교환기에서 용리되는 것인, 방법.
    
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 용리 완충액을 사용한 등용매 용리에 의해 상기 다중 모드 교환기로부터 용리되고, 상기 용리 완충액은 10mM 내지 500mM의 염 농도 및/또는 5.5 내지 7의 pH를 갖는 것인, 방법.
    
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급물은 불활성화된 바이러스를 포함하는 것인, 방법.
    
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 모드 크로마토그래피용 상기 공급물은 크로마토그래피 단계의 통과 분획 또는 이의 유래 분획인, 방법.
    
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항체인, 방법.
    
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 회분식 모드(batch mode) 또는 연속 크로마토그래피 모드로 수행되는 것인, 방법.
    
20. 하기를 포함하는 키트:
    소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함하는 다중 모드 크로마토그래피 수지; 및
    0.5 내지 3 M의 염 농도 및/또는 75 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 완충액.
    
21. 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드; 및 상기 소수성 모이어티에 결합한 단백질을 포함하는 다중 모드 이온 교환기.
    
22. 제21항에 있어서, 로딩 전에 상기 단백질이 0.5 내지 3 M의 염 농도 및/또는 75 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 완충액에 존재하는 것인, 다중 모드 이온 교환기.
    
23. 제21항에 있어서, 0.5 내지 3 M의 염 농도 및/또는 75 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 완충액을 포함하는, 다중 모드 이온 교환기.
    
24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 7 내지 9의 pH를 갖는 완충액을 포함하는, 다중 모드 이온 교환기.
    
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 모드 교환기는 상기 컬럼의 이온 교환 이외의 추가적인 상호 작용 기능을 허용하는, 예컨대 소수성 상호 작용 가능 모이어티 또는 수소 결합 가능 모이어티와 같은, 추가 모이어티를 포함하는, 다중 모드 이온 교환기.
    
26. 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 갖는 리간드를 포함하는 다중 모드 이온 교환기를 포함하고, 7 내지 9의 pH 및 0.5 M 내지 3 M 의 염 농도를 갖는 단백질 공급물을 더 포함하는, 단백질 정제 시스템.
    
27. 제26항에 있어서, 상기 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티는 분리된 리간드 상에 있는 것인, 단백질 정제 시스템.
    

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