KR102643328B1 - Il-17 항체 내의 시스테인 잔기의 선택적 환원 - Google Patents

Il-17 항체 내의 시스테인 잔기의 선택적 환원 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제제 (예를 들어, 세쿠키누맙(secukinumab) 항체의 제제) 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법에 관한 것이다. 소듐 도데실 술페이트 모세관 전기영동 (CE-SDS)으로 측정 시 제제 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 수준이 높고, 예를 들어, 적어도 약 90％이며, 양이온 교환 크로마토그래프 (CEX)로 측정 시 제제 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 활성의 수준이 높고, 예를 들어, 적어도 약 92％인, 이같은 방법에 의해 생산된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 정제된 제제, 예를 들어, 세쿠키누맙의 정제된 제제가 또한 제공된다.

Description

IL-17 항체 내의 시스테인 잔기의 선택적 환원{SELECTIVE REDUCTION OF CYSTEINE RESIDUES IN IL-17 ANTIBODIES}
관련 출원
본 출원은 2014년 12월 22일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/095,361을 우선권 주장하고, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제제, 예를 들어, 세쿠키누맙(secukinumab)의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법에 관한 것이다.
고전적인 항체는 분자량이 각각 약 25 kD인 2개의 경쇄 (L) 및 분자량이 각각 약 50 kD인 2개의 중쇄 (H)로 구성된다. 경쇄 및 중쇄는 디술피드 결합 (L-S-S-H)에 의해 연결되고, 2개의 LH 단위가 중쇄들 사이에서 2개의 디술피드 결합에 의해 추가로 연결된다. 고전적인 항체의 일반식은 L-SS-H(-SS-)2H-SS-L 또는 간단히 H2L2 (HHLL)이다. 이러한 보존된 쇄간 디술피드 결합 이외에, 보존된 쇄내 디술피드도 있다. 디술피드 결합의 양쪽 모두의 유형이 항체의 안정성 및 거동 (예를 들어, 친화력)에 중요하다. 일반적으로, 디술피드 결합은 항체 쇄 내의 보존된 위치에서 발견되는 2개의 시스테인 잔기 (Cys-SH)에 의해 생산되고, 이들은 자발적으로 디술피드 결합 (Cys-S-S-Cys)을 형성한다. 디술피드 결합 형성은 환경의 산화환원 전위, 및 티올-디술피드 교환에 특화된 효소의 존재에 의해 결정된다. 내부 디술피드 결합 (Cys-S-S-Cys)은 항체의 3차원 구조를 안정화시킨다.
항원 인식 및 결합에서 수반되는 추가적인 유리 시스테인(들) (즉, 쌍을 이루지 않은 시스테인)을 함유하는 일반적이지 않은 항체가 있다. 이러한 항체의 경우, 유리 시스테인의 변형은 분자의 활성 및 안정성에 대한 음성 효과가 있을 수 있고, 면역원성 증가에 이를 수 있다. 결과적으로, 최종 생성물이 실질적인 양의 불활성이고 미스폴딩된 쓸모없는 항체 물질을 함유할 수 있기 때문에, 이러한 항체의 프로세싱이 어려울 수 있다. 본원에 전문이 참고로 포함된 US20090280131은 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 3 루프 (L-CDR3) 내의 시스-프롤린 뒤의 유리 시스테인 잔기 (즉, 서열식별번호(SEQ ID NO): 6으로 기재된 바와 같은 L-CDR3의 아미노산 8이고, 이는 서열식별번호: 10으로 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 아미노산 97에 상응하며, 이하 "CysL97"로 지칭됨)가 있는 IL-17 항체, 예를 들어, 세쿠키누맙 (즉, AIN457)을 제공한다. 완전한 활성을 유지하기 위해, 세쿠키누맙의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 다른 시스테인 잔기와의 산화성 디술피드 쌍 형성에 의해 또는 외인성 화합물로의 산화 (예를 들어, 다른 단백질과의 혼합된 디술피드의 형성, 세포 대사물질 [예를 들어, 시스테인 또는 글루타티온]로의 유도체화, 및 산소에 의한 술폭시드의 형성)에 의해 차폐될 수 없다. 불행하게도, 세쿠키누맙은 포유동물 세포를 사용하여 제작되기 때문에, CysL97의 바람직하지 않은 세포-기반 변형이 발생한다.
포유동물 단백질을 혼합된 디술피드가 있는 폴딩되지 않은 불용성 응집물 (봉입체)로서 생산하는 박테리아 세포에서 발현된 포유동물 단백질의 리폴딩이 문헌에 기술되어 있다. 박테리아로부터 포유동물 단백질을 수득하기 위해, 봉입체 단백질을 단리하고, 가용화시키고, 강한 카오트로픽 시약 및 환원제로 변성시킨다. 변성제, 환원제, 디술피드 부가물 형성제, 및 경도의 산화/환원 환경 (pH 7-9)을 사용하여 디술피드 결합을 완전히 변성 및 환원시키는 것이 시판원으로부터 수득되거나 효모에서 재조합적으로 생산된 식물 단백질을 올바르게 리폴딩시키는데 또한 사용되었다 (US 4,766,205). 단백질의 완전한 변성 및 리폴딩을 사용하는 이러한 공정들은 비싸고, 가성이며, 시간 소모적이고, 포유동물 세포에서 생산된 단백질에는 불필요하다.
비-천연 발생 Fc 융합 단백질의 미스폴딩을 수정하기 위해 환원/산화 커플링 시약을 사용하는 것이 공지되어 있다 (WO02/68455). WO02/68455의 Fc 융합 단백질은 개시된 방법에 의해 환원 및 재산화되는 Fc 영역 내의 쇄간 디술피드를 함유할 것이지만, 선택적으로 환원된 시스테인 잔기가 있는 분자를 생산하는 방법은 교시되어 있지 않다. 또한, Fc 융합 단백질은 구조 및 활성을 위해 수많은 올바르게 연결된 쇄간 및 쇄내 디술피드에 의존하는 고도로 복합적인 면역글로불린인 항체가 결코 아니다.
US20050123532는 항체를 환원제로 활성화시킴으로써 또는 항체-생산 세포를 L-시스테인이 보충된 무혈청 배지에서 배양함으로써 유리 시스테인이 있는 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 세포 배양 방법을 사용할 때, 추후의 프로세싱 단계, 예를 들어, 여과, 바이러스 불활성화 및 크로마토그래피가 세포 배양 방법에 의해 생산된 유리 시스테인의 산화를 초래할 수 있다. 이같은 경우, 유리 티올 기를 산화제로 변형시킴으로써 유리 시스테인이 추후의 단계 동안 이상적으로 보호되고, 다양한 기술, 예를 들어, 여과를 사용하여 산화제 자체가 추후에 제거된다 (US20060257393). 상업적 생산을 위해, 이같은 방법은 원래의 배양 배지 내의 다량의 환원제, 추후의 프로세싱 동안의 다량의 산화제, 및 산화제를 제거하기 위한 추가적인 여과 방법을 필요로 하여, 시간 및 경비를 생산 비용에 부가한다.
미국 특허 번호 7,928,205는 포유동물 세포 배양물로부터 수득된 IgG2 항체를 리폴딩시키기 위해 산화환원 쌍을 사용하는 것에 대한 선호, 뿐만 아니라 146B7 (IgG1) 항체의 가변 영역 내의 유리 시스테인의 탈시스테인화 방법을 교시한다. 상응하는 연구 발표물인 문헌 [Banks et al. (2008) J. Pharmaceutical Sci. 97:764-779]에 재조합 모노클로날 IgG1 항체 (MAB007)의 가변 영역 내의 쌍을 이루지 않은 술프히드릴의 탈시스테인화가 교시되어 있다. 뱅크스(Banks) 등은 MAB007의 탈시스테인화가 강한 변성제 (GdnHCL) 및 환원제 (시스테인)의 사용을 요구하였는지 여부 또는 단독 시스테인의 존재 하에 선택적 환원이 발생할 수 있는지 여부를 연구하였다. 이러한 저자들은 변성제의 존재 및 부재 하에 MAB007로부터 시스테인화가 효과적으로 제거될 수 있는 것으로 결정하였다.
상기 참고문헌 중 어느 것에도 세쿠키누맙 내의 CysL97의 선택적 환원이 가능한지 여부가 교시되어 있지 않다. 상기 참고문헌들에는 세쿠키누맙의 1차, 2차 및 3차 구조; 세쿠키누맙 내의 산화된 CysL97의 위치 및 장소 (예를 들어, 용매-접근성 또는 접근불능성); 및 항체 내의 보존된 디술피드 결합의 상대적인 강도 (예를 들어, CysL97이 소정의 환원제와 먼저 반응하는지 또는 보존된 시스테인이 환원된 후에만 반응하는지 여부)에 특히 좌우되는, 세쿠키누맙 내의 CysL97의 선택적 환원에 필요한 시약 및 조건도 교시되어 있지 않다. 또한, 이러한 참고문헌 중 어느 것에도 세쿠키누맙 내의 산화된 CysL97의 선택적 환원이 항체 구조 (예를 들어, 폴딩), 화학적 조성 (예를 들어, 탈아미드화), 또는 성질 (결합 활성, 응집 또는 분해 성향)에 대한 변화를 초래할 것인지 여부가 기술되어 있지 않고, 이들 모두는 상업적 규모로 세쿠키누맙을 선택적으로 환원시키는 것을 기술적으로 실행불가능하게/비실용적이게 만들 수 있다.
최대 세쿠키누맙 항원-결합 활성을 유지시키기 위해, 본 발명가들은 보존된 디술피드 결합을 유의하게 환원시키지 않으면서 CysL97을 차폐된 형태 (1)에서 유리 형태 (2) (하기 I 참조)로 전환시키는 것이 세쿠키누맙의 프로세싱 동안 필요하다고 결정하였다; 그렇지 않으면, 쇄 연결이 풀리는 것 (H2L2 → H2L, HL2, HL, H 및 L)에 의해 더 낮은 활성 및 불활성의 분자량이 더 낮은 변이체가 형성될 것이다.
(I)
Figure 112017058118342-pct00001
상업적 규모의 항체 제조 동안 환원 조건을 도입하는 것은 반직관적이다 (예를 들어, 항체의 세포 배양 제작 동안 항체 디술피드 결합 환원을 방지하기 위해 다양한 시약 및 방법을 사용한 문헌 [Trexler-Schmidt et al. 2010 Biotech and Bioengineering 106:452-61]을 참조한다). 그럼에도 불구하고, 본 발명가들은 항체를 유의하게 변성시키지 않으면서 포유동물 세포에서의 대규모의 상업적 생산 동안 세쿠키누맙 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 것이 가능하다고 결정하였다. US20090280131에 개시된 IL-17 항체 (및 이의 단편), 특히 세쿠키누맙 내의 항원 결합 부위 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 방법은 이러한 항체의 결합 활성을 복원하는 것을 돕고, 따라서 이의 제제의 생체활성을 증가시킨다. 추가로, 이러한 방법은 무손상 항체의 수준을 증가시키는 것 및 이러한 항체의 제제의 균질성을 강화하는 것을 돕는다. 개시된 방법은 인큐베이션 동안의 시스템 내의 특정 비의 항체:환원제 및 제어된 산소 전달율의 조합된 효과에 의존한다.
따라서, 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
a) 제제를 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계; 및
b) ≤ 약 0.37 h-1의 시스템 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 단계이며, 상기 kLa*가 용존 산소 곡선을 포화 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계
를 포함하고, 여기서 IL-17 항체 각각이 서열식별번호: 8로 기재된 중쇄 가변 도메인 (VH)의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 면역글로불린 VH 및 서열식별번호: 10으로 기재된 경쇄 가변 도메인 (VL)의 3개의 CDR을 포함하는 면역글로불린 VL을 포함하며, 추가로, 단계 a) 전에, 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트가 25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시 적어도 약 60％인 방법이 본원에 개시된다.
포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
a) 제제를 시스테인/시스틴 및 시스테인/시스타민으로부터 선택된 산화/환원 시약 세트와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계; 및
b) 환원 혼합물을 약 37℃의 온도에서 혐기성 조건 하에 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션하거나, 또는 환원 혼합물을 약 18-24℃의 온도에서 약 16-24시간 동안 인큐베이션하는 단계
를 포함하고, 여기서 IL-17 항체 각각이 서열식별번호: 8로 기재된 중쇄 가변 도메인 (VH)의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 면역글로불린 VH 및 서열식별번호: 10으로 기재된 경쇄 가변 도메인 (VL)의 3개의 CDR을 포함하는 면역글로불린 VL을 포함하는 것인 방법이 또한 본원에 개시된다.
세쿠키누맙의 정제된 제제이며, 제제 내의 무손상 세쿠키누맙의 수준이 소듐 도데실 술페이트 모세관 전기영동 (CE-SDS)으로 측정 시 적어도 약 90％이고, 제제 내의 세쿠키누맙의 활성의 수준이 시스타민-CEX로 측정 시 적어도 약 90％인 제제가 또한 본원에 개시된다.
도 1은 상이한 환원제들에 적용한 후의 경시적인 무손상 항체 (LHHL)의 백분율을 나타낸다.
도 2A는 혐기성 조건 하에서의 8 mM 시스테인으로의 선택적 환원에 적용한 후의 실온에서의 경시적인 무손상 항체 (LHHL)의 백분율을 나타낸다. 도 2B는 호기성 조건 하에서의 8 mM 시스테인으로의 선택적 환원에 적용한 후의 실온에서의 경시적인 무손상 항체 (LHHL)의 백분율을 나타낸다. 도 2C는 혐기성 조건 하에서서의 8 mM 시스테인으로의 선택적 환원에 적용한 후의 37℃에서의 경시적인 무손상 항체 (LHHL)의 백분율을 나타낸다. 도 2D는 호기성 조건 하에서의 8 mM 시스테인으로의 선택적 환원에 적용한 후의 37℃에서의 경시적인 무손상 항체 (LHHL)의 백분율을 나타낸다.
도 3은 다양한 용존 산소 농도에서의 8 mM 시스테인으로의 선택적 환원에 적용한 후의 37℃ 온도에서의 경시적인 무손상 항체의 백분율을 나타낸다.
도 4A는 CEX에 의한 활성에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다. 도 4B는 CE-SDS에 대한 순도에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다. 도 4의 플롯들은 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도에 대한 시스테인 농도, 단백질 함량 및 시스테인/시스틴의 비의 영향 및 상호작용을 분석한다.
도 5A는 CEX에 의한 활성에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다. 도 5B는 CE-SDS에 대한 순도에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다. 도 5의 플롯들은 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도에 대한 시스테인 농도, 단백질 함량 및 시스틴 농도의 영향 및 상호작용을 분석한다.
도 6은 pH, 시간, 온도 및 시스테인 농도의 영향 및 상호작용을 관찰하는, CEX에 의한 활성에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다.
도 7는 pH, 시간, 온도 및 시스테인 농도의 영향 및 상호작용을 관찰하는, CE-SDS에 의한 순도에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다.
도 8은 검증 실행 1의 시스테인 처리의 용존 산소 차트를 나타낸다.
도 9는 검증 실행 2의 시스테인 처리의 용존 산소 차트를 나타낸다.
도 10은 검증 실행 3의 시스테인 처리의 용존 산소 차트를 나타낸다.
도 11은 검증 실행 4의 시스테인 처리의 용존 산소 차트를 나타낸다.
도 12는 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도와 관련하여 검증 실행 3 및 검증 실행 4의 반응 동역학을 비교한다.
도 13A는 REACT.P의 CEX에 의한 활성에 대한 척도화 및 중심화된 계수 플롯을 나타낸다. 도 13B는 REACT.P의 CEX에 의한 활성에 대한 4D 등고선 플롯을 나타낸다. 도 13의 플롯들은 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도에 대한 시스테인 농도, 단백질 함량 및 교반기 속도의 영향 및 상호작용을 분석한다.
도 14A는 0 rpm에서의 공정 특성화 실행의 용존 산소 프로파일을 나타낸다 (범례의 숫자는 실행 번호, 교반기 속도, 및 시스테인 및 항체 농도를 가리킨다). 도 14B는 50 rpm에서의 공정 특성화 실행의 용존 산소 프로파일을 나타낸다 (범례의 숫자는 실행 번호, 교반기 속도, 및 시스테인 및 항체 농도를 가리킨다). 도 14C는 100 rpm에서의 공정 특성화 실행의 용존 산소 프로파일을 나타낸다 (범례의 숫자는 실행 번호, 교반기 속도, 및 시스테인 및 항체 농도를 가리킨다). 도 14D는 50 rpm 및 6.0 mM 시스테인에서 50 mL 규모로 하나는 항체 없이, 다른 하나는 12.7 g/L의 항체와 함께 수행된 2가지 실행의 용존 산소 프로파일을 비교한다.
도 15는 상이한 인큐베이션 온도들에서의 CEX에 의한 활성의 선택적 환원 동역학을 나타낸다.
도 16은 공정의 다양한 단계 (시스테인 첨가, 가열, 인큐베이션, 냉각, 및 pH 조정)의 시기가 지시된, 규모-축소 모델 인증 실행으로부터의 용존 산소 차트의 오버레이를 나타낸다.
도 17은 선택적 환원 동안의 제작-규모 실행 및 규모-축소 모델 실행의 CEX에 의한 활성에 대한 동역학을 나타낸다
본 개시내용의 목표는 특정 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 세쿠키누맙의 항원 결합 부위 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법을 제공하는 것이다. "선택적으로 환원시킴"은 개시된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 내의 CysL97이 이러한 항체의 보존된 시스테인 잔기의 환원 없이 산화된 형태로 환원되는 것을 의미한다. 보존된 시스테인 잔기는, 고전적 IgG1 항체의 경우, 힌지 영역 내의 2개의 디술피드 다리, 2개의 쇄간 디술피드 다리 (각각의 Fab에 1개), Fc 영역 내의 4개의 쇄내 디술피드 다리, 및 항체의 Fab 부분 내의 8개의 쇄내 디술피드 다리이다. 선택적 환원 공정 동안, 특정 제제 내의 일부 항체의 보존된 시스테인의 일시적인 환원이 발생할 수 있다. 그러나, 반응 완료 시, 일시적으로 환원된 보존된 시스테인의 대다수가 전형적인 항체에서 발견되는 보존된 디술피드 결합을 형성하도록 재산화되어, 항체의 선택적으로 환원된 제제 (즉, 정제된 제제)에서의 높은 순도 및 활성을 초래할 것이다. 선택적 환원 반응의 완료 시, 선택적으로 환원된 제제 (즉, 정제된 제제)가 100％ 무손상 항체를 함유할 것으로 예상되지 않는다는 것이 이해될 것이다; 대신, 선택적으로 환원된 제제는 CE-SDS로 측정 시 이상적으로 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 약 100％ (이론상 최대값에 비해)의 무손상 항체를 함유할 것이다.
용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", 뿐만 아니라 "이루어진"을 포괄하고, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나, 또는 추가적인 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다.
수치 x와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어, +/-10％를 의미한다. 숫자 범위 또는 숫자 목록 앞에서 사용되는 경우, 용어 "약"은 일련의 숫자 각각에 적용되고, 예를 들어, "약 1-5"라는 문구는 "약 1 - 약 5"로 해석되어야 하거나, 예를 들어, "약 1, 2, 3, 4"라는 문구는 "약 1, 약 2, 약 3, 약 4 등"으로 해석되어야 하는 식이다.
번역 후 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적인 분자 질량은 147,944 돌턴이다. 이러한 분자량 (즉, 147,944 돌턴)이 본 개시내용 전반에 걸쳐 세쿠키누맙 몰농도 값 및 몰비의 계산에서 사용된다. 그러나, CHO 세포에서의 생산 동안, C-말단 리신이 통상적으로 각각의 중쇄로부터 제거된다. 각각의 중쇄로부터 C-말단 리신이 결여된 세쿠키누맙의 상대적인 분자 질량은 147,688 돌턴이다. 세쿠키누맙의 제제는 중쇄 상에 C-말단 리신 잔기가 있는 분자 및 없는 분자의 혼합물을 함유한다. 따라서, 본 개시내용에서 사용된 세쿠키누맙 몰농도 값 (및 이러한 몰농도 값을 사용하는 비)은 추정치이고, 이러한 수치와 관련된 "약", "대략적" 등의 용어는 상대적인 분자 질량 및 이로 이루어진 결과적인 계산에서의 이러한 변동을 적어도 포함한다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않고, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"가 본 개시내용의 정의에서 생략될 수 있다.
본원에서 지칭된 바와 같은 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원-결합 부분 또는 단일쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 디술피드 결합으로 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL인 1개의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역들이 산재되어 있는, 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어는 항원 (예를 들어, IL-17)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 1개의 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 CDR을 포함한다. 예시적인 항원 결합 부위는 서열식별번호: 1-6 및 11-13 (표 1)에 기재된 바와 같은 세쿠키누맙의 CDR, 바람직하게는 중쇄 CDR3을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여, 이들이 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐)로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]을 참조한다). 이같은 단일쇄 항체 또한 용어 "항체" 내에 포함되도록 의도된다. 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 단일쇄 항체 및 항원-결합 부분이 수득된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "단리된 항체"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, IL-17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 IL-17 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 본원에서 사용된 바와 같은 용어 ""모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자들의 제제를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 양쪽 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. "인간 항체"는 인간, 인간 조직 또는 인간 세포에 의해 생산될 필요가 없다. 본 개시내용의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 항체 유전자의 재조합 동안 생체 내에서 접합부에서의 N-뉴클레오티드 부가에 의해, 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, IL-17 항체는 인간 항체, 단리된 항체, 및/또는 모노클로날 항체이다.
용어 "IL-17"은 이전에는 CTLA8로 알려진 IL-17A를 지칭하고, 다양한 종 (예를 들어, 인간, 마우스 및 원숭이)으로부터의 야생형 IL-17A, IL-17A의 다형성 변이체, 및 IL-17A의 기능성 등가물을 포함한다. 본 개시내용에 따른 IL-17A의 기능성 등가물은 바람직하게는 야생형 IL-17A (예를 들어, 인간 IL-17A)와의 전체적인 서열 동일성이 적어도 약 65％, 75％, 85％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 심지어 99％이고, 인간 피부 섬유모세포에 의한 IL-6 생산을 유도하는 능력을 실질적으로 유지한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "KD"는 Kd 대 Ka 비 (즉 Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도 (M)로 표시되는 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 관련 기술 분야에 잘 확립되어 있는 방법을 사용하여 항체에 대한 KD 값을 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나 또는 바이오센서 시스템 예컨대 비아코어(Biacore)® 시스템을 이용하는 것에 의한 방법이다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 항원 결합 단편, 예를 들어, 세쿠키누맙은 인간 IL-17에 대한 KD가 약 100-250 pM이다.
용어 "친화력"은 단일 항원성 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원성 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역이 약한 비-공유결합 힘을 통해 다수의 부위에서 항원과 상호작용한다; 상호작용이 많을수록, 친화력이 더 강하다. 다양한 종의 IL-17에 대한 항체의 결합 친화력을 평가하는 표준 검정법이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함한다. 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화력)을 관련 기술 분야에 공지된 표준 검정법에 의해, 예컨대 비아코어 분석에 의해 평가할 수도 있다.
관련 기술 분야에 공지되어 있고 본원에 기술된 방법에 따라 결정된 바와 같이 IL-17의 이러한 기능성 성질 (예를 들어, 생화학적, 면역화학적, 세포성, 생리학적 또는 기타 생물학적 활성 등) 중 하나 이상을 "억제"하는 항체는 항체의 부재 하에 (또는 관련되지 않은 특이성의 대조군 항체가 존재할 때) 나타나는 것에 비해 특정 활성이 통계적으로 유의하게 감소되는 것에 관련되는 것으로 이해될 것이다. IL-17 활성을 억제하는 항체는 통계적으로 유의한 감소, 예를 들어, 측정된 파라미터의 적어도 약 10％, 적어도 50％, 80％ 또는 90％만큼의 감소를 야기하고, 개시된 방법 및 조성물의 특정 실시양태에서, 사용된 IL-17 항체는 IL-17의 기능성 활성을 95％, 98％ 또는 99％ 초과로 억제할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "IL-6을 억제한다"는 1차 인간 피부 섬유모세포로부터의 IL-6 생산을 감소시키는 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 능력을 지칭한다. 1차 인간 (피부) 섬유모세포에서의 IL-6 생산은 IL-17에 의존적이다 (Hwang et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:R120-128). 간략하게, 인간 피부 섬유모세포를 다양한 농도의 Fc 부분이 있는 인간 IL-17 수용체 또는 IL-17 결합 분자의 존재 하에 재조합 IL-17로 자극한다. 키메라 항-CD25 항체 시뮬렉트(Simulect)® (바실릭시맙(basiliximab))을 음성 대조군으로서 편리하게 사용할 수 있다. 16 h 자극 후 상청액을 취하고, ELISA로 IL-6에 대해 검정한다. 상기와 같이 테스트했을 때, 즉, 인간 피부 섬유모세포에서 hu-IL-17에 의해 유도되는 IL-6 생산에 대해 상기 억제 활성을 측정했을 때, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, 세쿠키누맙은 전형적으로 (1 nM 인간 IL-17의 존재 하에서의) IL-6 생산의 억제에 대한 IC50이 약 50 nM 이하 (예를 들어, 약 0.01 내지 약 50 nM)이다. 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, 세쿠키누맙, 및 이의 기능성 유도체는 상기 정의된 바와 같은 IL-6 생산의 억제에 대한 IC50이 약 20 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 2 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 1 nM 이하이다.
용어 "유도체"는, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시내용에 따른 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, 세쿠키누맙의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변형 (예를 들어, PEG화, 탈아미드화, 히드록실화, 인산화, 메틸화 등), 예를 들어, 특정 서열 (예를 들어, 가변 도메인)의 이러한 변이체 및 변형을 규정하도록 사용된다. "기능성 유도체"는 개시된 IL-17 항체와 공통되는 정성적인 생물학적 활성이 있는 분자를 포함한다. 기능성 유도체는 본원에 개시된 바와 같은 IL-17 항체의 단편 및 펩티드 유사체를 포함한다. 단편은 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 서열, 예를 들어, 특정 서열의 서열 내의 영역을 포함한다. 본원에 개시된 IL-17 항체의 기능성 유도체 (예를 들어, 세쿠키누맙의 기능성 유도체)는 바람직하게는 본원에 개시된 IL-17 항체 및 그의 항원 결합 단편의 VH 및/또는 VL 서열 (예를 들어, 표 1의 VH 및/또는 VL 서열)과의 전체적인 서열 동일성이 적어도 약 65％, 75％, 85％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％인 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하고, 인간 IL-17에 결합하거나 또는, 예를 들어, IL-17에 의해 유도된 인간 피부 섬유모세포의 IL-6 생산을 억제하는 능력을 실질적으로 유지한다
"실질적으로 동일한"이라는 문구는 관련된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, VH 또는 VL 도메인)이 특정 기준 서열과 동일하거나 또는 이와 비교하여 실질적이지 않은 차이 (예를 들어, 보존된 아미노산 치환을 통한 차이)가 있을 것임을 의미한다. 실질적이지 않은 차이는 미미한 아미노산 변화, 예컨대 특정 영역 (예를 들어, VH 또는 VL 도메인)의 아미노산 5개의 서열에서의 1 또는 2개의 치환을 포함한다. 항체의 경우, 제2 항체는 동일한 특이성을 갖고, 이의 친화력의 적어도 50％를 갖는다. 본원에 개시된 서열과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 적어도 약 85％의 서열 동일성) 또한 본 출원의 일부이다. 일부 실시양태에서, 유도체 IL-17 항체 (예를 들어, 세쿠키누맙의 유도체, 예를 들어, 세쿠키누맙의 바이오시밀러(biosimilar) 항체)의 서열 동일성은 개시된 서열에 비해 약 90％ 이상, 예를 들어, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 이를 초과하는 ％일 수 있다.
천연 폴리펩티드 및 이의 기능성 유도체에 관한 "동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여, 최대 동일성 퍼센트를 달성한 후의 상응하는 천연 폴리펩티드의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 여기서 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. N- 또는 C-말단 확장 또는 삽입은 동일성을 감소시키는 것으로 해석되지 않아야 한다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램이 널리 공지되어 있다. 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, 문헌 [Altshul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215: 403 410]에 기술된 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST); 문헌 [Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol., 48: 444 453]의 알고리즘; 또는 문헌 [Meyers et al., (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 17]의 알고리즘에 의해 동일성 퍼센트를 결정할 수 있다. 파라미터 세트는 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4, 및 프레임시프트(frameshift) 갭 페널티 5의 블로섬(Blosum) 62 채점 매트릭스일 수 있다. PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 통합된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS, 4:11-17]의 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트를 결정할 수도 있다.
"아미노산(들)"은 예를 들어 모든 천연 발생 L-α-아미노산을 지칭하고, D-아미노산을 포함한다. "아미노산 서열 변이체"라는 문구는 본 개시내용에 따른 서열에 비교했을 때 아미노산 서열에서 약간의 차이가 있는 분자를 지칭한다. 본 개시내용에 따른 항체의 아미노산 서열 변이체, 예를 들어, 특정 서열의 아미노산 서열 변이체는 인간 IL-17에 결합하거나 또는, 예를 들어, IL-17에 의해 유도된 인간 피부 섬유모세포의 IL-6 생산을 억제하는 능력을 여전히 갖는다. 아미노산 서열 변이체는 치환 변이체 (본 개시내용에 따른 폴리펩티드에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 상이한 아미노산이 이를 대신하여 동일한 위치에서 삽입된 것), 삽입 변이체 (본 개시내용에 따른 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 특정 위치의 아미노산에 바로 인접하여 삽입된 것), 및 결실 변이체 (본 개시내용에 따른 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것)을 포함한다.
"유리 시스테인", "비-전통적 시스테인" 및 "쌍을 이루지 않은 시스테인"이라는 문구들은 보존된 항체 디술피드 결합에서 수반되지 않는 시스테인을 상호교환가능하게 지칭한다. 유리 시스테인은 항체 프레임워크 영역 또는 가변 영역에 (예를 들어, CDR 내에) 존재할 수 있다. 세쿠키누맙에서, 서열식별번호: 10으로 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 아미노산 97에 상응하는, 서열식별번호: 6으로 기재된 바와 같은 L-CDR3의 아미노산 8 (본원에서 이하 CysL97으로 지칭됨)이 유리 시스테인이다. 각각의 세쿠키누맙 분자는 2개의 이같은 유리 시스테인 잔기를 포함한다 - 각각의 VL 도메인 내에 1개. 개시된 방법은 세쿠키누맙 내의 양쪽 유리 시스테인 잔기를 선택적으로 환원시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 개시된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄에서의 결실 및/또는 치환으로 인해, 유리 시스테인이 위치 CysL97에 존재하지 않을 것이다. 이같은 경우, 상응하는 유리 시스테인이 선택적 환원 반응의 표적이고, 용어 "CysL97"에 포함된다.
IL-17 항체 및 그의 항원 결합 단편
다양한 개시된 방법이 특정 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 선택적 환원에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH)을 적어도 하나 포함하고, 여기서 상기 CDR1은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL ')을 적어도 하나 포함하고, 여기서 상기 CDR1'는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3'는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 초가변 영역 CDR1-x, CDR2-x 및 CDR3-x를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH)을 적어도 하나 포함하고, 여기서 상기 CDR1-x는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2-x는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3-x는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 VH 도메인 및 적어도 하나의 면역글로불린 VL 도메인을 포함하고, 여기서 a) VH 도메인은 (예를 들어, 서열 면에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (상기 CDR1은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는다); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1-x, CDR2-x 및 CDR3-x (상기 CDR1-x는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2-x는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3-x는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 갖는다)을 포함하고; b) VL 도메인은 (예를 들어, 서열 면에서) 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3' (상기 CDR1'는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3'는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는다)를 포함한다.
한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 a) 서열식별번호: 8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH); b) 서열식별번호: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL); c) 서열식별번호: 8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열식별번호: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; d) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; e) 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; f) 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; g) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; 또는 h) 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함한다.
용이한 참조를 위해, 카바트 정의를 기초로 하고, X-선 분석에 의해 그리고 코티아 및 공동작업자의 접근법을 사용하여 결정된 바와 같은 세쿠키누맙 모노클로날 항체의 초가변 영역의 아미노산 서열이 하기 표 1에서 제공된다.
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표 1: 세쿠키누맙 모노클로날 항체의 초가변 영역의 아미노산 서열
바람직한 실시양태에서, 불변 영역 도메인은 바람직하게는, 예를 들어, 문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health]에 기술된 바와 같이, 적절한 인간 불변 영역 도메인을 또한 포함한다. 세쿠키누맙의 VL을 코딩하는 DNA가 서열식별번호: 9에서 기재된다. 세쿠키누맙의 VH를 코딩하는 DNA가 서열식별번호: 7에서 기재된다.
일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)은 서열식별번호: 10의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 8의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 10의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 8의 3개의 CDR을 포함한다. 표 1에서 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 10의 CDR을 확인할 수 있다. 서열식별번호: 6에서 경쇄 내의 유리 시스테인 (CysL97)을 볼 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 14의 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (C-말단 리신이 있는 또는 없는) 서열식별번호: 15의 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 14의 경쇄, 및 (C-말단 리신이 있는 또는 없는) 서열식별번호: 15의 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 14의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 15의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 14의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 15의 3개의 CDR을 포함한다. 표 1에서 서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 15의 CDR을 확인할 수 있다.
초가변 영역은 임의의 종류의 프레임워크 영역과 회합될 수 있지만, 바람직하게는 인간 기원의 것과 회합된다. 적절한 프레임워크 영역이 상기 문헌 [Kabat E.A. et al.]에 기술되어 있다. 바람직한 중쇄 프레임워크는 인간 중쇄 프레임워크, 예를 들어 세쿠키누맙 항체의 것이다. 예를 들어, 이는 서열 면에서 FR1 (서열식별번호: 8의 아미노산 1 내지 30), FR2 (서열식별번호: 8의 아미노산 36 내지 49), FR3 (서열식별번호: 8의 아미노산 67 내지 98) 및 FR4 (서열식별번호: 8의 아미노산 117 내지 127) 영역으로 이루어진다. X-선 분석에 의한 세쿠키누맙의 결정된 초가변 영역을 고려하여, 또 다른 바람직한 중쇄 프레임워크는 서열 면에서 FR1-x (서열식별번호: 8의 아미노산 1 내지 25), FR2-x (서열식별번호: 8의 아미노산 36 내지 49), FR3-x (서열식별번호: 8의 아미노산 61 내지 95) 및 FR4 (서열식별번호: 8의 아미노산 119 내지 127) 영역으로 이루어진다. 유사한 방식으로, 경쇄 프레임워크는, 서열 면에서, FR1' (서열식별번호: 10의 아미노산 1 내지 23), FR2' (서열식별번호: 10의 아미노산 36 내지 50), FR3' (서열식별번호: 10의 아미노산 58 내지 89) 및 FR4' (서열식별번호: 10의 아미노산 99 내지 109) 영역으로 이루어진다.
한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)은 a) 서열 면에서 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인, 및 인간 중쇄의 불변부 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편 (상기 CDR1은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는다); 및 b) 서열 면에서 초가변 영역 CDR1', CDR2', 및 CDR3'을 포함하는 가변 도메인, 및 인간 경쇄의 불변부 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편 (상기 CDR1'는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3'는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는다)을 적어도 포함하는 인간 IL-17 항체로부터 선택된다.
한 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 a) 서열 면에서 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인 (상기 CDR1은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는다); 및 b) 서열 면에서 초가변 영역 CDR1', CDR2', 및 CDR3'을 포함하는 제2 도메인 (상기 CDR1'는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 상기 CDR3'는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는다)를 포함하는 항원 결합 부위; 및 c) 제1 도메인의 N-말단 끝부분 및 제2 도메인의 C-말단의 끝부분에 또는 제1 도메인의 C-말단 끝부분 및 제2 도메인의 N-말단 끝부분에 결합된 펩티드 링커를 포함하는 단일쇄 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 선택된다.
대안적으로, 개시된 방법에서 사용된 바와 같은 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열에 의해 본원에 기재된 IL-17 항체의 유도체 (예를 들어, 세쿠키누맙의 PEG화 버전)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 개시된 방법에서 사용된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 또는 VL 도메인은 본원에 기재된 VH 또는 VL 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 8 및 10에 기재된 것)과 실질적으로 동일한 VH 또는 VL 도메인을 가질 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-17 항체는 (C-말단 리신이 있는 또는 없는) 서열식별번호: 15로 기재된 것과 실질적으로 동일한 중쇄 및/또는 서열식별번호: 14로 기재된 것과 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-17 항체는 (C-말단 리신이 있는 또는 없는) 서열식별번호: 15를 포함하는 중쇄 및/또는 서열식별번호: 14를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-17 항체는 a) 서열식별번호: 8에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 인간 중쇄의 불변부를 포함하는 중쇄 1개; 및 b) 서열식별번호: 10에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 인간 경쇄의 불변부를 포함하는 경쇄 1개를 포함할 수 있다.
대안적으로, 개시된 방법에서 사용된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, CysL97을 함유하는 한, 본원에 기재된 기준 IL-17 항체의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 본 개시내용은 세쿠키누맙의 VH 또는 VL 도메인의 아미노산 잔기 중 하나 이상 (CysL97은 아님), 전형적으로는 몇 개뿐인 잔기 (예를 들어, 1-10개)가, 예를 들어 돌연변이, 예를 들어, 상응하는 DNA 서열의 부위 지정 돌연변이유발에 의해, 변화된 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)을 또한 포함한다. 모든 이같은 유도체 및 변이체의 경우에, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 50 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 2 nM 이하, 또는 더욱 바람직하게는 약 1 nM 이하의 상기 분자의 농도에서 약 1 nM (= 30 ng/ml) 인간 IL-17의 활성을 50％만큼 억제할 수 있고, 상기 억제 활성은 WO 2006/013107의 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 피부 섬유모세포에서 hu-IL-17에 의해 유도된 IL-6 생산에 대해 측정된다.
일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, 세쿠키누맙은 Leu74, Tyr85, His86, Met87, Asn88, Val124, Thr125, Pro126, Ile127, Val128, His129를 포함하는 성숙 인간 IL-17의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체, 예를 들어, 세쿠키누맙은 Tyr43, Tyr44, Arg46, Ala79, Asp80을 포함하는 성숙 인간 IL-17의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체, 예를 들어, 세쿠키누맙은 2개의 성숙 인간 IL-17 쇄가 있는 IL-17 동종이량체의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 한쪽 쇄 상의 Leu74, Tyr85, His86, Met87, Asn88, Val124, Thr125, Pro126, Ile127, Val128, His129 및 다른쪽 쇄 상의 Tyr43, Tyr44, Arg46, Ala79, Asp80을 포함한다. 이러한 에피토프를 규정하는데 사용된 잔기 번호매김 체계는 잔기 1이 성숙 단백질 (즉, 아미노산 23개의 N-말단 신호 펩티드가 결여되고 글리신으로 시작되는 IL-17A)의 제1 아미노산인 것을 기초로 한다. 미성숙 IL-17A의 서열이 스위스-프롯(Swiss-Prot) 등록물 Q16552에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체는 KD가 약 100-200 pM이다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체는 약 0.67 nM 인간 IL-17A의 생물학적 활성의 시험관 내 중화에 대한 IC50이 약 0.4 nM이다. 일부 실시양태에서, 피하 (s.c.) 투여된 IL-17 항체의 절대 생체이용률은 약 60 - 약 80％의 범위, 예를 들어, 약 76％이다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체, 예컨대 세쿠키누맙은 제거 반감기가 약 4주 (예를 들어, 약 23 내지 약 35일, 약 23 내지 약 30일, 예를 들어, 약 30일)이다. 일부 실시양태에서, IL-17 항체 (예컨대 세쿠키누맙)는 Tmax가 약 7-8일이다.
개시된 방법에서 사용된 특히 바람직한 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 항체, 특히 WO 2006/013107의 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같은 세쿠키누맙이다. 세쿠키누맙은 현재 면역-매개 염증성 병태의 치료에서 임상 시험 중인, IgG1/카파 이소형의 완전히 인간형인 고-친화력 재조합 모노클로날 항-인간 인터루킨-17A (IL-17A, IL-17) 항체이다. 세쿠키누맙 (예를 들어, WO2006/013107 및 WO2007/117749을 참조한다)은 IL-17에 대한 친화력이 매우 높고, 즉, KD가 약 100-200 pM이며, 약 0.67 nM 인간 IL-17A의 생물학적 활성의 시험관 내 중화에 대한 IC50이 약 0.4 nM이다. 따라서, 세쿠키누맙은 약 1:1의 몰비에서 항원을 억제한다. 이러한 높은 결합 친화력은 세쿠키누맙 항체를 치료 용도에 특히 적합하게 한다. 또한, 세쿠키누맙의 반감기가 매우 길다는 것, 즉 약 4주라는 것이 결정되었고, 이는 만성 평생 장애, 예컨대 류머티스성 관절염을 치료할 때 탁월한 성질인 장기 간격 투여를 허용한다.
상기 언급된 IL-17 항체 및 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이 본원에 개시된다. 개시된 방법은 비용을 감소시키도록 항체 (예를 들어, IL-17 항체, 예를 들어, 세쿠키누맙)의 제제에 편리하게 수행될 수 있다. 항체의 "제제"는 복수의 항체 분자가 있는 조성물 (예를 들어, 용액)을 지칭한다. "제제"는 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 액체 조성물을 포함한다. 따라서, 제제는, 예를 들어, 물 또는 완충제, 칼럼 용출물, 투석 완충제 등 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 세쿠키누맙을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 초기 제제는 완충제 (예를 들어, 트리스(Tris), 예를 들어, 1 mM - 1 M 트리스, pH 6.0-8.0) 또는 WFI 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, 세쿠키누맙의 풀(pool)을 포함한다. 환원제를 항체에 첨가하기 전에, 용존 산소 수준, 용액 pH, 항체 농도 등을 변형시킴으로써 제제를 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원제 첨가 전에, 제제 내의 항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 농도가 약 4 mg/ml - 약 19.4 mg/ml, 예를 들어, 약 10 mg/ml - 약 19.4 mg/ml, 약 10 mg/ml - 약 15.4 mg/ml, 약 12 mg/ml - 약 15 mg/ml, 또는 약 13.5 mg/ml로 조정된다. 일부 실시양태에서, 환원제 첨가 전에, 제제 내의 산소 포화 퍼센트가 적어도 약 60％ (25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시), 예를 들어, 적어도 약 80％로 조정된다. 일부 실시양태에서, 환원제 첨가 전에, 제제의 pH가 약 7.3 - 약 8.5, 예를 들어, 약 7.8 - 약 8.2, 예를 들어, 약 7.9 - 약 8.1, 예를 들어, 약 8.0으로 조정된다. 항체 농도, pH 및 산소 수준은 환원제를 첨가한 직후에 (또는 심지어 첨가하는 동안에) 또한 조정될 수 있고, 따라서 등가물로서 이해되어야 한다.
개시된 방법에서 사용하기 위한 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제제는 임의의 포유동물 세포주, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 세포, 마우스 골수종 NS0 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 배아 신장 세포주 HEK-293, 인간 망막 세포주 Per.C6 (크루셀(Crucell), 네덜란드), HKB11 세포 클론 (HEK 293S와 버킷 림프종 세포주 2B8의 하이브리드 세포 융합으로부터 유래됨) 등을 사용하여 임의의 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. "포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된"은 포유동물 세포에서의 항체 생산이 재조합 DNA 기술을 사용하여 달성되었음을 의미한다. 선택적 환원에 적용되는 IL-17 항체 제제는 원심분리 (이후의 정화와 함께 또는 이후의 정화 없이)에 의해 포유동물 세포로부터 수확된 항체의 풀일 수 있다. 대안적으로, 선택적 환원에 적용되는 IL-17 항체 제제는 추가적인 하류 크로마토그래피 단계로부터의 항체의 풀, 예를 들어, 친화력 칼럼 (예를 들어, 단백질 A 칼럼), 양이온 교환 칼럼, 음이온 교환 칼럼 등으로부터의 용출물일 수 있다. 대안적으로, 선택적 환원에 적용되는 IL-17 항체 제제는 하류 여과 단계, 예를 들어, 심층 여과, 나노여과, 한외여과 등으로부터의 항체의 풀일 수 있다. 대안적으로, 선택적 환원에 적용되는 IL-17 항체 제제는 숙주 세포 단백질을 제거하고/하거나 바이러스를 불활성화시키도록 풀이 처리되는 하류 단계로부터의 항체의 풀일 수 있다. 한 실시양태에서, 선택적 환원에 적용되는 IL-17 항체의 제제는 항체의 단백질 A 용출물 풀이다.
선택된 공정 조건 (예를 들어, 온도, 반응 시간의 길이, pH 등)에 따라, 원래의 제제의 항체의 농도가 변할 것이다. 일부 실시양태에서, 원래의 제제에서 사용된 IL-17 항체의 농도는 약 2 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 3.8 mg/ml 내지 약 19.5 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 19.5 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 약 19.4 mg/ml, 예를 들어, 약 10 mg/ml 내지 약 15.4 mg/ml, 예를 들어, 약 12 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 예를 들어, 약 13.5 mg/ml의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 선택적 환원 전에, 주사용수 (WFI) 또는 선택된 완충제를 사용하여 원하는 대로 초기 항체 제제 내의 항체 농도가 조정될 수 있다.
본원에 기술된 선택적 환원 공정은 임의 크기의 용기에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 실험실 규모 (예를 들어, 1 L-2 L)이다. 다른 실시양태에서, 용기는 시범-규모 (예를 들어, 12 L-20 L)이다. 추가 실시양태에서, 용기는 상업적 규모 (예를 들어, 10,000 L 초과, 예를 들어, 14,000 L, 15,000 L, 16,000 L 등)이다.
환원제
환원제는 산화환원 (환원-산화) 반응에서 전자 공여가 가능한 물질이다. 구체적으로, 이같은 작용제는 수소를 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙 항체) 내의 차폐된 (또는 차단된) 시스테인으로 전달하는데 유용하다. 본원에 개시된 방법은 IL-17 항체의 선택적 환원을 위해 환원제를 사용한다. 본원에서 지칭되는 각각의 환원제는 이의 유도체 (예를 들어, 염, 에스테르 및 아미드)를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "시스테인"의 언급은 시스테인 및 시스테인-HCL을 포함하고, "TCEP"의 언급은 TCEP 및 TCEP-HCL을 포함하며, 티오글리콜산의 언급은 소듐 티오글리콜레이트를 포함하는 식이다. 개시된 방법에서 사용하기 위한 환원제는 중황산나트륨, 암모니아, 트리에틸실린, 글리실시스테인, 소듐 시아노보로히드리드, 암모늄 티오글리콜레이트, 칼슘 티오글리콜레이트, 소듐 티오글리콜레이트, 아스코르브산, 히드로퀴논, 아미노메탄술폰산, 시스테산, 시스테인술핀산, 에탄디술폰산, 에탄술폰산, 호모타우린, 하이포타우린, 이세티온산, 메르캅토에탄술폰산, N-메틸타우린 (MTAU), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드), N-N-디메틸-N-N 비스(메르캅토아세틸)히드라진 (DMH), 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (베타-메르캅토에탄올), 2-메르캅토아세트산 (티오글리콜산, TGA), 시스테인 (L-시스테인), 시스테아민 (베타-메르캅토에틸아민, 또는 MEA), 글루타티온, 및 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 환원제는 티올-함유 환원제 (즉, R-SH 기가 있는 화합물), 예를 들어, 유기황 화합물이다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 환원제는, 예를 들어, 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토아세트산, 시스테인, 시스테아민, 글루타티온 및 조합물이다.
환원제의 강도는 이의 산화-환원 전위 (산화환원 전위) Eo에 의해 지시되고, 이는 볼트 (V) 단위로 제공되고 전통적으로 pH 7, 25℃에서 결정된다. 예를 들어, CSH/CSSC에 대한 표준 산화-환원 전위 Eo가 약 -0.20 V 내지 약 -0.23 V (pH 7, 25℃)로서 제공된다 (P. C. Jocelyn (1967) Eu. J. Biochem 2:327-31; Liu "The role of Sulfur in Proteins," in The Proteins, 3rd Ed. (ed. Neurath) p. 250-252 Academic Press 1977). DTT의 표준 산화-환원 전위 Eo는 약 -0.33 V (pH 7, 25℃)로서 제공된다 (M.J.O'Neil, ed. (2001). Merck Index: an encyclopedia of chemicals, drugs, & biologicals: 13th ed. (13. ed. ed.) United States: MERCK & CO INC.; Liu, 상기 문헌). 글루타티온의 표준 산화-환원 전위 Eo는 약 -0.24 V 또는 약 -0.26 V (pH 7, 25℃)로서 제공된다 (Rost and Rapoport (1964) Nature 201:185; Gilbert (1990) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 63:69-172; Giles (2002) Gen. Physiol Biophys 21:65-72; Liu, 상기 문헌). 2-메르캅토에탄올의 표준 산화-환원 전위 Eo는 약 -0.26 V로서 제공된다 (Lee and Whitesides (1990) J. Org. Chem 58:642-647). 일부 실시양태에서, 환원제는 시스테인과 유사한 표준 산화-환원 전위 Eo (예를 들어, 약 -0.20 V 내지 약 -0.23 V, 약 -0.20 V 내지 약 -0.22 V, 약 -0.20 V 내지 약 -0.21 V, 약 -0.21 V 내지 약 -0.23 V, 약 -0.21 V 내지 -0.22 V, 약 -0.22 V 내지 약 -0.23 V, 약 -0.20 V, 약 -0.21 V, 약 -0.22 V, 약 -0.23 V)를 갖는다.
티올-함유 화합물의 표준 산화-환원 전위 Eo를 열 분석, NAD+의 환원, 폴라로그래피(polarography), Fe++와의 반응, 또는 티올-디술피드 교환 연구에 의해 측정할 수 있다 (Jocelyn, 상기 문헌; Borsook et al. (1937) J. Biol. Chem 117:281; Ghosh et al. (1932) J. Indian Chem. Soc. 9:43; Kolthoff et al. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77:4739; Tanaka et al. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77:2004; Kolthoff et al. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77:4733; Eldjarn (1957) J. Am. Chem. Soc. 79:4589). 일부 실시양태에서, 열 분석, 폴라로그래피, Fe++와의 반응, 또는 티올-디술피드 교환 연구에 의해, 예를 들어, 바람직하게는 티올-디술피드 교환 연구에 의해 표준 산화-환원 전위 Eo가 결정된다. 일부 실시양태에서, pH 7, 25℃에서 표준 산화-환원 전위 Eo가 결정된다.
환원제는, 항체 제제와 조합될 때, "환원 혼합물"을 형성한다. 환원 혼합물은 환원제 및 IL-17 항체에 더하여 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 작은 몰비의 산화된 형태 (예를 들어, 시스틴, 시스타민)의 환원제가 환원제와 동시에, 또는 순차적으로, 예를 들어, 인큐베이션을 시작하고 나서 10-30분 이상 후에 환원 혼합물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 시스테인이 환원제인 경우, 소량의 시스틴이, 예를 들어, 시스테인과 동시에, 또는, 예를 들어, 시스테인이 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합되고 나서 15, 20, 30분 후에, 환원 혼합물에 첨가될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 환원 혼합물은 산화/환원 시약 세트를 포함한다. "산화/환원 시약 세트"는 산화환원 쌍 또는 산화환원 커플, 즉, 절반 반응식의 반대편에서 나타나는 산화 및 환원 작용제 (예를 들어, 환원 종 및 이의 상응하는 산화된 형태, 예를 들어, Fe2+/Fe3+, 시스테인/시스틴, 시스테아민/시스타민)를 의미한다.
반응 조건 (온도, 반응 시간의 길이, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양, pH 등)에 따라, 특정 환원 혼합물 및 선택적 환원 반응에서 사용되는 환원제의 농도가 다양할 것이다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물에서 사용되는 환원제의 양은 약 1 내지 약 20 mM로 다양할 것이다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물에서 사용되는 환원제의 농도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 mM이다. 한 실시양태에서, 환원제 (예를 들어, 시스테인)의 양은 약 4 mM 내지 약 8 mM, 예를 들어, 5.9 mM, 6 mM, 7.7 mM, 7.9 mM, 8 mM이다.
한 실시양태에서, 환원제는 베타-메르캅토에탄올이다. 특정 실시양태에서, 베타-메르캅토에탄올은 약 2.0 mM 내지 약 8.0 mM의 농도로 사용된다.
한 실시양태에서, 환원제는 글루타티온이다. 특정 실시양태에서, 글루타티온은 약 2.0 mM 내지 약 5.0 mM의 농도로 사용된다.
한 실시양태에서, 환원제는 시스테아민이다. 특정 실시양태에서, 시스테아민은 약 1.0 mM 내지 20 mM, 약 4.0 mM 내지 약 19 mM, 약 2.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 4.8 mM 내지 약 8.0 mM, 약 5.5 mM 내지 약 6.7 mM, 또는 약 6.0 mM의 농도로 사용된다.
한 실시양태에서, 환원제는 시스테인이다. 특정 실시양태에서, 환원 혼합물 내의 시스테인의 농도는 약 1.0 mM 내지 20 mM, 약 4.0 mM 내지 약 19 mM, 약 2.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 4.8 mM 내지 약 8.0 mM, 약 5.5 mM 내지 약 6.7 mM, 또는 약 6.0 mM이다. 스톡 용액, 예를 들어, 120 mM 시스테인-HCL의 스톡 용액을 사용하여 시스테인 농도를 조정할 수 있다.
각각의 IL-17 항체에는 선택적 환원이 필요한 2개의 CysL97 잔기가 있다. 따라서, 사용되는 환원제의 양은 전통적인 디술피드 결합을 비가역적으로 환원시키는 것에 의해 항체를 부수적으로 과다-환원시키지 않으면서 항체 제제 내의 실질적인 분량의 IL-17 항체 상의 CysL97 잔기 양쪽 모두를 선택적으로 환원시키는데 충분하여야 한다. 반응 조건 (산화제의 존재, 온도, 반응 시간의 길이, pH 등)에 따라, 특정 환원 혼합물 및 선택적 환원 반응에서 사용되는 환원제:IL-17 항체의 몰비가 다양할 것이다. 본 발명가들은 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 몰비가 약 11:1 (실시예 5.2) 내지 최대 약 546:1 (실시예 6.2)의 범위일 수 있다는 것을 발견하였다. 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 몰비는 약 11:1 내지 약 462:1 (예를 들어, 약 21:1), 약 31:1 내지 약 545:1 (예를 들어, 약 31:1 내지 약 156:1), 약 21:1 내지 약 296:1, 또는 약 46:1 내지 약 91:1이다. 다른 실시양태에서, 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 몰비는 약 23:1 내지 약 91:1 (예를 들어, 약 23:1 내지 약 57:1), 약 44:1 내지 약 275:1 (예를 들어, 약 44:1), 약 44:1 내지 약 66:1 (예를 들어, 약 44:1 내지 약 66:1), 바람직하게는 약 46:1 내지 약 118:1 (예를 들어, 약 56:1 내지 약 118:1), 더욱 바람직하게는 약 54:1 내지 약 82:1이다. 한 실시양태에서, 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 몰비는 약 66:1이다.
환원제 (예를 들어, 시스테인):항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 더 높은 몰비가 사용되면 (항체에 비해 과량의 환원제를 나타냄), 소량의 상응하는 산화제 (예를 들어, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하는 것이 환원제 (예를 들어, 시스테인 또는 시스테아민)의 환원력을 완화하는데 유용할 수 있다. 이는 혐기성 환경에서 특히 이롭다. 따라서, 일부 실시양태에서, 산화/환원 시약 세트를 사용하여 (예를 들어, 호기성 또는 혐기성 환경, 바람직하게는 혐기성 환경에서) 선택적 환원이 수행된다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물 내의 약 2:1 내지 약 80:1, 약 4:1 내지 약 80:1, 약 26:1 내지 약 80:1, 약 2:1 내지 약 10:1 (예를 들어, 약 6:1 내지 약 10:1), 약 4:1 내지 약 28:1 (약 4:1 내지 약 18:1), 약 27:1 내지 약 53:1 (예를 들어, 약 27:1)의 환원제 (예를 들어, 시스테인):산화제 (예를 들어, 시스틴)의 몰비를 사용하여 선택적 환원이 수행된다. 특정 실시양태에서, 시스테인이 산화제 시스틴 또는 시스타민 (바람직하게는 시스틴)과 조합되어 환원 혼합물에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물 내의 약 4 mM -14 mM 시스테인 (예를 들어, 약 7.7 mM 내지 약 8.0 mM 시스테인) 및 약 0.1 내지 약 1 mM 시스틴 (예를 들어, 약 0.1 내지 약 0.3 mM 시스틴)을 사용하는 조건에서 선택적 환원이 수행된다. 특정 실시양태에서, 환원 혼합물은 약 8.0 mM 시스테인 및 약 0.1 mM 시스틴, 약 7.9 mM 시스테인 및 약 0.1 mM 시스틴, 또는 약 7.7 mM 시스테인 및 약 0.3 mM 시스틴을 함유한다. 개시된 방법에서 산화제, 예를 들어, 시스틴이 환원제, 예를 들어, 시스테인과 조합되어 사용되면, 환원제, 예를 들어, 시스테인이 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합된 후의 시점에 산화제, 예를 들어, 시스틴이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 시스테인과 조합하여 환원 혼합물을 형성시킨 후, 환원 혼합물을, 예를 들어, 15-30분 동안 인큐베이션하고 나서, 시스틴을 반응에 첨가할 수 있다.
용존 산소
본원에서 사용된 바와 같이, "용존 산소", "dO2" 및 "DO"는 소정의 매질 내에 용해 또는 보유된 산소의 양을 지칭한다. 액체 매질에서 산소 프로브, 예컨대 산소 센서 또는 옵토드(optode)로 이를 측정할 수 있다. DO는 농도 (리터 당 밀리그램 (mg/L)) 또는 "포화 퍼센트"로서 보고될 수 있다. 리터 당 밀리그램은 1 리터의 용매 내의 산소의 양이고, 또한 백만분율 = ppm과 등가이다. 산소 포화 퍼센트는 특정 온도에서 용액이 보유할 수 있는 산소의 총량에 대해 상대적인 용액 내의 산소의 양이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "초기 산소 포화 퍼센트"는 제제를 용기에서 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키기 전의 IL-17 항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 제제 내의 용존 산소의 양을 지칭한다. 선택적 환원 공정을 시작하기 전에 원하는 산소 수준을 달성하기 위해 초기 산소 포화 퍼센트를 직접적으로 (예를 들어, 스파징(sparging)에 의해) 또는 간접적으로 (예를 들어, 교반에 의해) 조정할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 환원제와의 접촉 전에 IL-17 항체 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트가 적어도 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 심지어 높게는 100％로 조정된다. 이러한 조정은 일단 환원제가 IL-17 항체 제제에 첨가되어 환원 혼합물을 형성하면 초기에 환원제의 힘을 완화하기 위해 행해질 수 있고, 이는 방지되지 않으면 활성 및 순도 상실을 초래할 항체의 전통적인 디술피드의 부분적인 또는 완전한 환원을 방지한다. 바람직한 실시양태에서, IL-17 항체 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트는 적어도 60％ (25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시)로 조정된다. 바람직한 실시양태에서, IL-17 항체 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트는 적어도 80％ (25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시)로 조정된다.
본 발명가들은 시스테인 처리 단계 동안의 상승된 산소 수준이 항체 활성에 해로운 효과를 미칠 수 있다고 결정하였고, 이는 산소가 시스테인의 환원력을 저해하여 세쿠키누맙의 C97의 불충분한 환원에 이르는 것에 기인할 것이다. 대기로부터 산소를 흡수하는 이러한 문제를, 특히 생산 규모로 작업할 때, 환원제의 양을 변화시킴으로써, 환원제:항체의 몰비를 변화시킴으로써, 규정된 교반 속도를 사용함으로써, 또는 심지어 교반 중단을 사용함으로써 다룰 수 있다. 더 높은 양의 환원제 (예를 들어, 시스테인)가 환원 혼합물 내의 더 높은 산소 수준을 처리할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원 공정의 인큐베이션 단계 동안, 환원 혼합물 내의 산소 포화는 일반적으로 낮은 백분율 (예를 들어, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만, 약 15％ 미만, 약 10％ 미만, 약 5％ 미만)에서 유지된다.
환원제 (예를 들어, 시스테인)의 환원력 상실은 인큐베이션 단계 동안 더 이른 시점에 CysL97-SH의 불완전한 탈차단을 초래할 것이고, 탈차단된 Cys97L을 인큐베이션 단계의 이후의 부분에 (또는 냉각 단계 동안에) 보호하는데 이용가능한 잔여 환원제 (예를 들어, 시스테인)가 없으면, 탈차단된 Cys97L-SH의 재산화가 발생할 수 있다. 따라서, 이상적으로는, 낮은 백분율 산소 포화가 적어도 약 60분 내지 약 330분, 예를 들어, 적어도 약 60분, 적어도 약 90분, 적어도 약 120분, 적어도 약 150분, 적어도 약 180분, 적어도 약 210분, 적어도 약 240분, 적어도 약 270분, 적어도 약 300분, 또는 적어도 약 330분 동안 유지될 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 낮은 백분율 산소 포화가 전체 인큐베이션 단계, 뿐만 아니라 냉각 단계의 일부 동안 유지될 것이다.
환원 혼합물의 인큐베이션 동안 원하는 산소 수준을 달성하기 위해 산소 포화 퍼센트를 직접적으로 (예를 들어, 스파징에 의해) 또는 간접적으로 (예를 들어, 교반에 의해) 조정할 수 있다. 호기성 환경에서, 환원 용액의 (연속적이기보다는) 간헐적인 혼합, 예를 들어, < 15분/시, 예를 들어, <2분/시를 사용함으로써, 또는 낮은 회전 속도로 연속 교반을 사용함으로써 낮은 산소 포화 퍼센트를 달성할 수 있다. 혐기성 환경에서는, 환원제의 소비를 초래할 산소가 존재하지 않거나 또는 거의 존재하지 않는다.
체적성 산소 물질 전달 ( k L a *)
선택적 환원이 호기성 조건 하에 수행될 때, 반응에서의 산소 수준은 직접적으로 제어되는 것이 아니라, 다른 공정 파라미터, 예를 들어, 교반 속도를 통해 제어된다. 각각의 반응의 물리적 셋업 또한 반응 혼합물 내에 존재하는 산소의 수준에 영향을 미친다. 따라서, 물리적 셋업들 사이에서, 그리고 특정한 항체 프로세싱 단계 동안 용액 내로 전달되는 산소를 비교하는데 사용될 수 있는 변수를 확인하는 것이 중요하다 - 이러한 변수가 "kLa*"이다 (예를 들어, 문헌 [Garcia-Ochoa and Gomez (2009) Biotechnology Advances 27:153-176]; [Bandino et al. (2001) Biochem. Engineering J. 8:111-119]; [Juarez and Orejas (2001) Latin Am. Appl. Res. 31:433-439]; [Yange and Wang (1992) Biotechnol. Prog. 8:244-61]을 참조한다). kLa*는 스파징 없이 헤드스페이스를 통해 경시적으로 용액 내로 전달되는 산소의 양을 나타낸다. 이러한 값은 각각의 셋업 및 규모에 대해 특이적이고, 교반기 유형, 교반기 속도, 충전 부피, 및 헤드스페이스와 접촉되는 용액의 표면적 (이는 각각의 용기의 개별적인 기하학의 영향을 받는다)에 의존적이다. 각각의 물리적 셋업의 kLa*가 상이한 한편, 선택적 환원 공정 동안의 용액 내의 산소의 수준이 세쿠키누맙의 활성 및 총체성에 영향을 미치기 때문에, 본 발명가들은 유사한 kLa* 범위를 나타내는 시스템에서 수행되는 경우, 선택적 환원 공정이 유사한 품질을 갖는 세쿠키누맙의 제제를 초래할 것으로 예상한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시스템"은 스파징 없이 헤드스페이스를 통해 경시적으로 용액 내로 전달되는 산소에 영향을 미치는 물리적 셋업 (용기, 교반 유형 등) 및 공정 조건 (충전 부피, 회전 속도 등) 양쪽 모두, 즉, 규모, 교반기 속도, 충전 부피, 헤드스페이스와 접촉되는 용액의 표면적 (이는 각각의 용기의 개별적인 기하학의 영향을 받는다) 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용기"는 선택적 환원 반응이 일어나는 임의의 컨테이너를 의미한다. 용기는 시범 및 상업적 규모의 항체 생산에 사용되는 생물반응기 (예를 들어, 강철 제품, 교반 탱크, 1회용 제품 또는 1회용이 아닌 제품), 뿐만 아니라 통상적인 실험실 컨테이너, 예컨대 플라스크, 튜브 등을 비제한적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 적어도 약 2 리터, 적어도 약 100 리터, 적어도 약 500 리터, 적어도 약 1000 리터, 적어도 약 2000 리터, 적어도 약 5000 리터, 적어도 약 10,000 리터, 적어도 약 15,000 리터 또는 이를 초과하는 부피를 보유할 수 있는 생물반응기이다.
kLa*는 산소 전달 실험에서 직접적으로 결정될 수 없다. 대신, 테스트 용액 내의 dO2를 질소로 교체하고, 경시적인 dO2의 증가를 보정된 dO2 프로브를 사용하여 모니터링하고, 이는 실험적 dO2 곡선의 생성을 허용한다. 그 후, 실험적 dO2 곡선을 하기에 제시된 방정식에 따라 (예를 들어, 매쓰캐드(Mathcad)®를 사용하여) 포화 곡선에 맞춤으로써 특정 시스템에 대해 본원에서 사용되는 kLa* 값을 계산한다:
DO = C × (1 - e - kLa *×( t - t 0))
[식 중, DO = 측정된 용존 산소 값이고, C는 산소의 포화 값이고 (무한적으로 교반되고 포화가 달성될 때 100％를 의미함), 오일러의 수 e = 2.718281....이고, t = DO 값에 상응하는 시점이며, t0 = 출발 시점이다]. 이러한 방정식은 용액 내로의 산소 전달 (kLa* 값)을 결정하기 위해 확립된 통합 형태의 경험식을 나타낸다. 이러한 식은 상이한 저자들에 의해 다양한 실험에서 입증되었다 (Doran, P. M. 1995. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, San Diego, California).
본 발명가들은 선택적 환원 공정의 가열 및 냉각 단계가 더 높은 kLa*에 대해 일반적으로 인큐베이션 단계보다 더 허용성이라고 결정하였다. 이는 인큐베이션 단계 동안의 상승된 산소 수준이 항체 활성에 대한 해로운 효과가 있을 수 있기 때문이고, 이러한 효과는 증가된 산소 전달이 환원제 (예를 들어, 시스테인)의 환원력을 저해하여 세쿠키누맙의 C97의 불충분한 환원에 이르는 것에 기인할 것이다. 호기성 환경에서, 선택적 환원 공정 동안 환원 혼합물에서 교반 속도 (또는 교반 시간)을 증가시키는 것은 kLa*를 증가시킨다. 더 높은 kLa* 값에 이르는 환원 혼합물의 연속 교반이 가열 및 냉각 단계 동안 허용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가열 및 냉각 단계 동안의 kLa*은 (별개적으로) 약 0.12 h-1 내지 약 1.69 h-1, 약 0.08 h-1 내지 약 0.69 h-1, 약 0.24 h-1 내지 약 0.44 h-1, 약 0.39 h-1 내지 약 0.69 h-1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가열 및 냉각 단계 동안의 시스템 내의 kLa*은 ≤ 약 0.69 h-1이고, 상기 kLa*는 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산된다.
인큐베이션 단계 동안, 예를 들어, 낮은 회전 속도로 연속 교반을 사용하여, 또는 바람직하게는 간헐 교반을 사용하여, kLa*를 더 낮게 유지하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, ≤ 약 0.37 h-1, ≤ 약 0.27 h-1, 바람직하게는 ≤ 약 0.18 h-1의 시스템 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 환원 혼합물이 인큐베이션되고, 상기 kLa*는 용존 산소 곡선을 포화 곡선에 맞춤으로써 계산된다. 선택적 환원 반응의 인큐베이션 단계 동안의 시스템 내의 kLa*가 0.37 h-1 미만 (< 0.37 h- 1)이면, 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체의 몰비가 46.11:1 (약 46:1) 내지 118.36:1 (약 118:1)로 다양할 수 있다 (더 짧은 인큐베이션 시간 및 더 긴 인큐베이션 시간 양쪽 모두, 예를 들어, 약 210 내지 약 330분의 경우). 환원제 (예를 들어, 시스테인):단백질의 몰비가 69.89:1 (약 70:1) 내지 118.36:1 (약 118:1) (더 짧은 인큐베이션 시간, 예를 들어, 약 240분 이하의 인큐베이션의 경우) 또는 76.85 (약 77:1) 내지 118.36:1 (약 118:1) (더 긴 인큐베이션 시간, 예를 들어, 약 300분 이하의 인큐베이션의 경우)이면, 선택적 환원 반응의 인큐베이션 단계 동안의 시스템 내의 kLa*가 최대 0.37 h-1 (≤ 0.37 h- 1)일 수 있다.
환원제 (예를 들어, 시스테인):항체의 몰비가 약 46:1 - 약 118:1이면, 일반적으로 전체적인 선택적 환원 공정 (즉, 가열 단계, 인큐베이션 단계, 및 냉각 단계)을 < 0.37의 h-1의 kLa*를 사용하여 수행할 수 있고, 이는 약 210 - 약 330분 인큐베이션 시간 (예를 들어, 약 240분 - 300분 인큐베이션 시간)을 포함한다. 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체의 몰비가 약 70:1 - 약 118:1이고, 인큐베이션이 약 240분 이하이거나; 또는 환원제 (예를 들어, 시스테인):항체의 몰비가 약 77:1 - 약 118:1이고, 인큐베이션이 약 300분 이하이면, 일반적으로 전체적인 선택적 환원 공정 (즉, 가열 단계, 인큐베이션 단계, 및 냉각 단계)을 kLa* ≤ 0.37 h-1을 사용하여 수행할 수 있다.
추가적인 공정 성분
본 개시내용은 항체를 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계를 포함하는, 특정 IL-17 항체, 예컨대 세쿠키누맙 내의 CysL97의 선택적 환원을 위한 방법을 제공한다. 환원 혼합물이 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 환원제에 더하여 성분들을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 환원 혼합물은 수성 성분 (예를 들어, 완충제, 예컨대 트리스 완충제), 뿐만 아니라 환원 혼합물의 pH를 증가 또는 감소시키는데 사용되는 시약, 염, EDTA 등을 함유할 수 있다. 따라서, 환원 혼합물이 필수적으로 IL-17 항체 (예를 들어, 세쿠키누맙) 및 환원제를 함유할 것인 한편, 환원 혼합물은 추가적인 성분들을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물은 금속 킬레이터 (예를 들어, EDTA, DMSA, DMPS)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물은 1.3 mM 내지 약 0.8 mM, 약 1.1 내지 약 0.9 mM, 또는 약 1.0 mM의 EDTA (예를 들어, 디-Na-EDTA)를 함유한다.
반응 조건 (온도, 반응 시간의 길이, IL-17 항체의 양, 환원제의 농도, 환원제:항체 비 등)에 따라, 특정 항체 제제의 pH가 다양할 것이다. 그러나, 본원에 기술된 반응 조건을 기초로, 원하는 선택적 환원을 달성하기 위해 이같은 조건이 변할 수 있는 것으로 인정된다. 일부 실시양태에서, 환원제와의 접촉 전의 항체 제제의 pH는 약 6.5 내지 약 9.5, 예를 들어, 약 7 내지 약 9로 다양할 것이다. 다른 실시양태에서, 항체 제제의 pH는 약 7.4 내지 약 8.5, 약 7.8 내지 약 8.2, 약 7.9 내지 약 8.1, 또는 약 8.0일 것이다. 일부 실시양태에서, 완충제, 예를 들어, 1 M 트리스 완충제 (예를 들어, 1 M 트리스 완충제 pH 10.8)를 사용하여 (예를 들어, 기체 처리로 초기 산소 포화 퍼센트를 조정한 후에) 항체 제제의 pH를 조정할 수 있다.
IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 세쿠키누맙)을 함유하는 제제와 환원제의 접촉 후에, 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (HLLH)의 수준에서 초기 환원이 있을 수 있다. 용어 "무손상"은 항체가 모든 보존된 디술피드 다리 (예를 들어, 고전적 IgG1 항체의 경우 14개의 보존된 디술피드 다리)를 갖는 것을 지칭한다. 다양한 IL-17 항체 단편, 즉, H2L, HL2, HL, H 및 L 밴드, 뿐만 아니라 무손상 H2L2 (HHLL) 밴드의 형성을 관련 기술 분야에 공지된 여러 분석 도구 (예컨대 SDS-PAGE, 양이온-교환 HPLC)를 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 혼합물 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준을 소듐 도데실 술페이트 모세관 전기영동 (CE-SDS)으로 측정한다. CE-SDS는 전기장에서 단백질들을 이들의 분자 크기에 따라 분리한다. 비-환원형 CE-SDS를 사용하여 항체 제제 내의 크기 변이체들을 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원제를 항체 제제에 첨가하고 나서 약 1-30분 (예를 들어, 약 15분) 이내에 혼합물 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준이 CE-SDS로 측정 시 적어도 약 80％로 감소한다. 일부 실시양태에서, 혼합물 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준이 CE-SDS로 측정 시 적어도 약 83％로 감소한다. 일부 실시양태에서, 혼합물 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준이 약 75％ 내지 약 87％로 감소한다. 일부 실시양태에서, 혼합물 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준이 CE-SDS로 측정 시 적어도 약 38, 39, 40, 41, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 또는 87％로 감소한다.
벡크만 쿨터(Beckman Coulter) PA-800 모세관 전기영동 시스템을 사용하여 CE-SDS 분석을 수행할 수 있다. 내경 50 ㎛ 및 길이 30 cm (환원형 CE-SDS 및 비-환원형 CE-SDS 분석에 대해 분리 범위가 각각 20 cm 및 10 cm임)의 코팅되지 않은 용융 실리카 모세관이 분석에 사용된다. 214 nm에서 UV 검출기로 분리를 모니터링한다. 비-환원형 CE-SDS 분석의 경우, 항체 샘플을 물로 6.0 mg/mL로 희석하고, 비-환원형 CE-SDS 샘플 완충제 (0.1 M 트리스/1.0％ SDS, pH 7.0) 및 250 mM 아이오도아세트아미드와 20/75/5 (v/v/v) 비로 철저하게 혼합하고, 70℃에서 10분 동안 가열하여, 디술피드 다리 셔플링(shuffling)을 방지한다. 분리를 위해 모세관 온도를 25℃로 설정한다. 20분 동안 정상 극성 모드로 15 kV의 일정 전압에서 전기영동을 수행한다.
일부 실시양태에서, 환원 혼합물이 가열된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션하는 단계 전에 가열이 발생한다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물이 약 32℃ 내지 약 42℃의 온도, 약 35℃ 내지 약 39℃, 약 37℃로 가열된다. 일부 실시양태에서, 약 30 내지 약 120분, 약 45 내지 약 90분, 약 45 내지 약 75분, 약 60분 동안 가열이 발생한다. 가열 동안, 임의의 교반 수단을 사용하여, 예를 들어, 연속적으로 또는 간헐적으로, 환원 혼합물을 교반할 수 있다. 교반은 축형일 수 있거나 (예를 들어, 경사날 임펠러를 사용함), 또는 방사형일 수 있다 (예를 들어, 러쉬톤(rushton) 터빈을 사용함). 일부 실시양태에서, 가열하는 동안 환원 혼합물이 연속적으로 65-200 rpm (예를 들어, 50 rpm, 65 rpm, 75 rpm, 85 rpm, 100 rpm 또는 200 rpm)에서 교반된다.
인큐베이션 단계 동안, 유리 시스테인 (예를 들어, 세쿠키누맙의 유리 시스테인)의 선택적 환원을 허용하도록 전형적으로 환원 혼합물이 미리 정해진 시간 동안 인큐베이션될 것이다. 일부 실시양태에서, 환원 혼합물의 가열 후에 인큐베이션이 발생한다. 반응 조건 (환원제, 온도, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양, pH 등)에 따라, 환원 혼합물의 인큐베이션을 위한 미리 정해진 시간이 다양할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 시간은 약 1 내지 24시간 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 18, 20 또는 24시간)으로 다양할 것이다. 일부 실시양태에서, 약 200 내지 약 500분, 약 210 내지 약 420분, 약 210 내지 약 330분, 약 240 내지 약 300분, 약 250분 동안 인큐베이션이 수행된다.
인큐베이션 단계 동안, 표적 유리 시스테인 (예를 들어, 세쿠키누맙의 항원 결합 부위 내의 CysL97)의 선택적 환원을 허용하도록 인큐베이션이 미리 정해진 온도에서 수행될 것이다. 반응 조건 (환원제, 시간, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양, pH 등)에 따라, 인큐베이션 온도가 다양할 것이다. 일부 실시양태에서, 미리 정해진 온도는 약 20 내지 약 42℃로 다양할 것이다. 일부 실시양태에서, 미리 정해진 온도는 약 32℃ - 약 42℃, 약 35℃ - 약 39℃, 또는 약 37℃일 것이다.
인큐베이션 단계 동안, 환원제가 IL-17 항체 제제, 예를 들어, 세쿠키누맙과 함께 인큐베이션되는 동안 생성물 균질성을 확실히 하도록 환원 혼합물이 교반될 수 있다. 그러나, 환원제가 효과적으로 IL-17 항체 내의 CysL97을 선택적으로 환원시킬 수 있게 하기 위해 선택적 환원 반응의 이러한 부분 동안 용기 내의 산소 수준이 낮게 유지되어야 한다. 호기성 조건 하에서는, 연속 교반을 방지함으로써, 예를 들어, 간헐 교반, 예를 들어, ≤ 15 분/시, 예를 들어, ≤ 2 분/시를 사용함으로써 낮은 산소를 달성할 수 있다. 혐기성 조건 하에서는, 산소 전달이 제한되고, 따라서 교반이 더 긴 기간 동안 진행될 수 있거나 또는 연속적일 수 있다. 또한, 혐기성 조건 하에서, 산소 전달의 엄격한 제어 (예를 들어, 조절된 스파징에 의한 제어)가 더 긴 교반 시간의 적용 (연속 교반을 포함함)을 또한 허용할 것이다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계 후에 혼합물이 냉각된다. 일부 실시양태에서, 혼합물이 실온 (예를 들어, 약 16℃ 내지 약 28℃의 온도)으로 냉각된다. 일부 실시양태에서, 약 30 내지 약 120분, 약 45 내지 약 90분, 약 45 내지 약 75분, 약 60분 동안 냉각이 발생한다. 냉각 동안, 임의의 교반 수단을 사용하여, 예를 들어, 연속적으로 또는 간헐적으로, 환원 혼합물을 교반할 수 있다. 교반은 축형일 수 있거나 (예를 들어, 경사날 임펠러를 사용함), 또는 방사형일 수 있다 (예를 들어, 러쉬톤 터빈을 사용함). 일부 실시양태에서, 냉각하는 동안 환원 혼합물이 연속적으로 65-200 rpm (예를 들어, 50 rpm, 65 rpm, 75 rpm, 85 rpm, 100 rpm 또는 200 rpm)에서 교반된다.
예를 들어, 아이오도아세트아미드 또는 o-인산을 사용하여 (예를 들어, 0.3 M o-인산의 스톡 용액을 사용하여), 선택적 환원 반응을 켄칭시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 냉각 단계 후에 켄팅이 발생한다. 일부 실시양태에서, 혼합물의 pH를 약 5.0 내지 약 5.5, 약 5.1 내지 약 5.3, 약 5.2로 조정함으로써 선택적 환원 반응이 켄칭된다. o-인산을 사용하여 pH 조정을 달성할 수 있다.
"정제된 제제"라는 문구는 선택적 환원에 적용되었던 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 혼합물을 지칭한다. 선택적 환원의 완료 후, 정제된 제제 내의 무손상 IL-17 항체의 수준이 증가될 것이다. 선택적 환원 후의 정제된 제제 내의 무손상 항체의 수준을 다양한 널리 공지된 기술 (예를 들어, 비-환원형 SDS PAGE, CE-SDS PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), HPLC)을 통해 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, CE-SDS로 무손상 항체의 수준을 측정한다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원의 완료 후 (예를 들어, 냉각 단계의 완료 후), 정제된 제제 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준은 CE-SDS로 측정 시 적어도 약 80％이다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원 후, 정제된 제제 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준은 CE-SDS로 측정 시 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 약 100％이다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원 후, 정제된 제제 내의 무손상 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수준은 CE-SDS로 측정 시 적어도 약 90％이다.
선택적 환원 전의 제제, 선택적 환원 동안의 제제 또는 선택적 환원 후의 제제 (즉, 정제된 제제) 내의 항체의 활성 (예를 들어, 친화력, 생물학적 활성 등)을 다양한 널리 공지된 기술을 통해 측정할 수 있다 (예를 들어, WO2006/013107; WO2007/117749; 문헌 [Shen and Gaffen (2008) Cytokine. 41(2): 92-104]를 참조한다). 특정 실시양태에서, ELISA 기반 검정법 또는 세포-기반 검정법 (예를 들어, IL-6 또는 GRO알파의 예를 들어 C-20/A4 연골세포 또는 BJ 세포주로부터의 IL-17 의존적 방출의 억제)을 사용하여 활성이 측정된다. 일부 실시양태에서, 시스타민-CEX (양이온 교환 크로마토그래피) 방법으로 활성이 측정된다. 시스타민-CEX 방법은 항체를 시스타민 (2,2'-디티오비스(에틸아민))으로 유도체화시킨 후, 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)를 사용하여 분석적으로 분리하는 것을 포함한다. CysL97이 산화된 형태로 있으면 본원에 개시된 항체 (예를 들어, 세쿠키누맙)의 활성이 감소되기 때문에, CysL97을 시스타민으로 유도체화시키는 것은 항체 활성을 측정하는 대용물로서의 역할을 하고, 즉 선택적 환원이 성공하면, 환원된 CysL97이 시스타민으로 유도체화될 수 있는 반면, 선택적 환원이 실패하면, 산화된 CysL97이 시스타민으로 유도체화될 수 없다. 시스타민에 의한 유도체화로 유리 Cys97 잔기 당 1개의 양성 전하가 부가된다. 그 후, 생성된 유도체화된 형태의 세쿠키누맙 (예를 들어, +2, +1 전하)을 유도체화되지 않은 형태로부터 분리하고, CEX로 정량할 수 있다. 양쪽 경쇄 상의 쌍을 이루지 않은 Cys97에 2개의 시스타민이 결합된 시스타민-유도체화 세쿠키누맙 분자는 이론적으로 100％ 생물학적 활성인 것으로 간주될 수 있다. 경쇄 중 하나 상의 쌍을 이루지 않은 Cys97에 결합된 1개의 시스타민이 부가된 시스타민-유도체화 세쿠키누맙 분자는 50％ 생물학적 활성인 것으로 간주될 수 있다. 어떠한 시스타민도 분자에 결합되지 않은 시스타민-유도체화 세쿠키누맙 분자는 생물학적 불활성인 것으로 간주될 수 있다. 그 후, 항체의 제제 (예를 들어, 세쿠키누맙 항체의 제제) 내의 시스테민 유도체화의 이론적 최대 수준에 비교된 이러한 제제 내의 시스타민 유도체화의 수준 (예를 들어, 이론적 최대값의 백분율로서 표현됨)을 제제의 활성의 척도로서 사용할 수 있다.
간략하게, 하기와 같이 시스타민-CEX를 수행할 수 있다. 항체 샘플 (50 ㎍)을 먼저 카르복시펩티다제 B (1:40, w:w)로 처리하여 중쇄 내의 C-말단 리신을 제거한 후, 5 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA, pH 4.7 내의 4 mM 시스타민으로 실온에서 2시간 동안 유도체화시킨다. 2 ㎕의 1 M 인산을 첨가하여 유도체화를 정지시킨다. 시스타민-유도체화 항체 샘플 상에서 프로팍(ProPac)™ WCX-10 분석용 칼럼 (4 mm x 250 mm, 다이오넥스(Dionex))을 사용하여 CEX를 수행한다. 유속 1.0 ml/분의 25 mM 인산나트륨, pH 6.0 내의 12.5 mM에서 92.5 mM까지의 염화나트륨의 구배를 사용하여 분리한다. 220 nm에서의 흡광도를 UV 검출기 (애질런트(Agilent) HPLC 1200)로 기록한다.
산화된 유리 시스테인이 있는 IL-17 항체의 일부 초기 제제는 활성 수준이 45％만큼 낮다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원 공정을 시작하기 전에, 제제 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성의 수준은 (예를 들어, 시스타민-CEX 방법으로 측정 시) 약 80％ 미만, 약 75％ 미만, 약 70％ 미만, 약 65％ 미만, 약 60％ 미만, 약 55％ 미만, 약 50％ 미만, 또는 약 45％ 미만이다. 선택적 환원 동안, 정제된 제제 내의 IL-17 항체의 활성의 수준이 증가될 것이다. 일부 실시양태에서, 항체 제제 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성의 수준이 항체 제제를 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키고 나서 약 60분 이내에 (예를 들어, 시스타민-CEX 방법으로 측정 시) 적어도 약 15 백분율 포인트만큼 (예를 들어, 약 60％에서 적어도 약 75％로), 적어도 약 20 백분율 포인트만큼 (예를 들어, 약 60％에서 적어도 약 80％로), 적어도 약 25 백분율 포인트만큼 (예를 들어, 약 60％에서 적어도 약 85％로) 또는 적어도 약 30 백분율 포인트만큼 (예를 들어, 약 60％에서 적어도 약 90％로) 증가된다.
선택적 환원 후, 정제된 제제는 환원된 형태의 CysL97이 있는 IL-17 항체에 대해 강화될 것이고, 초기 제제에 비해 증가된 수준의 활성을 나타낼 것이다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원의 완료 후, 정제된 제제 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성의 수준은 시스타민-CEX, ELISA 또는 세포-기반 결합 검정법 (예를 들어, 시스타민-CEX 검정법)으로 측정 시 (이론적 최대값에 비해) 적어도 약 80％이다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원의 완료 후, 정제된 제제 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성의 수준은 CEX, ELISA 또는 세포-기반 결합 검정법 (예를 들어, 시스타민-CEX 검정법)으로 측정 시 적어도 약 80, 81 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 약 100％이다. 일부 실시양태에서, 선택적 환원의 완료 후, 정제된 제제 내의 IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성의 수준은 시스타민-CEX, ELISA 또는 세포-기반 결합 검정법 (예를 들어, 시스타민-CEX 검정법)으로 측정 시 적어도 약 93％이다.
따라서, 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
a) 제제를 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계; 및
b) ≤ 약 0.37 h-1의 시스템 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 단계이며, 상기 kLa*가 용존 산소 곡선을 포화 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계
를 포함하고, 여기서 IL-17 항체 각각이 서열식별번호: 8로 기재된 중쇄 가변 도메인 (VH)의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 면역글로불린 VH 및 서열식별번호: 10으로 기재된 경쇄 가변 도메인 (VL)의 3개의 CDR을 포함하는 면역글로불린 VL을 포함하며, 추가로 단계 a) 전에, 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트가 25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시 적어도 약 60％인 방법이 본원에 개시된다.
포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
a) 제제를 시스테인/시스틴 및 시스테인/시스타민으로부터 선택된 산화/환원 시약 세트와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계; 및
b) 환원 혼합물을 약 37℃의 온도에서 혐기성 조건 하에 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션하거나, 또는 환원 혼합물을 약 18-24℃의 온도에서 약 16-24시간 동안 인큐베이션하는 단계
를 포함하고, 여기서 IL-17 항체 각각이 서열식별번호: 8로 기재된 중쇄 가변 도메인 (VH)의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 면역글로불린 VH 및 서열식별번호: 10으로 기재된 경쇄 가변 도메인 (VL)의 3개의 CDR을 포함하는 면역글로불린 VL을 포함하는 방법이 또한 본원에 개시된다.
포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 세쿠키누맙 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
a) 제제 내의 세쿠키누맙의 농도를 약 4 mg/ml - 약 19.4 mg/ml, 예를 들어, 약 10 mg/ml - 약 19.4 mg/ml, 예를 들어, 약 10 - 약 15.4, 예를 들어, 약 12 mg/ml - 약 15 mg/ml, 예를 들어, 약 13.5 mg/ml로 조정하는 단계;
b) 제제 내의 산소 포화 퍼센트를 적어도 약 60％, 예를 들어, 적어도 약 80％로 조정하는 단계;
c) 제제의 pH를 약 7.4 - 약 8.5, 예를 들어, 약 7.8 - 약 8.2, 예를 들어, 약 7.9 - 약 8.1, 예를 들어, 약 8.0으로 조정하는 단계;
d) 제제를 용기에서 시스테인과 접촉시켜 환원 혼합물을 생성시키는 단계이며, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인의 농도가 약 4.0 mM - 약 8.0 mM, 예를 들어, 약 4.8 mM - 약 8.0 mM, 예를 들어, 약 5.5 mM - 약 6.7 mM, 예를 들어, 약 6.0 mM인 단계;
e) 환원 혼합물을 약 32℃ - 약 42℃, 예를 들어, 약 35℃ - 약 39℃, 예를 들어, 약 37℃의 온도로 가열하는 단계이며, 상기 가열이 약 45 - 약 90분, 예를 들어, 약 45 - 약 75분, 예를 들어, 약 60분 동안 발생하는 것인 단계;
f) 단계 e)로부터의 환원 혼합물을 약 20℃ - 약 42℃, 예를 들어, 32℃ - 약 42℃, 예를 들어, 약 35℃ - 약 39℃, 예를 들어, 약 37℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계이며, 상기 인큐베이션이 ≤ 0.37 h-1의 용기 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 약 210 - 약 420분, 예를 들어, 약 210 - 약 330분, 예를 들어, 약 240 - 약 300분, 예를 들어, 약 250분 동안 발생하며, 상기 kLa*가 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계;
g) 단계 f)로부터 생성된 혼합물을 약 16℃ - 약 28℃의 온도로 냉각하는 단계이며 상기 냉각이 약 45 - 약 90분, 예를 들어, 약 45 - 약 75분, 예를 들어, 약 60분 동안 발생하는 것인 단계; 및
h) 단계 g)로부터 생성된 혼합물의 pH를 약 5.1 - 약 5.3, 예를 들어, 약 5.2로 조정하는 단계
를 포함하는 방법이 또한 본원에 개시된다.
세쿠키누맙의 정제된 제제이며, 제제 내의 무손상 세쿠키누맙의 수준이 소듐 도데실 술페이트 모세관 전기영동 (CE-SDS)으로 측정 시 적어도 약 90％이고, 제제 내의 세쿠키누맙의 활성의 수준이 시스타민-CEX로 측정 시 적어도 약 90％인 제제가 또한 본원에 개시된다.
일반 사항
상기 방법들의 일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 i) 서열식별번호: 8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH); ii) 서열식별번호: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL); iii) 서열식별번호: 8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열식별번호: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; iv) 서열 면에서 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; v) 서열 면에서 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; vi) 서열 면에서 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; vii) 서열 면에서 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 서열 면에서 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; 및 viii) 서열 면에서 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 서열 면에서 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함한다. 개시된 방법의 일부 실시양태에서, IL-17 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IgG1 이소형의 인간 항체이다. 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 항체는 세쿠키누맙이다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 상세사항이 상기의 첨부된 설명에서 기재된다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법 및 물질이 기술된다. 본 개시내용의 다른 특색, 목표 및 장점이 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한, 단수 형태는 복수의 지시대상을 포함한다. 달리 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는 참조로 포함된다. 하기의 실시예는 본 개시내용의 바람직한 실시양태를 더욱 충분히 예시하기 위해 제시된다. 이러한 실시예는 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 바와 같은 개시된 특허 내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 상이한 술프히드릴 작용제들에 의한 세쿠키누맙 단백질 A 중간체의 환원
실시예 1.1
다양한 술프히드릴 기-함유 환원제 (예를 들어, 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토아세트산, 시스테인, 시스테아민, 글루타티온)를 세쿠키누맙의 경쇄 내의 산화된 Cys97을 선택적으로 환원시키는 것에서 이들을 사용하는 것에 대해 스크리닝하였다. 제1 실험 세트에서, 초기 발효 공정으로부터 단백질 A 포착 단계 후에 수득된 1-mL 분량의 불활성 출발 물질을 37℃에서 다양한 농도의 β-메르캅토에탄올, 시스테인 및 글루타티온과 함께 다양한 pH에서 인큐베이션하였다. 특정 시점 후, 샘플을 20 mM 아세테이트 pH 6 완충제 내로의 겔 여과로 탈염시키고, 활성 복원을 ELISA로 결정하였다. 또한, 유리 술프히드릴 기의 함량을 엘만(Ellman) 테스트로 결정하였다 (술프히드릴 기의 탈차단은 항체 몰 당 2 몰의 유리 SH의 값을 초래할 것이다). 결과가 하기 표 2에서 열거된다.
Figure 112017058118342-pct00003
표 2: 소정의 조건에서의 반응 후의 샘플의 활성 및 유리-SH.
°: 2-메르캅토에탄올 (2-ME)
*: 기준에 대한 상대 %
이러한 연구의 결과로서, 1 내지 20 mM의 농도 및 20-40℃의 온도의 pH 범위 7-9의 메르캅토에탄올 및 시스테인이 가장 적절한 것으로 확인되었다.
추가 연구 과정에서, 환원제에 노출되는 동안, 쇄간 디술피드 다리가 부분적으로 환원된 항체가 형성되면서 항체가 과다환원될 수 있다는 것이 인식되었다. 이러한 과다환원은, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 투석여과에 의해 또는 크로마토그래피에 의해, 항체가 반응 혼합물로부터 단리될 때 대기 조건 하에 가역적인데, 이는 완충제 내에 존재하는 용존 산소가 무손상 항체가 재형성되는 자발적인 재산화를 초래하기 때문이다.
Figure 112017058118342-pct00004
실시예 1.2 (혐기성 조건)
제2 실험 세트에서, 단백질 A 포착 단계 후에 수득된 세쿠키누맙 항체의 처리를 탈기된 용액 및 아르곤 또는 질소 대기를 사용하는 것에 의해 혐기성 조건 하에 수행하여, 환원 결과에 대한 용존 산소의 효과를 배제시켰다. 간략하게, 단백질 A 포착 단계로부터의 세쿠키누맙 용액을 트리스 염기 스톡 용액을 첨가하여 pH 8.0으로 조정하였다. 그 후 시스테인/EDTA 스톡 용액 (예를 들어, 200 mM/12.5 mM EDTA, pH 8)의 첨가에 의해 용액을 8 mM 시스테인 및 1 mM EDTA의 농도로 조정하였다. 환원 용액 내의 세쿠키누맙의 농도는 4 mg/mL였다 (시스테인:항체의 몰비 약 296:1). 혼합물을 실온에서 24시간의 기간 동안 인큐베이션하였다. 여러 시점에, 샘플을 취하고, 과량의 아이오도아세트아미드를 스파이킹하였으며, 이는 환원제 및 항체의 술프히드릴 기를 켄칭하는 것에 의해 반응을 정지시킨다.
동일한 셋업을 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토아세트산, 시스테인, 시스테아민 및 글루타티온으로의 실험에 사용하였다. DTT의 경우, 1 mM의 농도를 사용하였다.
켄칭된 샘플을 비-환원 모드의 SDS 모세관 전기영동 (CE-SDS)으로 분석하였다. 이러한 분석 방법은 무손상 항체 (LHHL)로부터의 항체의 상이한 환원 생성물들 (HHL, HH, HL, H 및 L 종)을 분리하고, 이들을 온-라인 UV 검출 및 수득된 신호의 면적-적분에 의해 정량한다.
도 1에서, 0, 3, 15분, 1h, 2h, 4h 및 20-24h 환원 처리로부터의 무손상 항체 (LHHL)에 대한 데이터는 DTT 및 β-메르캅토 아세트산이 무손상 항체로의 재-평형화 없이 항체를 완전히 환원시킨다는 것을 나타낸다. 글루타티온 및 β-메르캅토에탄올 또한 확연한 환원을 나타내지만, 무손상 항체 (LHHL)로의 재-평형화를 유도할 수 있었다. 시스테인은 항체를 약 50％로 환원시키고, 무손상 항체로의 수월한 재-평형화가 이어진다. 시스테아민에 대한 데이터는 이러한 시약이 환원을 거의 발휘하지 않거나 또는 매우 신속하게 (3분 미만의 시간 이내에) 재-평형화에 이른다는 것을 나타낸다.
확인된 환원 순서 (즉, DTT > β-메르캅토 아세트산 > β-메르캅토에탄올 > 글루타티온)는 산화환원 전위 또는 디술피드 상호교환에 대한 공개된 데이터와 상관된다. 하기의 설명 및 데이터를 제공하는 문헌 [T. Liu in "The Proteins, 3rd Edition, Volume 3 (1977) p. 239]을 참조한다:
산화환원 전위 E = E0 + 0.059 × log [R-SS-R]/[R-SH]
전극으로서 직접적으로 측정가능하지 않은 표준 산화환원 전위 (볼트 단위의 E0)는 황과 대조된다. 따라서, 산화환원 전위가 간접적인 측정으로부터 추정되어야 했다:
디티오트레이톨 DTT/DTTox : E0 ~ -0.33 V (pH 7, 25℃)
글루타티온 GSH/GSSG : E0 ~ -0.24 V (pH 7, 25℃)
시스테인 CSH/CSSC : E0 ~ -0.22 V (pH 7, 25℃)
실시예 2: 시스테인이 호기성 및 혐기성 조건 하에 세쿠키누맙을 선택적으로 환원시킨다.
실온 (RT) (약 25℃) 또는 37℃에서 8 mM 시스테인, 4 mg/ml 세쿠키누맙, pH 8 (시스테인:항체의 몰비 약 295.88:1)을 사용하여 추가적인 실험을 수행하였다. 호기성 조건 (즉, 용액 제조 및 처리가 일반 공기 하에 수행됨), 또는 혐기성 조건 (즉, 용액 제조 및 처리가 탈기 및 아르곤 또는 질소 대기 하에서의 후속 작업에 의해 산소의 배제 또는 감소 하에 수행됨) 하에 반응을 수행하였다.
혐기성 조건 (예를 들어, 질소 또는 아르곤 대기 + 0％ 용존 산소) 하에서는, 처리의 초기 단계에서, 과다-환원의 징조인 항체 단편들이 형성되면서 항체가 실질적으로 분해된다. RT (도 2A) 또는 37℃ (도 2C)에서 수행된 실험에 대해 약 40％로의 무손상 항체 (LHHL)의 최대 감소가 약 15분에 발생한다. 20시간의 무손상 항체로의 재-평형화는 RT 샘플에서는 약 17.1％의 과다-환원된 변이체가 잔존하고, 37℃ 샘플에서는 12.1％의 과다-환원된 변이체가 잔존한다는 것을 나타낸다.
호기성 조건, 즉, 용존 산소의 존재 하에서는, 반응이 더욱 중도적이다. RT (도 2B)에서 수행된 실험의 경우는 약 80％, 37℃ (도 2D)에서 수행된 실험의 경우는 약 73％ 잔여 수준으로의 무손상 항체 (LHHL)의 최대 감소가 약 15분에 발생한다. 무손상 항체로의 재-평형화는 RT 샘플에서는 20시간 후에 단지 5.8％의 과다-환원된 변이체가 잔존하고, 37℃ 샘플에서는 8시간 후에 단지 9.3％의 과다-환원된 변이체가 잔존한다는 것을 나타낸다.
따라서, 혐기성 조건 하에서 초기 환원이 더 크고, 무손상 항체로의 재-평형화가 호기성 조건 하에서만큼 완전하지 않다.
실시예 3: 선택적 환원에 대한 용존 산소 및 시스틴의 영향
공기의 존재 하에 시스테인 (Cys-SH)이 시스틴 (Cys-SS-Cys)으로 산화되기 때문에, 호기성 및 혐기성 조건 하에 관찰된 차이는 호기성 조건 하에서의 시스테인 용액의 제조 동안, 그리고 또한 세쿠키누맙을 시스테인으로 실제로 처리하는 동안에 형성된 소량의 시스틴에 의해 야기될 수 있다. 세쿠키누맙의 선택적 환원에 대한 dO2 및 시스틴 (또는 시스타민)의 수준의 영향을 평가하기 위해, 본 발명가들은 항체를 단리하면서 여러 추가적인 예비 실험을 수행하였다.
일부 샘플에 대해, 100％ dO2 (질소 훈증 없음), 50％, 및 20％ dO2 (주위 온도에서의 교반 + 실험 전반에 걸쳐 용존 산소가 목적 수준에서 유지되도록 질소 훈증)의 호기성 조건, 및 시스틴이 없는 혐기성 (0％ dO2) 조건 (용액 탈기, 전량 질소 대기) 하에, 뿐만 아니라 약 0.1 mM 시스틴 [시스테인:시스틴의 비 = 80:1]이 존재하는 100％ dO2 하에 37℃에서 pH가 8.0인 용액 내의 8 mM 시스테인 (시스테인:항체의 몰비 295.88:1)으로 4 mg/ml 세쿠키누맙의 선택적 환원을 수행하였다. 한 실험에서, 혐기성 조건 하에서 8 mM 시스테인과 함께 초기에 30분 인큐베이션한 후 0.3 mM 시스틴을 첨가하였다. 또 다른 실험에서, 7.7 mM 시스테인 및 0.3 mM 시스틴 [시스테인:시스틴의 비 = 25.66:1]을 사용하여 혐기성 조건 하에 선택적 환원을 수행하였다. 또 다른 샘플에서, 시스틴 대신 0.1 mM 시스타민을 첨가하였다.
모든 이러한 실험에서, 여러 시점에 샘플을 취하였다. 처리가 끝날 때 (37℃에서 240분), 벌크 용액의 pH를 5.0으로 조정하고, 항체에 결합하는 양이온-교환 칼럼에 로딩함으로써, 항체를 단리하였다. 환원제를 제거하도록 세정한 후, 항체를 염 및/또는 pH-구배에 의해 용출시키고, CE-SDS, SE-HPLC 및 CEX로 분석하였다.
도 3은 여러 처리 시점에 취해진 아이오도아세트아미드로 켄칭된 샘플의 CE-SDS 분석을 나타낸다. dO2가 적을수록, 초기 단계의 환원이 더 크고, 선택적 환원의 후기 단계에서의 평형화가 더 느리다. 전체적인 혐기성 조건 (0％ dO2)에서 처리가 끝날 때 무손상 항체의 수준이 실질적으로 더 낮다 (70％). 50％ 이상의 용존 산소의 조건 하에 수행되었을 때 무손상 항체의 수준이 90％ 초과로 개선되었다. 소량의 시스틴 (또는 시스테아민)을 첨가하는 것은 항체의 초기 환원을 감소시켰다.
표 3은 상이한 재활성화 처리들 (혐기성 및 호기성 조건)로부터의 샘플을 SP-세파로스 FF 상에서의 후속 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후에 수득된 항체의 활성 및 순도를 나타낸다.
Figure 112017058118342-pct00005
표 3: 상이한 재활성화 처리들 후의 항체의 활성 및 순도
생체활성과 관련하여, 활성이 단지 45％였던 비-선택적으로 환원된 세쿠키누맙 출발 물질에 비해 모든 경우에 충분히 활성인 물질이 수득되었다 (이론적 최대값의 86-108％). CE-SDS 순도와 관련하여, 시스틴이 결여된 완전히 혐기성인 처리 하에 수득된 항체에서 손상된 순도 (82.3％)가 확인되었고, 이는 아마도 이러한 조건 하에서의 과다-환원에 기인하였을 것이다 (주: 환원 전위가 더 작고, 이에 의해 과다-환원 가능성이 더 적기 때문에, 혐기성 반응에 시스틴을 첨가하는 것이 CE-SDS로 측정 시 샘플의 순도를 증가시켰다). 그러나, 모든 다른 선택적 환원 처리는 유사한, 그리고 높은 항체 품질 및 활성을 초래하였다. 본 발명가들은 SP-세파로스 크로마토그래피 단계 전의 일부 CE-SDS 순도 값이 크로마토그래피 단계 후에 수득된 값보다 약간 더 낮았음 (예를 들어, 단계 전의 65％ 대 단계 후의 82％)을 또한 인지하였고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 크로마토그래피 단계 동안 추가적인 재-산화가 발생할 수 있다는 것을 시사한다. 시스테인의 환원력을 완화하는 산소가 더 많았기 때문에, 일반적으로 CEX 활성은 다양한 호기성 조건 하에 더 낮았다. 호기성 조건 하에 산화제인 시스틴 및 시스타민을 첨가하는 것이 CEX 활성을 추가로 감소시켰다.
실시예 1-3으로부터 도출된 요약 및 결론
본 발명가들은 예를 들어 구아디닌 HCl을 사용하여 전체 항체 구조를 부분적으로 언폴딩시키는 것을 요구하지 않으면서 세쿠키누맙의 CysL97이 용액에서의 환원에 이용가능하다고 결정하였다. 또한, 전체적인 세쿠키누맙에 선택적 환원이 이루어질 수 있고, 이는, 제어된 조건 하에, 실질적인 분해 없이 항체의 활성화를 허용할 것이다.
신속한 평형화와 함께 중도적일 뿐인 과다-환원을 나타냈기 때문에, 시스테인이 세쿠키누맙의 선택적 환원에 특히 이상적인 것으로 확인되었다. 시스테인을 이용한 선택적 환원으로부터 첫 한 시간에, 예를 들어, 혐기성 조건 하에서는 60％까지, 완전히 호기성인 조건 하에서는 약 30％까지, 항체가 부분적으로 환원된다. 이어서, 세쿠키누맙이 천천히 무손상 항체로 재-산화된다. 시스테인으로의 선택적 환원에 적용된 샘플의 재-산화는 37℃에서 수행된 반응보다 실온에서 훨씬 더 천천히 진행되었다 (실온에서의 재-평형화를 위한 21시간 대 37℃에서의 평형화를 위한 8시간 비교). 또한 실온 샘플은 37℃에서 수행된 선택적 환원 반응에 비교하여 무손상 항체의 더 작은 최대 감소를 일반적으로 나타냈다.
혐기성 조건 하에, 본 발명가들은 항체의 초기 환원이 더 크고 무손상 세쿠키누맙으로의 재-평형화가 호기성 조건 하에서만큼 완전하지 않다는 것을 인지하였다. 그러나, 소량의 시스틴을 혐기성 반응에 첨가하면, 시스틴의 부재 하에 수행된 혐기성 반응에 비해 개선된 순도 및 활성이 초래되었다. 따라서, 작은 몰비의 산화된 형태의 환원 시약 (예를 들어, 시스테인이 환원제인 경우 시스틴)이 존재할 때 혐기성 조건 하에 호기성 반응 과정이 모사될 수 있다. 또한, 본 발명가들은, 심지어 인큐베이션의 초기 30분 동안 시스틴이 존재하지 않았을 때에도, 시스틴 첨가가 무손상 항체의 평형을 가속화하였음을 인지하였다. 따라서, 공기의 존재 하에, 뿐만 아니라 불활성 기체 대기 (예를 들어, 질소 또는 아르곤)을 사용하는 것에 의한 용존 산소의 부재 하에, 선택적 환원이 수행될 수 있다. 완전히 혐기성인 조건 하에 수행되면, 작은 몰비의 산화된 형태의 환원 시약을 첨가하는 것이 유용하다.
실시예 4: 시스테인 선택적 환원 단계 개발 연구: 개념 증명 ( DoE1 )
실시예 4.1 - 연구 설계 및 방법
시스테인 처리 단계의 주요 목적은 세포 배양, 수확 및/또는 단백질 A 크로마토그래피 동안 발생할 수 있는 경쇄의 위치 97의 시스테인의 -SH 기의 차폐에 의해 세쿠키누맙 항체의 충분한 생물학적 활성을 회복시키는 것이다. 하기 실시예에서, 항체 총체성을 모니터링하는 비-환원형 CE-SDS 방법에 의해 항체의 순도를 분석하고 ("CE-SDS에 의한 순도"로 칭함), 항체의 생물학적 활성을 시스타민-CEX 크로마토그래피 방법으로 분석한다 ("CEX에 의한 활성"으로 칭함). 시스타민-CEX 크로마토그래피에서, 시스타민을 항체 샘플에 첨가하고, 세쿠키누맙 내의 임의의 유리 시스테인을 유도체화하게 한다. 그 후, 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 분석적 분리에 적용하고, 이에 의해, 추가적인 양전하를 보유하기 때문에 시스타민-유도체화 항체 종이 유도체화되지 않은 항체 종 이후에 용출된다. 그 후, 크로마토그램을 비처리 샘플의 크로마토그램과 비교한다. 용출 위치가 이동된 처리 샘플의 크로마토그램 내의 종의 분량이 원래의 샘플 내의 유리 CysL97-SH의 존재도의 직접적인 척도이고, 활성에 대한 대용 마커로서 사용될 수 있다.
이러한 개념 증명 연구 (DoE1)의 주요 목적은 제1 세트의 파라미터 범위를 테스트하여 주요 영향 요인을 확인하고 작업 범위의 규정을 지원하기 위한 시스테인 처리 단계 개선용 실험 설계 연구의 적용가능성을 점검하는 것이었다. 추가적으로, 실험 셋업이 입력 파라미터가 출력 파라미터에 미치는 영향을 검출하는데 적용가능한지 여부를 평가하기 위해 DoE1를 수행하였다. 이러한 개념 연구를 Modde 9.0 (유메트릭스(Umetrics)) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
입력 파라미터가 표 4에서 제시된다. 시스틴 (산화된 형태) 첨가를 추가적인 입력 파라미터로서 테스트하였는데, 산화환원 전위가 환원된 형태/산화된 형태의 비, 이러한 경우에는 시스테인/시스틴의 비에 영향을 받기 때문이다. 시스테인/시스틴의 비 및 시스테인 농도는 각각 3가지 수준에서, 항체 농도 ("ALC에 의한 함량")는 2가지 수준에서 조사하였다. 생성물 품질 출력 파라미터에 대해, CEC에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도를 결정하였다.
Figure 112017058118342-pct00006
표 4: 입력 파라미터
설계는 중심점 실행이 없는 32×2 다수준 요인 설계(Multilevel Factorial Design)이다. 시스테인 처리 단계 개선을 위한 데이터 및 공정 이해를 획득하기 위해 이러한 설계가 선택되었다. 이러한 설계 유형은 입력 파라미터인 시스테인/시스틴의 비 및 시스테인 농도에 대한 일차항, 상호작용항 및 이차항의 수학적 모델의 계산을 지원한다. 실험 설계 계획이 표 5에서 제공된다.
Figure 112017058118342-pct00007
표 5: 실험 설계 계획. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 돌턴이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
선택적 환원 반응을 닫힌 15 mL 폴리프로필렌 튜브에서 수행하였고, 이를 수조 내에 놓고, 37℃로 가온하였다. 단백질 용액을 WFI로 목적 농도로 희석하고, pH를 1 M 트리스로 pH 8.0으로 조정하였다. 시스테인 및 시스틴 용액을 첨가한 후, 튜브를 배합시키고, 수조에서 4h 동안 인큐베이션하였다. 그 후, ALC에 의한 함량 결정을 위해 샘플을 회수하였다. 인큐베이션 직후에 회수한 샘플로 CE-SDS를 수행하였고, 10배 과량 (시스테인 농도에 비해)의 아이오도아세트아미드를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 나머지 용액을 주위 온도로 냉각하고, pH를 pH 5.0 - 5.5로 조정하고, CEX 및 SEC 분석을 위해 샘플을 회수하였다.
이러한 설계를 표 6에서의 실제 실험 설계에 따라 수행하였다.
Figure 112017058118342-pct00008
표 6: 실제 실험 설계. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
실시예 4.2 - 개념 증명 연구의 결과
출력 파라미터에 대한 값이 입력 파라미터와 함께 표 7에서 열거된다. CEX에 의한 활성에 대한 값의 오름순으로 실행들이 열거된다. 시스테인 농도가 0.5 mM인 실행 모두가 활성이 더 낮은 것을 볼 수 있다 - 아마도 이러한 시스테인 농도가 Cys97의 차폐를 완전히 벗기기에는 너무 낮기 때문일 것이다. 이러한 세트에서, 시스테인:항체의 비가 약 11:1에서 21:1로 증가되었을 때 (REACT00_17, _14 및 _12), CEX에 의한 활성의 약간의 개선이 인지되었다. 이러한 3개의 실행 중에서, 시스테인:시스틴의 비가 약간 더 높은 실행 (REACT007_14 및 _12) (아마도 시스테인의 환원력에서의 약간의 완화를 나타낼 것이다)은 CE-SDS에 의한 순도 파라미터가 또한 양호하였다. 그 후, 활성 출력 파라미터에서의 차이가 작고 (92.4 내지 93.1％), 아마도 분석 정확도 이내여서, 이러한 군에서의 해석을 어렵게 만드는 일련의 실행이 있다. 마지막으로, 활성이 가장 높은 (93.7 내지 95.1％) 4개의 실행의 세트가 있다. 특히, 이러한 실행들은 가장 높은 시스테인/단백질 비 (462.33)를 함유하지 않았다.
Figure 112017058118342-pct00009
표 7: CEX에 의한 활성에 대한 값의 오름순으로 열거된 입력 및 출력 파라미터 값
우수한 모델 핏으로 인해, 시스템의 주요 영향 파라미터를 이해하기 위해 등고선 플롯을 사용하는 것이 가능하였다. 4가지 도구, 즉 R2, Q2, 모델 타당도 및 반복실험의 표준 편차 (SD)에 의해 모델의 품질이 표시된다. 데이터와 우수하게 일치하는 모델은 R2 및 Q2가 1.0에 근접할 것이고, 모델 타당도가 0.25를 초과할 것이다. 통계적 유의성이 더 낮은 모델은 R2 및 Q2 값이 더 낮다. 품질 출력 파라미터에 대한 모델 진단은 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도에 대한 모델이 통계적 유의성이 높다는 것을 가리킨다 (CEX에 의한 활성에 대해서는 R2 = 0.88 및 Q2 = 0.73, CE-SDS에 의한 순도에 대해서는 R2 = 0.84 및 Q2 = 0.63). CEX에 의한 활성에 대한 등고선 플롯 (도 4A)은 입력 파라미터인 시스테인 농도가 4.0 mM 내지 9.0 mM이면 93.0 ％ 이상의 CEX에 의한 활성 값이 달성된다는 것을 교시한다. 또한, 입력 요인인 시스테인/시스틴의 비가 이의 중심점 6으로 설정될 때 입력 요인인 ALC에 의한 함량이 저수준 (3.25 mg/mL) 내지 고수준 (6.5 mg/mL)으로 다양할 수 있다. CEX에 의한 활성을 개선하기 위해, 이러한 모델은 입력 파라미터인 ALC에 의한 함량이 조사된 고수준인 6.5 mg/mL보다 더 높아야한다는 것을 가리킨다.
표 8에서, 실행들이 CE-SDS 순도의 오름순으로 열거된다. 3개의 군을 볼 수 있다: 더 낮은 순도 (</=70％)의 실행 (462 M/M의 높은 몰비의 실행이 이에 속한다); 중간 순도 (70-83 ％)의 실행; 및 더 높은 순도 (>83％)의 실행. 우수한 모델 핏으로 인해, 입력 파라미터가 표 8에서 제시된 CE-SDS에 의한 순도 값에 어떻게 영향을 미치는지를 이해하기 위해 등고선 플롯을 또한 사용하는 것이 가능하다. 도 4B에서의 CE-SDS에 대한 등고선 플롯에 따르면, 이론적 최적값에 가장 가까운 구역이 오른쪽 아래에 있다. 이는 시스테인/시스틴의 비가 더 높은 수준으로 설정되어야 하고, 시스테인 농도가 더 낮은 수준으로 설정되어야 한다는 것을 시사한다. 추가적으로, 더 높은 ALC에 의한 함량이 CE-SDS에 의한 순도를 증가시키는데 사용될 수 있다.
Figure 112017058118342-pct00010
표 8: CE-SDS 순도의 오름순으로 열거된 입력 및 출력 파라미터
실시예 4.3 - 개념 증명 연구의 요약
이러한 개념 증명 연구로 시스테인 처리 단계의 입력 파라미터를 평가 및 정련하기 위한 실험 셋업의 적용가능성이 입증되었다. 본 발명가들은 시스테인 대 단백질의 높은 몰비가 낮은 CE-SDS에 의한 순도 값을 초래할 수 있다는 것을 인지하였다. 이러한 모델은 단백질 및 시스테인 농도를 증가시키는 것이 CE-SDS에 의한 순도 및 CEX에 의한 활성을 개선할 수 있다는 것을 또한 시사하였다. 따라서, 시스테인 농도, 및 ALC에 의한 함량에 대한 증가된 파라미터 범위가 생성물 품질 속성인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도에 미치는 영향을 하기의 연구 (반응 표면 설계 1)에서 더욱 상세하게 평가하였다.
실시예 5: 시스테인 선택적 환원 단계 개발 연구: 반응 표면 설계 1
실시예 5.1 - 연구 설계 및 방법
실시예 4로부터의 데이터를 기초로, 선택적 환원 단계의 입력 파라미터를 조정하였다. Modde 9.0 (유메트릭스) 소프트웨어를 사용하여 개발 연구를 분석하였다. 입력 파라미터가 표 9에서 열거된다. 요인들을 각각 3가지 수준에서 조사한다. 이러한 설계는 입력 파라미터인 ALC에 의한 함량 및 시스테인 농도의 수준이 조정된, 개념 증명 연구의 조정 버전이었다. 실험 셋업 및 추가적인 데이터 평가를 단순화하기 위해 입력 파라미터인 "시스테인/시스틴의 비"를 "시스틴의 농도" 파라미터로 교체하였다.
Figure 112017058118342-pct00011
표 9: 입력 파라미터
이러한 설계는 중심점 조건에서의 4개의 중심 실행이 있는 23 중심 합성 표면(Center Composite Face) (CCF) 설계이다. 이러한 설계 유형은 일차항, 상호작용항 및 이차항의 수학적 모델의 계산을 지원한다. 실험 설계 계획이 표 10에서 제공된다.
Figure 112017058118342-pct00012
표 10: 실험 설계 계획. 1) 중심점. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
선택적 환원 반응을 닫힌 15 mL 폴리프로필렌 튜브에서 수행하였고, 이를 수조 내에 놓고, 37℃로 가온하였다. 이러한 설계를 표 11에서의 실제 실험 설계에 따라 수행하였다.
Figure 112017058118342-pct00013
표 11: 실제 실험 설계. 1) 중심점; 2) 원래의 계획된 중심점으로부터의 10% 초과의 단백질 농도 편차로 인해, 이러한 실험은 사용된 DoE 소프트웨어의 중심점으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
실시예 5.2 - 반응 표면 설계 1의 결과
입력 파라미터, 및 출력 파라미터에 대한 값이 표 12에서 열거된다. CEX에 의한 활성의 오름순으로 실행들이 열거된다. 높은 CEX 활성의 실행들이 더 높은 시스테인 농도를 사용하였음을 볼 수 있다. 더 낮은 활성의 단일 실행 (React016_13)은 높은 단백질 농도, 낮은 시스테인 농도 및 높은 시스틴 농도였다.
생성물 품질 출력 파라미터에 대한 모델 진단은 CEX에 의한 활성에 대해서는 R2 = 0.95, Q2 = 0.76, SD = 0.20, 및 모델 타당도 = 0.78이었고, CE-SDS에 의한 순도에 대해서는 R2 = 0.79, Q2 = 0.53, SD = 2.91, 및 모델 타당도 = 0.83이었으며, 이는 양쪽 출력 파라미터 모두에 대해 유의한 모델을 가리킨다. 등고선 플롯을 계산하여 (도 5), 입력 파라미터 설정의 영향 및 CEX에 의한 활성에 미치는 영향에 관한 더 많은 통찰을 획득하였다.
Figure 112017058118342-pct00014
표 12: CEX에 의한 활성의 오름순으로 열거된 입력 및 출력 파라미터. 1) 중심점; 2) 원래의 계획된 중심점으로부터의 10% 초과의 단백질 농도 편차로 인해, 이러한 실험은 사용된 DoE 소프트웨어의 중심점으로 간주되지 않는다.
도 5에서의 등고선 플롯에 나타난 바와 같이, 높은 CEX에 의한 활성을 달성하기 위해, 가장 영향력이 있는 입력 파라미터는 시스테인 농도이고, 이는 이의 고수준으로 설정되어야 한다. 그러나, 저수준의 시스테인 농도에서도, ALC에 의한 함량 및 시스틴 농도가 상한에 있지 않으면 높은 CEX 활성 (> 93 ％)이 충족된다. 입력 파라미터인 ALC에 의한 함량 및 시스틴 농도 또한 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성에 영향을 미치지만, 정도가 더 작다.
표 13에서, 실행들이 CE-SDS 순도의 오름순으로 열거된다. 실행들이 3개의 군으로 나뉠 수 있다. 일련의 6개의 낮은 순도 (<80％)의 실행 (주로 14 mM 실행), 일련의 중간 순도 (85-91％)의 실행, 및 일련의 더 높은 순도 (>91％)의 실행이 있었고, 후자는 모두 4 mM 시스테인 실행이다.
Figure 112017058118342-pct00015
표 13: CE-SDS 순도의 오름순으로 열거된 입력 및 출력 파라미터. 1) 중심점; 2) 원래의 계획된 중심점으로부터의 10% 초과의 단백질 농도 편차로 인해, 이러한 실험은 사용된 DoE 소프트웨어의 중심점으로 간주되지 않는다.
이러한 결과를 기초로, 더 높은 CE-SDS에 의한 순도 값을 달성하기 위해 시스테인 농도는 낮아야 하고, ALC에 의한 함량 및 시스틴 농도는 높게 설정되어야 한다.
실험 React016_6, React016_7, React016_8 및 React016_11은 2개의 품질 출력 파라미터 양쪽 모두에 대해 높은 값을 갖는다. 이러한 DoE에 의해 확립된 모델을 기초로 시스테인 처리 단계의 실패의 위험을 추정하기 위해, 몬테 카를로 시뮬레이션을 사용하는 설계 공간 추정량(estimator)을 수행하였다. 출력 파라미터가 생성물 품질 및 공정 성능 출력 파라미터에 대한 목적 범위를 넘지 않으면서, 요인들이 변할 수 있는 범위가 설계 공간 추정량에 의해 제공된다. 이상적으로 ALC에 의한 함량이 12 mg/mL으로 설정되어야 하는 것으로 제안된다. 이러한 특정 실험에서 시스테인 농도는 4.0 mM이 이상적이다. 시스틴 농도에 대해서는, 0.32 mM이 이상적이다.
이러한 연구의 결에 따르면, 시스테인 처리 단계는 주로 시스테인 농도에 영향을 받는다. 높은 시스테인 농도는 높은 CEX에 의한 활성을 촉진하지만, 동시에 낮은 CE-SDS에 의한 순도를 초래한다. 설계 공간 추정량에 따르면, 시스테인 농도는 4 mM에서 유지되어야 하고, ALC에 의한 함량은 12 mg/mL (약 49의 시스테인 대 단백질의 비)로 설정되어야 한다.
통계적 설계의 결과의 검증을 위해, 공기 오버레이(overlay) 및 개방형 헤드스페이스가 있는 2 L의 교반 생물반응기에서 표적 실행을 수행하였다. 인큐베이션 동안 교반을 적용하지 않았다. 공정 파라미터가 표 14에서 열거되고, 분석 결과가 표 15에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00016
표 14: 표적 실행의 공정 파라미터. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
Figure 112017058118342-pct00017
표 15: 표적 실행의 분석 결과
3개의 실행 모두 CEX에 의한 활성에 관한 유사한 결과를 초래하였다. 이는 4.0 mM 시스테인이 항체 활성을 회복시키는데 충분하는 것을 가리키는 이전의 DoE 연구의 결과에 상응한다. 제3 표적 실행 (REACT021)에서, 시스틴이 생략되어, CE-SDS에 의한 순도에 대해 실행 1 (REACT019)에 필적하는 결과를 초래하였으며, 이는 테스트된 조건 하에 시스틴이 시스테인 처리 단계의 성능에 미미한 영향을 미칠 뿐이라는 것을 실연한다. 시스테인 농도가 8.0 mM (약 91의 시스테인 대 단백질의 비)로 증가되면, 더 높은 CEX에 의한 활성 값이 아니라, 90％의 개발 표적 미만으로 떨어지는 더 낮은 CE-SDS에 의한 순도가 이러한 풀에서 초래되었다. 통계적 설계에서는 시스틴이 유의성을 나타냈지만, 표적 실행에서는 양성 효과가 검출가능하지 않았다. 추가적으로, 통계적 설계에서의 CEX에 의한 활성에 대한 영향이 미미하고 (도 5 참조), 비-염기성 완충제에서의 시스틴의 낮은 용해성으로 인해 시스틴 함유 완충제의 제조가 어렵다. 따라서, 시스테인 처리 완충제에서 시스틴을 생략할 수 있다.
실시예 6: 시스테인 선택적 환원 단계 개발 연구: 반응 표면 설계 2
실시예 6.1 - 연구 설계 및 방법
반응 표면 설계 2 (DoE3)의 주요 목적은 시스테인 농도에 더하여 시스테인 처리 단계 상의 공정 파라미터인 온도, 시간 및 pH를 조사하는 것이었다. 이러한 데이터는 작업 범위의 규정을 지원하는데, 그리고 주요 영향 요인을 확인하는데 또한 사용된다. 이러한 개발 연구를 Modde 9.0 (유메트릭스) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 입력 파라미터가 표 16에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00018
표 16: 입력 파라미터
이러한 설계는 3개의 중심점 실행이 있는 중심 합성 표면 (CCF) 설계이다. 실험 설계 계획이 표 17에서 제공된다. 시스테인 처리 용액이 이전 실험에서 개선된 바와 같이, 이러한 설계는 추가적인 공정 파라미터의 영향을 평가하도록 선택되었다. 시스테인 처리 단계에 가장 영향을 미치는 입력 파라미터였고, 입력 파라미터들과의 상호작용이 예상되었기 때문에, 시스테인 농도를 다시 분석하였다. 이러한 설계 유형은 선형항, 상호작용항 및 이차항의 수학적 모델의 계산을 지원한다.
Figure 112017058118342-pct00019
표 17: 실험 설계 계획. 1) 중심점. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
선택적 환원 반응을 닫힌 15 mL 폴리프로필렌 튜브에서 수행하였고, 이를 수조 내에 놓고, 37℃로 가온하였다.
실시예 6.2 - 반응 표면 설계 2의 결과
이러한 연구를 표 18에서의 실제 실험 설계에 따라 수행하였다.
Figure 112017058118342-pct00020
표 18: 실제 실험 설계 계획. 1) 중심점. 2)는 사용된 소프트웨어의 중심점으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
생성물 품질 출력 파라미터에 대한 값이 CEX 활성 결과에 대해 오름순으로 표 19에서 열거된다. 생성물 품질 출력 파라미터에 대한 모델 진단은 CEX에 의한 활성에 대해서는 R2 = 0.93, Q2 = 0.80, 모델 타당도 = 0.79 및 SD = 0.42이고, CE-SDS에 의한 순도에 대해서는 R2 = 0.96, Q2 = 0.89, 모델 타당도 = 0.67 및 SD = 0.00이다.
Figure 112017058118342-pct00021
표 19: CEX에 의한 활성의 오름순으로 열거된 입력 및 출력 파라미터. 1) 중심점. 2)는 사용된 소프트웨어의 중심점으로 간주되지 않는다.
표 19는 실행들이 주로 3개의 군으로 나뉠 수 있다는 것을 나타낸다: 더 낮은 활성 (< 93 ％), 중간 활성 (93-95％), 및 높은 활성 (>95％). 우수한 모델 핏으로 인해, 시스템의 주요 영향 파라미터를 확인하기 위해 등고선 플롯 (도 6)을 사용하는 것이 가능하다. 도 6은 중간 내지 높은 인큐베이션 시간 (예를 들어, 4 내지 7시간) 및 높은 시스테인 농도가 CEX에 의한 활성을 증가시키는데 이롭다는 것을 나타낸다. 인큐베이션 온도 및 공정 pH는 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성에 영향을 덜 미친다. 그럼에도 불구하고, 95％ 이상의 순도에 대한 구역이 37℃에서의 pH 8.0 및 8.5에 대한 플롯에서 가장 크고, 이는 이것이 최적의 작업 범위라는 것을 시사한다.
표 20에서, CE-SDS에 의한 순도에 대해 오름순으로 실행들이 열거된다. 실행들이 3개의 군으로 나뉠 수 있다: 낮은 순도 (< 82％)의 실행, 중간 순도의 실행, 및 높은 순도 (>90 ％)의 실행. CD-SDS에 의한 순도가 높은 실행 모두가 2 mM 시스테인을 사용하였다.
Figure 112017058118342-pct00022
표 20: CE-SDS에 의한 순도의 오름순으로 열거된 입력 및 출력 파라미터. 1) 중심점. 2)는 사용된 소프트웨어의 중심점으로 간주되지 않는다.
우수한 모델 핏으로 인해, 공정 및 영향을 미치는 주요 입력 파라미터를 이해하기 위해 등고선 플롯 (도 7)을 사용할 수 있다. 도 7은 중간 내지 높은 인큐베이션 시간 및 낮은 시스테인 농도가 CE-SDS에 의한 순도를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 입력 파라미터인 인큐베이션 온도 및 공정 pH는 CE-SDS에 의한 순도에 미치는 영향이 미미하다.
실시예 6으로부터 도출된 요약 및 결론
온도는 중심 내지 높음으로 다양할 수 있고, pH는 중심 내지 높음으로 다양할 수 있으며, 시간은 중심 내지 높음으로 다양할 수 있으면서, 시스테인 농도가 낮은 수준에서 유지될 때 개발 표적이 충족된다. 높은 생성물 품질을 초래하는 입력 파라미터 범위를 추정하는 것을 돕기 위해, 몬테 카를로 시뮬레이션을 사용하는 설계 공간 추정량을 실행하였다. 이러한 시뮬레이션을 위해, CEX 활성은 >93％, CE-SDS 순도는 >90％의 목적을 설정하였다. 몬테 카를로 시뮬레이션은 온도가 이상적으로 39.1℃일 때 이러한 품질 목적이 충족되는 것으로 예측하였지만, 온도는 38.6℃ 내지 39.7℃로 다양할 수 있다. 인큐베이션 시간은 5.0 h가 이상적이지만, 4.0 h 내지 6.0 h로 다양할 수 있다. pH의 경우, 8.2가 이상적이고, 8.15 내지 8.25로 다양할 수 있다. 마지막 입력 파라미터인 시스테인 농도의 경우, 2.4 mM이 이상적인 것으로 예측되고, 2.2 mM 내지 2.5 mM로 다양할 수 있다. 이러한 범위 내에서, 설계 공간 추정량으로, 생성물 품질 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성에 대해서는 추정 DPMO (백만 회의 작업 당 결함) 값이 110일 것이고, CE-SDS에 의한 순도에 대한 DPMO 값은 20일 것임이 확인되었다. 이는 CEX에 의한 활성에 대한 목적 한계는 백만 회 중 110회가, CE-SDS에 의한 순도에 대한 목적 한계는 백만 회 중 20회가 충족되지 않을 것임을 의미한다.
등고선 플롯의 결과에 따라, 그리고 이전의 개발 연구 (DoE1 및 DoE2)의 결과를 고려하여, 인큐베이션 온도에 대한 목적은 37℃로 설정되었다. 현재의 실험 셋업으로는 제작 규모 용도에 대해 고려될 가열 및 냉각 시간이 포함되지 않았기 때문에 인큐베이션 시간 목적은 4시간 (240분)으로 설정되었다. 가열 및 냉각 시간과 조합되면, 약 6시간의 전체적인 공정 시간이 적용될 것이다. CE-SDS에 의한 순도에 대한 pH의 영향이 검출가능하지 않고, CEX에 의한 활성에 대해 영향이 미미하다. 따라서, 테스트된 범위 내에 잘 속하고, CEX에 의한 활성에 대한 개발 표적이 안전하게 충족될 수 있으며, CEX에 의한 산성 변이체가 형성되는 위험 (염기성 조건에 의해 강화됨)이 감소될 것이기 때문에, 목적이 8.0으로 설정되었다. 입력 파라미터인 시스테인 농도에 대한 결과는 2.4 mM의 낮은 최적 수준을 가리킨다; 그러나, 2 mM 시스테인을 사용한 실험 대부분이 원하는 것보다 더 낮은 CEX에 의한 활성을 초래하였다. 이는, 표적 실행의 결과와 조합되어, 검증 실행 동안 시스테인 농도에 대한 목적이 더 높아야 한다, 즉, 4 mM이어야 한다는 것을 시사한다.
실시예 7: 공정 비교 및 연속 교반의 분석
실시예 7.1 - 공정 B2 및 공정 C의 비교
실시예 6에서 기술된 고려사항은 지금까지 제작 규모 (본원에서의 공정 B2)로 수행된 것보다 더 높은 단백질 농도 및 더 낮은 시스테인 농도 (4-6 mM)에서 선택적 환원이 바람직하게 행해질 수 있다는 것을 시사하였다. 표 21은 이전의 공정 B2 및 제안 공정 C에 대한 입력 파라미터를 비교한다. 폴리프로필렌 튜브에서 50 mL 규모로 이중으로 비교 실행을 수행하였고, 튜브를 수조 내에 놓고 37℃로 가온하였다. 결과가 표 22에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00023
표 21: 공정 B2 및 제안 공정 C의 입력 파라미터. 1) pH 조정 및 시스테인 첨가 전. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
Figure 112017058118342-pct00024
표 22: 공정 B2 및 제안 공정 C의 출력 파라미터.
표 22는 공정 C의 변형된 시스테인 처리 단계가 CEX에 의한 활성을 매우 약간만 감소시키면서 CE-SDS 순도의 유의한 증가를 초래한다는 것을 나타낸다. 선택적 환원 단계 동안의 증가된 단백질 농도 및 감소된 시스테인 농도 (즉, 시스테인 대 단백질의 더 작은 몰비)에 의해 CE-SDS에 의한 순도의 더 높은 값이 달성된다. 이는 더 낮은 환원력을 초래하지만, 이러한 환원력은 그럼에도 불구하고 세쿠키누맙의 적당한 활성을 확실히 하는데 여전히 충분하다.
실시예 7.2 - 인큐베이션 동안의 연속 교반의 테스트
공정 B2에 따른 임상 제작 동안, 37℃에서의 인큐베이션 단계 동안 비균질성을 방지하기 위해 간헐 혼합 (매시간 마다 2분)이 적용되었다. 인큐베이션 전반에 걸쳐 균질성을 확실히 하기 위해 연속 교반을 사용하는 것의 실행가능성을 2 L 생물반응기에서 테스트하였다 (실행 REACT029). 실험 셋업 및 공정 조건이 표 23에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00025
표 23: 반응 동안의 연속 교반을 테스트하기 위한 입력 파라미터. 1) pH 조정 및 시스테인 첨가 전. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
REACT029에 대해, CE-SDS에 의한 순도는 96％였고, CEX에 의한 활성은 92.7 ％였으며, 이는 교반 없이 소규모로 수행된 실행 REACT030 및 REACT 031 (제안 공정 C)에서 나타나는 것보다 더 낮은 CEX 활성이다. 따라서, 연속 혼합에 의해 야기된 시스테인 처리 용액 내로의 증가된 산소 전달이 시스테인의 환원력을 저해할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 시스테인 처리 풀에서의 CEX에 의한 활성은 품질 목적에 근접하였다. 제작 규모로 규모가 확대되면 산소 전달 및 표면/부피의 비가 감소하기 때문에, 이러한 실험이 높은 산소 전달에 관한 최악의 경우로 간주되었다. 따라서, 공정 용액의 균질성을 확실히 하기 위해, 연속 혼합이 시범 규모 실행 ("공정 C")에 사용되었다.
실시예 5-7로부터 도출된 요약 및 결론
본 발명가들은 시스테인 처리 동안의 단백질 농도가 3배 증가될 수 있다고 결정하였고, 이는 공정 부피를 유의하게 감소시킨다. 또한 본 발명가들은 더 낮은 시스테인 농도가 시스테인 처리 후에 유사한 생성물 활성 및 생성물의 증가된 CE-SDS에 의한 순도를 제공한다는 것을 실연하였다. 따라서, 시스테인:단백질의 더 낮은 비가 양질의 생성물을 보장할 수 있다.
데이터는 온도 및 pH가 시스테인 처리 단계에 미미한 영향을 미친다는 것과 시스테인의 산화된 형태 (시스틴)를 첨가하는 것이 양질의 생성물을 수득하는데 필수적이지 않다는 것을 또한 나타낸다. 인큐베이션 시간은 5시간을 이상적인 것으로 나타냈지만, 제작-규모 용도 동안 고려되어야 하는 가열 및 냉각 시간이 현재의 실험 셋업에서는 포함되지 않았기 때문에 본 발명가들은 목적을 4시간으로 설정하였다. 활성 통기 없이 개방 조건 하에서의 연속 교반이 선택적 환원 방법에서 사용하기 위해 실행가능한 것으로 보였다; 그러나, 본 발명가들이 이후의 실시예에서 나타낼 바와 같이, 용액 내로의 산소 전달이 (예를 들어, 낮은/느린 교반을 사용하여) 제한되어야 한다.
실시예 8: 시범 규모에서의 공정 검증
1차 규모 확대를 수행하고 공정의 재현성 및 견고성에 대한 첫인상을 수득하기 위해 7 L 시범-규모에서의 공정 검증에 의해 공정 개선 후의 제안된 정제 조건을 테스트하였다. 공정 C에 따른 선택적 환원 단계 (표 21)을 시범 규모 실험 (REACT035)에서 사용하였다. 연속 교반을 적용하였다. pO2 프로브로 용존 산소 농도를 측정하였다.
검증 실행 1에 따른 선택적 환원 단계 후의 REACT035의 CEX에 의한 활성은 90.4％에 불과하였다. 용존 산소 곡선 (도 8 참조)의 분석에서, 처리의 첫 3시간에 pO2가 꾸준히 감소된다는 것이 밝혀졌고, 이는 교반에 의해 유발되는 용액 내로의 산소 전달보다 빠르게 용액에서 산소 소비가 일어난다는 것을 가리킨다. 본 발명가들은 시스테인 시약 (Cys-SH)의 시스틴 또는 시스테산 (Cys-SO3)으로의 산화에 의해 산소 소비가 야기된다고 가정하였다. 그 후, 반응의 마지막 시간의 산소 수준 증가는 시스테인 시약이 소비되었고, 교반에 의해 야기되는 용액에 의한 산소 흡수가 가시적이게 된다는 것을 가리킬 것이다. 이는 처리의 마지막 기간에 시스테인의 환원력이 효과적이지 않다는 것을 시사하여, 이러한 실행으로부터 수득된 손상된 활성을 설명할 수 있다.
실시예 8.1 - 검증 실행 1 동안의 시스테인 단계의 조사
제1 시범 규모 실행 REACT035에서 CEX에 의해 결정된 낮은 활성 (90.4％)에 대한 근본 원인을 조사하기 위해, 가능한 영향 요인을 평가하였다. 상기 언급된 바와 같이, 낮은 시스테인 농도, 반응 동안의 연장된 교반에 의한 산소 도입, 및 규모 변화 (증가된 반응 부피)가 불충분한 환원력을 초래할 수 있었다. 따라서, 인큐베이션 동안의 교반기 속도 및 시스테인 농도를 평가하였다.
실험 계획 및 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성이 표 24에서 제시된다. 이러한 실험에서, pO2 프로브로 용존 산소 농도를 측정하였다.
Figure 112017058118342-pct00026
표 24: 시스테인 처리 단계 상에서의 교반 및 시스테인 농도의 조사. 1) 20 L 생물반응기에서 7 L 충전 부피로 수행된 검증 실행 1. 2) 2 L 생물반응기에서 1.7 L 충전 부피로 수행된 실험. 3) 매시간 마다 2분 동안 50 rpm으로 혼합함. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 Da이고, 이를 사용하여 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
3개 모두의 더 작은 규모의 반응 (REACT038, REACT039, 및 REACT040)이 검증 실행 1 (REACT035)에 비교하여 개선된 CEX에 의한 활성을 나타냈다 (표 24). 그러나, 상응하는 CEX에 의한 활성이 REACT039에 비교했을 때 시스테인 농도가 상승된 실험 (REACT040) 또는 인큐베이션 시간 동안 연속 혼합이 없는 실험 (REACT038)에서 증가되지 않았다. 따라서, 시스테인 농도 또는 인큐베이션 동안의 교반이 이러한 지점에서 주요 영향 요인으로 확인될 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 시범 규모 검증 실행 1 (REACT035)의 용존 산소 (dO2) 프로파일 (도 8)이 약 3시간 인큐베이션 후 dO2의 증가를 나타냈고, 이는 시스테인의 환원력이 고갈되었음을 가리킨다. 연속 교반이 수행된 2개의 더 작은 규모의 실험 REACT039 및 REACT040의 dO2 차트는 처리 말기에 dO2 증가를 나타내지 않고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 이러한 더 작은 규모의 실험에서 시스테인의 환원력이 고갈되지 않았음을 가리킨다.
실시예 8.2 - 검증 실행 2 동안의 시스테인 단계의 조사
검증 실행 1에서와 같은 7 L 대신 충전 부피가 14 L였고, 2개의 교반기를 교반에 사용하였다 (하부의 방사형 교반기 및 추가적으로 상부의 축형 교반기). 시스테인 농도 (4 mM) 및 교반기 속도 (100 rpm)는 검증 실행 1인 REACT 035에서와 동일하였다. 선택적 환원 후, 항체 용액의 활성은 CEX로 측정 시 85.5％에 불과하였다. 도 9에 제시된 dO2 차트에 따르면, 시스테인의 환원력이 검증 실행 1 (도 8) 동안보다 더욱 더 이르게 고갈되었고, 이는 연속 교반에 의한 용액 내로의 산소 전달이 이러한 실행에서 더욱 확연하였음을 시사한다.
dO2 곡선 경향 (도 8 - 9)은 연속 교반에 의한 헤드스페이스를 통한 산소 전달이 검증 실행 1 및 2 동안의 선택적 환원 단계 후의 더 낮은 활성에 대한 주요 근본 원인이라는 것을 시사한다. 검증 실행 1에서의 7 L 충전 부피로는, 1개의 교반기 (하부의 방사형 교반기)만 시스테인 처리 단계의 공정 용액 내에 잠긴다. 검증 실행 2의 14 L 충전 부피로는, 2개의 교반기 (하부의 방사형 교반기 및 상부의 축형 교반기)가 공정 용액에 잠겨서, 용액 내로의 산소 전달이 더욱 더 증가된다. 따라서, 검증 실행 2의 더욱 불량한 결과는 dO2 곡선 (도 9)에 의해 가시적인, 공정 용액 내로의 산소 전달 상승에 기인하는 것이 유력할 것이다. 검증 실행 2에 대한 더 높은 용액 내로의 산소 전달로 인해, 시스테인의 환원력이 더 이르게 고갈되어, 더 적은 CEX에 의한 활성을 초래한다. 따라서, 예를 들어, 인큐베이션 동안의 혼합 (속도, 기간, 빈도)의 조정에 의해, 공정 중간체 내로의 산소 전달이 제한되어야 한다.
실시예 8.3 - 검증 실행 3 동안의 시스테인 단계의 조사
검증 실행 2에서와 같은 14 L 대신 충전 부피가 16 L였고, 교반 프로파일을 개조하였다. 시스테인 처리 동안의 연속 교반 대신, 매시간 마다 2분 동안만 혼합하는 것을 적용하였고, 이는 이전의 공정 B2에 상응한다. 선택적 환원 단계 후에 CEX에 의해 측정된 항체 용액의 활성은 92.5％였다.
시스테인 처리 단계에서 연속 혼합을 생략하는 것으로 인해, 산소 전달이 제한되었고, 이는 충분한 환원력을 보장하고, 높은 CEX에 의한 활성을 초래하였다. 도 10에 제시된 dO2 차트는 산소 수준의 급격한 감소를 나타낸다 - 처리를 시작할 때 거의 0％로 감소됨. 이러한 실험은 시스테인 처리 동안 도입되는 산소의 양을 조절하는 것이 적합한 반응 조건을 보장하고, 결과적으로, 높은 CEX에 의한 활성을 보장한다는 것을 실연한다.
실시예 8.4 - 검증 실행 4 동안의 시스테인 단계의 조사
검증 실행 3의 결과를 기초로, 검증 실행 3과 동일한 셋업 및 공정 조건으로 4차 시범-규모 검증 실행 (REACT040)을 수행하였다. 그러나, 검증 실행 4의 공정이 더 높은 용액 내로의 산소 전달을 취급할 수 있도록 풀 내의 시스테인 처리가 4 mM에서 6 mM로 증가되었다. 이러한 증가된 환원력은 감소를 통해 가능한 항체와 균형을 이루어야 한다. 그럼에도 불구하고, REACT040의 결과 (표 24 참조)를 기초로, 이러한 개조는 실패 위험이 낮은 변화를 나타낸다. 선택적 환원 단계 후의 REACT040의 CEX에 의한 활성은 91.9％였다.
도 11에서, 검증 실행 4의 dO2 차트가 제시된다. 검증 실행 3과 유사하게, dO2가 시스테인 첨가 후 감소하였고, 낮은 수준으로 유지되었으며, 이는 이러한 실험에서의 시스테인의 환원력이 고갈되지 않는다는 것을 가리키는 한편, CE-SDS에 의해 결정된 생성물 순도 요건이 충족된다.
도 12에서, 검증 실행 3 및 검증 실행 4의 반응 동역학이 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도와 관련되어 비교된다. CEX에 의한 활성의 동역학은 양쪽 실험에 대해 유사하다; 약 2 h 후, 안정기에 도달하고, 그 뒤에는 이후의 2시간 처리에서 활성 증가가 소량이다. 더 높은 시스테인 농도 (6 mM)에서의 실행에서 순도 하락이 더욱 확연하다는 점에서 CE-SDS에 의한 순도 곡선은 반응의 초기 단계에 약간 상이하다. 그러나, 시스테인 처리가 끝날 때 양쪽 절차가 유사한 생성물 품질을 초래하기 때문에, 충분한 생성물 품질을 확실히 하는데 양쪽 모두 적합하다. 그럼에도 불구하고, 공정 용액 내의 상승된 산소 수준의 효과를 고려하여, 검증 실행 4에서 적용된, 시스테인 농도가 증가된 공정이 시스테인 처리 동안의 공정 용액 내로의 산소 전달의 변동과 관련하여 더욱 견고할 것으로 예상된다. 최종적으로, 검증 실행 4의 조건과 동일하게, 6 mM의 시스테인 농도 (이와 함께 13.5 mg 항체 = 65.75:1의 시스테인:항체의 몰비 [즉, 약 66:1])가 제작-규모에서의 시스테인 처리 단계용으로 선택되었다. 본 발명가들은 약 275:1 (시스테인:단백질)의 몰비에서 수행된 실행에서 CEX 활성에 대한 더 빠른 동역학 (1시간 내의 안정기)을 또한 인지하였다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 8로부터 도출된 요약 및 결론
본 발명가들은 시스테인 처리 단계 동안의 상승된 산소 수준이 CEX에 의한 활성에 대한 해로운 효과를 미칠 수 있다고 결정하였고, 이는 산소가 시스테인의 환원력을 저해하여 세쿠키누맙의 C97의 불충분한 환원에 이르는 것에 기인할 것이다. 생산 규모로 작업할 때, 시스테인/단백질 비를 변화시킴으로써, 규정된 교반 속도를 사용함으로써, 또는 심지어 교반 중단을 사용함으로써 대기로부터의 산소 흡수를 다룰 수 있다.
검증 실행의 결과를 기초로, 시스테인 농도를 4 mM (43.84의 시스테인 대 단백질의 몰비)에서 6 mM (65.75의 시스테인 대 단백질의 몰비)로 증가시켰고, 이는 반응 용액 내에 존재하는 산소를 상쇄시킬 것이다. 또한, 선택적 환원 반응의 인큐베이션 단계 동안 존재하는 용존 산소의 수준을 감소시키기 위해, 연속 혼합을 인큐베이션 동안 매시간 마다 2분 동안 혼합하는 것으로 교체한다. 공정 검증 동안 선택적 환원 절차가 변화되었지만, 명확한 근본 원인이 확인되어 (선택적 환원 동안 용액 내로 전달되는 산소의 수준), 조정된 시스테인 처리 단계에 의해 약물 물질에서의 충분한 CEX에 의한 활성을 확실히 하였다.
실시예 9: 선택적 환원 단계의 특성화
입력 파라미터인 단백질 농도, 시스테인 농도 및 교반기 속도가 선택적 환원 단계에 미치는 영향을 통계적 설계에서 평가하였다. 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도를 사용하여, 선택적 환원 단계 후의 생성물 품질을 평가하고, 입력 파라미터에 대한 입증된 허용가능 범위를 규정하였다. 출력 파라미터 범위는 이전의 설계 공정에 따라 규정되었다. 이러한 한계들을 사용하여 입력 파라미터 범위를 규정하였다.
추가적으로, 3개의 규모-축소 모델 인증 실행 및 제작-규모로 수행된 7개의 선택적 환원 사이클의 결과를 사용하여, 환원력에 관한 최악/최상의 경우 연구 및 인큐베이션 시간 및 인큐베이션 온도에 대한 전용 실행에 대해 선택적 환원 후의 생성물 품질을 평가하였다.
실시예 9.1 - 공정 특성화: 반응 표면 설계
실시예 9.1.1 - 실험 설계 및 방법.
단백질 함량, 시스테인 농도, 및 인큐베이션 동안의 교반 양식 (교반하지 않음, 또는 50 또는 100 rpm에서의 연속 교반)을 이러한 반응 표면 설계에 대한 입력 파라미터로서 선택하였고, 표 25를 참조한다.
Figure 112017058118342-pct00027
표 25: 입력 파라미터. 1)은 선택적 환원 동안의 규정된 시스테인 농도에 상응한다. "ALC에 의한 함량"은 항체의 농도를 지칭한다.
"TITR3 첨가에 의한 희석 배율"로 표현되는 다양한 시스테인 농도를 사용하였고, 이는 공정 조건 및 잠재적인 변동, 예를 들어, 칭량 부정확, 용액 첨가 부정확 등에 의해 유도되는 변동을 반영한다. 항체 농도는 시스테인 대 단백질의 비에 기여하고, 잠재적인 상호작용을 검출하기 위해 이를 본 설계에서 또한 테스트하였다. 추가적으로, 실시예 8에서 나타난 바와 같이, 헤드스페이스로부터 용액 내로 전달되는 산소가 선택적 환원 단계에 영향을 미치기 때문에, 인큐베이션 동안의 교반기 속도를 입력 파라미터로서 테스트하였다.
3개의 중심점 실행이 있는 중심 합성 표면 설계를 사용하였다. 이러한 설계 유형은 일차항, 상호작용항 및 이차항의 수학적 모델의 계산을 지원한다. 제작-규모 실행 B012307로부터 유래되는 세쿠키누맙 INAKT.F (-60℃ 미만에서 보관됨)를 사용하였다. 공정 특성화에 사용된 완충제는 적정 완충제 AIN457-TITR1 (1 M 트리스 염기, pH 10.8 [pH 범위 ≥ 10.0, 전도도 0.10 - 0.30 mS/cm]), 적정 완충제 AIN457-TITR2 (0.3 M o-인산, pH 1.4 [pH 범위 <2.0; 전도도 범위 19.5-22.7 mS/cm]); 적정 완충제 AIN457-TITR3 (120 mM 시스테인-HCL + 20 mM 디-Na-EDTA, pH 8.0 [pH 범위 7.8-8.2; 전도도 범위 14.7-18.3 mS/cm])이었다.
인증된 규모-축소 모델 (실시예 10에서 상세하게 기술됨)에서, 공기를 자유롭게 교환시키고 pH, 용존 산소, 교반기 속도 및 온도를 모니터링하면서 교반 생물반응기 (최대 2 L 부피)에서 주위 온도에서 실험을 수행하였다. 실험 설계 계획이 표 26에서 제시된다. 개별적인 연구의 일부가 아닌 모든 입력 파라미터는 표 27에 따른 각각의 목적에서 일정하게 유지되었다.
Figure 112017058118342-pct00028
표 26: 실험 설계 계획. 1) 중심점.
Figure 112017058118342-pct00029
표 27: 선택적 환원 단계의 공정 파라미터. 1) 매시간 마다 2분 동안 50 rpm의 속도로 교반함
INAKT.F를 손 온도의 수조에서 해동시키고, WFI로 목적 농도로 희석하였다. pH 조정 후, 1 L의 용액을 dO2 프로브 및 교반기가 장착된 인증된 2 L 생물반응기 내로 옮겼다. 계산된 부피의 시스테인 스톡 용액 (TITR3 완충제)을 첨가하여 표 28에 열거된 시스테인 목적 농도를 달성함으로써 선택적 환원이 시작되었다. 용액을 50 rpm의 교반 하에 60분 이내에 37℃의 인큐베이션 온도로 가열하였다. 그 후, 실험 설계 계획에 따라 50 또는 100 rpm에서 연속적으로 교반하면서 또는 교반하지 않으면서 (0 rpm), 용액을 300분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 300분의 반응 시간 (60분 가열 및 240분 인큐베이션) 후, 샘플을 회수하였다 (REACT.PT300). 37℃에서 추가로 60분 동안 인큐베이션 한 후 (60분 가열 및 300분 인큐베이션), 50 rpm의 교반기 속도에서 60분 이내에 용액을 주위 온도로 냉각시키고, 또 다른 샘플을 회수하였다 (REACT.P, 총 반응 시간 420분). 이러한 절차는 2개의 시점 ("REACT.PT300" 및 "REACT.P"로 지칭됨)에서의 설계 평가 및 인큐베이션 시간의 잠재적인 영향의 평가를 가능하게 한다.
실시예 9.1.2 - 반응 표면 설계의 출력 파라미터
샘플 REACT.PT300 및 REACT.P에 대한 생성물 품질 출력 파라미터에 대한 값이 표 28 (REACT PT300 샘플에서의 CEX 활성의 오름순) 및 표 29 (REACT P 샘플에서의 CEX 활성의 오름순)에서 열거된다. 일반적으로, 데이터는 CE-SDS에 의한 순도가 모든 실행에서 높았지만 (> 90 ％), 일부 실행은 CEX에 의한 활성이 더 낮았음 (< 90 ％)을 나타낸다. REACT.PT300 샘플에서의 CEX 활성 (표 28)과 관련하여, 1개의 실행이 활성이 낮았다 (89.4 ％). 이러한 실행 (REACT085)에서, 시스테인 농도는 하한이었고, 항체 농도는 높았으며 (따라서, 시스테인 대 단백질의 몰비가 최저였다), 교반 속도는 최고였다 (최고의 산소 전달율). 또한, 교반이 일어나지 않은 실행 모두를 함유하는, 높은 활성 (96 ％ 초과)의 8개의 실행의 군이 있는 것을 볼 수 있다.
Figure 112017058118342-pct00030
표 28: REACT.PT300 샘플에 대한 CEX의 오름순으로 정렬된, REACT.PT300 및 REACT.P의 입력 파라미터 및 품질 출력 파라미터 값. 1) 중심점.
표 29에 나타난 바와 같이, REACT.P 샘플에서의 CEX 활성과 관련하여, 더 낮은 활성 (< 94 ％)을 초래한 6개의 실행의 군이 있었고, 이러한 군은 교반기 속도가 높은 실행 모두를 함유한다. 특히, 교반이 없는 실행 모두가 최고의 CEX 활성 (96 ％ 초과)을 초래하였다. 또한, 표 29로부터, 100 rpm에서 수행된 실행 및 50 rpm에서 수행된 실행 (덜 확연함)에서 CEX 활성이 REACT.P 샘플에서 (REACT.PT300 샘플에서의 CEX 활성에 비교하여) 감소되었음을 볼 수 있다. 이러한 실행들에서의 최고 하락은 시스테인의 몰비가 하한에 있었을 때 나타난다 (예를 들어, 몰비가 약 46:1인 REACT085에서 89.4에서 84.0％로 하락하고, REACT075, REACT084 및 REACT072에서 유사함).
Figure 112017058118342-pct00031
표 29: REACT.P 샘플에 대한 CEX의 오름순으로 정렬된, REACT.PT300 및 REACT.P의 입력 파라미터 및 품질 출력 파라미터 값. 1) 중심점.
통계적 진단 (표 30)은 선택적 환원이 끝날 때 양쪽 모두의 시점의 경우에 CE-SDS에 의한 순도에 대해, 그리고 REACT.P의 경우에 CEX에 의한 활성에 대해 통계적으로 유의한 모델을 가리킨다. REACT.PT300의 경우의 CEX에 의한 활성에 대한 모델은 더 낮은 통계적 유의성을 나타낸다 (0.15의 Q2).
Figure 112017058118342-pct00032
표 30: REACT.PT300 및 REACT.P의 생성물 품질 출력 파라미터에 대한 모델 진단. 데이터와 우수하게 일치하는 모델은 R2 및 Q2가 1.0에 근접할 것이고, 모델 타당도가 0.25를 초과할 것이다. 통계적 유의성이 낮은 모델은 R2 및 Q2 값이 낮다.
실시예 9.1.2.1 - 시점 1 (REACT.PT300)에서의 생성물 품질 출력 파라미터의 모델링 평가
시점 REACT.PT300에서의 CEX 활성에 대한 계수 플롯 및 등고선 플롯은 입력 파라미터인 인큐베이션 동안의 교반기 속도 (교반)가 CEX에 의한 활성에 영향을 미친다는 것을 실연한다 (데이터는 제시되지 않음). 단백질 농도 (contA) 및 시스테인 농도 (dil-c) 파라미터는 조사된 범위 내에서 CEX에 의한 활성에 대한 통계적으로 유의한 효과를 나타내지 않는다. 높은 CEX에 의한 활성을 달성하기 위해, 인큐베이션 동안의 교반기 속도가 낮아야 한다.
표 29에 나타난 바와 같이, 시점 REACT.PT300에서의 실험 모두가 CE-SDS에 의한 순도가 적어도 90％였다. 계수 플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 3개 모두의 입력 파라미터가 CE-SDS에 의한 순도에 영향을 미친다는 것을 실연한다. 또한 ALC에 의한 함량 (contA) 및 교반기 속도 (교반)에 대한 이차항이 있다. TITR3 첨가에 의한 희석 배율 (시스테인 농도를 나타내는 dil-c) 및 교반기 속도의 상호작용항, 뿐만 아니라 TITR3 첨가에 의한 희석 배율 및 ALC에 의한 함량의 상호작용항이 있다. 등고선 플롯 (데이터는 제시되지 않음)에서, 시각화된 바와 같은 모델 계수는 높은 교반기 속도, 높은 TITR3 첨가에 의한 희석 배율 (낮은 시스테인 농도를 나타냄), 및 중간 내지 높은 ALC에 의한 함량이 CE-SDS에 의한 순도에 양성으로 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 모든 이러한 설정은 시스테인의 환원력을 감소시키고, 항체 총체성에 양성으로 영향을 미친다. 그럼에도 불구하고, 모든 실행이 CE-SDS에 의한 순도가 높기 때문에, 조사된 입력 파라미터 범위 전부가 선택적 환원 후에 충분한 CE-SDS에 의한 순도를 보장하는데 적합하다.
실시예 9.1.2.2 - 시점 2 (REACT.P)에서의 생성물 품질 출력 파라미터의 모델링
시점 REACT.P에서의 CEX 활성에 대한 도 13A의 계수 플롯 및 도 13B의 등고선 플롯은 특히 입력 파라미터 교반기 속도 (교반)가 CEX에 의한 활성에 영향을 미친다는 것을 입증한다. 따라서, 높은 CEX에 의한 활성을 달성하기 위해, 용액 내로의 산소 전달을 제한하도록 인큐베이션 동안 최소의 교반이 수행되어야 한다. 또한, 낮은 TITR3 첨가에 의한 희석 배율 (dil-c, 높은 시스테인 농도를 나타냄)이 선택적 환원 후의 CEX에 의한 활성에 이롭다. 추가적으로, 교반기 속도와 TITR3 첨가에 의한 희석의 상호작용이 CEX에 의한 활성에 작기는 하지만 유의하게 영향을 미치는 반면, ALC에 의한 함량과 TITR3 첨가에 의한 희석 배율의 상호작용은 경계 상에 있다. ALC에 의한 함량의 영향은 유의하지 않다. 이러한 결과들은 환원력을 증가시키는 조건, 예를 들어, 최소 교반 속도에 의한 제한된 산소 전달 및 더 낮은 희석에 의한 더 높은 시스테인 농도가 더 높은 CEX에 의한 활성을 초래한다는 것을 명확하게 가리킨다.
표 29에 나타난 바와 같이, 시점 REACT.P에서의 실험 모두가 CE-SDS에 의한 순도가 적어도 90％였다. CE-SDS 순도에 대한 계수 및 등고선 플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 입력 파라미터인 ALC에 의한 함량 (단백질 농도를 나타냄), TITR3 첨가에 의한 희석 배율 (dil-c, 시스테인 농도를 나타냄), 및 교반기 속도 (교반, 산소 전달을 나타냄)가 CE-SDS에 의한 순도에 대해 작은 효과가 있을 뿐이라는 것을 실연한다. 교반기 속도는 2차(quadratic) 효과가 있고, TITR3에 의한 희석 배율과 교반기 속도의 상호작용이 통계적으로 유의하다. 중간 내지 높은 교반기 속도 및 높은 TITR3 첨가에 의한 희석 배율에 의해 CE-SDS에 의한 순도가 개선된다. 이러한 설정들은 시스테인의 환원력을 감소시키고, 항체 총체성에 양성으로 영향을 미친다. 그럼에도 불구하고, 모든 실행이 CE-SDS에 의한 순도에 대한 특정 범위를 충족시키기 때문에, 조사된 입력 파라미터 범위 전부가 선택적 환원 단계 후에 충분한 CE-SDS에 의한 순도를 보장하는데 적합하다.
실시예 9.1.2.1 - 용존 산소 수준과 출력 파라미터의 관계
표 26에 제시된 반응의 산소 프로파일을 분석하여 입력 파라미터인 교반 속도, 항체 함량 및 시스테인 농도가 산소 수준에 미치는 영향을 결정하였다. 이러한 산소 프로파일의 그래프가 도 14에서 제공된다 (주: x축의 0 내지 1.00은 1 h 가열 단계에 상응하고, 여기서 교반은 모든 실행에서 50 rpm이었고; 1.00 내지 6.00은 5 h 인큐베이션 단계에 상응하고, 여기서 교반은 0 rpm [즉, 교반되지 않음], 50, 또는 100 rpm이었으며; 6.00 내지 7.00은 1 h 냉각 단계에 상응하고, 여기서 교반은 모든 실행에서 50 rpm이었다). 모든 실행이 초기 단계에 낮은 수준으로의 용존 산소 감소를 나타낸다. 특히, 이러한 감소가 항체 함량이 낮은 실행에서 덜 현저하였고 (0 rpm 시리즈 (도 14A) 내의 실행 REACT090 및 REACT080, 50 rpm 시리즈 (도 14B) 내의 실행 REACT086 및 100 rpm 시리즈 (도 14C) 내의 실행 REACT084 및 REACT091을 참조한다), 항체 함량이 높은 실행에서 가장 확연하였다 (도 14의 15.4 mg/mL의 실행의 그래프의 프로파일을 참조한다).
인큐베이션 동안 교반되지 않은 실행 모두에서 (도 14A), dO2 수준이 인큐베이션 및 냉각 단계 양쪽 모두 동안 약 20％ 미만으로 유지되었다. 또한, REACT086을 제외하고는, 인큐베이션 동안 50 rpm 교반을 사용한 실행에서 (도 14B), 50 rpm 교반에 의해 인큐베이션 단계에서 산소가 전달될 수 있었음에도 불구하고 dO2 수준이 인큐베이션 및 냉각 단계 양쪽 모두 동안 약 20％ 미만으로 유지되었다. 그러나, 낮은 시스테인 농도 (4.8 mM)의 실행 REACT072에서는, 마지막 냉각 단계에서 약간의 산소 수준 증가를 볼 수 있다. 인큐베이션 동안 100 rpm으로 교반된 실행 (도 14C)은 매우 상이한 프로파일들을 나타냈다. 먼저, 상기 언급된 바와 같이, 낮은 항체 함량 (10 mg/mL)의 실행 (REACT084 및 REACT091)은 더 느린 dO2 감소를 나타냈고, 이것이 인큐베이션 단계 동안 계속되었다. 그러나, 낮은 시스테인 농도 (4.8 mM)의 실행 REACT084에서는, 그 후 인큐베이션의 마지막 시간인 5.00 내지 6.00시간 동안 dO2 수준이 거의 포화된 수준으로 상승하였다. 이같은 증가는 실행 REACT085에서 심지어 더 이른 시간 (4.00시간)에 또한 관찰되었다. REACT085 또한 낮은 수준의 시스테인을 사용하였지만, 항체 함량이 높았다 (15.4 mg/mL). dO2 수준의 증가가 실행 REACT075에서 냉각 단계 (6.00 내지 7.00시간) 동안 또한 관찰되었다. 실행 REACT075에서, 시스테인 농도는 중간 수준 (6.0 mM)이었다.
이러한 프로파일들은 헤드스페이스로부터 혼합물 내로 전달되는 것보다 높은 속도로 산소가 반응 혼합물에서 소비된다는 것과 항체 농도가 더 높은 실행에서 산소 소비가 더 빠르다는 것을 명확하게 가리킨다. 이는 차례로 항체 자체가 dO2 소비를 유발할 수 있다는 것을 시사한다. 시스테인 수준이 낮은 실행에서 선택적 환원의 후기 단계에 산소가 증가되는 것은, 아마도 하기와 같이, 산소 소비가 시스테인과의 반응에 연관된다는 것을 가리킨다: 4 Cys-SH + O2 → 2 Cys-SS-Cys + 2 H2O 및/또는 2 Cys-SH + 3 O2 → 2 Cys-SO3H. 실제로, 실행 REACT085에서는 약 4 h 후에, 실행 REACT084에서는 5 h 후에 모든 시스테인을 소비하기에 충분하게 속도가 빨랐다 (도 14C). 시스테인 소비 후, dO2 수준이 포화된 수준 (100％ dO2)으로 회복되었다.
항체가 산소 소비에 미치는 영향을 연구하기 위해, 본 발명가들은 6 mM 시스테인 및 50 rpm의 교반기 속도를 사용하여 50 mL 규모로 2개의 추가적인 실행을 수행하였다. 1개의 실행에서는, 항체 농도가 12.7 mg/ml (시스테인:항체의 몰비 = 69.89:1, 즉, 약 70:1)였고; 다른 실행에서는 항체 농도가 0이었다. 도 14D에 나타난 바와 같이, 항체가 없는 실행에서는 반응 온도가 20℃에서 37℃로 상승된 첫 한 시간에 dO2가 약 75％로 감소한다. dO2의 이러한 75％ 감소는 20℃에서의 8.9 mg/L에서 37℃에서의 6.6 mg/L로의 dO2 포화 농도 감소가 보고된 것에 잘 들어맞는다 (U.S. Geological Survey TWRI Book 9, April, 98). 나머지 인큐베이션 단계 동안에는 dO2 수준이 일정하게 유지된다. 냉각 단계가 시작되면 (6시간 후), 37℃에서 20℃로의 온도 저하로 인해 dO2 수준이 증가한다. 따라서, 항체의 부재 하에서는, 용액에서 산소 소비가 없거나, 또는 시스테인에 의한 산소 소비가 낮은 속도로 발생하여, 교반에 의해 야기되는 헤드스페이스로부터의 산소 전달이 이러한 소비를 즉각적으로 보상한다. 대조적으로, 항체가 있는 실행에서는, 약 5.5시간까지 dO2 수준이 꾸준히 감소한다. 인큐베이션 단계의 마지막 0.5시간에, dO2 수준이 약간 증가하고, 그 후 냉각 단계 (즉, 6 내지 7시간) 동안 dO2 수준이 더 강하게 증가된다. 따라서, 이러한 항체-함유 실행에서, 아마도 모두는 아니더라도 대부분의 시스테인이 5.5시간 후에 소비되었을 것이다. 실제로, 이러한 실행의 아미노산 분석 (데이터는 제시되지 않음)은 시스테인의 거의 완전한 소비에 상응하는, 시스틴의 수준 상승을 나타냈다.
이러한 정보로, 일부 실행에서 확인된 낮은 CEX에 의한 활성을 이들의 dO2 프로파일과 상호관련시키는 것이 가능하다. 실행 REACT085 (도 14C) (시스테인:항체의 몰비 약 46:1)는 REACT.PT300 (5.00시간 시점으로부터의 샘플)에서 CEX에 의한 활성이 89.4％였는데 (표 28 참조), 4.00 시점 이후에 시스테인이 소비되어 항체의 불완전한 환원을 초래하였기 때문이다. 이후의 시점 REACT.P (종점 7.00시간으로부터의 샘플)의 REACT085 (도 14C)는 CEX에 의한 활성이 더욱 더 적었는데 (84.0 ％, 표 29 참조), 시스테인의 부재 하에, 반응의 마지막 단계에서의 높은 산소 수준이 항체의 산화성 분해를 초래하였기 때문이다. 더 이른 REACT.PT300 시점에서는 활성이 높았지만, 실행 REACT084 (도 14C) (시스테인: 항체의 몰비 약 71:1) 및 REACT075 (도 14C) (시스테인:항체의 몰비 약 71:1)는 이후의 시점 REACT.P에 활성이 비교적 낮은 다른 2개의 실행이었다 (양쪽 모두 88.9％). 이러한 실행들에서, 5.00시간 시점 (REACT.PT300 시점)에 항체의 환원이 완료된 것으로 보였다; 그러나, 증가된 dO2 수준 및 시스테인의 부재로 인해 이후의 시점 REACT.P에 분해가 발생하였다. 유사하게, 실행 REACT072 (도 14B)에 대해 이후의 시점 REACT.P에 확인된 비교적 낮은 활성 (90.2％) (시스테인:항체의 몰비 약 56:1)는 반응의 냉각 단계 동안의 산소 수준 증가에 의해 설명된다. 0 rpm에서의 실행에서 (심지어 항체 함량이 높고 시스테인 농도가 낮은 실행 REACT082 [시스테인:항체의 몰비 약 46:1]에서) 수득된 높은 활성은 산소 전달율이 낮았고, 따라서 시스테인 소비가 명목적이어서, 환원의 이후의 냉각 단계 동안의 산화성 분해에 반하여 완전한 환원 (그리고 또한 보호)을 보장하였기 때문에 발생하였다.
결론적으로, 산소가 환원제 (시스테인)를 소비하고, 이러한 소비가 항체 자체에 의해 매개 (또는 가속화)되기 때문에, 환원 시스템에서 산소 전달이 낮게 유지되어야 한다. 따라서, 이러한 시스테인 소비의 이중적인 영향이 있다: 1) 시스테인의 환원력의 상실이 더 이른 시점 REACT.PT 300에 CysL97-SH의 불완전한 탈차단을 초래하고, 2) 탈차단된 Cys97L-SH를 REACT.P300과 REACT.P 사이의 시간 동안에 보호하는데 이용가능한 잔여 시스테인이 없으면, 탈차단된 Cys97L-SH의 재산화가 발생할 수 있다.
실시예 9.2 - 공정 특성화: 최악/최상의 경우 시나리오
최악/최상의 경우 연구의 주요 목적은 실험 설계 (DOE) 연구 동안 테스트되지 않았지만 공정 위험 분석에서 중요할 것으로 평가된 선택적 환원 단계의 입력 요인을 특성화하는 것이었다. 이러한 데이터는 입증된 허용가능 범위를 규정하는데, 그리고 입력 파라미터를 생성물 속성에 대한 이들의 효과의 영향을 기초로 분류하는 것을 지원하는데 또한 사용된다.
실시예 9.2.1 - 실험 설계 및 방법.
연장된 교반 기간으로 인해 선택적 환원 용액 내로의 산소 전달을 증가시키고, 이는 시스테인이 시스틴으로 전환되는 것에 의한 환원력 감소를 초래할 수 있고, 따라서 항체의 더 적은 선택적 환원을 초래할 수 있기 때문에, 증가된 가열 시간이 유의할 것으로 평가되었다. 동일한 이유로, 강화된 초기 dO2 수준이 유의할 입력 파라미터로 평가되었다.
시스테인의 술프히드릴 기의 산화는 pH 의존적이다. 따라서, pH의 영향이 유의할 입력 파라미터로 평가되었다.
높은 환원력은 항체의 과다환원을 초래할 수 있고, 연장된 냉각 시간은 항체 재조립을 촉진할 수 있다. 따라서, 연장된 냉각 시간 또한 유의할 입력 파라미터로 평가되었다.
이전의 공정 개발에서 이미 테스트되었지만 (32 - 42 ℃), 온도가 유의할 것으로 평가되었다. 전형적으로, 더 낮은 온도에서 화학 반응 속도가 감소된다. 따라서, 전용 실행에서 상한 및 하한에서 동역학을 결정하였다.
인큐베이션 시간 또한 조사하였다. 낮은 인큐베이션 시간은 선택적 환원 풀에서 더 높은 수준의 과다-환원된 생성물을 초래할 수 있다. 반대로, 연장된 인큐베이션 시간은 반응 표면 설계 결과에서 나타난 바와 같이 더 낮은 CEX에 의한 활성을 초래할 수 있다 (표 29 참조; REACT.PT300 및 REACT.P 샘플의 CEX 활성을 비교한다).
상기에 기술된 파라미터들이 선택적 환원 단계에 미치는 영향을 평가하기 위해 3개의 최악/최상의 경우 시퀀스를 규정하였다. 최악/최상의 경우 시퀀스에서 환원력을 평가하기 위한 입력 파라미터가 표 30에서 제시된다. 온도가 선택적 환원 단계에 미치는 영향을 평가하기 위해 제2의 최악/최상의 경우 시퀀스가 생성되었다 (표 31). 인큐베이션 시간의 영향을 표 32에 열거된 입력 파라미터에 따라 제3 최악/최상의 경우 연구에서 평가하였다. 최악/최상의 경우 연구의 결과를 평가하는데 사용된 생성물 품질 출력 파라미터는 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도이다.
Figure 112017058118342-pct00033
표 30: 환원력의 영향을 평가하기 위한 입력 파라미터
Figure 112017058118342-pct00034
표 31: 인큐베이션 온도의 영향을 평가하기 위한 입력 파라미터. 1) 18℃에서의 선택적 환원의 반응 속도가 충분하지 않아서 불충분한 재활성화를 초래하였기 때문에, 32℃를 테스트하였다.
Figure 112017058118342-pct00035
표 32: 인큐베이션 시간의 영향을 평가하기 위한 입력 파라미터.
추가적인 중요할 파라미터들의 영향을 평가하기 위해 전용 실행을 수행하였다. 제작-규모 실행 B008530으로부터 유래되는 세쿠키누맙 INAKT.F (-60℃ 미만에서 보관됨)를 사용하였다. 완충제 AIN457-TITR1, AIN457-TITR2 및 AIN457-TITR3은 실시예 10에 기술된 바와 같다. 인증된 규모-축소 모델 (실시예 10에서 상세하게 기술됨)에서, pH, 용존 산소, 교반기 속도 및 온도를 모니터링하면서 개방형 교반 생물반응기 (최대 2 L 부피)에서 주위 온도에서 실험을 수행하였다. 모든 실행에 대해, 표 27로부터의 공정 파라미터가 적용되었다. 개별적인 연구의 일부가 아닌 모든 입력 파라미터는 표준 시퀀스의 작업 범위 내의 표 27의 목적에서 일정하게 유지되었다.
실시예 9.2.2 - 최악/최상 시나리오의 결과
가열 시간, 냉각 시간, 시작할 때의 dO2 및 공정 pH의 영향의 조사를 위한 실험 설계 계획 및 출력 파라미터 (CE-SDS에 의한 순도 및 CEX에 의한 활성)가 표 33에서 제시된다. 인큐베이션 온도의 영향의 조사를 위한 실험 설계 계획 및 출력 파라미터 (CE-SDS에 의한 순도 및 CEX에 의한 활성)가 표 34에서 제시된다. 인큐베이션 시간의 영향의 조사를 위한 실험 설계 계획 및 출력 파라미터 (CE-SDS에 의한 순도 및 CEX에 의한 활성)가 표 35에서 제시된다.
표 33에 나타난 바와 같이, 낮은 환원력, 뿐만 아니라 높은 환원력으로의 이중 실행으로 높은 CEX에 의한 활성, 뿐만 아니라 높은 CE-SDS에 의한 순도가 초래되었다. 따라서, 공정이 입력 파라미터인 가열 시간 및 냉각 시간 (교반을 포함함), 시작할 때의 dO2 수준 및 공정 pH의 테스트된 범위 내에서의 변동을 포함할 수 있다.
Figure 112017058118342-pct00036
표 33: 가열 시간, 냉각 시간, 시작할 때의 dO2 및 공정 pH의 영향의 조사를 위한 실험 설계 계획 및 출력 파라미터. 1) 더 낮은 pH, 더 높은 시작할 때의 dO2 수준 및 더 긴 가열 및 냉각 시간으로 인한 더 낮은 환원력으로의 이중 실행. 2) 더 높은 pH, 더 낮은 시작할 때의 dO2 수준 및 더 짧은 가열 및 냉각 시간으로 인한 더 높은 환원력으로의 이중 실행
인큐베이션 온도의 영향을 평가하기 위한 실험의 결과가 표 34에서 제시된다. CE-SDS에 의한 순도는 항상 높았던 반면, 높은 CEX에 의한 활성은 32℃ 이상의 실행에서만 수득되었음을 볼 수 있다.
Figure 112017058118342-pct00037
표 34: 인큐베이션 온도의 영향의 조사를 위한 실험 설계 계획 및 출력 파라미터. 1) 추가적인 중심점 실행.
추가적으로, 상이한 인큐베이션 온도들에서 CEX에 의한 활성의 동역학을 결정하였다. 이러한 결과가 도 15에서 제시된다. 42℃에서의 동역학이, 특히 후기 단계 (60분 이상)에서, 32℃에서보다 더 빠르다는 것을 볼 수 있다. 그러나, 양쪽 온도에서, 동일한 안정기가 240분 및 REACT.P에 도달된다. 18℃에서는, 반응 속도가 더 느려서, 테스트된 단계 기간 내에 CEX에 의한 활성의 더 낮은 증가가 초래된다.
인큐베이션 시간의 영향을 평가하기 위한 실험의 결과가 표 35에서 제시된다. 모든 경우에, 높은 활성 및 순도가 수득되었다.
Figure 112017058118342-pct00038
표 35: 인큐베이션 시간의 영향의 조사를 위한 실험 설계 계획 및 출력 파라미터. 1) 낮은 인큐베이션 시간. 2) 높은 인큐베이션 시간.
실시예 9.3 - 공정 파라미터의 분류 및 정당화
실시예 9.3.1 - 반응 표면 설계 연구: 허용가능 범위
시점 1 (REACT.PT300) 및 선택적 환원이 끝날 때 (REACT.P)에 모든 실험에서 CE-SDS에 의한 순도가 적어도 90％였다. 높은 수준의 CE-SDS에 의한 순도를 달성하기 위해, 입력 파라미터인 TITR3 첨가에 의한 희석 배율이 높게 설정되어야 하고, 교반기 속도가 중심 내지 높은 것으로 설정되어야 한다. 이러한 조건들은 더 낮은 시스테인 농도 및 헤드스페이스를 통한 산소 전달 증가로 인한 낮은 환원력에 상응한다. 입력 파라미터인 ALC에 의한 함량, 즉, 항체 농도는 선택적 환원 단계 동안 시점 1 (REACT.PT300)에 유의한 영향이 있고, 이상적인 것은 대략적으로 중심점이다. 항체 농도 (ALC에 의한 함량)가 CE-SDS에 의한 순도의 절대값에 미치는 영향은 조사된 범위 내에서 미미하다. 그럼에도 불구하고, 특정 순도 값이 모든 실험에서 충족되었고, ALC에 의한 함량 (항체 농도), TITR3 첨가에 의한 희석 배율 (시스테인 농도) 및 교반기 속도 (산소 전달) 파라미터에 대한 조사된 범위 전부가 선택적 환원 후에 충분한 CE-SDS에 의한 순도를 보장하는데 적합하다.
CEX에 의한 활성은 시점 1 (REACT.PT300)에 REACT085를 제외한 모두에 대해 적어도 90％였다 (표 28 참조). 이러한 실험은 고수준의 교반기 속도로 수행되었고, 이는 더 높은 산소 전달을 나타낸다. 예상에도 불구하고, 추가적인 2개의 실험 (REACT075 및 REACT084, 표 29 참조)이 93％ 미만의 CEX에 의한 활성을 나타낸 바와 같이, 더 긴 인큐베이션 시간 (즉, 추가적인 60분, 시점 REACT.P)이 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성에 특히 이롭지 않았다. 이러한 실험들은 교반기 속도가 높거나 또는 TITR3 첨가에 의한 희석 배율의 수준이 높고, 이는 낮은 시스테인 농도 및 헤드스페이스를 통한 산소 전달 증가를 나타낸다. 이러한 결과들은 최고의 CEX에 의한 활성을 달성하기 위해, 입력 파라미터인 교반기 속도가 낮은 수준 (낮은 산소 전달을 의미함)으로 설정되어야 하고, TITR3 첨가에 의한 희석 배율이 중심점 또는 낮은 수준 (더 높은 시스테인 농도를 의미함)으로 설정되어야 한다는 것을 시사한다. 입력 파라미터인 ALC에 의한 함량 (항체 농도를 나타냄)은 이러한 실험에서 CEX에 의한 활성에 대한 유의한 영향이 없었다.
헤드스페이스로부터의 용액 내로의 산소 전달을 매개하는 교반기 속도 입력 파라미터가 선택적 환원 단계에 중요하고, 충분한 CEX에 의한 활성을 보장하기 위해 이의 더 낮은 수준으로 설정되어야 한다. 추가적인 제작-규모 실행 (B018838, 데이터는 제시되지 않음)에 따라, 시간 당 최대 15분의 교반을 테스트하였고, 허용가능한 생성물 품질이 선택적 환원 단계 후에 초래되었다. 그러나, 실시예 8의 결과는 교반에 의한 용액 내로의 산소 전달이 각각의 규모 및 셋업에 대해 독특하고, 간접적으로 제어된다는 것을 드러낸다. 따라서, 예를 들어, 공정 변화 또는 규모-확대의 경우에, 인큐베이션 동안의 교반 조건을 평가하여야 한다. 반응 용액 내로의 dO2 전달 수준을 간접적으로 나타내는 인큐베이션 동안의 교반은 공정 관점에서 유의한 입력 파라미터로 분류된다.
입력 파라미터인 ALC에 의한 함량, 즉 항체 농도, 및 TITR3 첨가에 의한 희석 배율, 즉 시스테인 농도는 통계적으로 유의한 효과를 나타내지만, 잘 제어되고, 선택적 환원 단계에 미치는 영향이 미미하다. 따라서, 이들은 공정 관점에서 중요하지 않은 것으로 분류된다. 인큐베이션 동안의 혼합 시간이 허용가능한 범위 내에 있는 한, 조사된 범위 내에서의 시스테인 농도 및 항체 농도의 변동은 공정 성능 및 선택적 환원 단계 후의 생성물 품질이 충분한 것을 초래할 것이다. 이러한 입력 파라미터들에 대한 입증된 허용가능 범위의 목록이 표 36에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00039
표 36: 인큐베이션 동안의 교반기 속도, ALC에 의한 함량 및 TITR3 첨가에 의한 희석 배율 (시스테인 농도)에 대한 허용가능 범위. 1) 4h 인큐베이션 시간의 제작-규모의 특성화 실행인 배치 B018838, 사이트 A에 따름.
실시예 9.3.2 - 최악/ 최상의 경우 연구: 허용가능 범위
입력 파라미터인 가열 시간 및 냉각 시간 (교반을 포함함), 시작할 때의 dO2 수준 및 공정 pH는 표 37에 나타난 조사된 범위 내에서 생성물 품질 속성인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도에 관하여 유의한 영향이 없다. 그러나, 반응 표면 설계의 경험으로 인해, 선택적 환원 용액 내로의 너무 높은 산소 전달을 방지해야하는데, 이는 환원력을 감소시키기 때문이다. 산소 전달은 각각의 규모 및 셋업에 대해 특이적이지만, 호기성 공정에서는 다른 공정 조건, 예컨대 교반 및 헤드스페이스 내로의 기류에 의해 간접적으로 제어된다. 그러므로, 산소 전달에 영향을 미치는, 가열 및 냉각 동안의 교반을, 특히 예를 들어 공정 변화, 공정 전달 또는 규모-확대의 경우에, 주의깊게 평가하여야 한다. 따라서, 가열 및 냉각 시간 (교반을 포함함)이 공정 관점에서 유의한 파라미터로 분류된다. 45 - 90분의 가열 및 냉각 시간 (교반을 포함함)에 대한 범위가 테스트되었지만, 허용가능 범위가 ≤ 90분으로 설정되었는데, 90분 가열 및 냉각 시간 (교반을 포함함)이 적합한 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도를 초래하는 산소 전달에 관한 최악의 경우를 반영하기 때문이다.
Figure 112017058118342-pct00040
표 37: 가열 시간, 냉각 시간, 시작할 때의 용존 산소 및 공정 pH의 테스트 범위.
입력 파라미터인 인큐베이션 온도를 조사하는 실험의 결과는 18℃의 인큐베이션 온도가 불충분한 재활성화를 초래하는 느린 반응 동역학을 일으킨다는 것을 실연한다. 이러한 낮은 온도는 CEX에 의한 활성을 240분의 인큐베이션 시간 내에 93.0％보다 높은 수준으로 증가시키는데 불충분하다. 따라서, 생성물 품질 속성인 CE-SDS에 의한 순도가 18 - 42℃의 인큐베이션 온도 범위 내에서 달성될 수 있지만, 선택적 환원 단계 후의 충분한 CEX에 의한 활성을 보장하도록 18 - 42℃의 테스트 범위가 32 - 42℃로 좁혀진다. 따라서, 인큐베이션 온도에 대한 허용가능 범위는 하한이 32℃이고 상한이 42℃이다.
마지막으로, 210 - 330분의 인큐베이션 시간의 테스트 범위가 선택적 환원 단계 후 적합한 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도를 보장한다.
실시예 9로부터의 요약 및 결론
공정 특성화 연구의 결과를 기초로, 조사된 공정 입력 파라미터들에 대한 허용가능 범위가 규정되었다. 2개의 생성물 품질 출력 파라미터인 CE-SDS에 의한 순도 및 CEX에 의한 활성에 의해 선택적 환원 단계가 특성화된다. 파라미터 분류 및 허용가능 범위가 표 38에서 요약된다. PAR에 대한 시스테인:항체의 비는 약 46:1 내지 약 118:1이다. SOR에 대한 시스테인:항체의 비는 약 54:1 내지 약 83:1이다.
Figure 112017058118342-pct00041
표 38: 분류를 포함하는 선택적 환원 단계의 입력 파라미터. 1) WFI로의 희석 후, pH 조정 및 TITR3 첨가 전. 2) 가열 전. 3) 인큐베이션 동안. 4) 4 h 인큐베이션 시간의 제작-규모의 특성화 실행인 배치 B018838에 따름. 5) WFI 첨가 및 TITR1로의 pH 조정 후의 중간 부피에 관련됨
선택적 환원 단계를 시작할 때는, 용액 내로의 연속적인 산소 전달이 증가된 산소 수준 및 더 적은 CEX에 의한 항체 활성을 초래하면서, 산소가 시스테인의 환원력을 완화한다. 그러나, 선택적 환원 단계가 끝날 때는, 환원력이 높은 때인 반응 시작 시에 해리된 항체 내의 디술피드 결합의 형성을 산소 도입이 강화할 수 있고, 따라서 비-환원형 CE-SDS에 의한 충분한 순도를 보장하는데 산소가 중요하다. 항체 활성을 위한 산소 전달의 중요성이 교반기 속도가 산소 전달에, 그리고 따라서 CEX에 의한 생성물 활성에 미치는 유의한 효과가 관찰된 반응 표면 설계 연구의 결과 (표 28 및 29 참조)에 의해 실연된다. 그러나, 교반기 속도는 용기 크기, 교반기 크기, 교반기 유형 등에 따라 dO2 수준에 대한 효과가 상이하다. 따라서, 물리적 셋업들 사이에서 용액 내로 전달되는 산소를 비교하는데 사용될 수 있는 변수를 확인하는 것이 중요하다.
실시예 10: 규모-축소 모델의 산소 전달율 ( k L a *)
이전의 실시예에서, 본 발명가들은 선택적 환원 동안, 특히 인큐베이션 단계 동안 존재하는 dO2의 양이 세쿠키누맙의 품질 및 활성에 강한 영향을 미친다는 것을 특히 나타냈다. 선택적 환원이 호기성 조건 하에 수행될 때, 반응 내의 산소 수준은 직접적이 아니라, 다른 작업 조건, 예를 들어, 교반 속도 및 헤드스페이스 내로의 기류를 통해 제어된다. 각각의 반응의 물리적 셋업 또한 반응 혼합물 내에 존재하는 산소의 수준에 영향을 미친다 (기기 및 작업 조건이 함께 "시스템"을 형성한다). "kLa*"를 사용하여 물리적 셋업들 사이에서, 그리고 특정한 항체 프로세싱 단계 동안 용액 내로 전달되는 산소를 비교할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Garcia-Ochoa and Gomez (2009) Biotechnology Advances 27:153-176]; [Bandino et al. (2001) Biochem. Engineering J. 8:111-119]; [Juarez and Orejas (2001) Latin Am. Appl. Res. 31:433-439]; [Yange and Wang (1992) Biotechnol. Prog. 8:244-61]을 참조한다). kLa*는 스파징 없이 헤드스페이스를 통해 경시적으로 용액 내로 전달되는 산소의 양을 나타낸다. 이러한 값은 각각의 셋업 및 규모에 대해 특이적이고, 교반기 유형, 교반기 속도, 충전 부피, 및 헤드스페이스와 접촉되는 용액의 표면적 (이는 각각의 용기의 개별적인 기하학의 영향을 받는다)에 의존적이다. 각각의 물리적 셋업의 kLa*가 상이한 한편, 선택적 환원 단계 동안의 용액 내의 산소의 수준이 세쿠키누맙의 활성 및 총체성에 유의하게 영향을 미치기 때문에, 본 발명가들은 유사한 kLa* 범위를 나타내는 시스템에서 수행되는 경우, 선택적 환원 단계가 유사한 품질을 갖는 세쿠키누맙의 제제를 초래할 것으로 예상한다.
kLa*는 산소 전달 실험에서 직접적으로 결정될 수 없다. 대신, 테스트 용액 내의 dO2를 질소로 교체하고, 경시적인 dO2의 증가를 보정된 dO2 프로브를 사용하여 모니터링하고, 이는 실험적 dO2 곡선의 생성을 허용한다. 그 후, 실험적 dO2 곡선을 하기에 제시된 방정식에 따라 (예를 들어, 매쓰캐드®를 사용하여) 포화 곡선에 맞춤으로써 특정 시스템에 대해 kLa* 값을 계산한다:
DO = C × (1 - e - kLa *×( t - t 0))
[식 중, DO = 측정된 용존 산소 값이고, C는 산소의 포화 값이고 (무한적으로 교반되고 포화가 달성될 때 100％를 의미함), e = 2.718281....이고, t = DO 값에 상응하는 시점이며, t0 = 출발 시점이다]. 이러한 방정식은 용액 내로의 산소 전달 (kLa* 값)을 결정하기 위해 확립된 통합 형태의 경험식을 나타낸다. 이러한 식은 상이한 저자들에 의해 다양한 실험에서 입증되었다 (Doran, P. M. 1995. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, San Diego, California, chapter 9.10.2, p. 210-213).
실시예 10.1 - 실험 설계 및 통계적 설계 방법
용존 산소 수준이 산화환원 반응에 대한 중요한 영향 요인이기 때문에, 규모-축소 모델의 인증 및 제작-규모와의 비교를 위해 산소 전달을 평가하였다.
통계적 설계를 사용하여 kLa* 값과 입력 파라미터인 부피, 헤드스페이스 내로의 기류, 교반기 속도 및 교반기 유형의 의존성을 결정하였다. 입력 파라미터가 표 39에서 열거된다. 각각 통계적 설계 계획에 따른 3가지 수준으로 요인들을 조사하였다. 출력 파라미터는 kLa* 값이다.
Figure 112017058118342-pct00042
표 39 - 규모-축소 모델의 kLa* 값 결정에 대한 입력 파라미터.
각각의 샘플에 대한 kLa* 값을 결정하기 위해, 2 L 생물반응기에 물을 충전하고, 37℃로 가열하였다. 기류를 질량 유량계로 제어하고, 헤드스페이스에 적용하였다. 그 후, 용액에 질소 기체를 스파징하여 물에서 dO2를 제거하였다. 그 후, 러쉬톤 터빈 (방사형)을 사용하여 일정한 교반을 적용하였다. 시간 과정에 걸쳐, dO2가 90％에 도달할 때까지 산소 프로브 (실온, 약 18-25℃에서 보정됨)를 사용하여 물 내의 dO2 수준을 기록하였다. 그 후, 상기 기술된 바와 같이 실험적 dO2 곡선을 포화 곡선에 맞춤으로써 kLa* 값을 계산하였다.
3개의 중심점 실행이 있는 중심 합성 표면 중심화 설계 (CCF)를 사용하였다. 가장 중요한 공정 파라미터와 이들이 kLa*에 미치는 영향 사이의 상관관계를 결정하기 위해 이러한 설계가 선택되었다. 이러한 설계 유형은 일차항, 상호작용항 및 이차항의 수학적 모델의 계산을 지원한다.
실시예 10.3 - 출력 파라미터 ( k L a *) 값
실험 조건 및 공정 성능 출력 파라미터인 kLa*에 대한 값이 표 40에서 열거된다.
Figure 112017058118342-pct00043
표 40 - 통계적 설계 - 수행된 시퀀스 및 실험 조건.
실시예 10.4 - 출력 파라미터 k L a *에 대한 통계적 진단
4가지 도구, 즉 R2, Q2, 모델 타당도 및 반복실험의 표준 편차 (SD)에 의해 모델의 품질이 표시된다. 데이터를 잘 설명하는 모델은 R2 및 Q2가 1.0에 근접할 것이고, 모델 타당도가 0.25를 초과할 것이다. 모델 분석에서, 변환되지 않은 kLa* 결과의 평가가 잔차가 정규 분포의 요건을 충족시키지 않는 모델을 초래한다는 것이 인지되었다. 이것은 kLa* 값의 변환이 결과를 알맞은 방식으로 기술하는데 필요하다는 것을 가리키고, 이는 생물반응기에서의 통상적인 kLa* 측정에 대해 종종 관찰된다. 공정 성능 출력 파라미터에 대한 모델 진단은 R2 = 0.98; Q2 = 0.91 (-0.5의 거듭제곱에 의한 변환 후); 모델 타당도 = 0.56, 및 반복실험의 표준 편차 = 0.06이고, 이는 통계적 유의성이 높은 모델을 가리킨다.
실시예 10.5 - 수학적 모델의 설명
잔차의 N-플롯에서, 표준화 잔차 (표준 편차로 나눈 반응의 잔차)를 수평축에, 정규 확률을 수직축에 플롯팅한다. 이상값이 ± 4 표준화 잔차의 밖에 있으면 이를 그래프로 확인할 수 있다. 또한, 비-선형 플롯이 출력 파라미터 변환을 필요로 하는 모델을 가리킬 수 있다 ("Design of Experiments - Principles and Applications," (1999-2008) MKS Umetrics AB, ed. Eriksson et al.). 공정 출력 파라미터인 kLa*에 대한 잔차의 N-플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 실험 결과와 모델의 우수한 핏을 가리킨다. 값들이 회귀선에 가깝게 핏팅되고, 이는 모델 변환이 적절하다 (표준화 잔차가 정규 분포의 요건을 충족시킨다)는 것을 의미한다. 추가적으로, 모든 실험 값이 ± 3 표준화 잔차의 범위 내에 있어, 측정된 값이 어떠한 이상값도 포함하지 않는다는 것을 가리킨다.
공정 출력 파라미터에 대한 계수 플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 입력 파라미터인 기류, 부피 및 교반기 속도가 공정 파라미터인 kLa*에 유의하게 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 등고선 플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 기류, 부피 및 교반기 속도가 kLa*에 미치는 효과를 도해한다 - 기류가 높을수록, 부피가 낮을수록 (즉, 헤드스페이스가 클수록), 그리고 교반기 속도가 높을수록, kLa*로 표현되는 헤드스페이스를 통한 산소 전달이 더 높다.
등고선 및 계수 플롯을 사용하여, 실험 조건의 상응하는 kLa* 값을 통계적 모델을 사용하여 MODDE 8.02로 예측하였다. 결과가 표 41에서 제시되고, 이는 규모-축소 모델을 사용하여 공정 특성화 (실시예 9 참조) 동안 테스트된 kLa* 범위를 나타낸다.
Figure 112017058118342-pct00044
표 41 - 공정 특성화 연구 동안 사용된 파라미터 설정 및 상응하는 kLa* 값.
실시예 11: 제작 규모에서의 산소 전달율 ( k L a *)
제작-규모 (1800 L 용기)에서의 일정한 교반 (즉, 선택적 환원 공정의 가열 및 냉각 단계 동안 사용된 교반 유형) 동안의 kLa*를 결정하였다.
실시예 11.1 - 사이트 A에서의 제작-규모에서의 k L a * 값의 결정
실시예 11.1.1 - 실험 설계 및 통계적 설계 방법
통계적 설계를 사용하여 테스트된 입력 파라미터 범위 내에서의 kLa*의 의존성을 결정하였다. 입력 파라미터가 하기 표 42에서 열거된다. 각각 통계적 설계 계획에 따른 3가지 수준으로 요인들을 조사하였다. 출력 파라미터는 kLa* 값이다.
Figure 112017058118342-pct00045
표 42: 제작-규모 사이트 A에서의 kLa* 값 결정에 대한 입력 파라미터.
사이트 A에서의 이러한 실험들은 최대 작업 부피 1800 L, 높이 2.7 m 및 직경 1.0 m의 스테인레스 스틸 용기에서 수행되었다. 각각의 샘플에 대한 kLa* 값을 결정하기 위해, 용기에 물을 충전하고, 지시된 온도로 가열하였다. 그 후, 질소 기체를 헤드스페이스에 적용하여 물에서 dO2를 제거하였다. 그 후, 일정한 교반을 적용하였다 (바닥으로부터의 프로펠러 교반기를 사용함). 시간 과정에 걸쳐, dO2가 90％에 도달할 때까지 산소 프로브 (실온, 예를 들어, 18-25℃에서 보정됨)를 사용하여 물 내의 dO2 수준을 기록하였다. 그 후, 상기 기술된 바와 같이 실험적 dO2 곡선을 포화 곡선에 맞춤으로써 kLa* 값을 계산하였다. 입력 파라미터 및 상응하는 결과가 표 43에서 제시된다.
4개의 중심점이 있는 중심 합성 표면 중심화 (CCF) 설계를 사용하였다. 가장 중요한 입력 파라미터와 이들이 산소 전달에 미치는 영향 사이의 상관관계를 결정하기 위해 이러한 설계가 선택되었다. 이러한 설계 유형은 일차항, 상호작용항 및 이차항의 수학적 모델의 계산을 지원한다.
실시예 11.1.2 - 출력 파라미터 ( k L a *) 값
실험 조건 및 공정 성능 출력 파라미터인 kLa*에 대한 값이 표 43에서 열거된다.
Figure 112017058118342-pct00046
표 43 - 통계적 설계 - 수행된 시퀀스 및 실험 조건
실시예 11.1.3 - 출력 파라미터 k L a *에 대한 통계적 진단
4가지 도구, 즉 R2, Q2, 모델 타당도 및 반복실험의 표준 편차 (SD)에 의해 모델의 품질이 표시된다. 데이터를 잘 설명하는 모델은 R2 및 Q2가 1.0에 근접할 것이고, 모델 타당도가 0.25를 초과할 것이다. 통계적 유의성이 낮은 모델은 R2 및 Q2 값이 낮다. 변환되지 않은 kLa* 결과의 평가가 잔차가 정규 분포의 요건을 충족시키지 않는 모델을 초래한다는 것이 인지되었다. 이것은 kLa* 값의 변환이 결과를 알맞은 방식으로 기술하는데 필요하다는 것을 가리킨다. 견고한 모델을 획득하기 위해, 출력 파라미터가 -0.5의 거듭제곱에 의해 변환되었다. 공정 성능에 대한 모델 진단은 R2 = 0.95, Q2 = 0.88, 모델 타당도 = 0.82, SD = 0.15였고, 이는 통계적 유의성이 높은 모델을 가리킨다.
실시예 11.1.4 - 수학적 모델의 설명
공정 출력 파라미터인 kLa* 값에 대한 잔차의 N-플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 실험 결과와 모델의 우수한 핏을 가리킨다. 값들이 회귀선에 가깝게 핏팅되고, 이는 모델 변환이 적절하다 (표준화 잔차가 정규 분포의 요건을 충족시킨다)는 것을 의미한다. 추가적으로, 모든 실험 값이 ± 3 표준화 잔차의 범위 내에 있어, 측정된 값이 이상값을 포함하지 않는다는 것을 가리킨다.
계수 플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 오차 막대가 x축을 절단하지 않음에 따라 모든 입력 파라미터, 즉 교반 속도, 부피 및 온도가 공정 파라미터인 kLa* 값에 유의하게 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 추가적으로, 교반기 속도와 부피의 상호작용이 유의하다. kLa* 값의 등고선 플롯 (데이터는 제시되지 않음)은 온도, 부피 및 교반기 속도가 kLa*에 미치는 효과를 도해하고, 즉 온도가 높을수록, 부피가 낮을수록, 그리고 교반기 속도가 높을수록, kLa*로 표현되는 헤드스페이스를 통한 산소 전달이 더 높다.
실시예 11.1.5 - 제작 규모에서의 전용 실행의 결과
kLa* 값을 전용 실험에서 결정하고, MODDE 8.02에 의해 계산된 모델의 예측과 비교하였다. 예측 및 전용 실행의 결과가 표 44에서 제시된다. 이러한 결과에 따르면, 수학적 모델이 적절한 방식으로 kLa* 값을 예측할 수 있었다.
Figure 112017058118342-pct00047
표 44: 제작-규모 (사이트 A)에서의 표준 공정 조건의 kLa* 값 (예측치 및 측정치)
실시예 11.1.6 - 사이트 A에서의 공정 조건에 대한 k L a * 예측치
사이트 A에서의 캠페인 AT493021 동안 사용된 공정 조건에 대한 kLa*를 MODDE 8.02에 의해 계산된 모델로 예측하였다. 결과가 표 45에서 제시되고, 일정한 교반이 적용되었을 때 kLa* 값 예측치는 0.05 h-1 내지 0.69 h- 1이다. 이러한 값들은 상이한 공정 부피들로부터 초래된 광범위한 kLa* 값에 걸쳐 공정 단계가 견고하다는 것을 가리킨다. kLa*에 (그리고 따라서 산소 전달에) 영향을 미치는 파라미터가 공정 견고성의 최종 평가를 위해 고려되어야 하고, 예를 들어, 전체적인 교반 시간이 산소 전달에 유의하게 영향을 미친다.
Figure 112017058118342-pct00048
표 45: 제작-규모 (사이트 A)에서의 공정 조건의 kLa* 값. 1) 부피가 평가 범위를 초과한다. 외삽은 부정확한 값을 초래할 수 있다.
실시예 12: 규모-축소 모델의 인증 실행 및 사이트 A에서의 제작 규모에 대한 비교
실시예 12.1 - 방법
표준 조건 하에 수행된 3개의 규모-축소 모델 인증 실행 (REACT065, REACT066, 및 REACT067)을 7개의 대표적인 제작 규모 실행과 비교하였다. 규모-축소 모델 인증 실행을 위해, 제작-규모 실행 B008530 (캠페인 AT493021, 사이트 A)으로부터 유래되는 세쿠키누맙 INAKT.F (-60℃ 미만에서 보관됨)를 사용하였다. 사용 전에 로드 (INAKT.F)를 손 온도의 수조에서 해동시켰다 (15-35℃). 전체적인 선택적 환원 절차의 단계들이 표 46에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00049
표 46: 선택적 환원 절차의 설명. * WFI 첨가에 대한 계산: Vol (WFI) = (Vol (INAKT.F) * c (INAKT.F) / 13.5 mg/mL) - Vol(INAKT.F); ** TITR3 첨가에 대한 계산: Vol(TITR3) = (Vol(INAKT.F) + Vol(WFI) + Vol(TITR1)) * 배율 (TITR3) [식 중, 배율 (TITR3) = 0.05 / 0.95 = 0.05263이다] (재활성화 용액 내의 6 mM 시스테인).
표 47에 열거된 공정 파라미터가 규모-축소 모델 인증 실행에 적용되었다. 파라미터들은 제작-규모 (사이트 A)에서의 공정 조건에 상응하고, 적합하게 규모가 축소되었다.
Figure 112017058118342-pct00050
표 47 - 선택적 환원 단계의 공정 파라미터. 1 매시간 마다 2분 동안 50 rpm으로 교반함.
샘플을 회수하고, 0.3 M 인산, pH 1.4 (AIN457-TITR2)로 5분 내에 pH를 5.2 (허용가능 범위 5.0-5.4)로 조정한 후, 샘플을 분석 실험실로 옮겼다. 모든 유지된 샘플을 냉동하고, ≤ -60℃에서 보관하였다. 앞서 기술된 바와 같이 생성물 품질 속성인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도의 비교에 의해 규모-축소 모델의 인증을 평가하였다. 하기의 시간 간격을 테스트하였다: 0, 10, 20, 30, 45, 60, 120, 240분.
실시예 12.2 - 결과
3개의 대표적인 제작-규모 실행 (데이터는 제시되지 않음) 및 규모-축소 모델 인증 실행 (도 16)으로부터의 용존 산소 차트가 선택적 환원 단계의 특징적인 형상을 나타낸다. 이러한 곡선들은 시스테인의 산화에 의해 용존 산소가 시스템에서 제거된다는 것을 나타낸다. 개발 경험에 따르면, 연장된 교반은 더 높은 산소 전달을 초래하고, 불충분한 CEX에 의한 활성을 일으킨다. 따라서, 선택적 환원 용액이 인큐베이션 동안 시간 당 2 - 15분 동안만 교반되고, 이에 의해 선택적 환원이 정지될 때까지 용액 내로의 산소 전달을 제한하고 용존 산소 수준을 낮게 유지시킨다. 냉각 단계 동안, 연속 혼합에 의한 용액 내로의 산소 전달로 인해 산소 수준이 약간 증가하는 한편, 특정량의 시스테인이 산화되어, 이를 용존 산소에 대한 환원제로서 이용가능하지 않게 한다.
사이트 A에서의 캠페인 AT493021의 제작-규모 실행 3-6의 경우, CEX에 의한 활성은 0.8 ％의 표준 편차로 평균 96.3％인 한편, CE-SDS에 의한 순도는 1％의 표준 편차로 평균 92％였다. 각각의 실행의 결과가 표 45로부터 유래되는 kLa* 값 예상치와 함께 표 48에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00051
표 48: 제작-규모 실행의 실험 결과
규모-축소 모델 인증 실행의 경우, CEX에 의한 활성은 1.6％의 표준 편차로 평균 95.0％인 한편, CE-SDS에 의한 순도는 1％의 표준 편차로 평균 94％였다 (표 49).
Figure 112017058118342-pct00052
표 49: 규모-축소 모델 인증 실행의 실험 결과.
선택적 환원 단계가 끝날 때의 생성물 품질의 평가에 더하여, CEX에 의한 활성에 대한 동역학을 또한 모니터링하였고, 규모-축소 모델 실행 (REACT065, 66 및 67의 평균) 및 사이트 A에서의 제작-규모의 결과를 비교하였다. 결과가 도 17에서 제시된다. 규모-축소 모델로부터 수득된 데이터가 제작 규모의 변동 내에 있었고, 이는 대규모 (사이트 A) 및 소규모에서의 동역학이 유사하다는 것을 실연한다.
실시예 13 - 실시예 9-12로부터의 k L a * 값의 조합 분석
선택적 환원 반응 동안의 용액 내의 용존 산소 수준의 중요성으로 인해, 용기의 헤드스페이스로부터의 제어된 산소 전달이 선택적 환원 단계에 중요하다. 각각의 시스템에 대해, 이러한 변수들이 kLa* 값으로서 포착될 수 있다. kLa*는 교반기 속도, 교반기 유형, 충전 부피, 온도, 및 헤드스페이스와 접촉되는 용액의 표면적 (각각의 용기의 개별적인 기하학에 영향을 받음)에 의존적이다. 상기 실험들로부터 각각의 셋업에 따라 kLa*가 변화될 것이지만, 광범위한 kLa* 값이 선택적 환원 공정 동안의 세쿠키누맙의 품질 및 활성을 보장하도록 허용가능하다는 것을 볼 수 있다.
규모 축소 연구의 실험 조건에 대한 0.18 h-1 - 0.37 h-1의 kLa* 예측치 범위가 통계적 모델의 사용에 의해 결정되었다 (표 41). 정해진 부피 하에, 교반 속도가 감소함에 따라 kLa* 값이 감소하였다. 실시예 9에서의 반응 표면 설계 실험 조건 및 셋업이 실시예 10에서의 규모-축소 모델에서 사용된 것과 동일하기 때문에, 표 41의 kLa* 값 예측치가 표 28의 조건 및 결과와 상호관련될 수 있다. 이러한 분석이 표 50에서 제시된다.
Figure 112017058118342-pct00053
표 50 - REACT.PT300 및 REACT.P의 출력 파라미터 값에 대한 kla* 분석. 몰비는 가장 가까운 정수로 반올림된다. 아미노산 서열을 기초로 하는 세쿠키누맙의 상대적 분자 질량은 147,944 돌턴이고, 이를 사용하여 칼럼 4의 시스테인 대 단백질의 몰비를 계산한다.
240분 인큐베이션 기간이 있는 실험 (REACT.PT300)의 경우, REACT085를 제외한 모든 반응이 CEX 및 CE-SDS로 측정 시 매우 높은 선택적 환원 성능을 적합한 생성물 품질과 함께 초래하였다 (표 50). REACT085는 교반 속도가 100 rpm이었고, kLa* 값이 인큐베이션 동안 0.37 h-1이었으며, 시스테인 대 항체의 몰비가 매우 낮았다 (약 46:1). 시스테인 대 항체의 낮은 몰비가, 용기 내로의 높은 산소 전달 (높은 kLa* 값에 의해 나타남)과 조합되어, 불충분한 재활성화를 초래하였을 것이다.
300분 인큐베이션 기간이 있는 실험 (REACT.P)의 경우, REACT085, REACT075, 및 REACT084를 제외한 모든 반응이 CEX 및 CE-SDS로 측정 시 매우 높은 선택적 환원 성능을 적합한 생성물 품질과 함께 초래하였다 (표 50). REACT085, REACT075, 및 REACT084는 교반 속도가 100 rpm이었고, 인큐베이션 동안 kLa* 값이 0.37 h-1이었으며, 시스테인 대 항체의 몰비가 낮음-중간이었다 (약 46:1 및 약 71:1). 시스테인 대 항체의 낮음-중간 몰비가, 용기 내로의 높은 산소 전달 (높은 kLa* 값에 의해 나타남)과 조합되어, 불충분한 재활성화를 초래하였을 것이다. (REACT.PT300 샘플에 비해) 증가된 인큐베이션 시간은 일부 REACT.P 실행에서 더 불량한 CEX 값에 기여하는 것으로 보였다.
표 50에서 볼 수 있듯이, CEX 활성이 90％를 초과하는 반응은 선택적 환원 반응의 인큐베이션 부분 동안 시스템 내의 kLa*와 관련하여 하기의 특성을 갖는다:
1) 선택적 환원 반응의 인큐베이션 단계 동안의 시스템 내의 kLa*가 < 0.37 h-1이면, 시스테인:항체의 몰비가 약 46:1 내지 약 118:1로 다양할 수 있고 (더 짧은 인큐베이션 시간 및 더 긴 인큐베이션 시간 양쪽 모두, 예를 들어, 약 210 내지 약 330분, 예를 들어, 240-300분의 경우);
2) 시스테인:단백질의 몰비가 약 56:1 내지 약 118:1 (더 짧은 인큐베이션 시간, 예를 들어, 약 240분 이하의 인큐베이션의 경우) 또는 약 77:1 내지 약 118:1 (더 긴 인큐베이션 시간, 예를 들어, 약 300분 이하의 인큐베이션의 경우)이면, 선택적 환원 반응의 인큐베이션 단계 동안의 시스템 내의 kLa*가 최대 0.37 h-1일 수 있다.
물론, 가열 및 냉각 단계 동안의 kLa*는 인큐베이션 단계 동안의 kLa*보다 훨씬 더 높을 수 있고, 예를 들어, 표 54는 가열/냉각 단계 동안 최대 0.69 h- 1 의 kLa*가 적용될 수 있고, 높은 품질의 생성물을 여전히 생산할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 9 (공정 특성화 연구)는 인큐베이션 단계 동안 일정한 교반을 적용한 규모-축소 모델을 사용하여 출력 파라미터인 CEX에 의한 활성 및 CE-SDS에 의한 순도를 검사하였다. 실시예 10은 마찬가지로 일정한 교반을 적용한 규모-축소 모델을 사용하여 kLa* 값을 검사하였다. 실시예 11은 제작-규모에서 연속 교반을 사용할 때의 kLa* 값을 검사하였다. 실제 제작 동안, 연속 교반은 선택적 환원 반응의 가열 및 냉각 단계 동안에만 적용되는 한편, 간헐 교반 (예를 들어, 시간 당 2 - 15분)이 선택적 환원 반응의 인큐베이션 단계 동안 적용된다. 따라서, 제작하는 동안, 선택적 환원 반응 단계의 인큐베이션 단계 동안의 시스템의 kLa*가 실시예 10 및 11에서 관찰된 kLa* 값보다 훨씬 더 낮을 것이다. 그럼에도 불구하고, 실시예 9-11의 조합된 결과로부터, 일반적으로 전체적인 선택적 환원 단계 (즉, 가열 단계, 인큐베이션 단계, 및 냉각 단계)가 시스테인:항체의 몰비가 약 46:1 내지 약 118:1이면 약 240 내지 약 300분의 인큐베이션 단계를 포함하여 < 0.37 h-1의 kLa*를 사용하여 수행될 수 있다는 것을 볼 수 있다.
실시예 9의 최악/최상의 경우 실험은 동일한 인증된 규모-축소 모델을 사용하여, 인큐베이션 단계 동안 무시할 수 있을 정도 (즉, 시간 당 2분)로 교반하면서 (< 0.18 h-1의 kLa*), 약 66:1의 시스테인:항체의 몰비를 사용하여 수행되었다. 실 시예 9의 최악/최상의 경우 실험에서 210 내지 330분 동안 인큐베이션된 반응 모두가 높은 품질의 생성물을 생산하였기 때문에, kLa*가 낮고 시스테인:항체의 몰비가 중간 (예를 들어, 약 66:1)이면 인큐베이션 시간이 약 210 - 약 330분으로 확장될 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 14- 바람직한 선택적 환원 공정 파라미터 및 절차
선택적 환원 단계의 바람직한 공정 파라미터가 표 51에서 열거된다. 제안된 작업 범위는 약 54:1 내지 약 83:1이고 입증된 허용가능 범위는 약 46:1 내지 약 118:1이면서, 설정점에 대한 시스테인:항체의 몰비는 약 66:1이다.
Figure 112017058118342-pct00054
표 51: 선택적 환원 - 공정 파라미터의 목록.
선택적 환원 절차의 개별적인 단계들이 표 52에서 제시된다. 먼저, WFI 첨가에 의해 출발 물질의 단백질 농도를 13.5 mg/mL의 목적 농도로 조정한다. 그 다음, 1 M 트리스 첨가에 의해 pH를 8.0으로 조정한다. dO2를 점검하고, 작업 범위가 충족되지 않으면, 예를 들어, 추가적인 혼합, 침수형 통기 등에 의해, 이를 (예를 들어, ≥ 60％로) 조정한다. 시스테인을 6 mM로 첨가함으로써 반응이 시작되고, 그 후 용액을 (약 1시간에 걸쳐) 인큐베이션 온도 (약 37℃)로 가열한다. 인큐베이션 시간 동안 헤드스페이스로부터 용액 내로 산소가 전달되는 것을 제한하도록 시간 당 약 2분 동안 교반하면서 용액을 약 250분 동안 인큐베이션한다. 마지막으로, 용액을 (약 1시간에 걸쳐) 실온으로 냉각하고, 예를 들어, 0.3 M 오르토-인산으로, pH를 약 5.2로 조정하여, 반응을 정지시킨다.
Figure 112017058118342-pct00055
표 52: 선택적 환원 절차의 설명. * WFI 첨가에 대한 계산: Vol (WFI) = (Vol (INAKT.F) * c (INAKT.F) / 13.5 mg/mL) - Vol(INAKT.F); ** TITR3 첨가에 대한 계산: Vol(TITR3) = (Vol(INAKT.F) + Vol(WFI) + Vol(TITR1)) * 배율 (TITR3) [식 중, 배율 (TITR3) = 0.05 / 0.95 = 0.05263이다] (재활성화 용액 내의 6 mM 시스테인).
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG Heitzmann, Markus Winkler, Johann <120> SELECTIVE REDUCTION OF CYSTEINE RESIDUES IN IL-17 ANTIBODIES <130> 56418 FF <140> Herewith <141> Herewith <150> 62/095361 <151> 2014-12-22 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 = hypervariable region 1 of heavy chain of AIN457 <400> 1 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR2 = hypervariable region 2 of heavy chain of AIN457 <400> 2 Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR3 = hypervariable region 3 of heavy chain of AIN457 <400> 3 Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp Tyr Phe 1 5 10 15 Asp Leu <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR1' = hypervariable region 1 of light chain of AIN457 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR2' = hypervariable region 2 of light chain AIN457 <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR3' = hypervariable region 3 of light chain AIN457 <400> 6 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Thr 1 5 <210> 7 <211> 381 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 7 gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 tgg atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg 144 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc gcc ata aac caa gat gga agt gag aaa tac tat gtg ggc tct gtg 192 Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gtg agg gac tat tac gat att ttg acc gat tat tac atc cac tat tgg 336 Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp 100 105 110 tac ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc act gtc tcc tca 381 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp 100 105 110 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 327 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 9 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa cga 327 Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1-x = hypervariable domain x of heavy chain of AIN457 <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR2-x = hypervariable domain of heavy chain x of AIN457 <400> 12 Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR3-x = hypervariable domain x of heavy chain AIN457 <400> 13 Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr 1 5 10 15 Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 20 <210> 14 <211> 215 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 14 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 15 <211> 457 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp 100 105 110 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

Claims (46)

  1. 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 세쿠키누맙 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
    a) 제제를 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계이며, 적어도 하나의 환원제가 티올-디술피드 교환에 의해 측정 시 pH 7.0에서 표준 산화-환원 전위 Eo가 -0.20 V - -0.23 V인 티올-함유 환원제이고, 환원 혼합물 내의 환원제:항체의 몰비가 46:1 - 118:1인 단계; 및
    b) ≤ 0.37 h-1의 시스템 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 단계이며, 상기 kLa*가 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계
    를 포함하고, 여기서 단계 a) 전에, 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트가 25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시 적어도 60％인 방법.
  2. 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 세쿠키누맙 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
    a) 제제를 시스템에서 시스테인과 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계이며, 환원 혼합물 내의 시스테인:항체의 몰비가 46:1 - 118:1인 단계; 및
    b) ≤ 0.37 h-1의 시스템 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 단계이며, 상기 kLa*가 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 a) 전에, 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트가 25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시 적어도 60％인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 b) 동안의 시스템 내의 kLa*가
    a. ≤ 0.37 h-1이고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙 항체의 몰비가 56:1 - 118:1이고, 환원 혼합물이 단계 b)에 따라 240분 이하 동안 인큐베이션되거나;
    b. ≤ 0.37 h-1이고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙 항체의 몰비가 77:1 - 118:1이고, 환원 혼합물이 단계 b)에 따라 300분 이하 동안 인큐베이션되거나;
    c. < 0.37 h-1이고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙 항체의 몰비가 46:1 - 118:1이거나;
    d. < 0.37 h-1이고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙 항체의 몰비가 54:1 - 82:1이거나; 또는
    e. ≤ 0.27 h-1인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙 항체의 몰비가 66:1인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 환원 혼합물 내의 시스테인의 농도가 4.0 mM - 8.0 mM인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)와 단계 b) 사이에, 환원 혼합물이 32℃ - 42℃의 온도로 45분 - 90분 동안 가열되고, 여기서 가열 동안의 시스템 내의 kLa*는 ≤ 0.69 h-1이고, 상기 kLa*는 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 혼합물이 단계 b)에 따라 20℃ - 42℃의 온도에서 210분 - 420분 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 산화된 형태의 환원 시약이 환원 혼합물에 첨가되지 않는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제가 환원 혼합물에 첨가되지 않는 것인 방법.
  11. 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 세쿠키누맙 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
    a) 제제를 시스템에서 4.0 mM - 8.0 mM 시스테인과 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계;
    b) 환원 혼합물을 32℃ - 42℃의 온도로 45분 - 90분 동안 가열하는 단계이며, 가열 동안의 시스템 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)가 < 0.69 h-1인 단계; 및
    c) 시스템 내의 kLa*를
    i. ≤ 0.37 h-1로 유지시키고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙의 몰비가 56:1 - 118:1이고, 환원 혼합물이 240분 이하 동안 인큐베이션되거나;
    ii. ≤ 0.37 h-1로 유지시키고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙의 몰비가 77:1 - 118:1이고, 환원 혼합물이 300분 이하 동안 인큐베이션되거나;
    iii. < 0.37 h-1로 유지시키고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙의 몰비가 46:1 - 118:1이거나;
    iv. < 0.37 h-1로 유지시키고, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙의 몰비가 54:1 - 82:1이거나;
    v. ≤ 0.27 h-1로 유지시키면서
    환원 혼합물을 20℃ - 42℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계이고, 상기 kLa*가 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계
    를 포함하고, 여기서 단계 a) 전에, 제제 내의 초기 산소 포화 퍼센트가 25℃에서 보정된 산소 프로브를 사용하여 측정 시 적어도 60％인 방법.
  12. 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 세쿠키누맙 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
    a) 제제를 시스테인/시스틴 및 시스테인/시스타민으로부터 선택된 산화/환원 시약 세트와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계이고, 환원 혼합물 내의 산화/환원 시약의 몰비가 4:1 - 80:1이고, 환원 혼합물 내의 시스테인:세쿠키누맙 항체의 몰비가 21:1 - 296:1인 단계; 및
    b) 환원 혼합물을
    i. 37℃의 온도에서 혐기성 조건 하에 적어도 4시간 동안, 또는
    ii. 18℃ - 24℃의 온도에서 16시간 - 24시간 동안
    인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 산화/환원 시약 세트가 시스테인/시스틴인 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 내의 세쿠키누맙 항체의 활성의 수준이 시스타민-CEX로 측정 시 단계 b) 후 60분 이내에 적어도 10 백분율 포인트 만큼 증가하는 것인 방법.
  15. 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 세쿠키누맙 항체의 제제 내의 CysL97을 선택적으로 환원시키는 방법이며,
    a) 제제 내의 세쿠키누맙 항체의 농도를 4 mg/ml - 19.4 mg/ml로 조정하는 단계;
    b) 제제 내의 산소 포화 퍼센트를 적어도 60％로 조정하는 단계;
    c) 제제의 pH를 7.4 - 8.5로 조정하는 단계;
    d) 제제를 용기에서 시스테인과 접촉시켜 환원 혼합물을 형성시키는 단계이며, 여기서 환원 혼합물 내의 시스테인의 농도가 4.0 mM - 8.0 mM인 단계;
    e) 환원 혼합물을 32℃ - 42℃의 온도로 가열하는 단계;
    f) 단계 e)로부터의 환원 혼합물을 20℃ - 42℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계이며, 상기 인큐베이션이 ≤ 0.37 h-1의 용기 내의 체적성 산소 물질-전달 계수 (kLa*)를 유지시키면서 210분 - 420분 동안 발생하며, 상기 kLa*가 포화 곡선을 용존 산소 곡선에 맞춤으로써 계산되는 것인 단계;
    g) 단계 f)로부터 생성된 혼합물을 16℃ - 28℃의 온도로 냉각하는 단계이며, 상기 냉각이 45분 - 90분 동안 발생하는 것인 단계; 및
    h) 단계 g)로부터 생성된 혼합물의 pH를 5.1 - 5.3으로 조정하는 단계
    를 포함하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI763732B (zh) 2016-11-07 2022-05-11 美商西雅圖遺傳學公司 工程化半胱胺酸帽之分佈
CA3071852A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Amgen Inc. Method of conjugation of cys-mabs
JP2021534151A (ja) * 2018-08-15 2021-12-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company 下流クロマトグラフィーにおける再酸化によるタンパク質断片化制御戦略
CN109369806B (zh) * 2019-01-14 2019-04-19 迈威(上海)生物科技有限公司 苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体的去除方法
EP4255927A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Methods of selectively reducing antibodies
CN116635416A (zh) 2020-12-22 2023-08-22 诺华股份有限公司 用于在细胞培养期间降低分泌的重组表达蛋白质中半胱氨酸残基的氧化水平的方法
CN113189184B (zh) * 2021-04-28 2022-09-09 浙江大学 含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液
WO2023067626A1 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 Dr. Reddy's Laboratories Limited A cell culture process to produce an antibody composition

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4766205A (en) 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
JP2669859B2 (ja) * 1987-08-04 1997-10-29 協和醗酵工業株式会社 タンパク質の再活性化法
JP3610395B2 (ja) * 1991-08-26 2005-01-12 敏一 中村 成熟肝実質細胞増殖因子
CA2438094C (en) 2001-02-23 2011-10-11 Immunex Corporation Increased recovery of active proteins
WO2003048357A1 (fr) * 2001-12-04 2003-06-12 Mitsubishi Pharma Corporation Procede d'activation de proteine
JPWO2004056872A1 (ja) 2002-12-20 2006-04-20 三菱ウェルファーマ株式会社 タンパク質のチオール基を保護する方法
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
US7928205B2 (en) 2004-10-22 2011-04-19 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
EP2360170A3 (en) * 2005-06-17 2012-03-28 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine
GB0513852D0 (en) * 2005-07-06 2005-08-10 Celltech R&D Ltd Biological products
RU2430110C2 (ru) 2006-01-31 2011-09-27 Новартис Аг Антитела - антагонисты интерлейкина-17 (ил-17) для лечения рака
ES2391657T3 (es) 2006-02-07 2012-11-28 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Composiciones estabilizadas de proteínas que tienen un resto tiol libre
KR20190140090A (ko) 2007-07-09 2019-12-18 제넨테크, 인크. 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지
MX2010007767A (es) 2008-01-18 2010-08-09 Medimmune Llc Anticuerpos manipulados con cisteina para conjugacion especifica de sitio.
CN102458479B (zh) * 2009-06-04 2016-07-13 诺华公司 识别IgG结合位点的方法
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
EP4137514A1 (en) 2010-10-08 2023-02-22 Novartis AG Methods of treating psoriasis using il-17 antagonists
AU2014259523B2 (en) * 2010-11-05 2016-02-04 Novartis Ag Methods of treating psoriatic arthritis using IL-17 antagonists
WO2012082573A1 (en) * 2010-12-13 2012-06-21 Novartis Ag Predictive methods and methods of treating arthritis using il-17 antagonists
JP5782279B2 (ja) 2011-01-20 2015-09-24 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス 基板処理方法および基板処理装置
EP2771364B1 (en) 2011-10-27 2019-05-22 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
JP2015504430A (ja) 2011-11-21 2015-02-12 ノバルティス アーゲー Ｉｌ−７アンタゴニスト及びｐｓａ応答又は非応答対立遺伝子を用いた乾癬性関節炎（ｐｓａ）を治療する方法
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
British Association of Dermatologists 2013 168, pp412-421*

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