CN104178515A - 一种化合物的细胞透膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化合物的细胞透膜的方法，包括如下步骤：（1）取原料：化合物以及DNA或RNA；（2）连接：将所述化合物与DNA或RNA连接，得到分子结合体；（3）转运：用基因转运方法，将步骤（2）得到的分子结合体转运至细胞内，即可。本发明还公开了一种用于跨膜转运的分子结合体的结构和合成方法。本发明方法有效地解决了化合物透膜性差的问题，使得化合物进入细胞内对其靶标进行作用，从而提供了一种新型的给药方式。本发明可以用于透膜性差的药物的临床治疗，极大提高潜在药物的数量，使得许多因透膜性差而被淘汰的药物的临床应用成为可能，并且可以用于药物细胞内未知靶标的捕获与靶标机理研究，极大缩短药物研发过程，应用前景良好。

Description

一种化合物的细胞透膜的方法
技术领域
本发明涉及一种化合物的细胞透膜的方法。
背景技术
对于部分细胞内的药物靶标，小分子药物需要穿过细胞膜与相关的靶点相结合从而显示出生物活性。由于细胞膜自身的结构特点，导致分子量大，分子极性大或容易带电荷的小分子难以穿过细胞膜到达生物靶点，也无法产生相关的活性。部分在分子水平的生物测试中显示出良好活性的小分子，却无法在细胞水平显示出生物活性，一个重要的原因就是小分子自身无法通过细胞膜。如何提高小分子的透膜性能是解决此类问题的关键。
现有的提高小分子药物透膜性能的方法是直接对小分子进行修饰，比如做成前药，或者是选择用其他材料作为载体将小分子带入细胞，比如纳米材料，细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）等。但是，对小分子本身的修饰风险较高，可能无法保持小分子本身的活性【Journal of MedicinalChemistry,2002，45,4443-4459】。而传统的载体存在着操作较为复杂，成本高，转运效率对不同药物分子差异大，复合物稳定性差或者转运材料本身具有细胞毒性等不足【Drug Discov Today Technol49-55】。因此，寻找一种操作简便，转运效率高，最大限度保持小分子化合物活性并且安全无毒的小分子化合物透膜方式，对药物早期研究和临床治疗开发都具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种化合物的细胞透膜方法，并且提供了一种如结构式1的跨膜转运的分子结合体及其合成方法。
本发明化合物的细胞透膜方法，包括如下步骤：
（1）取原料：化合物以及DNA或RNA；
（2）连接：将所述化合物与DNA或RNA连接，得到如图1所示的分子结合体；
（3）转运：用基因转运方法，将步骤（2）得到的分子结合体转运至细胞内，即可。
步骤（1）中，所述化合物的分子量为100～4000Da的小分子化合物或多肽。
步骤（1）中，所述DNA或RNA为长度不小于5个碱基或碱基对的任意序列。
在一个具体的实施方式中，和化合物连接的DNA或RNA可以为：5bp的polyA、19bp的的polyA，38bp的polyA、19bp的单链随机序列或19bp的双链随机序列。
步骤（1）中，所述DNA或RNA为单链或者双链。所述DNA或RNA的链端或链中共价键结合零个或多个标记。所述标记为荧光或同位素。
步骤（2）中，化合物与DNA或RNA通过连接臂连接。所述连接臂为任意能够修饰化合物和DNA/RNA的饱和与非饱和的共价基团连接而成。
步骤（3）中，所述基因转运方法是阳离子脂质体转染法、磷酸钙法转染法、纳米颗粒转染法或电穿孔转染法以及其他能够将核酸转运至细胞内的技术手段。
所述“基因转运”是指使用物理、化学或者生物方法将核酸转移到细胞内的过程。
一种分子结合体，其结构式如下：
XlinkerDNA/RNA
式1
其中，X为难以透过细胞膜的化合物，linker为X与DNA或RNA之间的连接臂。
所述化合物的分子量为100～4000Da的小分子或多肽。
所述DNA或RNA为长度不小于5个碱基或碱基对的任意序列。
所述DNA或RNA为单链或者双链。
所述DNA或RNA的链端或链中共价键结合零个或多个标记。
所述标记为荧光或同位素。
所述连接臂为任意能够修饰化合物和DNA/RNA的饱和与非饱和的共价基团连接而成。
在一个具体的实施方式中，本发明制备的分子结合体的结构式可以是如下四种的任意一种：
采用本发明的方法，将透膜性差的化合物与DNA或RNA连接起来，，得到可以跨膜转运的分子结合体，再采用基因转运方法，如，阳离子脂质体转染，磷酸钙法转染，纳米颗粒转染，电穿孔转染以及其他能将核酸物质转入细胞内部的技术手段，将分子结合体转运到细胞内，使得透膜性差的化合物能够在细胞内发挥作用，为透膜性差的药物在临床上的使用提供了可能性，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明用于跨膜转运的分子结合体的结构图
图2-1分子结合体1的范例合成路线
图2-2分子结合体2的范例合成路线
图2-3分子结合体3的范例合成路线
图2-4分子结合体4的范例合成路线
图3-1化合物1-3的1H NMR谱图
图3-2化合物1-5的1H NMR谱图
图4-1分子结合体1的HPLC纯度分析
图4-2分子结合体1的质谱分析
图5不同长度及单双链DNA或RNA，不同化合物及不同连接臂的分子结合体的穿膜实验的激光共聚焦显微定位（蓝色为细胞核，绿色为FITC标记的单双链DNA或RNA）
图6A）4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯(化合物1-1)单独用FITC标记的穿膜实验的激光共聚焦显微定位；B）分子结合体1穿膜实验的激光共聚焦显微定位（蓝色为细胞核，绿色为FITC标记的分子结合体1）
图7A)相差显微镜下观察参与转运实验的细胞总数；B)荧光显微镜下观察成功转运分子结合体1的细胞总数；C)分子结合体1的转运效率统计
图8具有PTP1B抑制剂作用的化合物以分子结合体形式转运入细胞内对细胞磷酸化水平的影响。图中，1：X-tremeGENEsiRNA试剂，2：分子结合体1（5nM），3：分子结合体1加X-tremeGENEsiRNA试剂（5nM），4：分子结合体1加X-tremeGENEsiRNA试剂（15nM）
具体实施方式
实施例1使用本发明方法制备用于跨膜转运的分子结合体
1、实验材料和试剂
分子结合体1根据参考文献的方法（D.P.Wilson et al,J.Med.Chem.2007,50,4681-4698）在本公司合成；5’-氨基、3’-荧光素修饰的多聚腺苷酸（5’-(CH2)12-A19-3’-FITC），购自英潍捷基（上海）贸易有限公司（InvitrogenTrading Shanghai Co.,Ltd）；其余化学合成使用的试剂分别从Aldrich或TCI购买而得。
2、合成方法
（1）分子结合体1的合成路线（如图2-1）。
合成化合物1-2：4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯
将4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯（化合物1-1）(250mg,0.4mmol)、溴丙炔(70mg,0.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.5mL)溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺，并在90℃下搅拌5小时，冷却到室温减压蒸馏得粗产品，通过柱层析分离得到4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯（化合物1-2）(白色固体，130mg,49%收率)。MS m/z(ESI):668,670(M+H)+；690,692(M+Na)+。
合成化合物1-3：4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸
将氢氧化锂(200mg,2.38mmol)加入到4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯（化合物1-2）(100mg,0.15mmol)的5mL四氢呋喃和5mL水溶液中，室温搅拌过夜。将反应液中加入2N盐酸并酸化至pH2，浓缩得到粗品。粗品经HPLC制备后得到4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸（化合物1-3）(白色固体，40mg,42%收率)。MS m/z(ESI):626,628(M+H)+;1H NMR(CDCl3):δ8.45(s,1H),7.43(m,2H),7.33(t,J=7.6Hz,1H),7.21(m,2H),7.03(s,1H),6.92(m,3H),4.88(s,2H),4.15(m,4H),3.28(m,2H),3.20(m,1H),2.70(m,2H),1.82(m,1H),1.73(m,2H),1.24(m,3H).（1H NMR见图3-1）
合成化合物1-5：4-叠氮基苯甲酸琥珀酰亚胺酯
在冰浴下，将1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI,570mg,3.7mmol)加入到含有4-叠氮苯甲酸（化合物1-4）(500mg,3.06mmol)的10mLN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入N-羟基琥珀酸亚胺(440mg,3.7mmol)。反应在避光和氮气保护下反应1个小时，然后升温到室温避光搅拌过夜。减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，然后残余物溶于乙酸乙酯中，并用水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，得到粗品。经柱层析后得到产物4-叠氮基苯甲酸琥珀酰亚胺酯（化合物1-5）(白色固体，780mg,97.5%收率)。1HNMR(DMSO-d6):δ8.11(d,J=8.4Hz,2H),7.37(d,J=8.4Hz,2H),7.37(s,4H)。（1H NMR见图3-2）
合成化合物1-6：4-叠氮基苯甲酰胺12-烷基19聚腺苷酸荧光素
将5’-氨基、3’-荧光素修饰的多聚腺苷酸（5’-(CH2)12-A19-3’-FITC）(50nmol)和4-叠氮基苯甲酸琥珀酰亚胺酯（化合物1-5）（5μmol，100eq.）的500μL0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(pH9)和500μL二甲亚砜混合溶液室温低速震摇过夜。然后，反应体系直接用反向HPLC色谱柱进行分离、冻干得到4-叠氮基苯甲酰胺12-烷基19聚腺苷酸荧光素（化合物1-6）（淡黄色固体，大于90%收率）。
合成分子结合体1：4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-(4-（荧光素19聚腺苷酸）12-烷基异酰胺苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-亚甲基)((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)氨基)苯基)噻吩-2-甲酸
将30μL的溶液A(硫酸铜和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺摩尔比为1:2溶于体积比为4:3:1的水/二甲亚砜/叔丁醇的溶液中，浓度为10mM)加入到溶液B（4-叠氮基苯甲酰胺12-烷基19聚腺苷酸荧光素（化合物1-6）(15nmol)的200μL水溶液和4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸（化合物1-3）(960nmol)的50μLDMSO溶液），涡旋离心后，将60μL新鲜配制的抗坏血酸钠(600nmol)水溶液加入到上述反应体系中，室温下低速震荡过夜。然后，反应液直接用反向HPLC色谱柱进行分离纯化得到产物4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-(4-（荧光素19聚腺苷酸）12-烷基异酰胺苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-亚甲基)((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)氨基)苯基)噻吩-2-甲酸（分子结合体1）（淡黄色固体，约80%收率）。（分子结合体1的HPLC纯度分析如图4-1，分子结合体1的质谱分析如图4-2）
（2）分子结合体2的合成路线（如图2-2）。
合成化合物2-2：14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂正十四烷基-1-羧酸叔丁酯：
将叔丁醇钾(336mg,3mmol)加入到15mL（化合物2-1）(372mg,2mmol)的叔丁醇溶液中，30度搅拌15分钟。然后将溴乙酸叔丁酯（780mg，4mmol）加入到以上体系中，30度搅拌过夜。减压蒸馏得到粗产品。溶于30mL的二氯甲烷，依次用水洗3次、饱和食盐水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，得到化合物2-2(无色油状液体，466mg,70%收率)。MS m/z(ESI):250(M-tBu-N2+H)+；278(M-tBu+H)+
合成化合物2-3：14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂正十四烷基-1-羧酸
将三氟乙酸（1mL）加入到化合物2-2（466mg,1.4mmol）的5mL二氯甲烷溶液中，室温搅拌2小时。浓缩得到粗品化合物2-3(无色油状，370mg,95%收率)MS m/z(ESI):250(M-N2+H)+；278(M+H)+。
合成化合物2-4：14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂正十四烷基-1-甲酰基-正十二烷基19聚腺苷酸荧光素
将5’-氨基、3’-荧光素修饰的多聚腺苷酸（5’-(CH2)12-A19-3’-FITC）(80nmol)、化合物2-3（1.6μmol，200eq.）、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM,1.6μmol，200eq.)的80μL0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(pH9)、160μL去离子水和160μL二甲亚砜混合溶液室温低速震摇过夜。然后，反应体系直接用反向HPLC色谱柱进行分离、冻干得到化合物2-4（白色固体）。MS m/z(TOF)：6896
合成分子结合体2：
将60μL的溶液A(硫酸铜和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺摩尔比为1:2溶于体积比为4:3:1的水/二甲亚砜/叔丁醇的溶液中，浓度为10mM)加入到溶液B（化合物2-4(50nmol)的400μL水溶液和4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸（化合物1-3）(3umol)的100μLDMSO溶液），涡旋离心后，将120μL新鲜配制的抗坏血酸钠(1200nmol)水溶液加入到上述反应体系中，室温下低速震荡过夜。然后，反应液直接用反向HPLC色谱柱进行分离纯化得到分子结合体2（淡黄色固体）。MS m/z(TOF)：7521
（3）分子结合体3的合成路线（如图2-3）。
合成化合物3-2：
将5’-氨基、3’-荧光素修饰的多聚腺苷酸（5’-(CH2)12-A19-3’-FITC）(80nmol)、叠氮乙酸（化合物3-1）（1.6μmol，200eq.）、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM,1.6μmol，200eq.)的80μL0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(pH9)、160μL去离子水和160μL二甲亚砜混合溶液室温低速震摇过夜。然后，反应体系直接用反向HPLC色谱柱进行分离、冻干得到化合物（化合物3-2）（白色固体）。MS m/z(TOF)：6720
合成分子结合体3：
将60μL的溶液A(硫酸铜和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺摩尔比为1:2溶于体积比为4:3:1的水/二甲亚砜/叔丁醇的溶液中，浓度为10mM)加入到溶液B（化合物3-2(50nmol)的400μL水溶液和4-溴-3-氧代乙酸-5-(3-(((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)-N-炔丙氨基)苯基)噻吩-2-甲酸（化合物1-3）(3umol)的100μLDMSO溶液），涡旋离心后，将120μL新鲜配制的抗坏血酸钠(1200nmol)水溶液加入到上述反应体系中，室温下低速震荡过夜。然后，反应液直接用反向HPLC色谱柱进行分离纯化得到产物分子结合体3（淡黄色固体）。MS m/z(TOF)：7345。
（4）分子结合体4的合成路线（如图2-4）。
合成化合物4-2：
将化合物4-1(441mg,1mmol)、溴丙炔(95mg,0.8mmol)、碳酸钾（138mg，1mmol）溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌过夜。减压蒸馏得到粗产品。溶于50mL的二氯甲烷，依次用水洗3次、饱和食盐水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，得到化合物4-2(黄色固体，287mg,60%收率)。MS m/z(ESI):424(M-tBu+H)+；480(M+H)+。
合成化合物4-3：
将化合物4-2(87mg,0.6mmol)、氢氧化锂一水化合物(126mg,3mmol)溶于5mL的甲醇和5mL的水中，回流搅拌过夜。蒸馏除去乙醇。用20mL的水稀释，1N HCl酸化到pH2.0左右，冻干得到粗产品，直接用反相高相液相分离得到化合物4-3(黄色固体，216mg,80%收率)。MS m/z(ESI):410(M+H)+。
合成分子结合体4：
将60μL的溶液A(硫酸铜和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺摩尔比为1:2溶于体积比为4:3:1的水/二甲亚砜/叔丁醇的溶液中，浓度为10mM)加入到溶液B（化合物4-4(50nmol)的400μL水溶液和化合物4-3(3umol)的100μLDMSO溶液），涡旋离心后，将120μL新鲜配制的抗坏血酸钠(1200nmol)水溶液加入到上述反应体系中，室温下低速震荡过夜。然后，反应液直接用反向HPLC色谱柱进行分离纯化得到分子结合体4（淡黄色固体）。MS m/z(TOF)：7191
实施例2单链或双链DNA或RNA的跨膜转运效率评价
1、实验材料和试剂
HepG2细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；RPMI-1640培养基购自上海前尘生物科技有限公司（Hyclone Shanghai）；胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司；胰蛋白酶和Opti-MEM购自上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen Shanghai）；X-tremeGENEsiRNA转染试剂购自罗氏中国公司（Roche）；其余细胞培养皿等耗材均购自康宁中国公司（Corning China）；
5bp的polyA：5'-NH2-(CH2)12-PO4-A5-3'–FITC，
19bp的的polyA：5'-NH2-(CH2)12-PO4-A19-3'–FITC，
38bp的polyA：5'-NH2-(CH2)12-PO4-A38-3'–FITC，
19bp的单链随机序列：5'-NH2-(CH2)12-PO4–TGGGCTGGCCAAACTGCTG-3'–FITC,
19bp的双链随机序列：
均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
2、不同序列单双链DNA/RNA转运前的细胞准备
转运前24h，用胰蛋白酶消化对数期生长期的HepG2细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为0.5×106细胞/mL，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃，5%CO2培养箱培养。24h待细胞密度达到60%-70%时即可用于实验。
3、单链或双链DNA/RNA的转运
取15mL无菌离心管（管A），分别加入4nmol合成的不同序列单双链DNA/RNA片断，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2mL；将X-tremeGENEsiRNA试剂轻轻摇匀，取160μL X-tremeGENEsiRNA试剂与另一管（管B）中1.84mL Opti-MEM混合；将A管和B管混合，用枪头轻轻吹打，室温孵育20min。
加入6mL无血清RPMI-1640培养基至混合物，混合均匀；弃掉HepG2细胞培养皿中旧的培养基，并用无血清RPMI-1640培养基轻轻吹打一次，然后将上述混合物转移至HepG2-PT细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱培养。6h后，激光共聚焦显微镜观察DNA/RNA在细胞内的定位情况。
4、实验结果
结果如图5所示，5bp的polyA、19bp的的polyA，38bp的polyA、19bp的单链随机序列或19bp的双链随机序列片断都可被X-tremesiRNA转运进细胞内，大部分在细胞浆内，少数进入细胞核。
实施例3分子结合体的跨膜转运效率评价
1、材料和试剂
HepG2细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；RPMI-1640培养基购自上海前尘生物科技有限公司（Hyclone Shanghai）；胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司；胰蛋白酶和Opti-MEM购自上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen Shanghai）；X-tremeGENEsiRNA转染试剂购自罗氏中国公司（Roche）；其余细胞培养皿等耗材均购自康宁中国公司（Corning China）。
2、分子结合体转运前的细胞准备
转运前24h，用胰蛋白酶消化对数期生长期的HepG2细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为0.5×106细胞/mL，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃，5%CO2培养箱培养。24h待细胞密度达到60%-70%时即可用于实验。
3、分子结合体的转运
取五支15mL无菌离心管（标记为管A1、A2、A3、A4和A5），分别加入4nmol的分子结合体1、2、3、4（按照实施例1的合成路线制备得到）和单独的用FITC直接标记的4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2mL。
另取五支15mL无菌离心管（标记为管B1、B2、B3、B4、B5），每支中装有1.84mL Opti-MEM；将X-tremeGENEsiRNA试剂轻轻摇匀，在B1、B2、B3、B4、B5分别加入160μL并混合均匀。与每管；
将对应的数字的A管和B管混合，如A1和B1，用枪头轻轻吹打，室温孵育20min。
每管加入6mL无血清RPMI-1640培养基至混合物，混合均匀；弃掉HepG2细胞培养皿中旧的培养基，并用无血清RPMI-1640培养基轻轻吹打一次，然后将上述混合物转移至HepG2-PT细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱培养。6h后，激光共聚焦显微镜观察分子结合体1、2、3、4和单独的化合物在细胞内的定位情况。
4、实验结果
（1）如图5和图6B所示，分子结合体1、2、3、4都能够成功透过细胞膜转运到细胞内。
（2）如图6A所示，用FITC直接标记的4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯不能透过细胞膜进入细胞内；如图6B所示，在单独的化合物的基础上连接了DNA/RNA的分子结合体1可被转运进细胞内，大部分在细胞浆内，少数进入细胞核。
（3）根据显微镜下观察统计得到转运效率：图7A为相差显微镜下观察到的参与转运实验的细胞总数，图7B为荧光显微镜下观察到的成功转运分子结合体1的细胞总数，如图7C所示，统计结果并计算可知分子结合体1的转运效率可达到80%以上。
实施例4分子结合体对化合物的透膜转运的影响研究
1、实验材料和试剂
HepG2细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；RPMI-1640培养基购自Hyclone；胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司；胰蛋白酶购自Invitrogen；细胞裂解液和蛋白酶抑制剂购自Pierce；P-IRS-1ELSA试剂盒购自bio-swamp，其余细胞培养皿等耗材均购自Corning。
2、分子结合体对化合物透膜转运的影响研究
蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）属于蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族,以跨膜受体样蛋白和胞内酶2种形式存在，催化蛋白质的磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应，是哺乳动物体内最早被鉴定、纯化的PTPs。PTP1B作用于胰岛素受体(IR)，胰岛素受体底物1、2(IRS-1，IRS-2)，生长因子受体结合蛋白2(Grb2)，磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)等与胰岛素信号转导相关的蛋白，使它们的磷酸化酪氨酸残基脱磷酸，衰减胰岛素信号转导，从而产生受体后的胰岛素抵抗。已知原料化合物4-溴-3-氧代乙酸叔丁酯-5-(3-((1-苯基氨甲酰基哌啶)-4-甲基)苯基)噻吩-2-甲酸甲酯有PTP1B抑制剂的作用（J.Med.Chem.2007,50,4681-4698），所以，本发明通过测定分子结合体1转运入细胞内IRS-1磷酸化水平的变化来确定化合物在与DNA/RNA的共价连接后，确实以分子结合体的形式进入了细胞内，并可以有效地对胰岛素信号通路功能产生影响。验证方法如下：
（1）转运前24h，用胰蛋白酶消化对数期生长期的HepG2细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为0.5×106细胞/mL，重新接种于6孔板中，37℃，5%CO2培养箱培养24h后待细胞密度达到60%-70%时即可用于实验。
（2）取2支1.5mL无菌离心管（管C1、C2），分别加入0.025μg和0.075μg分子结合体1，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为100μL；将X-tremeGENEsiRNA试剂轻轻摇匀，取2.5μL X-tremeGENEsiRNA试剂与另2管（管D1、D2）中97.5μL Opti-MEM混合,调整总体积为100μL；将对应的C管和D管混合，如C1和D1，用枪头轻轻吹打，室温孵育20min。如以上类似操作，用不加化合物、不加X-tremeGENEsiRNA和两种都不加的分别作为两个对照和一个空白。
（3）分别加入800μL无血清RPMI-1640培养基至混合物，混合均匀；弃掉HepG2细胞培养皿中旧的培养基，并用无血清RPMI-1640培养基轻轻清洗一次，然后将步骤（2）得到的混合液转移至HepG2细胞培养皿中，并设不加X-tremeGENEsiRNA转染试剂和分子结合体1的为空白对照，于37℃，5%CO2培养箱孵育5小时。加入1μg/mL胰岛素和5mM葡萄糖诱导30分钟。
（4）细胞用冰PBS清洗三次后，每孔加入50μL细胞裂解液冰上裂解1小时，离心取上清，用BCA试剂盒做蛋白定量。将等量的总蛋白加入EＬＩＳＡ板中，用ELISA试剂盒测定ＩＲＳ-1的磷酸化水平。每次实验设定4个平行孔，数据来自3次独立的实验。
3、实验结果：
如图8所示，不同浓度的分子结合体转运进HepG2细胞后，与未加入分子结合体的空白对照相比，细胞内IRS-1的磷酸化水平升高，并与化合物的浓度成正相应，这就表明，化合物在与DNA/RNA的共价连接后，确实和DNA/RNA一起进入了细胞内，并且能够以分子结合体的形式发挥原有的作用。
综上所述，本发明的细胞透膜方法可以有效的将透膜性差的化合物转运到细胞内部，操作简便，转运效率高，最大限度保持小分子化合物活性并且安全无毒。为透膜性差的药物的临床治疗提供了新途径，应用本发明技术可以极大提高潜在药物的数量，使得许多因透膜性差而被淘汰的药物的临床应用成为可能，并且可以用于药物细胞内未知靶标的捕获与靶标机理研究，极大缩短药物研发过程，应用前景良好。

Claims (16)

1.一种化合物的细胞透膜方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取原料：化合物以及DNA或RNA；
（2）连接：将所述化合物与DNA或RNA连接，得到分子结合体；
（3）转运：用基因转运方法，将步骤（2）得到的分子结合体转运至细胞内，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述化合物的分子量为100～4000Da的小分子化合物或多肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述DNA或RNA为长度不小于5个碱基或碱基对的任意序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述DNA或RNA为单链或者双链。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA或RNA的链端或链中共价键结合零个或多个标记。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述标记为荧光或同位素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，化合物与DNA或RNA通过连接臂连接。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述连接臂为任意能够修饰化合物和DNA/RNA的饱和与非饱和的共价基团连接而成。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述基因转运方法是阳离子脂质体转染法、磷酸钙法转染法、纳米颗粒转染法或电穿孔转染法以及其他能够将核酸转运至细胞内的技术手段。
10.一种分子结合体，其特征在于：其结构式如下：
XlinkerDNA/RNA
式1
其中，X为难以透过细胞膜的化合物，linker为X与DNA或RNA之间的连接臂。
11.根据权利要求10所述的分子结合体，其特征在于：所述化合物的分子量为100～4000Da的小分子化合物或多肽。
12.根据权利要求10所述的分子结合体，其特征在于：所述DNA或RNA为长度不小于5个碱基或碱基对的任意序列。
13.根据权利要求10所述的分子结合体，其特征在于：所述DNA或RNA为单链或者双链。
14.根据权利要求13所述的分子结合体，其特征在于：所述DNA或RNA的链端或链中共价键结合零个或多个标记。
15.根据权利要求14所述的分子结合体，其特征在于：所述标记为荧光或同位素。
16.根据权利要求10所述的分子结合体，其特征在于：所述连接臂为任意能够修饰化合物和DNA/RNA的饱和与非饱和的共价基团连接而成。
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