JP2016522827A

JP2016522827A - 化合物の細胞膜透過の方法

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Publication number: JP2016522827A
Application number: JP2016514262A
Authority: JP
Inventors: 李進; 楊本艶姿; ▲とう▼登峰; 葛嘯虎; 宋宏梅; 万金橋; 張艶; 胡曉; 王星; 馮静超; 鐘国慶
Original assignee: HITGEN INC.
Current assignee: HITGEN INC.
Priority date: 2013-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2016-08-04
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: US20160153002A1; CN104178515B; CN104178515A; JP6276390B2; WO2014187313A1

Abstract

【課題】化合物の細胞膜透過の方法を提供し、（１）化合物及びＤＮＡ又はＲＮＡを取得するステップと、（２）前記化合物とＤＮＡ又はＲＮＡとを接続し、分子結合体が得られるステップと、（３）遺伝子トランスファー方法によって、ステップ（２）で得られた分子結合体を細胞にトランスファーさせるステップと、を含む。膜貫通トランスファーのための分子結合体及びその合成方法をさらに提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、化合物の細胞膜透過の方法に関する。

一部の細胞内の薬物標的に対して、小分子薬物は細胞膜を通過して関った標的と結合することで生物活性が示される。細胞膜自体の構造特性なので、分子量が大きく、分子極性が大きく、或いは荷電しやすい小分子は細胞膜を通過して生物標的に達することが困難になり、関する活性を発生することもできないことを引き起こす。部分の分子レベルの生物試験において良好な活性を示す小分子は、細胞レベルで生物活性を示すことができず、１つの重要な原因は小分子自体が細胞膜を通過することができないからである。どのように小分子の膜透過性能を向上させるのはこの問題のキーである。

既存の小分子薬物の膜透過性能を向上させる方法は、直接的に小分子を修飾し、例えば、プロドラッグを作成し、或いはそのほかの材料、例えば、ナノ材料、細胞膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰｓ）などを選択して担体として小分子を細胞に導入する。しかし、小分子自体に対する修飾リスクは比較的高く、小分子自体の活性を保持することができない可能性がある「ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４５，４４４３−４４５９」。伝統の担体は操作が比較的複雑であり、コストが高く、異なる薬物分子に対するトランスファー効率の差異が大きく、複合物の安定性が悪く、或いはトランスファー材料自体が細胞毒性を有するなどの不足を有する「ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＴｏｄａｙＴｅｃｈｎｏｌ４９−５５」。そのため、操作が簡単であり、トランスファー効率が高く、小分子化合物の活性を最大限に保持し、かつ安全無毒である小分子化合物の膜透過方式を求めることは、薬物の早期研究及び臨床治療開発に対して重要な意義を有する。

上記問題を解決するために、本発明は、化合物の細胞膜透過の方法を提供し、かつ分子式１に示すような膜貫通トランスファーの分子結合体及びその合成方法を提供する。

本発明の化合物の細胞膜透過の方法は、
（１）化合物及びＤＮＡ又はＲＮＡという原料を取得するステップと、
（２）前記化合物とＤＮＡ又はＲＮＡとを接続し、図１に示すような分子結合体が得られるステップと、
（３）遺伝子トランスファー方法によって、ステップ（２）で得られた分子結合体が細胞にトランスファーさればよいステップと、を含む。

ステップ（１）において、前記化合物は分子量１００〜４０００Ｄａの小分子化合物又はポリペプチドである。

ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは長さが５個の塩基又は塩基対以上の任意の配列である。

１つの具体的な実施形態において、化合物に接続するＤＮＡ又はＲＮＡは、５ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐのｐｏｌｙＡ、３８ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐの一本鎖ランダム配列又は１９ｂｐの二本鎖ランダム配列であっでもよい。

ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。前記ＤＮＡ又はＲＮＡの鎖端又は鎖中にゼロ個又は複数の標識が共有結合される。前記標識は蛍光又は同位体である。

ステップ（２）において、化合物とＤＮＡ又はＲＮＡとは接続アームによって接続される。前記接続アームはいずれの化合物及びＤＮＡ／ＲＮＡを修飾することができる飽和及び不飽和の共有結合基が接続してなる。

ステップ（３）において、前記遺伝子トランスファー方法は陽イオン性リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション又は電気穿孔トランスフェクション及びその他の核酸を細胞にトランスファーすること可能な技術手段である。

前記「遺伝子トランスファー」とは、物理、化学又は生物方法を使用して核酸を細胞に転移する過程を意味する。

分子結合体であって、その分子式は以下の通りである。

ただし、Ｘは細胞膜を通過することが困難である化合物を示し、ｌｉｎｋｅｒはＸとＤＮＡ又はＲＮＡとの間の接続アームを示す。

前記化合物は分子量１００〜４０００Ｄａの小分子又はポリペプチドでる。

前記ＤＮＡ又はＲＮＡは長さが５個の塩基又は塩基対以上の任意の配列である。

前記ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。

前記ＤＮＡ又はＲＮＡは鎖端又は鎖中にゼロ個又は複数の標識が共有結合される。

前記標識は蛍光又は同位体である。

前記接続アームはいずれの化合物及びＤＮＡ／ＲＮＡを修飾することができる飽和及び不飽和の共有結合基が接続してなる。

１つの具体的な実施形態において、本発明は調製した分子結合体の分子式は以下の４種のいずれの一種であっでもよい。

本発明の方法を採用し、膜透過性が悪い化合物とＤＮＡ又はＲＮＡとを接続し、膜貫通トランスファー可能な分子結合体が得られ、遺伝子トランスファー方法、例えば、陽イオン性リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション又は電気穿孔トランスフェクション及びそのほかの核酸物質を細胞内部にトランスファーすること可能な技術手段をさらに採用し、分子結合体を細胞にトランスファーさせ、膜透過性が悪い化合物は細胞内に作用を発揮することができ、膜透過性が悪い薬物の臨床的使用に対して可能性を提供し、応用への見通しがよい。

明らかに、本発明の上記内容に基づいて、本分野の通常の技術知識及び慣用手段に従って、本発明の上記基本技術思想を逸脱しない前提で、そのほかの複数種の改正、置換、又は変更を行うことができる。

以下、実施例形式の具体的な実施形態によって、本発明の上記内容をさらに詳しく説明する。本発明の上記保護範囲は以下の実施例に限定されることがしない。本発明の上記内容に基づいて実現した技術はいずれも本発明の範囲に属する。

図１は本発明に係る膜貫通トランスファーのための分子結合体の構成図である。図２−１は分子結合体１の例示的な合成経路である。図２−２は分子結合体２の例示的な合成経路である。図２−３は分子結合体３の例示的な合成経路である。図２−４は分子結合体４の例示的な合成経路である。図３−１は化合物１−３の^１ＨＮＭＲスペクトルである。図３−２は化合物１−５の^１ＨＮＭＲスペクトルである。図４−１は分子結合体１のＨＰＬＣ純度分析である。図４−２は分子結合体１の質量スペクトル分析である。図５は異なる長さ及び一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、異なる化合物及び異なる接続アームの分子結合体の膜透過実験のレーザー共焦点顕微位置決めである（青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の一本又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを示す。）図６ Α）４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（化合物１−１）はＦＩＴＣ標識を単独に使用した膜透過実験のレーザー共焦点顕微位置決めである。Ｂ）分子結合体１の膜透過実験のレーザー共焦点顕微位置決めである（青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の分子結合体１を示す）図７Ａ）は位相差顕微鏡にて観察したトランスファー実験に関わる細胞総数である。Ｂ）は蛍光顕微鏡にて観察した分子結合体１に成功にトランスファーした細胞総数である。Ｃ）は分子結合体１のトランスファー効率統計である。図８はＰＴＰ１Ｂ抑制剤作用を有する化合物が分子結合体形式で細胞にトランスファーすることの細胞リン酸化レベルに対する影響である。

実施例１本発明の方法を使用して膜貫通トランスファーのための分子結合体を調製する。

１、実験材料及び試薬
分子結合体１は参考文献の方法（Ｄ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，４６８１−４６９８）に従って本会社で合成する。５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ_２）_１２−Ａ_１９−３'−ＦＩＴＣ）は、英い捷基（上海）貿易有限会社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴｒａｄｉｎｇＳｈａｎｇｈａｉＣｏ．，Ｌｔｄ）から購入し、そのほかの化学合成に使用した試薬はそれぞれＡｌｄｒｉｃｈ又はＴＣＩから購入する。

２、合成方法
（１）分子結合体１の合成経路（図２−１に示す）。
合成化合物１−２：４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル

４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（化合物１−１）（２５０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）、臭化プロパルギル（７０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）及びΝ，Ν−ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍＬ）を２０ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、かつ９０°Ｃにて５時間攪拌し、室温まで冷却して減圧し蒸留して粗生成物が得られ、カラムクロマトグラフィーによって４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（化合物１−２）（白色固体，１３０ｍｇ，４９％収率）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＥＳＩ）:６６８，６７０（Ｍ＋Ｈ）^＋;６９０，６９２（Ｍ＋Ｎａ）^＋。

合成化合物１−３：４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸

水酸化リチウム（２００ｍｇ，２．３８ｍｍｏｌ）を４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（化合物１−２）（１００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の５ｍＬテトラヒドロフランと５ｍＬ水溶液に加入し、室温にて終夜攪拌する。反応液に２Ｎ塩酸を加入してｐＨ２まで酸性化し、濃縮して粗生成物が得られる。粗生成物はＨＰＬＣで調製した後に４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ｎ−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（化合物１−３）（白色固体，４０ｍｇ，４２％収率）得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＥＳＩ）:６２６，６２８（Ｍ＋Ｈ）^＋;^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）:δ８．４５（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ηｚ，１Η），７．２１（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｍ，３Ｈ），４．８８（ｓ，２Ｈ），４．１５（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，１Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｍ，３Ｈ）．（^１ＨＮＭＲ図３−１参照）

合成化合物１−５: ４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル
氷浴にて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ，５７０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）を４−アジド安息香酸（化合物１−４）（５００ｍｇ，３．０６ｍｍｏｌ）を含有する１０ｍＬ Ν，Ν−ジメチルホルムアミドに加入し、その後にΝ−ヒドロキシこはく酸イミド（４４０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）を加入する。反応は遮光及び窒素雰囲気で１時間反応し、その後に室温まで加温し、遮光して終夜攪拌する。減圧し蒸留してΝ，Ν−ジメチルホルムアミドを除去し、その後に残部を酢酸エチルに溶解し、かつ３回水洗し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、粗生成物が得られる。カラムクロマトグラフィーによって生成物４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル（化合物１−５）（白色固体，７８０ｍｇ，９７．５％収率）。^１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）:δ８．１１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｓ，４Ｈ）が得れる。（^１ＨＮＭＲ３−２参照）

合成化合物１−６: ４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ_２）_１２−Ａ_１９−３'−ＦＩＴＣ）（５０ｎｍｏｌ）及び４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル（化合物１−５）（５μｍｏｌ、１００ｅｑ．）の５００μＬ０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）と５００μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離され、凍結乾燥されて４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン（化合物１−６）（淡黄色固体、９０％収率より大きい）が得られる。

合成分子結合体１: ４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−（４−（フルオレセイン１９ポリアデニル酸）１２−アルキルイソアミドフェニル）−１Η−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）アミノ）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸
３μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル] アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に加入し、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン（化合物１−６）（１５ｎｍｏｌ）の２００μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ν−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（化合物１−３）（９６０ｎｍｏｌ）の５０μＬＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、６０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（６００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離して純化して生成物４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−（４−（フルオレセイン１９ポリアデニル酸）１２−アルキルイソアミドフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）（（１−フェニルカルバモイルピペリジル）−４−メチル）アミノ）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（分子結合体１）（淡黄色固体、約８０％収率）が得られる。（分子結合体１のＨＰＬＣ純度分析は図４−１に示し、分子結合体１の質量スペクトル分析は図４−２に示す）

（２）分子結合体２の合成経路（図２−２に示す）。
合成化合物２−２：１４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサN−テトラデシル−１−カルボキシレートｔｅｒｔ−ブタノール：
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３３６ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を１５ｍＬ（化合物２−１）（３７２ｍｇ，２ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液に加入し、３０度にて１５分間攪拌する。その後にｔ−ブチルブロモ酢酸（７８０ｍｇ，４ｍｍｏｌ）を以上の体系に加入し、３０度にて終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。３０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、順次に３回水洗し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物２−２（無色油状液体，４６６ｍｇ，７０％収率）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＥＳＩ）:２５０（Ｍ−ｔＢｕ−Ｎ_２＋Ｈ）^＋;２７８（Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ）^＋

化合物２−３の合成：１４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサN−テトラデシル−１−カルボン酸
トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を化合物２−２（４６６ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）の５ｍＬジクロロメタン溶液に加入し、室温にて２時間攪拌する。濃縮して粗生成物である化合物２−３（無色油状，３７０ｍｇ，９５％収率）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＥＳＩ）:２５０（Ｍ−Ｎ_２＋Ｈ）^＋;２７８（Ｍ＋Ｈ）^＋。

合成化合物２−４：１４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサＮ−テトラデシル−１−ホルミル基−ｎ−ドデシル１９ポリアデニル化フルオレセイン
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ_２）_１２−Ａ_１９−３'−ＦＩＴＣ）（８０ｎｍｏｌ）、化合物２−３（１．６μｍｏｌ、２００ｅｑ．）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴ−ＭＭ，１．６μｍｏｌ、２００ｅｑ．）の８０μＬ０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐΗ９）、１６０μ脱イオン水及び１６０μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離され、凍結乾燥されて化合物２−４（白色固体）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＴＯＦ）:６８９６。

分子結合体２の合成:
６μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル] アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（化合物２−４（５０ｎｍｏｌ）の４００μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ν−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（化合物１−３）（３μｍｏｌ）の１００μＬＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（１２００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離し純化して分子結合体２（淡黄色固体）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＴＯＦ）:７５２１

（３）分子結合体３の合成経路（図２−３に示す）。
化合物３−２の合成：
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−（ＣＨ_２）_１２−Ａ_１９−３'−ＦＩＴＣ）（８０ｎｍｏｌ）、アジド酢酸（化合物３−１）（１．６μｍｏｌ，２００ｅｑ．）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴ−ＭＭ，１．６μｍｏｌ，２００ｅｑ．）の８０μＬ０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）、１６０μＬ脱イオン水及び１６０μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離され、凍結乾燥して化合物（化合物３−２）（白色固体）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＴＯＦ）:６７２０

分子結合体３の合成:
６μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル] アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（化合物３−２（５０ｎｍｏｌ）の４００μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−（３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）−Ν−プロパルギルアミン）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸（化合物１−３）（３ｕｍｏｌ）の１００μＬＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（１２００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離して純化して生成物である分子結合体３（淡黄色固体）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＴＯＦ）:７３４５。

（４）分子結合体４の合成経路（図２−４に示す）。
化合物４−２の合成：
化合物４−１（４４１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、臭化プロパルギル（９５ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１３８ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、室温にて終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、順次に３回水洗し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物４−２（黄色固体，２８７ｍｇ，６０％収率）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＥＳＩ）:４２４（Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ）^＋;４８０（Ｍ＋Ｈ）^＋。

化合物４−３の合成:
化合物４−２（８７ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）、水酸化リチウム一水化合物（１２６ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を５ｍＬのメタノールと５ｍＬの水に溶解し、回流して終夜攪拌する。蒸留してアルコールを除去する。２０ｍＬの水で希釈され、１ＮＨＣｌでｐＨ２．０程度酸性化され、凍結乾燥されて粗生成物が得られ、直接的に逆相高速液体分離によって化合物４−３（黄色固体，２１６ｍｇ，８０％収率）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＥＳＩ）:４１０（Ｍ＋Ｈ）^＋。

分子結合体４の合成:
６μＬの溶液Ａ（硫酸銅とトリス[（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル] アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである）を溶液Ｂ（化合物４−４（５０ｎｍｏｌ）の４００μＬ水溶液と化合物４−３（３ｕｍｏｌ）の１０μＬＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム（１２００ｎｍｏｌ）水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムによって分離して純化して分子結合体４（淡黄色固体）が得られる。ＭＳｍ／ｚ（ＴＯＦ）:７１９１

実施例２一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの膜貫通トランスファーの効率評価

１、実験材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地は上海前塵生物科技有限会社（ＨｙｃｌｏｎｅＳｈａｎｇｈａｉ）から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとＯｐｔｉ−ＭＥＭとは上海英駿生物技術有限会社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳｈａｎｇｈａｉ）から購入し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は羅氏中国会社（Ｒｏｃｈｅ）から購入し、残した細胞培養ディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社（ＣｏｍｉｎｇＣｈｉｎａ）から購入する。
５ｂｐのｐｏｌｙＡ：５'−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_１２−ＰＯ_４−Ａ_５−３'−ＦＩＴＣ、
１９ｂｐのｐｏｌｙＡ：５'−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_１２−ＰＯ_４−Ａ_１９−３'−ＦＩＴＣ、
３８ｂｐのｐｏｌｙＡ:５'−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_１２−ＰＯ_４−Ａ_３８−３'−ＦＩＴＣ、
１９ｂｐの一本鎖ランダム配列：５'−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_１２−ＰＯ_４−ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧ−３'−ＦＩＴＣ、
１９ｂｐの二本鎖ランダム配列：

はいずれも英い捷基（上海）貿易有限会社で合成する。

２、異なる配列の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡのトランスファーする前の細胞準備
トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有する培地で細胞密度が０．５×１０^６細胞／ｍＬになるように調整し、新たに１５ｃｍ細胞培養ディッシュに接種し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ_２培養箱で培養する。２４ｈに、細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。

３、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡのトランスファー
１５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ）を取得し、それぞれ４ｎｍｏｌの合成した異なる配列の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントを加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が２ｍＬになるように調整する。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆったりと均一に揺動し、１６０μＬＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬を取得して他管（管Ｂ）における１．８４ｍＬＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、Ａ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて２０ｍｉｎ培養する。

６ｍＬの無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加入し、均一に混合し、ＨｅｐＧ２細胞培養ディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくりと一回ピペットし、その後に上記混合物をＨｅｐＧ２−ＰＴ細胞培養ディッシュに転移し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ_２培養箱で培養する。６ｈ後に、レーザー共焦点顕微鏡でＤＮＡ／ＲＮＡの細胞内の位置決め状況を観察する。

４、実験結果
結果は図５に示すようになり、５ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐのｐｏｌｙＡ、３８ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐの一本鎖ランダム配列又は１９ｂｐの二本鎖ランダム配列フラグメントは、いずれもＸ−ｔｒｅｍｅｓｉＲＮＡに細胞にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。

実施例３分子結合体の膜貫通トランスファーの効率評価

１、材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地は上海前塵生物科技有限会社（ＨｙｃｌｏｎｅＳｈａｎｇｈａｉ）から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとＯｐｔｉ−ＭＥＭとは上海英駿生物技術有限会社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳｈａｎｇｈａｉ）から購入し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は羅氏中国会社（Ｒｏｃｈｅ）から購入し、そのほかの細胞培養ディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社（ＣｏｒｎｉｎｇＣｈｉｎａ）から購入する。

２、分子結合体のトランスファー前の細胞準備
トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有した培地で細胞密度が０．５×１０^６細胞／ｍＬになるように調整し、新たに１５ｃｍ細胞培養ディッシュに接種し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ_２培養箱で培養する。２４ｈに、細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。

３、分子結合体のトランスファー
５つの１５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５として標識される）を取り、それぞれ４ｎｍｏｌの分子結合体１、２、３、４（実施例１の合成経路に従って調製して得られる）と単独のＦＩＴＣで直接的に標識された４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステルを加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が２ｍＬになるように調整する。

さらに５つの１５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５として標識される）を取り、それそれに１．８４ｍＬＯｐｔｉ−ＭＥＭを加入する。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆっくりと均一に揺動し、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５にそれぞれ１６μＬを加入してかつ均一に混合する。各管に対して、例えば、Ａ１とＢ１という、対応した数字のＡ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて２０ｍｉｎ培養する。

各管に６ｍＬの無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を加入して混合物になり、均一に混合する。ＨｅｐＧ２細胞培養ディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくりと一回ピペットし、その後に上記混合物をＨｅｐＧ２−ＰＴ細胞培養ディッシュに転移し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ_２培養箱で培養する。６ｈ後に、レーザー共焦点顕微鏡で分子結合体１、２、３、４と単独の化合物の細胞内の位置決め情況を観察する。

４、実験結果
（１）図５及び図６Ｂに示すように、分子結合体１、２、３、４はいずれも細胞膜を成功に透過して細胞にトランスファーすることができる。

（２）図６Ａに示すように、ＦＩＴＣで直接的に標識された４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステルは細胞膜を透過して細胞に進入することができない。図６Ｂに示すように、単独の化合物の元でＤＮＡ／ＲＮＡが接続された分子結合体１は細胞にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。

（３）顕微鏡で統計を観察してトランスファー効率が得られる。図７Ａは位相差顕微鏡で観察した、トランスファー実験に関わる細胞総数であり、図７Ｂは蛍光顕微鏡で観察した、分子結合体１に成功にトランスファーする細胞総数であり、図７Ｃに示すように、統計結果に基づいて、かつ計算すると、分子結合体１のトランスファー効率は８０％以上に達することができることが知られる。

実施例４分子結合体の化合物の膜透過トランスファーに対する影響の研究

１、実験材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地はＨｙｃｌｏｎｅから購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、細胞溶解液とプロテアーゼ抑制剤とはＰｉｅｒｃｅから購入し、Ｐ−ＩＲＳ−１ＥＬＳＡキットはｂｉｏ−ｓｗａｍｐから購入し、そのほかの細胞培養ディッシュなどの用品はいずれもＣｏｍｉｎｇから購入する。

２、分子結合体の化合物膜透過トランスファーに対する影響の研究
タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）族に属し、膜貫通受容体様タンパク質と細胞内酵素という２種の形式で存在し、タンパク質のリン酸化チロシン残基の脱リン酸化反応を触媒し、哺乳動物体内の最も早く同定され、純化されるＰＴＰｓである。ＰＴＰ１Ｂはインスリン受容体（ＩＲ）、インスリン受容体基質１、２（ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２）、成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）などのインスリン信号変換に関するタンパク質に作用し、それらのリン酸化チロシン残基を脱リン酸化させ、インスリン信号変換を減衰させ、従って受容体後のインスリン抵抗性を発生する。既知の原料化合物４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−（３−（（１−フェニルカルバモイルピペリジン）−４−メチル）フェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルエステルはＰＴＰ１Ｂ抑制剤の作用を有し（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，４６８１−４６９８）、そのため、本発明は分子結合体１の細胞にトランスファーされるＩＲＳ−１リン酸化レベルの変化を測定することで、化合物がＤＮＡ／ＲＮＡと共有結合された後に、分子結合体の形式で確実的に細胞に進入し、かつインスリン信号チャネル機能に対して影響を効果的に発生することができる。検証方法は以下の通りである。

（１）トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有した培地で細胞密度が０．５×１０^６細胞／ｍＬになるように調整し、新たに６ウェルプレートに接種し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ_２培養箱で２４ｈ培養した後に、細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。

（２）２つの１．５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ｃ１、Ｃ２）を取り、それぞれ０．０２５μｇと０．０７５μｇ分子結合体１を加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が１００μＬになるように調整し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆっくり均一に揺動させ、２．５μＬＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬を取って別の２つの管（管Ｄ１、Ｄ２）における９７．５μＬＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、総体積が１００μＬになるように調整し、例えば、Ｃ１とＤ１という、対応したＣ管とＤ管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて２０ｍｉｎ培養する。以上の類似操作のように、化合物を添加せず、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡを添加せず、及び両者が添加されず、それぞれ２つの対照と１つの空白とする。

（３）それぞれ８００μＬ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加入し、均一に混合する。ＨｅｐＧ２細胞培養ディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくり一回洗浄し、その後にステップ（２）で得られた混合液をＨｅｐＧ２細胞培養ディッシュに転移し、かつＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬及び分子結合体１が添加されないものを空白制御とし、３７°Ｃにて、５％ＣＯ_２培養箱で５時間培養する。１μｇ／ｍＬインスリンと５ｍＭグルコースを加入して３０分間誘導される。

（４）細胞は氷ＰＢＳで３回洗浄した後に、各孔に５０μＬ細胞溶解液を加入して氷で１時間分解し、遠心分離して上澄みを取り、ＢＣＡキットでタンパク質定量を行う。等量の総タンパク質をＥＬＩＳＡ板に加入し、ＥＬＩＳＡキットでＩＲＳ−１のリン酸化レベルを測定する。毎回実験において４つの平行孔を設定し、データが３回の独立の実験から由来する。

３、実験結果：
図８に示すように、異なる濃度の分子結合体がＨｅｐＧ_２細胞にトランスファーされた後に、分子結合体が添加されない空白制御と比べて、細胞内のＩＲＳ−１のリン酸化レベルが向上し、かつ化合物の濃度に相応し、それは、化合物がＤＮＡ／ＲＮＡと共有結合された後に、確実的にＤＮＡ／ＲＮＡと共に細胞に進入し、かつ分子結合体の形式で既存の作用を発揮することを示す。

以上のように、本発明の細胞膜透過方法は膜透過性が悪い化合物を細胞に効果的にトランスファーすることができ、操作が便利であり、トランスファー効率が高く、小分子化合物の活性を最大限に保持してかつ安全無毒である。膜透過性が悪い薬物の臨床治療に新しい方法を提供し、本発明の技術を応用すると潜在薬物の数量を極大に増加することができ、多くの膜透過性が悪いので取り除いた薬物の臨床応用を可能にし、かつ薬物細胞において未知の標的の捕獲と標的機構の研究に用いられ、薬物の研究開発過程を極大に短縮し、応用への見通しがよい。

１:Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬、２：分子結合体１（５ｎＭ）、３：分子結合体１にＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬（５ｎＭ）を加入すること、４：分子結合体１にＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬（１５ｎＭ）を加入すること

Claims

化合物の細胞膜透過方法であって、
（１）化合物及びＤＮＡ又はＲＮＡという原料を取得するステップと、
（２）前記化合物とＤＮＡ又はＲＮＡとを接続させ、分子結合体が得られるステップと、
（３）遺伝子トランスファー方法を用いて、ステップ（２）で得られた分子結合体を細胞内にトランスファーするステップと、を含むことを特徴とする化合物の細胞膜透過方法。
ステップ（１）において、前記化合物は分子量１００〜４０００Ｄａの小分子化合物又はポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは長さが５個以上塩基又は塩基対の任意の配列であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップ（１）において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡ又はＲＮＡの鎖端又は鎖中にゼロ個又は複数個の標識が共有結合されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
前記標識は蛍光又は同位体（Isotope）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
ステップ（２）において、化合物とＤＮＡ又はＲＮＡとが接続アームによって接続されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記接続アームは化合物とＤＮＡ／ＲＮＡを修飾できる飽和及び不飽和の共有結合基が接続してなる任意のものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
ステップ（３）において、前記遺伝子トランスファー方法は陽イオン性リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション又は電気穿孔トランスフェクション及びそのほかの核酸を細胞にトランスファーすること可能な技術手段であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
分子結合体であって、その分子式は、

であり、
ただし、Ｘは細胞膜を透過することが困難である化合物であり、ｌｉｎｋｅｒはＸとＤＮＡ又はＲＮＡとの間の接続アームであることを特徴とする分子結合体。
前記化合物は分子量１００〜４０００Ｄａの小分子化合物又はポリペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の分子結合体。
前記ＤＮＡ又はＲＮＡは長さが５個以上塩基又は塩基対の任意の配列であることを特徴とする請求項１０に記載の分子結合体。
前記ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であることを特徴とする請求項１０に記載の分子結合体。
前記ＤＮＡ又はＲＮＡの鎖端又は鎖中にゼロ個又は複数の標識が共有結合されることを特徴とする請求項１３に記載の分子結合体。
前記標識は蛍光又は同位体であることを特徴とする請求項１４に記載の分子結合体
前記接続アームは化合物及びＤＮＡ／ＲＮＡを修飾することができる飽和及び不飽和の共有結合基が接続してなる任意のものであることを特徴とする請求項１０に記載の分子結合体。