JP2016522827A - 化合物の細胞膜透過の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)化合物及びDNA又はRNAという原料を取得するステップと、
(2)前記化合物とDNA又はRNAとを接続し、図1に示すような分子結合体が得られるステップと、
(3)遺伝子トランスファー方法によって、ステップ(2)で得られた分子結合体が細胞にトランスファーさればよいステップと、を含む。
ただし、Xは細胞膜を通過することが困難である化合物を示し、linkerはXとDNA又はRNAとの間の接続アームを示す。
分子結合体1は参考文献の方法(D.P.Wilson et al,J.Med.Chem.2007,50,4681−4698)に従って本会社で合成する。5'−アミノ、3'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(5'−(CH2)12−A19−3'−FITC)は、英い捷基(上海)貿易有限会社(Invitrogen Trading ShanghaiCo.,Ltd)から購入し、そのほかの化学合成に使用した試薬はそれぞれAldrich又はTCIから購入する。
(1)分子結合体1の合成経路(図2−1に示す)。
合成化合物1−2: 4−ブロム−3−オキソ酢酸tert‐ブチル−5−(3−(((1−フェニルカルバモイルピペリジン)−4−メチル)−N−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸メチルエステル
氷浴にて、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI,570mg,3.7mmol)を4−アジド安息香酸(化合物1−4)(500mg,3.06mmol)を含有する10mL Ν,Ν−ジメチルホルムアミドに加入し、その後にΝ−ヒドロキシこはく酸イミド(440mg,3.7mmol)を加入する。反応は遮光及び窒素雰囲気で1時間反応し、その後に室温まで加温し、遮光して終夜攪拌する。減圧し蒸留してΝ,Ν−ジメチルホルムアミドを除去し、その後に残部を酢酸エチルに溶解し、かつ3回水洗し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、粗生成物が得られる。カラムクロマトグラフィーによって生成物4−アジド安息香酸スクシンイミドエステル(化合物1−5)(白色固体,780mg,97.5%収率)。1H NMR(DMSO−d6):δ8.11(d,J=8.4Hz,2H),7.37(d,J=8.4Hz,2H),7.37(s,4H)が得れる。(1H NMR 3−2参照)
5'−アミノ、3'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(5'−(CH2)12−A19−3'−FITC)(50nmol)及び4−アジド安息香酸スクシンイミドエステル(化合物1−5)(5μmol、100eq.)の500μL 0.5M炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9)と500μL ジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相HPLCカラムによって分離され、凍結乾燥されて4−アジドベンズアミド12−アルキル19ポリアデニル化フルオレセイン(化合物1−6)(淡黄色固体、90%収率より大きい)が得られる。
3μLの溶液A(硫酸銅とトリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル] アミンがモル比1:2で体積比4:3:1の水/ジメチル・スルホキシド/tert−ブタノールの溶液に加入し、濃度が10mMである)を溶液B(4−アジドベンズアミド12−アルキル19ポリアデニル化フルオレセイン(化合物1−6)(15nmol)の200μL水溶液と4−ブロム−3−オキソ酢酸−5−(3−(((1−フェニルカルバモイルピペリジン)−4−メチル)−Ν−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸(化合物1−3)(960nmol)の50μL DMSO溶液)に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、60μLの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(600nmol)水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相HPLCカラムによって分離して純化して生成物4−ブロム−3−オキソ酢酸−5−(3−(((1−(4−(フルオレセイン19ポリアデニル酸)12−アルキルイソアミドフェニル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イルメチル)((1−フェニルカルバモイルピペリジル)−4−メチル)アミノ)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸(分子結合体1)(淡黄色固体、約80%収率)が得られる。(分子結合体1のHPLC純度分析は図4−1に示し、分子結合体1の質量スペクトル分析は図4−2に示す)
合成化合物2−2: 14−アジド−3,6,9,12−テトラオキサN−テトラデシル−1−カルボキシレートtert−ブタノール:
カリウムtert−ブトキシド(336mg,3mmol)を15mL(化合物2−1)(372mg,2mmol)のtert−ブタノール溶液に加入し、30度にて15分間攪拌する。その後にt−ブチルブロモ酢酸(780mg,4mmol)を以上の体系に加入し、30度にて終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。30mLのジクロロメタンに溶解し、順次に3回水洗し、飽和塩水で3回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物2−2(無色油状液体,466mg,70%収率)が得られる。MS m/z(ESI):250(M−tBu−N2+H)+;278(M−tBu+H)+
トリフルオロ酢酸(1mL)を化合物2−2(466mg,1.4mmol)の5mLジクロロメタン溶液に加入し、室温にて2時間攪拌する。濃縮して粗生成物である化合物2−3(無色油状,370mg,95%収率)が得られる。MS m/z(ESI):250(M−N2+H)+;278(M+H)+。
5'−アミノ、3'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(5'−(CH2)12−A19−3'−FITC)(80nmol)、化合物2−3(1.6μmol、200eq.)、4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMT−MM, 1.6μmol、200eq.)の80μL 0.5M炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム緩衝液(pΗ9)、160μ脱イオン水及び160μL ジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相HPLCカラムによって分離され、凍結乾燥されて化合物2−4(白色固体)が得られる。MSm/z(TOF):6896。
6μLの溶液A(硫酸銅とトリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル] アミンがモル比1:2で体積比4:3:1の水/ジメチル・スルホキシド/tert−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が10mMである)を溶液B(化合物2−4(50nmol)の400μL水溶液と4−ブロム−3−オキソ酢酸−5−(3−(((1−フェニルカルバモイルピペリジン)−4−メチル)−Ν−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸(化合物1−3)(3μmol)の100μL DMSO溶液)に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、120μLの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(1200nmol)水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相HPLCカラムによって分離し純化して分子結合体2(淡黄色固体)が得られる。MS m/z(TOF):7521
化合物3−2の合成:
5'−アミノ、3'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(5'−(CH2)12−A19−3'−FITC)(80nmol)、アジド酢酸(化合物3−1)(1.6μmol,200eq.)、4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMT−MM,1.6μmol,200eq.)の80μL 0.5M炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9)、160μL脱イオン水及び160μLジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相HPLCカラムによって分離され、凍結乾燥して化合物(化合物3−2)(白色固体)が得られる。MS m/z(TOF):6720
6μLの溶液A(硫酸銅とトリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル] アミンがモル比1:2で体積比4:3:1の水/ジメチル・スルホキシド/tert−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が10mMである)を溶液B(化合物3−2(50nmol)の400μL水溶液と4−ブロム−3−オキソ酢酸−5−(3−(((1−フェニルカルバモイルピペリジン)−4−メチル)−Ν−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸(化合物1−3)(3umol)の100μL DMSO溶液)に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、120μLの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(1200nmol)水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相HPLCカラムによって分離して純化して生成物である分子結合体3(淡黄色固体)が得られる。MS m/z(TOF):7345。
化合物4−2の合成:
化合物4−1(441mg,1mmol)、臭化プロパルギル(95mg,0.8mmol)、炭酸カリウム(138mg,1mmol)を20mLのΝ,Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、室温にて終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。50mLのジクロロメタンに溶解し、順次に3回水洗し、飽和塩水で3回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物4−2(黄色固体,287mg,60%収率)が得られる。MS m/z(ESI):424(M−tBu+H)+;480(M+H)+。
化合物4−2(87mg,0.6mmol)、水酸化リチウム一水化合物(126mg,3mmol)を5mLのメタノールと5mLの水に溶解し、回流して終夜攪拌する。蒸留してアルコールを除去する。20mLの水で希釈され、1N HClでpH2.0程度酸性化され、凍結乾燥されて粗生成物が得られ、直接的に逆相高速液体分離によって化合物4−3(黄色固体,216mg,80%収率)が得られる。MS m/z(ESI):410(M+H)+。
6μLの溶液A(硫酸銅とトリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル] アミンがモル比1:2で体積比4:3:1の水/ジメチル・スルホキシド/tert−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が10mMである)を溶液B(化合物4−4(50nmol)の400μL水溶液と化合物4−3(3umol)の10μL DMSO溶液)に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、120μLの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(1200nmol)水溶液を上記反応系に加入し、室温にてゆっくり終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相HPLCカラムによって分離して純化して分子結合体4(淡黄色固体)が得られる。MS m/z(TOF):7191
HepG2細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、RPMI−1640培地は上海前塵生物科技有限会社(Hyclone Shanghai)から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとOpti−MEMとは上海英駿生物技術有限会社(Invitrogen Shanghai)から購入し、X−tremeGENEsiRNAトランスフェクション試薬は羅氏中国会社(Roche)から購入し、残した細胞培養ディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社(Coming China)から購入する。
5bpのpolyA:5'−NH2−(CH2)12−PO4−A5−3'−FITC、
19bpのpolyA:5'−NH2−(CH2)12−PO4−A19−3'−FITC、
38bpのpolyA:5'−NH2−(CH2)12−PO4−A38−3'−FITC、
19bpの一本鎖ランダム配列:5'−NH2−(CH2)12−PO4−TGGGCTGGCCAAACTGCTG−3'−FITC、
19bpの二本鎖ランダム配列:
はいずれも英い捷基(上海)貿易有限会社で合成する。
トランスファー前の24hに、トリプシンで対数期成長期のHepG2細胞を消化し、10%血清を含有する培地で細胞密度が0.5×106細胞/mLになるように調整し、新たに15cm細胞培養ディッシュに接種し、37°Cにて、5%CO2培養箱で培養する。24hに、細胞密度が60%−70%に達すると実験に用いられる。
15mL無菌遠心分離管(管A)を取得し、それぞれ4nmolの合成した異なる配列の一本鎖又は二本鎖DNA/RNAフラグメントを加入し、相応体積のOpti−MEMと均一に混合し、総体積が2mLになるように調整する。X−tremeGENEsiRNA試薬をゆったりと均一に揺動し、160μL X−tremeGENEsiRNA試薬を取得して他管(管B)における1.84mL Opti−MEMと混合し、A管とB管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて20min培養する。
結果は図5に示すようになり、5bpのpolyA、19bpのpolyA、38bpのpolyA、19bpの一本鎖ランダム配列又は19bpの二本鎖ランダム配列フラグメントは、いずれもX−tremesiRNAに細胞にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。
HepG2細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、RPMI−1640培地は上海前塵生物科技有限会社(Hyclone Shanghai)から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとOpti−MEMとは上海英駿生物技術有限会社(Invitrogen Shanghai)から購入し、X−tremeGENEsiRNAトランスフェクション試薬は羅氏中国会社(Roche)から購入し、そのほかの細胞培養ディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社(Corning China)から購入する。
トランスファー前の24hに、トリプシンで対数期成長期のHepG2細胞を消化し、10%血清を含有した培地で細胞密度が0.5×106細胞/mLになるように調整し、新たに15cm細胞培養ディッシュに接種し、37°Cにて、5%CO2培養箱で培養する。24hに、細胞密度が60%−70%に達すると実験に用いられる。
5つの15mL無菌遠心分離管(管A1、A2、A3、A4及びA5として標識される)を取り、それぞれ4nmolの分子結合体1、2、3、4(実施例1の合成経路に従って調製して得られる)と単独のFITCで直接的に標識された4−ブロム−3−オキソ酢酸tert‐ブチル−5−(3−((1−フェニルカルバモイルピペリジン)−4−メチル)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸メチルエステルを加入し、相応体積のOpti−MEMと均一に混合し、総体積が2mLになるように調整する。
(1)図5及び図6Bに示すように、分子結合体1、2、3、4はいずれも細胞膜を成功に透過して細胞にトランスファーすることができる。
HepG2細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、RPMI−1640培地はHycloneから購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンはInvitrogenから購入し、細胞溶解液とプロテアーゼ抑制剤とはPierceから購入し、P−IRS−1ELSAキットはbio−swampから購入し、そのほかの細胞培養ディッシュなどの用品はいずれもComingから購入する。
タンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)はタンパク質チロシンホスファターゼ(PTPs)族に属し、膜貫通受容体様タンパク質と細胞内酵素という2種の形式で存在し、タンパク質のリン酸化チロシン残基の脱リン酸化反応を触媒し、哺乳動物体内の最も早く同定され、純化されるPTPsである。PTP1Bはインスリン受容体(IR)、インスリン受容体基質1、2(IRS−1、IRS−2)、成長因子受容体結合タンパク質2(Grb2)、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI−3K)などのインスリン信号変換に関するタンパク質に作用し、それらのリン酸化チロシン残基を脱リン酸化させ、インスリン信号変換を減衰させ、従って受容体後のインスリン抵抗性を発生する。既知の原料化合物4−ブロム−3−オキソ酢酸tert‐ブチル−5−(3−((1−フェニルカルバモイルピペリジン)−4−メチル)フェニル)チオフェン−2−カルボン酸メチルエステルはPTP1B抑制剤の作用を有し(J.Med.Chem.2007,50,4681−4698)、そのため、本発明は分子結合体1の細胞にトランスファーされるIRS−1リン酸化レベルの変化を測定することで、化合物がDNA/RNAと共有結合された後に、分子結合体の形式で確実的に細胞に進入し、かつインスリン信号チャネル機能に対して影響を効果的に発生することができる。検証方法は以下の通りである。
図8に示すように、異なる濃度の分子結合体がHepG2細胞にトランスファーされた後に、分子結合体が添加されない空白制御と比べて、細胞内のIRS−1のリン酸化レベルが向上し、かつ化合物の濃度に相応し、それは、化合物がDNA/RNAと共有結合された後に、確実的にDNA/RNAと共に細胞に進入し、かつ分子結合体の形式で既存の作用を発揮することを示す。
Claims (16)
- 化合物の細胞膜透過方法であって、
(1)化合物及びDNA又はRNAという原料を取得するステップと、
(2)前記化合物とDNA又はRNAとを接続させ、分子結合体が得られるステップと、
(3)遺伝子トランスファー方法を用いて、ステップ(2)で得られた分子結合体を細胞内にトランスファーするステップと、を含むことを特徴とする化合物の細胞膜透過方法。 - ステップ(1)において、前記化合物は分子量100〜4000Daの小分子化合物又はポリペプチドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ステップ(1)において、前記DNA又はRNAは長さが5個以上塩基又は塩基対の任意の配列であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ステップ(1)において、前記DNA又はRNAは一本鎖又は二本鎖であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記DNA又はRNAの鎖端又は鎖中にゼロ個又は複数個の標識が共有結合されることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記標識は蛍光又は同位体(Isotope)であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- ステップ(2)において、化合物とDNA又はRNAとが接続アームによって接続されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記接続アームは化合物とDNA/RNAを修飾できる飽和及び不飽和の共有結合基が接続してなる任意のものであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- ステップ(3)において、前記遺伝子トランスファー方法は陽イオン性リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション又は電気穿孔トランスフェクション及びそのほかの核酸を細胞にトランスファーすること可能な技術手段であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 分子結合体であって、その分子式は、
であり、
ただし、Xは細胞膜を透過することが困難である化合物であり、linkerはXとDNA又はRNAとの間の接続アームであることを特徴とする分子結合体。 - 前記化合物は分子量100〜4000Daの小分子化合物又はポリペプチドであることを特徴とする請求項10に記載の分子結合体。
- 前記DNA又はRNAは長さが5個以上塩基又は塩基対の任意の配列であることを特徴とする請求項10に記載の分子結合体。
- 前記DNA又はRNAは一本鎖又は二本鎖であることを特徴とする請求項10に記載の分子結合体。
- 前記DNA又はRNAの鎖端又は鎖中にゼロ個又は複数の標識が共有結合されることを特徴とする請求項13に記載の分子結合体。
- 前記標識は蛍光又は同位体であることを特徴とする請求項14に記載の分子結合体
- 前記接続アームは化合物及びDNA/RNAを修飾することができる飽和及び不飽和の共有結合基が接続してなる任意のものであることを特徴とする請求項10に記載の分子結合体。
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