CN117305308A - 一种高稳定核酸适配体分子及其复合物和应用 - Google Patents
一种高稳定核酸适配体分子及其复合物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种适配体核酸分子,包含该适配体和荧光团小分子的复合物,该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法,以及包含该适配体的试剂盒。本申请的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子,并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。
Description
技术领域
本申请涉及一种适配体核酸分子,包含该适配体核酸分子的复合物,用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法,以及包含该适配体的试剂盒。本申请的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子,并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。
背景技术
分子生物学的中心法则是生物间共用的,DNA上的遗传信息通过转录传递至RNA,RNA则通过翻译产生执行功能的蛋白质。RNA与蛋白质一样,具有丰富的生理功能,对生命活动有重要意义。细胞中除了我们广泛认知的信使RNA外,还含有大量的非编码RNA,这些RNA种类繁多,广泛参与代谢调节、细胞增殖、免疫调节和细胞凋亡等多种细胞生命过程。因此,具有高空间和时间分辨率的用于对感兴趣的RNA成像和跟踪的技术对于理解细胞通路和许多生理过程至关重要。
目前人们已经开发用于标记和跟踪活细胞中的RNA的工具,这些工具主要是已应用于哺乳动物细胞的工具。这些工具主要分为两类:依靠蛋白质结合RNA元件的工具和利用小分子探针结合RNA元件的工具。
由于绿色荧光蛋白(GFP)的发现和发展,RNA的成像通常是通过基因编码系统实现的。这种天然存在的荧光蛋白的系统可以克服现有非遗传编码系统的缺点,例如有限的生物相容性和细胞功能扰动等。最流行的基于荧光蛋白的RNA成像技术是MCP-GFP系统(Bertrand etal.Molecular Cell 1998.2,437–445),其中融合到GFP的噬菌体MS2外壳蛋白(MCP)用于对插入了MS2结合RNA序列进行成像。为了提高信噪比,科学家们设计了具有核定位信号MS2结合RNA序列的串联阵列(Daigle et al.Nature Methods 2007,4,633–636)和分裂GFP(Rackham et al.Embo Journal,2014.23(16):3346-3355),但是MCP-GFP系统仍然有几个缺点:融合蛋白需要相当长的时间来翻译和成熟;并且无法在转录水平对ncRNA进行成像(Tyagi etal.Nature Methods 2009.6,331–338);此外,核定位信号可能会混淆RNA的细胞定位;此外,已证明与MS2结合RNA序列结合的大而重的融合蛋白会对标记的RNA的功能产生不利影响(Tyagi et al.Nature Methods 2009.6,331–338),人们仍然需要具有高生物稳定性、灵敏度和稳定性的新技术,用以对RNA的分布和动态成像和研究。
最近,出现和发展是基于RNA序列的基因编码成像技术成为研究活细胞RNA的重要工具。荧光RNA(在某些文献中也称为荧光适体、荧光开启适体或荧光结合适体),可以特异性结合它们的同源荧光染料并显著激活它们荧光。荧光剂在溶液中游离时显示出最小的荧光,但在与荧光RNA结合时会发出荧光。与MCP-GFP系统相比,荧光RNA具有高信噪比,可以在转录水平上对感兴趣的RNA进行成像。此外,荧光RNA的分子量相对较小,高度模块化且易于编程。除了对感兴趣的RNA的位置和动态进行成像和跟踪(Okuda et al.Nucleic AcidsReserch 2017.45,1404–1415)之外,许多荧光RNA也被用于检测非核酸目标。目标包括但不限于代谢物(Paige et al.Science 2012.335,1194–1194)、金属离子(DasGupta etal.Chemical Communications 2015.51,9034–9037)、辅酶因子(Zhang et al.Sensorsand Actuators B:Chemical 2019.281,439–444)、多肽和蛋白质(Strack et al.NaturePtotocol 2014.9,146–155),这对理解复杂的细胞通路、活细胞的生理过程和生化活动有很大帮助。
Jaffrey及其同事使用模拟绿色荧光蛋白(GFP)结构的荧光团开发了第一个被广泛识别的定制染料结合适体Spinach,基于Spinach-DFHBI复合物的用于检测细胞代谢物(Paige et al.Science 2011.333:642-646)。后来,结合荧光分析的筛选进一步提高了探针的绝对亮度,产生了一种新的适体Broccoli(Filonov et al.Journal of the AmericanChemical Society 2014.136:16299-16308)。通过对原始DFHBI染料改造得到的衍生物,由于苯并咪唑取代基而被称为BI,当与Broccoli结合时,显示出更高的光稳定性并具有了更好的热稳定性(Li et al.Angewandte Chemie International Edition 2020.59(11):4511-4518)。
目前已开发的Spinach、Broccoli、Corn和Mango等荧光RNA应用的潜在限制之一是适体结构中存在G-四链体。这种二级结构在哺乳动物细胞中会主动降解(Guo etal.Science.2016.353(6306));同时其亮度和结合能力较弱,限制了其在活细胞成像领域的应用。
最近由Yang及其同事开发的Pepper适配体,与其他荧光团-适体复合物相比,Pepper530在哺乳动物细胞中显示出比Broccoli和Corn高9倍和11倍的荧光信号。用4xPepper和4xMS2串联标记的mRNA显示Pepper530的性能优于MCP-GFP,而Pepper620的信噪比优于MCP-mCherry。研究还表明,Peppers可用于对各种不同类别的RNA进行成像。然而,Pepper适配体的折叠严重依赖于Mg2+,这一定程度上影响了它在活细胞中的成像亮度,特别是哺乳动物细胞。
到目前为止,荧光RNA已成为构建基于基因编码的RNA荧光生物传感器的强大工具。然而,受限于目前荧光RNA的相对较低的荧光亮度和活细胞中的低稳定性,急需一个亮度更高、细胞内稳定性更高的荧光RNA可以对细胞中各种单分子RNA进行标记与成像,探究它们的生物功能。
技术解决方案
本申请提供了一种核酸适配体分子,编码该核酸适配体分子的DNA分子,一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物,以及该复合物的用途。
本发明提供的技术方案如下:
本申请一种核酸适配体分子,所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c):
(a):核苷酸序列
N1CAUCGUGGCGUGUCGN17-N18-N19ACUGGCGCUN29-N30-N31CAGN34(称为通式Capsicum结构),其中N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34代表长度大于或等于1个的核苷酸片段,并且N1与N34核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对,N17与N19核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对,N29与N31核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对
(b):与(a)限定的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列;
(c):在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34的位置,经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加,且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。
在一些实施例中,所述核苷酸序列(b)与核苷酸序列(a)限定的通式Capsicum结构核苷酸序列具有至少74%、78%、81%、85%、89%、93%、96%或100%同一性。在一些实施例中,核苷酸序列(c)是在核苷酸序列(a)限定的通式Capsicum结构核苷酸序列中不包括N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34的位置,经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。在一些实施例中,所述核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34的位置,经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
在一些实施例中,所述核苷酸序列(a)中的N1与N34互补配对时,N1核苷酸序列的方向为5’-3’,N34核苷酸序列的方向为3’-5’;N17与N19互补配对时,N17核苷酸序列的方向为5’-3’,N19核苷酸序列的方向为3’-5’;N29与N31互补配对时,N29核苷酸序列的方向为5’-3’,N31核苷酸序列的方向为3’-5’。
在一些实施例中,当所述核苷酸序列(a)中的N1与N34中的至少一条片段的长度大于或等于5个核苷酸碱基时,则N1与N34核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对;当N17与N19中的至少一条片段的长度大于或等于5个核苷酸碱基时,则N17与N19核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对;当N29与N31中的至少一条片段的长度大于或等于5个核苷酸碱基时,则N29与N31核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。
在一些实施例中,对通式Capsicum结构的核苷酸取代:C5U、C5A、U12C、U12G、G13A、U14A、U14C、C15U、G16A、G16C、A20G、A20C、C21U、C21G、U22G、U22C、G23A、G23C、G24U、U28C、C5U/U28C、U12G/G24U、U14C/U22G、U14C/U22C、G16A/C21U、G16C/C21G、U12C/U28C、U14A/U28C、G24A/U28C、G16A/C21U/G24A、G16A/C21G/G24A、G16A/C21U/U28C、G16A/C21G/U28C、G16A/C21U/G24A/U28C、G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/G16A/C21G/G24A/U28C、U12C/G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/U12C/G16A/C21G/G24A/U28C和C5U/U12C/U14A/G16A/C21G/G24A/U28C。
在一些实施例中,对通式Capsicum结构的核苷酸取代:C5U、C5A、U12C、U12G、G13A、U14A、U14C、C15U、G16A、G16C、A20G、A20C、C21U、C21G、U22G、U22C、G23A、G23C、G24U、U28C、C5U/U28C、U12G/G24U、U14C/U22G、U14C/U22C、G16A/C21U、G16C/C21G、U12C/U28C、U14A/U28C、G24A/U28C、G16A/C21U/G24A、G16A/C21G/G24A、G16A/C21U/U28C、G16A/C21G/U28C、G16A/C21U/G24A/U28C、G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/G16A/C21G/G24A/U28C、U12C/G16A/C21G/G24A/U28C和
C5U/U12C/G16A/C21G/G24A/U28C。
在一些实施例中,对通式Capsicum结构的核苷酸取代:C5U、C5A、U12C、U12G、G13A、U14A、U14C、C15U、G16A、G16C、A20G、A20C、C21U、C21G、U22G、U22C、G23A、G23C、G24U、U28C、C5U/U28C、U12G/G24U、U14C/U22G、U14C/U22C、G16A/C21U、G16C/C21G、U12C/U28C、U14A/U28C、G24A/U28C、G16A/C21U/G24A、G16A/C21G/G24A、G16A/C21U/U28C、G16A/C21G/U28C、G16A/C21U/G24A/U28C、G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/G16A/C21G/G24A/U28C和U12C/G16A/C21G/G24A/U28C。
在一些实施例中,所述核酸适配体分子还可包含它的循环更替突变体。
在一些实施例中,所述核苷酸序列(a)中的N1与N34处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。
在一些实施例中,所述核酸适配体分子是RNA分子或经碱基或核糖修饰的RNA分子。
在一些实施例中,所述核酸适配体分子是DNA-RNA杂交分子或经修饰的RNA分子,包括但不限于碱基修饰和/或核糖修饰。
在一些实施例中,所述核苷酸序列(a)中的N17-N18-N19包含一个可以识别靶标分子的核苷酸序列。
在一些实施例中,所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍,至少5-10倍,至少20-50倍,至少100-200倍或者提高至少500-1000倍。
在一些实施例中,所述核酸适配体分子还可包含可以结合多个荧光团分子的串联体,所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起,所述间隔序列具有2、3、4、5、6、7、8或者更多个核苷酸片段的长度。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列SEQ ID No:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。
在一些实施例中,所述核酸适配体分子具有序列SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。
本申请还提供一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物,其中所述核酸适配体分子为上述任意一种核酸适配体分子,所述荧光团分子具有下述式(I)所述的结构:
其中:D-为X1O-或N(X2)(X3)-;X1、X2、X3各自独立地选自氢、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基,X2、X3任选相互连接为饱和或不饱和的环;R-选自氢、氰基、羧基、酰胺基、酯基、羟基、1-10个碳的直链或支链烷基或改性烷基;Ar1、Ar2各自独立地选自单环芳亚基、单环杂芳亚基,或由单环芳基、单环杂芳基中的一种或两种稠合组成的具有2-3个环结构的芳香亚基;
其中:Ar1、Ar2中的氢原子可以独立地被F、Cl、Br、I、羟基、硝基、醛基、羧基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、伯氨基、仲氨基、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基取代;
其中:以上所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自F、Cl、Br、I、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S=O)-、叠氮基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、环氧乙烷、琥珀酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氯、磺酰氯、饱和或不饱和的单环或双环亚环羟基、桥联酯杂环中的至少一种基团置换所得的基团,所述改性烷基具有1-10个碳原子,其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换;
其中,所述复合物中的所述核酸适配体分子与所述荧光团分子分别存在于单独的溶液中,或者所述核酸适配体分子与所述荧光团分子在同一溶液中。
在一些实施例中,所述改性烷基含有选自-OH、-O-、乙二醇单元、单糖单元、二糖单元、-O-CO-、-NH-CO-、-SO2-O-、-SO-、Me2N-、Et2N-、-S-S-、-CH=CH-、F、Cl、Br、I、-NO2和氰基中的至少一种基团。
在一些实施例中,所述荧光团分子含有的芳香环选自下式(Ⅱ-1)~(Ⅱ-15)中的结构:
在一些实施例中,荧光团分子选自下式化合物:
在一些实施例中,所述复合物中的所述荧光团分子选自HBC485、HBC497、HBC508、HBC514、HBC525、HBC530、HBC599、HBC620、III-1、III-2、III-5、III-9、III-10、III-11、III-12、III-13、III-14、III-16、III-17、III-19和III-20。
在一些实施例中,所述复合物中的所述适配体分子包含核苷酸序列SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。
本申请还提供一种上述任意一种复合物用于体外或体内目标核酸分子的检测或标记。
本申请还提供一种上述任意一种复合物用于细胞外或细胞内靶标分子的检测或标记。
本申请还提供一种DNA分子,其转录上述任意一种核酸适配体分子。
本申请还提供一种表达载体,其包含上述DNA分子。
本申请还提供一种宿主细胞,其包含上述表达载体或基因组中整合有上述DNA分子。
本申请还提供一种试剂盒,包含上述任意一种核酸适配体分子和/或上述任意一种表达载体和/或上述任意一种宿主细胞和/或上述任意一种复合物。
本申请还提供一种检测靶标分子的方法,包括步骤:
(1)在包含靶标分子的溶液中加入上述任意一种复合物;
(2)用合适波长的光激发复合物;
(3)检测复合物的荧光。
本申请还提供一种提取与纯化RNA的方法,包含利用上述任意一种复合物提取与纯化RNA。
本发明的有益效果
本发明人设计了全新的高稳定核酸适配体分子,并合成全新的荧光团分子,以组成全新的荧光团-核酸适配体复合物。所述适配体分子结合荧光团分子之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度,与此前荧光团-核酸适配体复合物相比,该复合物具有更高的热稳定性、更低的离子依赖性以及更高强度的荧光信号,能够在细胞内产生更加稳定的荧光,克服了前者诸多缺点,从而能更有效用于活细胞中的RNA/DNA实时标记。本申请的核酸适配体对荧光团分子具有很强的亲和力,并展现出了不同的荧光光谱和很好的光与温度稳定性。这些核酸适配体-荧光团分子复合物可以对原核和真核细胞中RNA或DNA进行实时标记与成像,或用于RNA的提取与纯化的标签等作用。
附图简要说明
图1核酸适配体分子的二级结构预测;(A)为预测的Capsicum的通用结构,包括可以形成茎结构的N1和N34,可以形成茎环结构的N17、N18和N19以及N29、N30和N31。(B)为预测的Capsicum-1的结构,N1和N34的碱基序列如图中茎1所对应的虚线框所示,N17、N18和N19的碱基序列如茎环1所对应的虚线框所示,N29、N30和N31的碱基序列如茎环2所对应的虚线框所示。
图2F30-Capsicum-1的二级结构预测。
图3tRNA-Capsicum-2的二级结构预测。
图4Capsicum-4-HBC50复合物性质鉴定。(A)Capsicum-4-HBC530复合物的荧光激发光谱和发射光谱;(B)不同串联乘数Capsicum-HBC530复合物的寡聚化鉴定;“标尺”为单链RNA标准,用于标定适配体的大小(C)Capsicum-4与HBC530复合物对Mg2+的依赖性测定;(D)Capsicum-4与HBC530结合的解离常数测定;(E)Capsicum-4-HBC530复合物的热稳定性;(F)Capsicum-4-HBC530复合物的pH稳定性测定;(G)Capsicum-4-HBC530复合物与Pepper-HBC530复合物在不同镁离子浓度下荧光强度比较;(H)Capsicum-4-HBC530复合物与Pepper-HBC530复合物在不同温度下荧光强度比较,误差线代表标准差,数据用双尾t检验统计分析。
图5不同碱基修饰的Capsicum对HBC530的激活效果。(A)含脱氧核糖核苷酸(图中深色颜色标注)的Capsicum-6适配体的二级结构示意图;(B)含2’-F修饰(图中深色颜色标注)的Capsicum-7适配体的二级结构示意图;(C)含不同修饰的Capsicum对HBC530的激活效果。“对照”是利用缓冲液替换Capsicum-6或Capsicum-7适配体。
图6不同Capsicum串联体对HBC530的激活效果;(A)按照“串联1”方式获得Capsicum串联体;(B)按照“串联2”方式获得Capsicum串联体;(C)按照“串联3”方式获得Capsicum串联体;(D)按照“串联4”方式获得Capsicum串联体;(E)按照“串联5”方式获得Capsicum串联体;(F)不同按照“串联1”方式获得Capsicum串联体对HBC530的激活效果;(G)不同按照“串联2”方式获得Capsicum串联体对HBC530的激活效果;(H)不同按照“串联3”方式获得Capsicum串联体对HBC530的激活效果;(I)不同按照“串联4”方式获得Capsicum串联体对HBC530的激活效果;(J)不同按照“串联5”方式获得Capsicum串联体对HBC530的激活效果。
图7“循环更替突变体”的Capsicum对HBC530的激活效果。(A)“循环更替突变体”的Capsicum-8适配体的二级结构示意图;(B)“循环更替突变体”的Capsicum-9适配体的二级结构示意图;(C)不同“循环更替突变体”的Capsicum对HBC530的激活效果。“对照”是利用缓冲液替换Capsicum-8或Capsicum-9适配体。
图8Capsicum-4-HBC530复合物用于细菌中RNA的标记效果;(A)比较Capsicum-4-HBC530和Pepper-HBC530在细菌中RNA的标记效果;(B)对(A)图荧光的统计结果;误差线代表标准差,数据用双尾t检验统计分析,比例尺:10μm。
图9Capsicum与HBC530复合物及Capsicum与HBC620复合物用于哺乳动物细胞中RNA的标记的标记效果;(A)比较F30-Spinach2-DFHBI-1T、F30-Broccoli-BI、F30-Pepper-HBC530和F30-Capsicum-1-HBC530在哺乳动物细胞中标记RNA的效果;(B)比较tRNA-Corn-DFHO、F30-Broccoli-OBI、F30-Pepper-HBC620和F30-Capsicum-1-HBC620在哺乳动物细胞中标记RNA的效果;(C)对(A)图荧光的统计结果;(D)对(B)图荧光的统计结果;误差线代表标准差,数据用双尾t检验统计分析,比例尺:50μm。
图10Capsicum与HBC530其他衍生物复合物用于哺乳动物细胞中RNA的标记的标记效果;(A)比较F30-Capsicum-1-HBC485和F30-Pepper-HBC485、F30-Capsicum-1-HBC497和F30-Pepper-HBC497、F30-Capsicum-1-HBC508和F30-Pepper-HBC508、F30-Capsicum-1-HBC514和F30-Pepper-HBC514、F30-Capsicum-1-HBC525和F30-Pepper-HBC525、F30-Capsicum-1-HBC599和F30-Pepper-HBC599在哺乳动物细胞中标记RNA的效果;(B)对(A)图荧光的统计结果;误差线代表标准差,数据用双尾t检验统计分析,比例尺:50μm。
图11基于Capsicum-4的探针构建;(A)探针构建示意图,其中的茎-环1结构能识别SAM;(B)SAM探针的检测效果。
图12Capsicum用于示踪细胞中RNA定位;(A)Capsicum用于检测GADPH mRNA的定位;(B)Capsicum用于检测BFP mRNA的定位;(C)Capsicum用于检测U6小核RNA的定位;(D)Capsicum用于检测5S小核RNA的定位;误差线代表标准差,数据用双尾t检验统计分析,比例尺:10μm。
本发明的发明详述
本申请在此通过对使用下述定义和实施例的引用进行详细描述。所有在本文中提及的专利和公开文献的内容,包括在这些专利和公开中披露的所有序列,明确地通过提述并入本文。下文中,“核苷酸”与“核苷酸碱基”互换使用,表示相同意思。
以下,关于本申请的一些术语进行详细解释。
核酸适配体分子
本申请所述的“核酸适配体分子”也称为“适配体分子”。该核酸适配体分子包含(a)核苷酸序列为N1CAUCGUGGCGUGUCGN17-N18-N19ACUGGCGCUN29-N30-N31CAGN34(对应于图1A的通式Capsicum结构);或(b)与(a)所述的核苷酸序列具有至少70%同一性的序列;其中N1与N34核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对,即N1核苷酸序列的方向为5’-3’,N34核苷酸序列的方向为3’-5’。当N1与N34至少一条核苷酸碱基长度小于或等于4时,需要至少一对碱基形成互补配对;当N1与N34至少一条核苷酸碱基长度大于或等于5时,需要至少两对碱基形成互补配对。其中N17与N19核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对,即N17核苷酸序列的方向为5’-3’,N19核苷酸序列的方向为3’-5’。当N17与N19至少一条核苷酸碱基长度小于或等于4时,需要至少一对碱基形成互补配对;当N17与N19至少一条核苷酸碱基长度大于或等于5时,需要至少两对碱基形成互补配对。其中N18为任意长度任意组成的核苷酸碱基;其中N29与N31核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对,即N29核苷酸序列的方向为5’-3’,N31核苷酸序列的方向为3’-5’。当N29与N31至少一条核苷酸碱基长度小于或等于4时,需要至少一对碱基形成互补配对;当N29与N31至少一条核苷酸碱基长度大于或等于5时,需要至少两对碱基形成互补配对。其中N30为任意长度任意组成的核苷酸碱基;或(c)在所述的核苷酸序列(a)的任一位置经过1-7个核苷酸的取代、缺失和/或增加。
核酸适配体分子包含对通式Capsicum结构的核苷酸的取代:C5U、C5A、U12C、U12G、G13A、U14A、U14C、C15U、G16A、G16C、A20G、A20C、C21U、C21G、U22G、U22C、G23A、G23C、G24U、U28C、C5U/U28C、U12G/G24U、U14C/U22G、U14C/U22C、G16A/C21U、G16C/C21G、U12C/U28C、U14A/U28C、G24A/U28C、G16A/C21U/G24A、G16A/C21G/G24A、G16A/C21U/U28C、G16A/C21G/U28C、G16A/C21U/G24A/U28C、G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/G16A/C21G/G24A/U28C、U12C/G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/U12C/G16A/C21G/G24A/U28C和C5U/U12C/U14A/G16A/C21G/G24A/U28C(即表1中的适配体分子结构)。突变体能特异性结合荧光团分子,并在结合之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度。其中核苷酸的位置序列对应于图1A中的位置。
上述的突变表示在通式Capsicum结构的适配体核苷酸序列的相应位点发生核苷酸替换,即U28C表示Capsicum的第28位胸腺嘧啶U被取代为胞嘧啶核苷酸C。
表1:Capsicum通式结构经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸取代的适配体结构
适配体分子是单链核酸分子,它们有着一个或多个碱基配对区域(茎)以及一个或多个非配对的区域(环)构成的二级结构(图1)。本申请所述的核酸适配体分子包含一个如图1所预测的二级结构。该二级结构含有2个环结构、2个茎结构和2个茎-环结构,其中茎1是起到稳定整个核酸适配体分子结构的作用,可以被替换成其他可以形成茎结构的任意长度任意组成的核苷酸碱基对。所述茎1结构的5’端或3’端可以与任意目标RNA分子融合,用于细胞外或细胞内检测目标RNA分子。在本申请一优选的实施方案中,核酸适配体分子的5’端融合GAPDH RNA序列(Genebank:BC009081);在本申请另一优选的实施方案中,核酸适配体分子的5’端融合BFP RNA序列(Genebank:MN623118);在本申请另一优选的实施方案中,核酸适配体分子的5’端融合U6 RNA序列(Genebank:NR_138085.1);在本申请另一优选的实施方案中,核酸适配体分子的5’端融合5S RNA序列(Genebank:NR_023377.1)。
图1中的茎-环结构起到稳定整个核酸适配体分子结构的作用,可以被替换成其他可以形成茎-环结构的任意长度任意组成的核苷酸碱基对。本申请所述的适配体分子还可包含插入到N17-N18-N19位置的其他核苷酸序列,该插入的核苷酸序列替换图1A中的茎-环结构。所述核苷酸序列可以特异性识别/结合靶标分子。当靶标分子不存在时,所述适配体分子与荧光团分子的结合能力弱,导致荧光团分子显示弱荧光;当靶标分子存在时,靶标分子与所述适配体的结合会促进所述适配体与荧光团分子的结合,显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光。所述靶标分子可以是一种小分子、一种细胞表面的信号分子等。这些核酸适配体与特定的靶标分子通过非共价结合,这种非共价结合主要是依赖分子间的离子力、偶极力、氢键、范德华力、正负电子相互作用、堆积作用或者以上几种作用力的结合。所述茎-环结构可被替换成识别靶标分子的RNA序列,用于细胞外或细胞内检测靶标分子。在本申请一优选的实施方案中,适配体分子的茎-环结构可以结合腺苷分子。
本申请优选的实施方案中,所述核酸适配体分子优选为SEQ ID NO:No:1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28,或者可以结合荧光团分子显著提高其在合适波长激发光下荧光的它们的突变序列。
本申请所述的核酸适配体分子还可包含一段增加其稳定性的核苷酸序列。在本申请的一优选的实施方案中,采用F30脚手架RNA(SEQ ID NO:6),其与所述核酸适配体分子的连接方式如图2所示;在在本申请的另一优选的实施方案中,采用tRNA脚手架RNA(SEQ IDNO:7),其与所述核酸适配体分子的连接方式如图3所示。
本申请中所述的“核酸适配体分子”是一种RNA分子,或者部分核苷酸被替换成脱氧核糖核苷酸的DNA-RNA杂交分子。其中的核苷酸可以是它们的D和L对映体形式,同时也包含它们的衍生物,包括但不限于2’-F,2’-氨基,2’-甲氧基,5’-iodo,5’-溴-修饰的多聚核苷酸。核酸包含各种修饰的核苷酸。
循环更替突变体
“循环更替突变体”在本申请中指将核酸适配体分子原来的5’端和3’端采用核苷酸序列进行可操作性连接,同时在核酸适配体分子的其他位置引入新的5’端和3’端。在本发明的一具体实施方式中,所述核酸适配体分子的循环更替突变体二级结构如图7所示,其仍保留结合特定荧光团分子并显著激活其荧光的能力,其对应的RNA序列分别为SEQ IDNO:46和47。
同一性
“同一性”在本申请中描述两个核苷酸序列之间的相关性。本申请的两个适配体核苷酸序列的同一性计算中不包括(a)序列中的N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31、N34。就本申请而言,两个核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends in Genetics 16:276-277)的Needle程序,优选3.0.0版或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的任选参数为缺口罚分(gappenalty)10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62取代矩阵(BLOSUM62的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”(使用-nobrief选项获得)的输出结果作为百分比同一性,并计算如下:
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)。
如本申请表1中Capsicum(C5U)的序列为N1CAUUGUGGCGUGUCGN17-N18-N19ACUGGCGCUN29-N30-N31CAGN34,Capsicum(C5A)的序列为N1CAUAGUGGCGUGUCGN17-N18-N19ACUGGCGCUN29-N30-N31CAGN34,对它们同一性比对的时候,按照本申请的定义,应不包含N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34的核苷酸碱基,因此它们的序列同一性比对结果为96.3%(相差1个核苷酸)。
荧光团分子
本申请所述的“荧光团分子”也称为“荧光团”或“荧光分子”。“荧光团分子”在本申请中是一类可被条件性激活的荧光团分子。它们在没有核酸适配体的情况下显示出较低的量子产率。在具体的实施方式中,当没有与特定适配体结合时,荧光团的量子产率低于0.1,更优的低于0.01,最优的低于0.001;当荧光团被特定适配体结合后,荧光团的量子产率提高2倍以上,更优的提高10倍以上,最优的提高100倍以上。荧光团分子优选水溶性的,对细胞无毒且易穿透膜的。本申请的荧光团优选能够通过主动运输或者被动扩散通过细胞膜或细胞壁进入细胞浆或细胞周质。在本申请的实施方式中,荧光团可以透过革兰氏阴性菌的外膜和内膜,植物细胞的细胞壁和细胞膜,真菌和细胞壁和细胞膜,动物细胞的细胞膜,以及活体动物的GI和内皮细胞膜。
本申请所述的核酸适配体分子可以特异性结合一种荧光团,显著增加其在特定波长激发下的荧光值。“提高荧光信号”、“荧光增加”、“提高荧光强度”、“增加荧光强度”在本申请中指合适波长激发光照射下荧光团量子产率的提高,或者荧光信号最大发射峰的迁移(相对乙醇或者水溶液中荧光团本身的发射峰),或者摩尔消光系数的增加,或者以上的两种或更多。在本申请一优选实施方式中,量子产率的增加至少是2倍;在本申请另一优选实施方式中,量子产率的增加至少是5-10倍;在本申请另一更优选实施方式中,量子产率的增加至少是20-50倍;在本申请另一更优选实施方式中,量子产率的增加至少是100-200倍;在本申请另一更优选实施方式中,量子产率的增加至少是500-1000倍;在本申请另一更优选实施方式中,量子产率的增加至少是1000-10000倍;在本申请另一更优选实施方式中,量子产率的增加大于10000倍;用于激发荧光团产生荧光信号的光源可以是任意合适的光照设备,如包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光;激发光既可以是直接从这些设备中发出,也可以间接通过其他荧光团获取,如FERT的供体荧光团,或BRET的供体发光团。
靶标分子
本申请所述的靶标分子可以是任意的生物材料或者小分子,包括但不限于:蛋白质,核酸(RNA或者DNA),脂质分子,碳水化合物,激素,细胞因子,趋化因子,代谢物金属离子等。靶标分子可以是与疾病或者病原菌感染相关的分子。
通过在本申请所述的适配体分子,如图1所示的结构中,该插入的核苷酸序列替换了图1中的N17、N18、N19的茎-环结构,该核苷酸序列可以特异性识别/结合靶标分子。当靶标分子不存在时,适配体分子与荧光团分子不结合或结合能力弱,不能显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光;当靶标分子存在时,靶标分子与所述核苷酸序列的结合会促进适配体分子与荧光团分子的结合,显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光,实现对靶标分子的检测、成像和定量分析。
靶标分子也可以是整个细胞或表达在整个细胞表面的分子。典型的细胞包括但不限于癌症细胞、细菌细胞,真菌细胞以及正常动物细胞。靶标分子也可以是病毒颗粒。目前很多的上述靶标分子的适配体被鉴定出来,它们可以被整合本申请中的多价核酸适配体中。目前已报道的可以结合靶标分子的RNA适配体包括但不限于:T4 RNA聚合酶适配体,HIV逆转录酶适配体,噬菌体R17衣壳蛋白适配体。
在本申请的一个优选的实施方案中,靶标分子为SAM,其对应的识别靶标分子的探针序列如SEQ ID NO:38(图11A所示)。
目标核酸分子
“目标核酸分子”又称“靶标核酸分子”是指待检测的核酸分子,可以是细胞内的,也可以是细胞外的;包括目标RNA分子和目标DNA分子。本申请通过将目标核酸分子与所述核酸适配体分子连接,通过荧光团分子与核酸适配体分子结合,显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光值,进而实现检测目标核酸分子的含量与分布的目的。
“目标RNA分子”在本申请中包括任意的RNA分子,包括但不限于pre-mRNA,编码细胞本身或外源表达产物的mRNA,pre-rRNA,rRNA,tRNA,hnRNA,snRNA,miRNA,siRNA,shRNA,sgRNA,crRNA,长链非编码RNA,噬菌体衣壳蛋白MCP识别结合序列MS2RNA、噬菌体衣壳蛋白PCP识别结合序列PP7RNA,λ噬菌体转录终止蛋白N识别结合序列boxB RNA等。靶标RNA可以融合在本申请RNA适配体分子的5’端或3’端或N17-N18-N19的位置。
核酸适配体的串联体
本申请所述的核酸适配体分子进一步还可包含可以结合多个荧光团分子的串联体。所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起,串联的Capsicum结构的个数可以是2,3,4,5,6,7,8,9,10或者更多。在本申请一优选的实施方案中,串联的形式为“串联1”,如图6A所示,优选的核苷酸序列为SEQ ID NO:11、12、13或14;其中的2Capsicum-3表示具有2个Capsicum-3结构的串联体1;在本申请另一优选的实施方案中,串联的形式为“串联2”,如图6B所示,优选的核苷酸序列为SEQ ID NO:15、16、17或18;其中的2Capsicum-4表示具有2个Capsicum-4结构的串联体2;在本申请另一优选的实施方案中,串联的形式为“串联3”,如图6C所示,优选的核苷酸序列为SEQ ID NO:19、20、21或22;其中的2xCapsicum-5表示具有2个Capsicum-5结构的串联体3;在本申请另一优选的实施方案中,串联的形式为“串联4”,如图6D所示,优选的核苷酸序列为SEQ ID NO:23、24或25;其中的2x2Capsicum-3表示具有4个Capsicum-3结构的串联体4;在本申请另一优选的实施方案中,串联的形式为“串联5”,如图6E所示,优选的核苷酸序列为SEQ ID NO:26、27或28;其中的2x2Capsicum-4表示具有4个Capsicum-4结构的串联体5;无论何种形式,串联体之间的间隔序列可以进行更换
本申请所述的单体形式的适配体是指仅含有1个Capsicum结构的适配体,也就是含2个茎结构,2个环结构和2个茎环结构(图1A)的适配体。
多聚体形式的适配体是指含有1个以上Capsicum结构的适配体,包含但不限于图6所示的串联形式构成的适配体。
适配体-荧光团复合物
本申请的适配体-荧光团复合物包含1个核酸适配体分子以及1个或多个荧光团分子。在本申请的一具体实施方式中,包含1个核酸分子以及1个荧光团分子的分子复合物为Capsicum-HBC485、Capsicum-HBC497、Capsicum-HBC508、Capsicum-HBC514、Capsicum-HBC525、Capsicum-HBC530、Capsicum-HBC599和Capsicum-HBC620。
在本申请的另一具体实施方式中,串联体的核酸分子与多个荧光团分子的形成复合物,例如以“串联1”方式形成的包含8个适配体单元的F30-8Capsicum-3与8个荧光体分子HBC530形成的复合物8Capsicum-3-8HBC485、8Capsicum-3-8HBC497、8Capsicum-3-8HBC508、8Capsicum-3-HBC514、8Capsicum-3-8HBC525、8Capsicum-3-8HBC530、8Capsicum-3-8HBC599和8Capsicum-3-8HBC620。所述分子复合物可以在体外以单独的两种溶液形式存在,或者在同一种溶液中存在,也可以存在于细胞内。
核酸适配体功能
本申请的适配体功能指可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度,可以采用具体实施例中的常用实验方法(五)核酸适配体的功能检测来对适配体进行检测。在本申请的一个优选实施方式中,荧光强度的增加至少是2倍(荧光强度按照实验方法(五)进行检测);在本申请另一优选实施方式中,荧光强度的增加至少是5-10倍;在本申请另一更优选实施方式中,荧光强度的增加至少是20-50倍;在本申请另一更优选实施方式中,荧光强度的增加至少是100-200倍;在本申请另一更优选实施方式中,荧光强度的增加至少是500-1000倍;在本申请另一更优选实施方式中,荧光强度的增加至少是1000-10000倍;在本申请另一更优选实施方式中,荧光强度的增加大于10000倍。
核酸适配体二级结构
本专利中的核酸适配体的二级结构是利用mFold在线分析软件模拟预测得到的(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)。二级结构中的茎结构是指核酸适配体分子单链内某些区域靠氢键互补配对形成局部双链结构。一般情况下,双链结构的形成并不需要该段区域内的所有核苷酸均发生互补配对;一般情况下,N1与N34、N17与N19以及N29与N31中其中一段序列的至少50%的核苷酸与另一片段发生发生互补配对即可形成茎结构。如果N1与N34是单个核苷酸,则需要N1与N34完全互补才能形成茎结构(如图1所示)。
表达核酸适配体的DNA分子
所述DNA分子包含可以编码本申请的核酸适配体分子的DNA序列。所述DNA分子包含核苷酸序列R1CATCGTGGCGTGTCGR17-R18-R19ACTGGCGCTR29-R30-R31CAGR34,以及其具有至少70%同一性的核苷酸序列。其中R1编码通式Capsicum结构中的N1,R17编码通式Capsicum结构中的N17,R18编码通式Capsicum结构中的N18,R19编码通式Capsicum结构中的N19,R29编码通式Capsicum结构中的N29,R30编码通式Capsicum结构中的N30,R31编码通式Capsicum结构中的N31,R34编码通式Capsicum结构中的N34。所述DNA分子还可包含一个控制DNA转录的启动子,启动子与编码核酸适配体的DNA序列之间可操作性连接。在本申请的一具体实施方式中,DNA分子包含U6启动子;在本申请的另一具体实施方式中,DNA分子包含CMV启动子。DNA分子包含所述DNA分子进一步还可包含编码任意目标核酸分子的DNA序列。在本申请的一具体实施方式中,编码目标RNA的DNA分子包含编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的DNA序列(嵌合RNA的序列分别为SEQ ID No:29、33)。在本申请的一具体实施方式中,编码目标RNA的DNA分子包含编码蓝色荧光蛋白(BFP)的DNA序列(嵌合RNA的序列分别为SEQ ID No:30、34)。
启动子
“启动子”在本申请中包括真核细胞与原核细胞启动子。真核细胞的启动子序列与原核细胞的启动子序列完全不同。一般地,真核启动子不能被原核细胞中的RNA聚合酶所识别介导RNA的转录。同理,原核启动子也不能被真核细胞中的RNA聚合酶所识别介导RNA的转录。不同启动子的强度差别很大(强度指介导转录的能力)。根据实际应用的不同,可以使用强启动子达到高水平转录。比如当用于标记的话,高水平表达就比较好,而如果评估转录行为,较低水平的转录可以允许细胞及时的处理转录过程。根据宿主细胞的不同,可以选用一种或者多种合适的启动子。例如,当在大肠杆菌细胞中使用时,T7噬菌体启动子,lac启动子,trp启动子,recA启动子,核糖体RNA启动子,λ噬菌体中的PR和PL启动子,以及其他启动子,但不限于:lacUV5启动子,ompF启动子,bla启动子,lpp启动子等。此外,一个杂交的trp-lacUV5启动子(tac启动子)或者其他通过重组或合成DNA技术得到的大肠杆菌启动子,均可用于转录本申请所述的RNA适配体。细菌中本身的一些操作子序列可以与启动子序列结合在一起构成诱导型启动子,此时需要加入特定的诱导物才能诱导DNA分子的转录。比如lac操作子需要加入乳糖或者乳糖类似物(IPTG)诱导其表达,其他的操作子还有trp,pro等。
如上所述,DNA分子编码序列的5’端的调控序列是启动子。无论是体外转录获得RNA适配体,还是在培养的细胞或组织中表达适配体,都需要依据启动子的强度选择合适的启动子。由于体内表达适配体可以被遗传操作,另一类型的启动子就是响应特定环境诱导DNA转录的诱导型启动子,如表达在特定的组织,特定的时间,特定的发育阶段等。这些不同的启动子可以被RNA聚合酶I,II或III识别。
真核细胞中转录的启动也需要合适的启动子,包括但不限于β-球蛋白启动子,CAG启动子,GAPDH启动子,β-肌动蛋白启动子,肌动蛋白启动子,Cstf2t启动子,SV40启动子,PGK启动子,MMTV启动子,腺病毒Ela启动子,CMV启动子等。真核细胞中转录的终止依赖于RNA序列中特定的切割位点。同样的,RNA聚合酶转录基因的不同,其转录终止子也差别很大。然而,筛选合适的3’转录终止子区域是本领域人源日常的实验技能就能实现。
表达系统
本申请的“表达系统”,也称为“表达载体”,包含整合有表达核酸适配体的DNA分子。本申请的表达系统,可以是一个质粒,也可以是病毒颗粒。
“表达载体”重组病毒可以通过将质粒转染进入感染病毒的细胞中获得。合适的载体包括但不限于病毒载体如λ载体系统gt11,gt WES.tB,Charon 4,质粒载体包括pBR322,pBR325,pACYC177,pACYC184,pUC8,pUC9,pUC18,pUC19,pLG399,pR290,pKC37,pKC101,pBluescript II SK+/-或KS+/-(见Stratagene克隆系统),pET28系列,pACYCDuet1,pCDFDuet1,pRSET系列,pBAD系列,pQE,pIH821,pGEX,pIIIEx426 RPR等。
大量的宿主表达系统可以用于表达本申请所述的DNA分子。主要地,载体系统必须要与所用的宿主细胞相容,宿主载体系统包括但不限于:转化的噬菌体DNA,或质粒DNA,或考斯质粒DNA的细菌;包含酵母载体的酵母;感染病毒的哺乳动物细胞(如腺病毒,腺相关病毒,逆转录病毒);感染病毒的昆虫细胞(如杆状病毒);感染细菌或者通过粒子轰击转化的植物细胞。所述的载体中的表达元件的强度和特性差异很大。根据使用的宿主-载体系统选用任意一种或多种合适的转录元件。
一旦构建的DNA分子被克隆到载体系统中,很容易将它们转入宿主细胞中。根据不同的载体或宿主细胞系统,方法包括但不限于转化,转导,接合,固定,电转等。
在本申请的一具体实施方式中,提供含编码Capsicum-4RNA的DNA分子的表达质粒pET28a-T7-Capsicum-4、pEGFP-Capsicum-4。在本申请的另一具体实施方式中,提供含编码GAPDH-4Capsicum-3和BFP-4Capsicum-3的DNA分子的表达质粒pCDNA3.1hygro(+)-GAPDH-4Capsicum-3和pCDNA3.1 hygro(+)-BFP-4Capsicum-3。
本申请也提供整合了编码核酸适配体DNA分子,但目标RNA分子编码DNA序列空缺的表达载体,目标RNA分子的编码DNA序列空缺是让用户可以自行选择所需检测的目标RNA分子的DNA序列,例如GAPDH mRNA对应的编码DNA序列,用标准的重组DNA技术将DNA序列插入本申请的这种表达载体中,将获得的表达载体导入到(转染、转化、感染等)宿主细胞,检测目标RNA的含量及分布。
宿主细胞
“宿主细胞”在本申请中包括但不限于细菌,酵母,哺乳动物细胞,昆虫细胞,植物细胞,斑马鱼细胞,果蝇细胞,线虫细胞。宿主细胞更优选培养的体外细胞或整个体内活体组织。本申请中的宿主细胞,其包含的哺乳动物细胞包括但不限于297T,COS-7,BHK,CHO,HEK293,HeLa,H1299,受精卵干细胞,诱导全能干细胞,从哺乳动物组织中直接分离的原代细胞等;其包含的大肠杆菌细胞包括但不限于BL21(DE3)、BL21(DE3,Star)、TOP10、Mach1、DH5α;其包含的酵母细胞包含但不限于BY4741,BY4742,AH109。
检测阵列
本申请所述的检测阵列包含一个或多个本申请的核酸适配体分子,其中核酸适配体分子被锚定在阵列表面的离散位置,阵列表面是由固体支撑物构成,包括但不限于玻璃、金属、陶瓷等。将本申请所述核酸适配体分子锚定到阵列表面可通过但不限于以下方法:(1)利用生物素标记所述核酸适配体分子的5’或3’端,将链霉亲和素包被在阵列表面,通过生物素与链霉亲和素的特异性结合将所述核酸适配体分子进行锚定;(2)将噬菌体衣壳蛋白MCP识别结合序列MS2、噬菌体衣壳蛋白PCP识别结合序列PP7或λ噬菌体转录终止蛋白N识别结合序列boxB RNA序列融合在所述核酸适配体分子的5’、3’或茎环结构,将它们识别结合的蛋白MCP、PP7或λN蛋白包被在阵列表面,通过MS2与MCP蛋白、PP7与PCP蛋白或boxB RNA与λN蛋白的特异性作用将所述核酸适配体分子进行锚定;(3)将一段RNA或DNA序列融合在所述核酸适配体分子的5’或3’端,将与该段RNA序列互补配对的RNA序列或与该段DNA序列互补配对的DNA序列锚定在阵列表面,通过分子杂交的原理将所述核酸适配体分子锚定在阵列表面。所述检测阵列可用于检测靶标分子的存在与否以及浓度高低,因此,只有在靶标分子存在下,所述核酸适配体分子才会与荧光团分子结合,显著提高其在合适激发光波长下的荧光强度,且在一定范围内,靶标分子的浓度越高,荧光强度越高。
试剂盒
本申请的试剂盒,包含本申请所述的核酸适配体分子和/或荧光团分子,及相应的说明书;或者包含表达所述核酸适配体分子的表达系统和/或荧光团分子,及相应的说明书;或者包含表达核酸适配体分子表达系统的宿主细胞和/或荧光团分子,及相应的说明书。试剂盒中的核酸适配体分子与荧光团分子分别存在于单独的溶液中,或者核酸适配体分子与荧光团分子在同一溶液中。
以下用实施例对本申请作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明,而不对本申请的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法,这些方法是本领域普通技术人员所熟知的,例如:简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著,黄培堂等译:《分子克隆实验指南》(第三版,2002年8月,科学出版社出版,北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例,不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本申请。
实施例中所用的pCDNA3.1 hygro(+)质粒载体购自Invitrogen公司,pEGFP-puro质粒载体购自Sigma公司,pET28a质粒载体购自Novagen公司。所有用于PCR的引物均由上海杰瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定,序列测定由杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自上海翊圣生物科技有限公司,PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司,三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。EcoRI、BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、SacI、XbaI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4 PNK)、T7 RNA聚合酶购自Fermentas公司,购买时附带有相对应的缓冲液等。实施例中所用的Hieff CloneTMOne Step克隆试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。除非特别声明,无机盐类化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。卡那霉素(Kanamycin)购自Ameresco公司;氨苄青霉素(Amp)购自Ameresco公司;384孔和96孔荧光检测黑板购自Grenier公司。SAM购自Sigma公司。
实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大),普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。BL21(DE3,Star)菌株购自Invitrogen公司。293T/17细胞和COS-7细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。BY4741酵母菌株购自上海唯地生物技术有限公司。
实施例中用到的主要仪器:Synergy Neo2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司),X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司),Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司),PCR扩增仪(德国Biometra公司),活体成像系统(美国Kodak公司),光度计(日本和光公司),核酸电泳仪(申能博彩公司)。
缩写词意义如下:“h”指小时,“min”指分钟,“s”指秒,“d”指天,“μL”指微升,“ml”指毫升,“L“指升,“bp”指碱基对,“mM”指毫摩尔,“μM”指微摩尔,“μm”指微米。
实施例中常用实验方法及材料
(一)核酸适配体分子制备:
利用含T7启动子的引物对待检测RNA对应的cDNA进行扩增,利用T7 RNA聚合酶(购自Fermentas公司)以回收得到的双链cDNA为模板转录获得RNA。在20μL的转录体系中加入10μL 3M NaAc,115μL DEPC水,混匀后加入150μL酚氯仿-异丙醇混合液(苯酚:氯仿:异丙醇=25:24:1),振荡混匀,10000rpm离心5min后取上清。加入等体积氯仿溶液,振荡混匀,10000rpm离心5min后取上清,反复一次。在上清中加入2.5倍体积的无水乙醇,-20℃冰箱放置30min,4℃12000rpm离心5min,弃上清,利用75%预冷的无水乙醇清洗沉淀2次。待乙醇挥发完后,加入适当量的筛选缓冲液重悬沉淀,75℃处理5min,室温放置10min以上,用于后续实验。
(二)细胞培养及转染:
本实施例中的细胞均在CO2培养箱中用含10%胎牛血清(FBS)及链霉素和青霉素高糖培养基(DMEM)培养,生长达到80-90%汇合度时将细胞传代培养。转染时,用HD(购自Promega)按照说明书进行操作。/>
(三)荧光成像:
实施例中主要的成像实验是利用Leica SP8共聚焦激光显微镜进行拍摄,使用HCXPL APO 63.0x1.47油镜和HyD检测器。为了拍摄Capsicum-HBC530复合物和Pepper-HBC530复合物荧光,使用488nm激光器。为了拍摄BFP荧光,使用405nm激光器。为了拍摄Capsicum-HBC485和Pepper-HBC485、Capsicum-HBC497和Pepper-HBC497、Capsicum-HBC508和Pepper-HBC508、Capsicum-HBC514和Pepper-HBC514、Capsicum-HBC525和Pepper-HBC525、Capsicum-HBC599和Pepper-HBC599、Capsicum-HBC620和Pepper-HBC620的荧光,分别使用458nm、458nm、488nm、488nm、488nm、561nm、561nm的激光器。为了拍摄Spinach2-DFHBI-1T和Broccoli-BI的荧光,使用488nm激光器。为了拍摄Corn-DFHO和redBroccoli-OBI的荧光,使用561nm激光器。
(四)基于同源重组方法的重组质粒构建
1.制备线性化载体:选择合适的克隆位点,并对载体进行线性化,可采用酶切或反向PCR扩增制备线性化载体。
2.PCR扩增制备插入片段:通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25bp(不包括酶切位点)的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。
3.线性化载体与插入片段浓度测定:将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度,原始产物和稀释后产物各取1μL进行琼脂糖凝胶电泳,与DNA分子量标准(DNA Marker)比较条带亮度以确定其近似浓度。
4.重组反应
重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol;最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3,即最适插入片段使用量为0.06-0.09pmol。
X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用。体系配制完成后,混匀各组分,置于50℃反应20min。当插入片段>5kb时,可将孵育温度延长至25min。待反应完成后,建议将反应管置于冰上冷却5min。反应产物可直接进行转化,也可储存于-20℃,待需要时解冻转化。
(五)核酸适配体的功能检测
按照常用实验方法(一)制备Capsicum或Pepper突变体核酸适配体分子,将5μM核酸适配体分子与1μM荧光团分子在检测缓冲液(40mM HEPES,pH 7.4,125mM KCl,5mMMgCl2,5% DMSO)中孵育,利用Synergy Neo2多功能酶标仪检测获取核酸适配体-荧光团分子复合物荧光的最大激发峰和最大发射峰。再利用Synergy Neo2多功能酶标仪检测核酸适配体-荧光团分子复合物在其最大激发和发射条件下的荧光强度,对照样品(不含核酸适配体的1μM荧光团分子)也在相同的条件进行测定,计算荧光强度的比值。如5μM F30-Capsicum-1核酸适配体与1μM HBC530荧光团分子形成的复合物的荧光最大激发峰为485nm,最大发射峰为530。利用Synergy Neo2多功能酶标仪检测该复合物在485±10nm激发、530nm±10nm发射条件下的荧光强度为36000,而对照(1μM HBC530荧光团分子)在相同检测条件下的荧光强度为10,那么F30-Capsicum-2核酸适配体对HBC530荧光团分子的激活倍数为3600倍。
实施例1.Capsicum核酸适配体分子的二级结构
利用mFold在线RNA结构分析软件分析Capsicum核酸适配体的二级结构。Capsicum包含2个茎结构,2个环结构和2个茎环结构(图1A)。对于其中一种茎1和茎环的序列,Capsicum-1(SEQ ID NO:1)预测的二级结构为图1B。
实施例2.Capsicum-HBC530复合物性质鉴定
为了检测Capsicum-HBC530复合物的光谱性质,按照常用实验方法(一)制备Capsicum-4(SEQ ID NO:4)RNA。将1μM HBC530与5μM Capsicum-4孵育。检测结果显示,Capsicum-3-HBC530复合物的最大激发光为485nm,最大发射光为530nm(图4A)。
为了检测Capsicum是以单体的形式还是多聚体的形式与HBC530结合,对Capsicum-4进行Native PAGE鉴定,用已知的单体形式的核酸适配体Pepper(SEQ ID NO:8)(Chen etal.Nature Biotechnology.2019.37(11):1287-1293)为对照。荧光成像结果与SYBR Gold(通用核酸染料,购自Invitrogen)染色结果对比可以发现,Capsicum位于小于100bp大小的位置,与Pepper类似,这与其实际大小67bp是一致的。因此,结果说明Capsicum也是以单体的形式与HBC530结合的(图4B)。
为了检测Capsicum与HBC530结合的镁离子依赖性,在不同镁离子浓度下将20nM的Capsicum-4与50nM的HBC530孵育后,检测它们的荧光值。检测结果显示Capsicum-4与HBC530结合后的镁离子解离常数为159nM远小于Pepper与HBC530结合后的434nM(图4C),说明Capsicum-4与HBC530结合后对镁离子的依赖性远小于Pepper与HBC530结合形成的复合物。
为了检测Capsicum与HBC530结合的结合常数,利用2nM的Capsicum-4与不同浓度的HBC530孵育,检测它们的荧光值。检测结果显示Capsicum-4与HBC530结合的结合常数为4nM(图4D)。
为了检测Capsicum的温度稳定性,将10μM HBC530与1μM Capsicum-4在包含0.5mMMg2+缓冲溶液中孵育,然后置于不同的温度下放置5min,检测荧光值。以10μMHBC530与1μMCapsicum-4(SEQ ID NO:4)孵育为对照。检测结果显示,Capsicum-4的Tm值为41℃,显著高于Pepper的34℃(图4E),说明Capsicum有着更好的温度稳定性。
为了检测Capsicum-HBC530复合物在不同pH下的稳定性,将Capsicum-4-HBC530复合物置于不同pH环境下60min,检测荧光值。以Pepper-HBC530复合物为对照。检测结果显示,Capsicum-4-HBC530复合物在pH5-9的范围内均保持很高的荧光信号(图4F),说明Capsicum-4-HBC530复合物有着更好的pH稳定性。
为了比较Capsicum-4-HBC530复合物与Pepper-HBC530复合物在不同镁离子浓度下荧光强度,将10μM HBC530与1μM Capsicum-4分别在包含0、0.2、0.5、1、2、5、10mM Mg2+缓冲溶液中孵育,以10μM HBC530与1μM Pepper孵育为对照(图4G),说明在不同镁离子浓度条件下Capsicum-4-HBC530复合物均具有更高的荧光强度,至少是Pepper-HBC530复合物荧光强度的1.5倍。
为了比较Capsicum-4-HBC530复合物与Pepper-HBC530复合物在不同温度下荧光强度,将10μM HBC530与1μM Capsicum-4分别在20℃、37℃孵育30min,以10μM HBC530与1μMPepper孵育为对照(图4H),说明不同温度下Capsicum-4-HBC530复合物相较于Pepper-HBC530复合物均具有更高的荧光强度。
实施例3.不同Capsicum突变体对HBC530荧光团分子的荧光激活效果
为了检测不同Capsicum突变体对HBC530荧光团分子的荧光激活效果,对F30-Capsicum-1中Capsicum-1序列进行如表1所示的点突变,按照常用实验方法(一)制备含不同碱基突变的Capsicum突变体RNA,将1μM HBC530分别与5μM不同的F30-Capsicum-1突变体RNA孵育,按照常用实验方法(五)它们对HBC530荧光团分子的荧光激活倍数。检测结果显示,大部分含单个碱基突变的F30-Capsicum-1突变体保留对HBC530的较强的荧光激活效果(>10倍)(表2)。部分含2-7个碱基突变的F30-Capsicum-1突变体仍保留对HBC530的较强的荧光激活效果(>100倍)(表3)。综上,Capsicum的很多单碱基和多碱基突变体仍保留激活HBC530荧光团分子的适配体功能。
表2含单碱基突变的Capsicum突变体对HBC530的激活效果
突变体 | 激活倍数 |
Capsicum-4 | 4150 |
C5U | 3022 |
C5A | 563 |
U12C | 1562 |
U12G | 59 |
G13A | 1160 |
U14A | 1657 |
U14C | 340 |
C15U | 952 |
G16A | 862 |
G16C | 786 |
A20G | 879 |
A20C | 668 |
C21U | 1054 |
C21G | 983 |
U22G | 168 |
U22C | 42 |
G23A | 246 |
G23C | 198 |
G24U | 1952 |
U28C | 4040 |
注:表2中的Capsicum-4是序列为SEQ ID NO:4的核酸适配体;其它的适配体是在Capsicum-4序列中与图1A的Capsicum对应核苷酸位置做的点突变。
表3含多碱基突变的Capsicum突变体对HBC530的激活效果
实施例4.碱基修饰的Capsicum对HBC530的激活效果
为了检测经碱基修饰的Capsicum对HBC530的激活效果,合成含碱基修饰的Capsicum-6(SEQ ID NO:44,该序列GGGGCCAUCGUGGCGUGUCGACCUGCUUCGGCAGGUACUGGCGCUGGGCCGAAAGGCCCCAGGCCCC中带下划线的碱基为脱氧核糖核苷酸碱基)和Capsicum-7(SEQ IDNO:45,该序列GGGGGCCAUCGUGGCGUGUCGACCUGCUUCGGCAGGUACUGGCGCUGGGCCGAAAGGCCCCAGGCCCCC中带下划线的碱基为经2’-F修饰的碱基)(由上海吉玛制药技术有限公司合成),它们分别含茎-环结构碱基替换为脱氧核糖核苷酸(图5A中阴影部分的碱基)和部分碱基经2’-F修饰(图5B中阴影部分的碱基)。按照常用实验方法(五)检测这些碱基修饰的Capsicum对HBC530荧光团分子的荧光激活效果。检测结果显示,经碱基修饰的Capsicum-6和Capsicum-7依然可以显著激活HBC530荧光团分子的荧光(图5C)。
实施例5.Capsicum串联体
为了检测Capsicum串联体对HBC530荧光的激活效果,将Capsicum按照不同的形式进行串联,包含以下三种:
(1)“串联1”方式(图6A),将Capsicum结构上的“头”和“茎环2”按照“头-尾”连接的方式进行连接,以此获得nCapsicum(其中n为可为任意拷贝的Capsicum)。在本实施例中,分别全基因合成F30-2Capsicum-3、F30-4Capsicum-3、F30-8Capsicum-3和F30-16Capsicum-3的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14),PCR扩增后,按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA,将0.1μM RNA适配体与10μM HBC530孵育后,按照常用实验方法(五)检测荧光强度。检测结果显示,随着n的增加,nCapsicum-HBC530的荧光也随之增加(图6F)。当n>8时,随着n的增加,nCapsicum-III-3的荧光并不是等倍数增加,但依然比Capsicum-HBC530的荧光要高很多(图6F),说明可以通过“串联1”方式提高Capsicum-HBC530复合物的荧光强度。
(2)“串联2”方式(图6B),将Capsicum结构上的“头”和“茎环1”按照“头-尾”连接的方式进行连接,以此获得nCapsicum(其中n为可为任意拷贝的Capsicum)。在本实施例中,分别全基因合成F30-2Capsicum-4、F30-4Capsicum-4、F30-8Capsicum-4和F30-16Capsicum-4的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18),PCR扩增后,按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA,将0.1μM RNA适配体与10μM HBC530孵育后,按照常用实验方法(五)检测荧光强度。检测结果显示,随着n的增加,nCapsicum-HBC530的荧光也随之增加(图6G)。当n>8时,随着n的增加,nCapsicum-HBC530的荧光并不是等倍数增加,但依然比Capsicum-HBC530的荧光要高很多(图6G),说明可以通过“串联2”方式提高Capsicum-HBC530复合物的荧光强度,并且“串联2”能提高的荧光强度弱于“串联1”形式。
(3)“串联3”方式(图6C),将Capsicum作为一个结构单元进行串联,以此获得nxCapsicum(其中n为可为任意拷贝的Capsicum)。在本实施例中,分别全基因合成2xCapsicum-5、4xCapsicum-5、8xCapsicum-5和16xCapsicum-5的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22),按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA,将0.1μM RNA适配体与10μM HBC530孵育后,按照常用实验方法(五)检测荧光强度。检测结果显示,随着n的增加,nCapsicum-HBC530的荧光也随之增加(图6H),说明可以通过“串联3”方式提高Capsicum-HBC530复合物的荧光强度。
(4)“串联4”方式(图6D),是将上述“串联1”与“串联3”结合起来,将“串联1”得到的nCapsicum作为一个结构单元按照“串联3”的方式进行串联,以此获得n1xn2Capsicum(其中n1和n2为可为任意拷贝的Capsicum)。在本实施例中,分别全基因合成2x2Capsicum-3、4x2Capsicum-3、8x2Capsicum-3的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25),按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA,将0.1μM RNA适配体与20μM HBC530孵育后,按照常用实验方法(五)检测荧光强度。检测结果显示,这种通过“串联4”方式得到的Capsicum串联体-HBC530的荧光强度要显著高于Capsicum-HBC530(图6I),说明可以通过“串联4”方式提高Capsicum-HBC530复合物的荧光强度。
(5)“串联5”方式(图6E),是将上述“串联2”与“串联3”结合起来,将“串联2”得到的nCapsicum作为一个结构单元按照“串联3”的方式进行串联,以此获得n1xn2Capsicum(其中n1和n2为可为任意拷贝的Capsicum)。在本实施例中,分别全基因合成2x2Capsicum-4、4x2Capsicum-4、8x2Capsicum-4的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28),按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA,将0.1μM RNA适配体与20μM HBC530孵育后,按照常用实验方法(五)检测荧光强度。检测结果显示,这种通过“串联3”方式得到的Capsicum串联体-HBC530的荧光强度要显著高于Capsicum-HBC530(图6J),说明可以通过“串联5”方式提高Capsicum-HBC530复合物的荧光强度,并且“串联5”能提高的荧光强度弱于“串联4”形式。
实施例6.Capsicum循环更替突变体
为了检测不同形式“循环更替突变体”的Capsicum对HBC530的激活效果,将Capsicum按照不同的形式“循环更替”得到Capsicum突变体:
(1)“循环更替”方式1
将Capsicum核酸适配体分子原来的5’端和3’端采用核苷酸序列进行可操作性连接,同时在Capsicum的茎-环2引入新的5’端和3’端,所述核酸适配体分子的循环更替突变体Capsicum-8二级结构如图7A所示,编码RNA适配体的序列为SEQ ID NO:46;
(2)“循环更替”方式2
将Capsicum核酸适配体分子原来的5’端和3’端采用核苷酸序列进行可操作性连接,同时在Capsicum的茎-环1引入新的5’端和3’端,所述核酸适配体分子的循环更替突变体Capsicum-9二级结构如图7B所示,编码RNA适配体的序列为SEQ ID NO:47;
按照常用实验方法(五)检测这些“循环更替突变体”对HBC530荧光团分子的荧光激活效果。检测结果显示,经“循环更替”的Capsicum-8和Capsicum-9依然可以显著激活HBC530荧光团分子的荧光(图7C)。
实施例7.HBC530类似物的性质鉴定
按照常用实验方法(一)制备Capsicum-4RNA适配体分子,利用其检测HBC530类似物与Capsicum结合的基本性质,包括荧光光谱、摩尔消光系数、量子产率和荧光激活倍数和结合常数(Kd),检测结果如表4所示,从表中数据可以看出,Capsicum-4可以不同程度地激活HBC530类似物的荧光强度。
表4:Capsicum-4RNA适配体分子与不同荧光分子结合的理化性质测定
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实施例8.Capsicum-HBC530复合物用于细菌中RNA的标记
为了检测Capsicum-HBC530在细菌中的效果,首先构建表达Capsicum-4的细菌表达质粒。利用引物对实施例2中的Capsicum-4进行扩增,利用引物对pET28a进行扩增去除了启动子和多克隆位点区,将扩增得到的Capsicum-4DNA片段与pET28a线性化载体按照实验方法(四)进行连接,得到的重组质粒命名为pET28a-T7-Capsicum-4。
扩增Capsicum-4片段所用的引物为:
上游引物(P1):5’-CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAGTCAGCCGGCATCGTGGCGTGTCGACCTGCT-3’
下游引物(P2):5’-CCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGGAGTCAGCCGGCTGGGGCCTTTCGGCC-3’
扩增pET28a载体使其线性化所用的引物为:
上游引物(P3):5’-TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAG-3’
下游引物(P4):5’-ATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACG-3’
将pET28a-T7-Capsicum-4重组质粒转化BL21(DE3,Star)大肠杆菌菌株,挑取单克隆37℃培养,在OD600=0.2左右时,加入1mM IPTG诱导Capsicum-4的表达,4h后收菌,利用含2μM HBC530的PBS溶液重悬。以转化了pET28a空载体的BL21(DE3,Star)大肠杆菌作为对照。结果显示,只有表达了Capsicum-4且在HBC530存在下,细菌才能显示出明亮的黄绿色荧光(图8),表明Capsicum-4复合物可以用于细菌中RNA的荧光标记。
实施例9.Capsicum-4与HBC530用于哺乳动物细胞中RNA的标记
为了检测Capsicum与HBC530和HBC620用于哺乳动物细胞中RNA的标记,以已报道的Pepper、Spinach2、Broccoli、redBroccoli和Corn核酸适配体分子(分别结合HBC530和HBC620、DFHBI-1T、BI、OBI、DFHO荧光团分子)作为对照(Chen et al.Nature Biotechnology.2019.37(11):1287-1293;Strack R L et al.Nature methods 2013.10(12):1219–1224;Fil onov et al.Journal of the American Chemical Society 2014.136:16299-16308;Li X et al.Journal of the American Chemical Society2020.142(33):14117–14124;Song et al.Nature che mical biology 2017.13:1187-1194),构建它们的哺乳动物细胞表达质粒。
分别引物P11和P12扩增实施例2中的F30-Capsicum-1和F30-Pepper以及全基因合成的F30-Spinach2、F30-Broccoli和F30-redBroccoli(编码的RNA序列分别为SEQ ID No:39、40、41),利用引物P13和P14扩增全基因合成的tRNA-Corn cDNA片段(编码的RNA序列为SEQ ID No:42),利用实验方法(四)将这些片段插入到pEGFP puro载体中。得到的表达载体命名为pEGFP-F30-Capsicum-1、pEGFP-F30-Pepper、pEGFP-F30-Spinach2、pEGFP-F30-Broccoli、pEGFP-F30-redBroccoli和pEGFP-tRNA-Corn,这些质粒分别表达F30-Capsicum-1、F30-Pepper、F30-Spinach2、F30-Broccoli、F30-redBroccoli和tRNA-Corn。
将pEGFP-F30-Capsicum-1、pEGFP-F30-Pepper、pEGFP-F30-Spinach2、pEGFP-F30-Broccoli、pEGFP-F30-redBroccoli和pEGFP-tRNA-Corn质粒转染293T/17细胞,24h后加入1μMHBC530和1μM HBC620同时对F30-Capsicum-1、F30-Pepper进行标记,使用20μM DFHBI、10μM BI、10μM OBI和10μM DFHO分别对F30-Spinach2、F30-Broccoli、F30-redBroccoli和tRNA-Corn进行标记,以不表达相应适配体的细胞作为对照,利用实验方法(三)检测标记效果。结果显示,F30-Capsicum-1-HBC530复合物展现出非常明亮的黄绿色荧光,荧光强度明显高于F30-Pepper-HBC530、F30-Spinach2-HBC530和F30-Broccoli-BI复合物(图9A和C),表明Capsicum-HBC530可以更好的在哺乳动物细胞中工作;F30-Capsicum-1-HBC620复合物展现出非常明亮的橙红色荧光,荧光强度明显高于F30-Pepper-HBC620、F30-redBroccoli-OBI和tRNA-Corn-DFHO复合物(图9B和D),表明Capsicum-HBC620可以很好的在哺乳动物细胞中工作,说明Capsicum-HBC系列染液组成的复合物发出的红色和绿色荧光都远高于现有的其他RNA-萤光团复合物,其在细胞中具有更稳定的性质、更亮的标记荧光。
扩增pEGFP-N1去除启动子和多克隆位点区所用的引物为:
上游引物(P5):5’-TTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCA-3’
下游引物(P6):5’-GGTGAAGGGGGCGGCCGCTCGAGG-3’
扩增载体使其线性化引入U6启动子所用的引物为:
上游引物(P7):5’-TCTAGAGCCCGGATAGCTCAGTCGGT-3’
下游引物(P8):5’-GGTGAAGGGGGCGGCCGCTCGAGG-3’
扩增U6启动子所用的引物为:
上游引物(P9):5’-GCCGCCCCCTTCACCGAGGGCCTATTTCCCATG-3’
下游引物(P10):5’-TATCCGGGCTCTAGAGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATAT-3’
扩增F30-Capsicum-1、F30-Pepper、F30-Spinach2、F30-Broccoli和F30-redBroccoli所用的引物为:
上游引物(P11):5’-TGGCGCTGGGCCGAAAGGCCCCAGCCTTCATTCATGGCAATTTTTTTGAATTC-3’
下游引物(P12):5’-GTACCTGCCGAAGCAGGTCGACACGCCACGATGCCTTCATCAGAGTATGTGGGCGAACC-3’
扩增tRNA-Corn所用的引物为:
上游引物(P13):5’-GGAAAGGACGAAACTCTAGAGCCCGGATAGCTCAGTCGG-3’
下游引物(P14):5’-TGTCTCGAGGTCGAGAATTCAAAAAAATGGCGCCCGAACAGGG ACTTGCGAGCTCAGGATCCTTCCGTTTCGCACTGG-3’。
实施例10.基于Capsicum的探针构建
为了构建基于Capsicum的待检测物探针,将Capsicum-4(SEQ ID No:4)结构中茎-环结构处的核苷酸更换为可以特异性识别结合S-腺苷蛋氨酸(SAM),这些适配体与Capsicum-4之间利用不同长度和组成的碱基进行连接(图11A),按照常用实验方法(一)制备探针RNA,将其与HBC530孵育,利用多功能酶标仪分别检测它们在有无SAM存在下的荧光强度。检测结果显示,对于SAM探针,当SAM适配体与Capsicum-4间的连接碱基为图11B中的连接1的碱基对时,激活倍数为4倍,对应的探针RNA序列为SEQ ID No:38。
实施例11.Capsicum用于示踪细胞中RNA定位
为了检测Capsicum用于示踪细胞中RNA定位,首先构建Capsicum与不同RNA融合的嵌合RNA的表达质粒。全基因合成4Capsicum-3和4Pepper的cDNA(其编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID No:12、43),利用引物扩增4Capsicum-3和4Pepper基因片段,利用同源重组的方法将它们插入到经HindIII和XhoI双酶切的pCDNA3.1 hygro(+)载体,得到pCDNA3.1hygro(+)-4Capsicum-3和pCDNA3.1 hygro(+)-4Pepper重组质粒。全基因合成GAPDH基因片段(GAPDH编码基因序列为Genebank:BC009081)和BFP基因片段(BFP编码基因序列为Genebank:MN623118),分别利用引物对GAPDH和BFP基因片段进行扩增,将它们分别插入到经NheI和HindIII双酶切的pCDNA3.1 hygro(+)-4Capsicum-3和pCDNA3.1hygro(+)-4Pepper载体中,获得pCDNA3.1 hygro(+)-GAPDH-4Capsicum-3、pCDNA3.1hygro(+)-GAPDH-4Pepper、pCDNA3.1 hygro(+)-BFP-4Capsicum-3和pCDNA3.1hygro(+)-BFP-4Pepper重组质粒,分别编码为GAPDH-4Capsicum-3、GAPDH-4Pepper、BFP-4Capsicum-3和BFP-4Pepper嵌合RNA,它们的序列分别为SEQ ID No:29、SEQ ID No:33、SEQ ID No:30和SEQ ID No:34。
利用引物P19和P20对pEGFP载体进行扩增,分别用引物P21、P22和P23、P24扩增实施例2中的Capsicum-4和Pepper,编码的RNA序列分别为SEQ ID No:4、8,,利用实验方法(四)将这些片段插入到pEGFP puro载体中,得到的表达载体命名为pEGFP-Capsicum-4、pEGFP-Pepper。利用引物P27和P28对pEGFP-Capsicum-4、pEGFP-Pepper载体进行扩增去除其本身的CMV启动子和多克隆位点区,并利用引物P29和P30扩增全基因合成5S基因片段,利用实验方法(四)将这些片段插入P31和P32扩增的载体pEGFP-Capsicum-4、pEGFP-Pepper中,获得5S-Capsicum-4和5S-Pepper重组质粒,编码为5S-Capsicum-4和5S-Pepper嵌合RNA,它们的序列为SEQ ID No:32和SEQ ID No:36。
利用引物P19和P20对pEGFP载体进行扩增,用引物P33和P34对全基因合成U6-Capsicum-4和U6-Capsicum基因片段扩增,利用实验方法(四)将这些片段插入使用P31和P32扩增得到的线性化pEGFP载体中,获得pEGFP-U6-Capsicum-4和pEGFP-U6-Pepper重组质粒,编码为U6-Capsicum-4和U6-Pepper嵌合RNA,它们的序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:35。
扩增4Capsicum-3所用的引物为:
上游引物(P15):5’-GTACTGGCGCTGGGCCGAAAGGCCCCAGCCTCCTTTTTTTGAAT TCTCGA-3’;
下游引物(P16):5’-CTGCCGAAGCAGGTCGACACGCCACGATGCCTCCTCTAGAGTTTCGTCCTTTCC-3’
扩增4Pepper所用的引物为:
上游引物(P17):5’-TGTCGGCCTGCTTCGGCAGGCACTGGCGCCGGGGCCCTTTTTTTTTTTGAATTCTCG-3’;
下游引物(P18):5’-CAGGCCGACACGCCACGATTGGGGGCCCTCTAGAGTTTCGTCCT T-3’
扩增pEGFP所用的引物为:
上游引物(P19):5’-TTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGC-3’
下游引物(P20):5’-CTAGAGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGC-3’
扩增Capsicum-4所用的引物为:
上游引物(P21):5’-GTACTGGCGCTGGGCCGAAAGGCCCCAGCCTCCTTTTTTTGAAT TCTCGA-3’;
下游引物(P22):5’-CTGCCGAAGCAGGTCGACACGCCACGATGCCTCCTCTAGAGTTTCGTCCTTTCC-3’
扩增Pepper所用的引物为:
上游引物(P23):5’-TGTCGGCCTGCTTCGGCAGGCACTGGCGCCGGGGCCCTTTTTTTTTTTGAATTCTCG-3’;
下游引物(P24):5’-CAGGCCGACACGCCACGATTGGGGGCCCTCTAGAGTTTCGTCCT T-3’
扩增GAPDH所用的引物为:
上游引物(P25):5’-GGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3’
下游引物(P26):5’-GGATCCTCCGTGGGAAGCTTAACCATGCTCTAGCGAGTGTTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’
扩增BFP片段所用的引物为:
上游引物(P27):5’-ATGAGCGAGCTGATTAAGG-3’
下游引物(P28):5’-AATTCTTAATTGAGCTTGTGCCCC-3’
扩增pEGFP-Capsicum-4和pEGFP-Pepper去除启动子引物为:
上游引物(P29):5’-TTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCA-3’
下游引物(P30):5’-GGTGAAGGGGGCGGCCGCTCGAGG-3’
扩增5S所用的引物为:
上游引物(P31):5’-GCCGCCCCCTTCACCGGCCCCGGGCTGGCGGTGTC-3’
下游引物(P32):5’-GGTATGGCCGTAGACGCTGAAGGAGGCGCCTGGCT-3’
扩增pEGFP所用的引物为:
上游引物(P33):5’-TTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGC-3’
下游引物(P34):5’-CTAGAGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGC-3’
扩增U6-Capsicum-4和Pepper所用的引物为:
上游引物(P35):5’-ATCTTGTGGAAAGGACGAAACTCTAGAGTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’
下游引物(P36):5’-GTCTCGAGGTCGAGAATTCAAAAAAACAAAAATATGGAACGC-3’
构建完成以上质粒后,均经测序鉴定插入的序列完全正确,用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒,用于后续转染实验。
将本实施例构建的pCDNA3.1 hygro(+)-GAPDH-4Capsicum-3、pCDNA3.1hygro(+)-GAPDH-4Pepper、pCDNA3.1 hygro(+)-BFP-4Capsicum-3和pCDNA3.1hygro(+)-BFP-4Pepper重组质粒分别转染COS-7细胞,将本实施例构建的5S-Capsicum-4、5S-Pepper、pEGFP-U6-Capsicum-4和pEGFP-U6-Pepper重组质粒分别转染293T/17细胞转染24h后按照具体实验方法(三)所述荧光成像方法对细胞进行成像。成像结果显示,GAPDH-4Capsicum-4和BFP-4Capsicum-3的荧光主要集中在胞浆中,U6-Capsicum-4和5S-Capsicum-4的荧光主要集中在细胞核中,这与之前的报道是一致的,且其荧光强度远高于Pepper的标记效果,以上结果显示Capsicum可用于示踪RNA的定位。
实施例12.HBC530类似物的合成
化合物Ⅲ-1:
4-N,N-二甲基-苯甲醛(0.35g,2.3mmol),4-氰基-苯乙腈(0.4g,2.8mmol)于100ml圆底烧瓶中,加入40ml无水乙醇溶解,加入二滴哌啶,Ar保护条件下油浴加热回流2h,反应完毕,冷却至室温,大量固体析出,过滤,冷乙醇冲洗滤饼三次,真空烘干的橙色固体(0.60g,95%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=3.05(s,6H),6.83(d,J=9.2Hz,2H,),7.84-7.94(m,6H),8.02ppm(s,1H).HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C18H16O3[M+H]+:274.1344.Found:274.1345.
化合物Ⅲ-2:
参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.34g,89%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=1.23(t,J=7.60Hz,6H),3.05(t,J=7.60Hz,4H),6.84(d,J=9.2Hz,2H,),7.84-7.95(m,6H),8.09ppm(s,1H).HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C20H20O3[M+H]+:302.1657.Found:302.1658.
化合物Ⅲ-5:
4-羟基-3,5-二氟-苯甲醛(0.32g,2.0mmol),4-氰基-苯乙腈(0.35g,2.4mmol)于100ml圆底烧瓶中,加入40ml无水乙醇溶解,加入二滴哌啶,Ar保护条件下油浴加热回流2h,反应完毕,冷却至室温,大量固体析出,过滤,冷乙醇冲洗滤饼三次,真空烘干的橙色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.80(d,J=9.0Hz,2H),7.74–7.66(m,4H),7.48(s,1H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C16H9F2N2O[M+H]+:283.0683.Found:283.0684.
化合物Ⅲ-9:
参照化合物Ⅲ-4的合成方法,(0.31g,92%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.55(d,J=4.0Hz,1H),8.31(dd,J=9.3,2.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.93(d,J=8.0Hz,2H),7.84(d,J=8.0Hz,2H),6.85(d,J=8.0Hz,1H),4.78(t,J=5.4Hz,1H),3.67(t,J=5.3Hz,2H),3.60(q,J=5.4Hz,2H),3.17(t,J=8.0Hz,4H),1.17(t,J=8.0Hz,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C22H26 N5[M+H]+:360.2188.Found:360.2187.
化合物Ⅲ-10:
其中,4-N,N-二甲基-6醛基-吡啶:
参照4-N-甲基-N-(2-N’,N’-二甲基-乙基)-苯甲醛的合成方法,(0.31g,49%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.86(d,J=0.6Hz,1H),8.17(d,J=2.9Hz,1H),7.83(d,J=8.9Hz,1H),6.94(dd,J=8.8,2.9Hz,1H),3.10(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C8H11N2O[M+H]+:151.1.Found:151.1.
化合物Ⅲ-10的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.36g,96%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.86(d,J=0.6Hz,1H),8.26(s,1H),8.17(d,J=2.9Hz,1H),7.83(d,J=8.9Hz,1H),7.46(m,4H),6.94(dd,J=8.8,2.9Hz,1H),3.10(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C17H15 N4[M+H]+:275.1297.Found:275.1298.
化合物Ⅲ-11:
其中,2-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-5-醛基-嘧啶:
参照4-N-甲基-N-(2-N’,N’-二甲基-乙基)-苯甲醛的合成方法,(0.42g,72%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.89(s,1H),8.73(s,2H),3.64(t,J=8.9Hz,2H),3.45(t,J=8.8Hz,2H),3.10(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C8H12 N3O[M+H]+:182.1.Found:182.1.
化合物Ⅲ-11的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.36g,96%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.26(s,1H),8.73(s,2H),7.64(m,4H),3.64(t,J=8.9Hz,2H),3.44(t,J=8.8Hz,2H),3.11(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C17H16 N5O[M+H]+:306.1355.Found:306.1356.
5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-2-醛基-嘧啶:
参照化合物4-N-甲基-N-(2-N’,N’-二甲基-乙基)-苯甲醛的合成方法,(0.42g,72%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.98(s,1H),8.21(s,2H),3.64(t,J=8.9Hz,2H),3.44(t,J=8.8Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C8H12 N3O2[M+H]+:182.1.Found:182.1.
化合物Ⅲ-12:
其中,1-氰基-1-(4-苯乙腈)-2-2-(5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-)嘧啶-乙烯:
参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.56g,89%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.21(s,2H),7.99(s,1H),7.64(s,4H),3.64(t,J=8.9Hz,2H),3.44(t,J=8.8Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C17H16 N5O[M+H]+:306.1.Found:306.1.
化合物Ⅲ-12的制备参照化合物Ⅲ-4的合成方法,(0.36g,96%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.21(s,2H),7.99(s,1H),7.64(s,4H),3.77(t,J=6.5Hz,2H),3.20(s,3H),2.56(m,2H),2.23(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C19H21 N6[M+H]+:333.1828.Found:333.1829.
化合物Ⅲ-13:
其中,2-乙腈-5-氰基-吡啶:
2-溴甲基-5-氰基吡啶(0.50g,2.5mmol)于100ml圆底烧瓶中,加入50ml THF溶解,Ar保护条件下加入10ml NaCN的2M的水溶液,油浴加热回流12h,反应完毕,体系冷却至室温,DCM萃取(3×100ml),合并有机相,分别用水、饱和食盐水洗涤(2×100ml),有机相用NaSO4干燥,减压除去溶剂,残余物经柱色谱纯化分离得2-乙腈-5-氰基吡啶(0.19g,56%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.78(s,1H),7.95(m,1H),7.56(m,1H),4.01(s,2H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C8H6 N3[M+H]+:144.1.Found:144.1.
化合物Ⅲ-13的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.45g,95%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.78(s,1H),8.21(s,1H),7.94(m,1H),7.86(d,J=8.0Hz,2H),7.57(m,1H),6.80(d,J=8.0Hz,2H),3.64(t,J=8.9Hz,2H),3.44(t,J=8.8Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C18H17 N4O[M+H]+:305.1402.Found:305.1403.
化合物Ⅲ-14:
其中,2-氰基-5-乙腈-吡嗪:
2-氯-吡嗪-5-乙腈(0.32g,2.0mmol)、CuCN(0.93g,10.0mmol)于100ml圆底烧瓶中,加入30ml干燥DMSO溶解,Ar保护条件下80℃油浴加热12h,反应完毕,体系倒入100ml水中,DCM萃取(4×50ml),合并有机相,分别用水、饱和食盐水洗涤(2×100ml),有机相用Na2SO4干燥,减压除去有机溶剂,残余物经柱色谱分离得2-氰基-吡嗪-5-乙腈(0.20g,69%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.60(s,1H),8.48(s,1H),3.92(s,2H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C7H5 N4[M+H]+:145.1.Found:145.1.
化合物Ⅲ-14的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.25g,91%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.60(s,1H),8.48(s,1H),8.11(s,1H),7.81(d,J=8.2Hz,2H),6.84(d,J=8.2Hz,2H),3.60(t,J=9.2Hz,2H),3.46(t,J=9.2Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C17H16 N5O[M+H]+:306.1355.Found:306.1354.
化合物Ⅲ-16:
参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.29g,94%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.11(2H,d,J=10.4Hz),7.99(3H,dd,J=8.6,3.0Hz),7.54(1H,dd,J=8.0,8.0Hz),7.44(1H,dd,J=8.0,8.0Hz),6.88(2H,d,J=9.2Hz),4.82(1H,bt,t,J=5.2Hz),3.60(2H,t,J=5.2Hz),3.56(2H,t,J=5.2Hz),3.09(3H,s).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C19H18N3OS[M+H]+:336.1171.Found:336.1170.
化合物Ⅲ-17:
其中,6-甲胺-苯并[b]噻吩-2-甲醛:
6-溴苯并[b]噻吩-2-甲醛(0.42g,1.7mmol)、二甲基乙胺(40%水溶液,1g,8.9mmol)、CuI(13.9mg,0.073mmol)、K3PO4·H2O(155.4mg,0.73mmol)、甲胺(33%水溶液,1g)于100ml耐压瓶中,密封条件下60℃油浴加热12h,体系冷却至室温,加入50ml水,DCM萃取(3×100ml),合并有机相,Na2SO4干燥,减压除去有机溶剂,残余物经柱色谱分离纯化(0.23g,68%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.92(1H,s),8.14(1H,s),7.82(1H,d,J=9.1Hz),7.18(1H,d,J=2.1Hz),7.01(1H,dd,J=9.1,2.3Hz),3.05(3H,s).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C10H10NOS[M+H]+:192.0.Found:192.0.
化合物Ⅲ-17的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.29g,94%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.45(s,1H),7.92(d,J=8.6Hz,2H),7.85(d,J=8.3Hz,3H),7.73(dd,J=8.6,3.9Hz,1H),7.21(d,J=1.9Hz,1H),7.21(d,J=1.9Hz,1H),6.96(dd,J=9.1,2.3Hz,1H),3.05(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C19H14N3S[M+H]+:360.1171.Found:360.1173.
化合物Ⅲ-19:
其中,5-N,N-二甲胺-2-醛基并二噻吩:
参照6-N-甲基-N-羟乙基-苯并[b]噻吩-2-甲醛的合成方法,(0.54g,79%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.66(s,1H),8.05(s,1H),6.30(s,1H),4.88(bt,1H),3.07(s,6H).MS(ESI):m/z Calcd.For C9H12NOS2[M+H]+:214.0;found 214.0.
化合物Ⅲ-19的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.31g,90%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.34(s,1H),7.86(d,J=8.0Hz,2H),7.81(s,1H),7.77(d,J=8.0Hz,2H),6.32(s,1H),4.88(t,J=4.0Hz,1H),3.08(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C18H14N3S2[M+H]+:336.0629.Found:336.0630.
化合物Ⅲ-20:
其中,5-N,N-二乙胺-2-醛基并二噻吩:
参照6-N-甲基-N-羟乙基-苯并[b]噻吩-2-甲醛的合成方法,(0.44g,75%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.78(s,1H),8.09(s,1H),6.30(s,1H),4.87(bt,1H),3.27(t,J=8.4Hz,4H),1.26(t,J=8.4Hz,4H).MS(ESI):m/z Calcd.For C9H12NOS2[M+H]+:214.0;found 214.0.
化合物Ⅲ-20的制备参照化合物Ⅲ-1的合成方法,(0.31g,90%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=8.34(s,1H),7.86(d,J=8.0Hz,2H),7.81(s,1H),7.77(d,J=8.0Hz,2H),6.32(s,1H),4.88(t,J=4.0Hz,1H),3.27(t,J=8.4Hz,4H),1.26(t,J=8.4Hz,4H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C20H18N3S2[M+H]+:364.0942.Found:364.0943.
应该理解,本说明书各实施例中的用量、反应条件等除非特别注明均为近似值,可根据实际情况略作改变而获得类似结果。除专门定义外,本文所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所理解的含意相同。本文提及的所有文献都引入本申请作为参考。本说明书中描述的是作为示范用的优选实施方案,本领域技术人员可采用与本文所述相似的方法及材料实施本申请获得相同或相似的结果,对本申请所作的各种改动或修改仍属于本申请所附权利要求书限定的范围内。
Claims (18)
1.一种核酸适配体分子,包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c):
(a):核苷酸序列
N1CAUCGUGGCGUGUCGN17-N18-N19ACUGGCGCUN29-N30-N31CAGN34,其中N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34代表长度大于或等于1个核苷酸的片段,并且N1与N34核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对,N17与N19核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对,N29与N31核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对;
(b):与(a)限定的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列;
(c):在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N17、N18、N19、N29、N30、N31和N34的位置,经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加,且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(a)中的N1与N34互补配对时,N1核苷酸序列的方向为5’-3’,N34核苷酸序列的方向为3’-5’;N17与N19互补配对时,N17核苷酸序列的方向为5’-3’,N19核苷酸序列的方向为3’-5’;N29与N31互补配对时,N29核苷酸序列的方向为5’-3’,N31核苷酸序列的方向为3’-5’。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体分子,其中当N1与N34中的至少一条片段的长度大于或等于5个核苷酸碱基时,则N1与N34核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对;当N17与N19中的至少一条片段的长度大于或等于5个核苷酸碱基时,则N17与N19核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对配对;当N29与N31中的至少一条片段的长度大于或等于5个核苷酸碱基时,则N29与N31核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中对所述核苷酸序列(a)的核苷酸取代:C5U、C5A、U12C、U12G、G13A、U14A、U14C、C15U、G16A、G16C、A20G、A20C、C21U、C21G、U22G、U22C、G23A、G23C、G24U、U28C、C5U/U28C、U12G/G24U、U14C/U22G、U14C/U22C、G16A/C21U、G16C/C21G、U12C/U28C、U14A/U28C、G24A/U28C、G16A/C21U/G24A、G16A/C21G/G24A、G16A/C21U/U28C、G16A/C21G/U28C、G16A/C21U/G24A/U28C、G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/G16A/C21G/G24A/U28C、U12C/G16A/C21G/G24A/U28C、C5U/U12C/G16A/C21G/G24A/U28C和C5U/U12C/U14A/G16A/C21G/G24A/U28C。
5.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中所述核酸适配体分子还可包含它的循环更替突变体。
6.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(a)中的N1与N34处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。
7.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中所述核酸适配体分子是RNA分子或DNA-RNA杂交分子或经修饰的RNA分子。
8.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(a)的N17-N18-N19包含一个可以识别靶标分子的核苷酸序列;所述靶标分子为蛋白质、核酸、脂质分子、碳水化合物、激素、细胞因子、趋化因子和代谢物金属离子中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(a)的N17-N18-N19为可以识别SAM分子的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍,至少5-10倍,至少20-50倍,至少100-200倍或者提高至少500-1000倍。
11.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,还包含:可以结合多个荧光团分子的串联体,所述串联体通过间隔序列连在一起,所述间隔序列具有2、3、4、5、6、7或者更多个核苷酸片段的长度;并且,所述串联体的核苷酸选自序列SEQ IDNo:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。
12.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,具有序列SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。
13.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物,其中所述核酸适配体分子为权利要求1所述核酸适配体分子,所述荧光团分子具有下述式(I)所述的结构:
其中,D-为X1O-或N(X2)(X3)-;X1、X2、X3各自独立地选自氢、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基,X2、X3任选相互连接为饱和或不饱和的环;R-选自氢、氰基、羧基、酰胺基、酯基、羟基、1-10个碳的直链或支链烷基或改性烷基;Ar1、Ar2各自独立地选自单环芳亚基、单环杂芳亚基,或由单环芳基、单环杂芳基中的一种或两种稠合组成的具有2-3个环结构的芳香亚基;
Ar1、Ar2中的氢原子独立地被F、Cl、Br、I、羟基、硝基、醛基、羧基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、伯氨基、仲氨基、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基取代;
所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自F、Cl、Br、I、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S=O)-、叠氮基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、环氧乙烷、琥珀酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氯、磺酰氯、饱和或不饱和的单环或双环亚环羟基、桥联酯杂环中的至少一种基团置换所得的基团,所述改性烷基具有1-10个碳原子,其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换;
并且,所述复合物中的所述核酸适配体分子与所述荧光团分子分别存在于单独的溶液中,或者,所述核酸适配体分子与所述荧光团分子在同一溶液中。
14.根据权利要求13所述的复合物,其中所述改性烷基含有选自-OH、-O-、乙二醇单元、单糖单元、二糖单元、-O-CO-、-NH-CO-、-SO2-O-、-SO-、Me2N-、Et2N-、-S-S-、-CH=CH-、F、Cl、Br、I、-NO2和氰基中的至少一种基团;
所述荧光团分子含有的芳香环选自下式(Ⅱ-1)~(Ⅱ-15)中的结构:
15.根据权利要求13所述的复合物,其中所述荧光团分子选自下式化合物:
16.根据权利要求13所述的复合物,其中所述适配体分子包含核苷酸序列SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。
17.一种试剂盒,包含:权利要求1所述的核酸适配体分子、权利要求13所述的复合物、表达载体或宿主细胞中的至少一种,其中,所述表达载体包含转录权利要求1所述的核酸适配体分子的DNA分子;所述宿主细胞包含所述表达载体。
18.一种权利要求13所述的复合物在体外或体内目标核酸分子的检测或标记、细胞外或细胞内靶标分子的检测或标记、或者,提取及纯化RNA中的应用。
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