CN115704025A - 一种新型核酸分子检测与定量技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适配体核酸分子，包含该适配体和荧光团小分子的复合物，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。

Description

一种新型核酸分子检测与定量技术

技术领域

本发明涉及一种适配体核酸分子，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。

背景技术

在活细胞中，RNA具有独特的结构、种类繁多的生物学功能以及复杂的时间空间分布。对不同种类的RNA及其修饰形式的鉴定、功能与调控研究现已经成为了国际前沿。开发技术对它们进行实时示踪和分析，对于理解各种细胞生命过程至关重要。

目前，对于RNA成像的比较成熟的技术手段，主要有以下几种，RNA荧光原位杂交技术、分子信标技术、RNA结合蛋白-荧光蛋白MCP-FPs系统和荧光RNA技术。其中，RNA荧光原位杂交技术是长期以来被广泛用于来研究RNA在细胞内水平与分布的方法，它是通过分子杂交对特异RNA分子进行荧光标记，进而进行成像的技术。然而其操作较复杂且含有洗脱步骤，只能用于固定化细胞即死细胞的研究，不能用于实时监测活细胞中RNA的动态变化过程。而分子信标技术是最早发展起来的活细胞RNA成像技术。它是一种在5’和3’末端自身形成发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，当其与靶标RNA结合后，标记在一端的猝灭基团对荧光基团的猝灭作用消除，荧光基团产生荧光，或者两端荧光基团的FRET消失。然而分子信标存在着荧光信号偏低、进细胞困难、易降解、较严重的细胞核内非特异性聚集、易受RNA二级结构的影响且需要对每条RNA专门定制寡核苷酸探针等缺点，这些缺点限制了该技术的广泛应用。目前用于活细胞RNA成像的方法主要是利用MCP-FPs系统，MCP-FPs可以特异性识别结合融合了多拷贝MS2序列的mRNA分子，通过检测荧光蛋白的信号实时监测mRNA的合成及分布(Ozawa et al.Nature Methods.2007.4:413-419)。但由于未结合mRNA分子的MCP-FPs会产生很高的本底荧光，使得该方法的信噪比很低。随后，科学家们将MCP-FPs融合蛋白加上核定位信号，使得没有与mRNA分子结合的GFP-MS2定位细胞核中，一定程度降低了细胞胞浆中的非特异荧光，提高了检测的信噪比。

2003年.荧光蛋白的诺贝尔化学奖获得者之一钱永健(Roger Tsien)教授提出可以利用RNA适配体特异性识别结合并激活染料分子，进而实现对RNA的可视化。基于这样的原理，他的课题组筛选获得了可以结合并激活三苯甲烷染料孔雀石绿(MG)染料分子，荧光增强倍数可达2360倍。可惜的是，由于MG本身是生物染色剂，因而不能用于活细胞RNA标记。受这一发现的鼓舞和启发，在过去的十多年里，科学家们还发展了其他的RNA适配体-荧光团复合物，包括基于Hoechst衍生物、花菁类染料、荧光团-猝灭基团(FQ)以及荧光蛋白生色团衍生物的荧光RNA。相比较其他RNA成像技术，人们只需要将RNA适配体编码序列与靶标RNA编码序列融合表达，加入染料分子即可对RNA标记成像，无需引入其他核酸活蛋白质分子，因此是最直接的一种RNA成像方法，也是最有希望成为理想的活细胞RNA标记与成像技术。

2011年S.Jaffrey课题组利用SELEX方法，以绿色荧光蛋白生色团HBI的衍生物DFHBI(3,5-difluoro-4-hydroxybenzyli-dene imidazolinone)为筛选靶标，获得了称为“Spinach”的核酸适配体。Spinach与DFHBI结合后，可显著增强DFHBI的荧光信号。利用Spinach-DFHBI复合物，他们首次实现了在哺乳动物细胞内对靶标RNA的示踪(Paige etal.Science.2011.333:642-646)。该课题组将“Spinach”中的一个茎环结构换成可以特异性结合细胞代谢物的核酸适配体，开发了基于Spinach-DFHBI复合物的可以检测细胞代谢物的工具(Paige et al.Science.2012.335:1194)。到目前为止，该方法已被成功用于细菌、酵母和哺乳动物细胞中的RNA动态变化的监测及分析。之后，该课题组对核酸适配体分子及荧光团分别做了优化，获得了Spinach2-DFHBI-1T，新复合物性质得到进一步提升。2014年，该课题组将SELEX与流式细胞分析术结合并筛选获得了Broccoli(Filonov etal.Journal of the American Chemical Society.2014.136:16299-16308)，Broccoli-DFHBI-1T相比于之前的Spinach-DFHBI和Spinach2-DFHBI-1T，在荧光强度、稳定性等各方面均有显著的提升。但是Broccoli-DFHBI-1T依旧存在着镁离子依赖严重、光稳定性差的问题。2020年，该课题组对DFHBI-1T进一步优化，得到新的荧光团BI，最终获得新的复合物Broccoli-BI(Li et al.Angewandte Chemie International Edition inEnglish.2020.59:4511-4518)。2017年，该课题组还开发了Corn-DFHO复合物用于检测哺乳动物细胞RNA聚合酶III启动子的活性检测(Song et al.Nature ChemicalBiology.2017.13:1187-1194)。

2019年，来自中国的杨弋教授与朱麟勇教授构成的联合攻关团队在荧光RNA领域取得了突破性进展。他们基于全新的分子设计理念设计合成了全新的荧光团分子HBC，并筛选得到了与之高度亲和的核酸适配体Pepper。同时，在HBC基础上进行化学修饰，得到一系列衍生物，与Pepper结合后的复合物光谱涵盖青色、绿色、橙色和红色。Pepper-HBC620复合物可以发出明亮的红色荧光，且有着较好的光稳定性，可以实现SIM超分辨成像。

综上所述，目前使用的RNA标记技术都存在各自的缺点。MCP-FPs标记技术存在着非特异性结合造成的本底荧光强，信噪比低。基于适配体-荧光团-猝灭剂构成的复合物的RNA标记技术目前只在细菌中实现对RNA的标记，还没有实现在哺乳动物细胞中标记RNA。基于单荧光团-核酸适配体的RNA标记技术看起来是非常完美的RNA标记技术，然而受限于目前可供选择的可以生物正交的荧光RNA种类少，且大多数复合物位于绿色波段，存在较强镁离子依赖性，光稳定差等，因而该技术也没有被广泛使用。因此，科研界和产业界一直都需要更加有效的荧光团-核酸适配体复合物，能克服此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，用于活细胞中的RNA或DNA的实时标记。

发明的简述

本发明提供了一种核酸适配体分子，编码该核酸适配体分子的DNA分子，一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，以及该复合物的用途。

本发明提供的技术方案如下：

1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：

(a)核苷酸序列为：N₁UGUAGUAN₉-N₁₀-N₁₁GGAAGAAUUGAUCUCGGN₂₉，其中N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉代表长度≥1个的核苷酸片段，并且N₁和N₂₉核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，N₉和N₁₁核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；

(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少58％同一性的核苷酸序列；

(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的Paprika结构核苷酸序列具有至少58％，63％，67％，71％，75％，79％，83％，94％，96％，98％或100％同一性的序列。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的Paprika结构核苷酸序列中不包括N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉的位置，经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。

4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉的位置，经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。

5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N₁与N₂₉互补配对时，N₁核苷酸序列的方向为5’-3’，N₂₉核苷酸序列的方向为3’-5’；N₉与N₁₁互补配对时，N₉核苷酸序列的方向为5’-3’，N₁₁核苷酸序列的方向为3’-5’。

6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当N₁与N₂₉中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N₁与N₂₉核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当N₉与N₁₁中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N₉与N₁₁核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。

7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、G3A、G3U、G3C、U4A、U4C、U4G、A5U、A5C、A5G、G6A、G6U、G6C、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、A18G、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、U25G、C26A、C26U、C26G、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。

8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、U4A、U4C、U4G、A5C、A5G、G6U、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、C26A、C26U、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。

9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、U4A、U4C、U4G、A5C、A5G、G6U、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、U19A、U19C、U20A、U20C、U20G、G21U、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24G、U25C、C26U、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。

10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N₁与N₂₉处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。

11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是RNA分子或经碱基修饰的RNA分子。

12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是DNA-RNA杂交分子或经碱基修饰的DNA-RNA分子。

13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5-10倍，至少20-50倍，至少100-200倍，至少200-1000倍或者至少1000-5000倍。

14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。

15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1-14任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(I)所述的结构：

其中：D-为X1O-或N(X2)(X3)-；X1、X2、X3各自独立地选自氢、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基，X2、X3任选相互连接为饱和或不饱和的环；R-选自氢、氰基、羧基、酰胺基、酯基、羟基、1-10个碳的直链或支链烷基或改性烷基；Ar1、Ar2各自独立地选自单环芳亚基、单环杂芳亚基，或由单环芳基、单环杂芳基中的一种或两种稠合组成的具有2-3个环结构的芳香亚基；

其中：Ar1、Ar2中的氢原子可以独立地被F、Cl、Br、I、羟基、硝基、醛基、羧基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、伯氨基、仲氨基、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基取代；

其中：以上所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自F、Cl、Br、I、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S＝O)-、叠氮基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、环氧乙烷、琥珀酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氯、磺酰氯、饱和或不饱和的单环或双环亚环羟基、桥联酯杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1-10个碳原子，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；

其中，复合物中的核酸适配体分子与荧光团分子分别存在于单独的溶液中，或者核酸适配体分子与荧光团分子在同一溶液中。

16.根据权利要求15所述的荧光团分子的复合物，所述改性烷基含有选自-OH、-O-、乙二醇单元、单糖单元、二糖单元、-O-CO-、-NH-CO-、-SO₂-O-、-SO-、Me₂N-、Et₂N-、-S-S-、-CH＝CH-、F、Cl、Br、I、-NO₂和氰基中的至少一种基团；

可选地，荧光团分子含有的芳香环选自下式(Ⅱ-1)～(Ⅱ-15)中的结构：

可选地，荧光团分子选自下式化合物：

17.根据权利要求16所述的复合物，其中的荧光团分子选自III-1、III-2、III-3、III-4、III-5、III-6、III-7、III-8、III-9、III-10、III-11、III-12、III-13、III-14、III-15、III-16、III-17、III-18、III-19、III-20和Ⅲ-21。

18.根据权利要求15-17任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。

19.一种权利要求15-18任一项所述的复合物用于体外或体内目标核酸分子的检测或标记。

20.一种DNA分子，其转录权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子。

21.一种表达载体，其包含权利要求20所述的DNA分子。

22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的表达系统。

23.一种试剂盒，包含权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求21所述的表达载体和/或权利要求22所述的宿主细胞和/或权利要求15-18任一项所述的复合物。

24.一种检测靶标分子的方法，包括步骤：

a)在包含靶标分子的溶液中加入权利要求15-18任一项所述的复合物；

b)用合适波长的光激发复合物；

c)检测复合物的荧光。

25.一种提取与纯化RNA的方法，包含利用权利要求15-18任一项所述复合物提取与纯化RNA。

本发明人设计了全新的核酸适配体分子，组成全新的荧光团-核酸适配体复合物，适配体分子结合荧光团分子之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度，它们克服了此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，能有效用于活细胞中的RNA/DNA实时标记。本发明的核酸适配体对荧光团分子具有很强的亲和力，并展现出了很好的光稳定性与温度稳定性。这些核酸适配体-荧光团分子复合物可以对原核和真核细胞中RNA/DNA进行实时标记与成像，检测蛋白质-RNA相互作用，探究细胞中mRNA含量与蛋白质间的关系，或用于RNA的提取与纯化的标签等作用。

附图说明

图1.核酸适配体分子的二级结构预测。(A)预测的Paprika的通用结构，包括可以形成茎结构的N₁和N₂₉，可以形成茎环结构的N₉、N₁₀和N₁₁。(B)预测的Paprika-1的结构，N₁和N₂₉的碱基序列如图中茎1所对应的虚线框所示，N₉、N₁₀和N₁₁的碱基序列如“茎环”所对应的虚线框所示。

图2.Paprika-1的二级结构预测。(A)F30-Paprika-1的二级结构预测；(B)tRNA-Paprika-1的二级结构预测。

图3.Paprika-1-Ⅲ-21复合物光谱性质鉴定。(A)Paprika-1-Ⅲ-21复合物在核磁管中的成像；(B)Paprika-1-Ⅲ-21复合物的荧光激发光谱和发射光谱；(C)Paprika-1-Ⅲ-21复合物和荧光团分子Ⅲ-21的吸收光谱；(D)Paprika-1与Ⅲ-21结合的解离常数测定。

图4.Paprika-1-Ⅲ-21复合物稳定性性质鉴定。(A)Paprika-1-Ⅲ-21复合物的pH稳定性测定；(B)Paprika-1-Ⅲ-21复合物对Mg²⁺的依赖性测定；(C)Paprika-1-Ⅲ-21复合物温度稳定性测定(额外补充5mM Mg²⁺)；(D)Paprika-1-Ⅲ-21复合物对K⁺的依赖性测定。

图5.在Paprika-1序列上含不同修饰的Paprika-2和Paprika-3对Ⅲ-21的激活效果。(A)含脱氧核糖核苷酸(图中浅色颜色标注)的Paprika-2适配体的二级结构示意图；(B)含2’F修饰(图中浅色颜色标注)的Paprika-3适配体的二级结构示意图；(C)定量分析Paprika-2和Paprika-3对Ⅲ-21的激活效果。“对照”是利用缓冲液替换Paprika-2或Paprika-3适配体。

图6.不同Paprika-1串联体对Ⅲ-21的激活效果。(A)Paprika-1按照“串联1”方式获得Paprika-4串联体；(B)Paprika-1按照“串联2”方式获得Paprika-5串联体；(C)按照“串联3”方式获得Paprika-4串联体；(D)不同按照“串联1”方式获得Paprika-4串联体对Ⅲ-21的激活效果；(E)不同按照“串联2”方式获得Paprika-5串联体对Ⅲ-21的激活效果；(F)不同按照“串联3”方式获得Paprika-4串联体对Ⅲ-21的激活效果。

图7.F30-Paprika-1-Ⅲ-21复合物用于细菌中RNA的标记效果(比例尺：10μm)。

图8.Circular-Paprika-1与Ⅲ-21复合物在哺乳动物细胞中表达(比例尺：50μm)。

图9.F30-Paprika-1与Ⅲ-21复合物在哺乳动物细胞中表达(比例尺：50μm)。

图10.Paprika-1-Ⅲ-21复合物用于标记U6剪接体RNA定位(比例尺：10μm)。

图11.Paprika-1-Ⅲ-21复合物用于标记纤维状肌动蛋白ACTB的mRNA定位(比例尺：10μm)。

图12.Paprika-1用于RNA的提取与纯化的定量结果。

发明详述

本发明在此通过对使用下述定义和实施例的引用进行详细描述。所有在本文中提及的专利和公开文献的内容，包括在这些专利和公开中披露的所有序列，明确地通过提述并入本文。下文中，“核苷酸”与“核苷酸碱基”互换使用，表示相同意思。

以下，关于本申请的一些术语进行详细解释。

核酸适配体分子

本发明所述的“核酸适配体分子”也称为“适配体分子”。该核酸适配体分子包含(a)核苷酸序列为：

N₁UGUAGUAN₉-N₁₀-N₁₁GGAAGAAUUGAUCUCGGN₂₉(对应于图1A的通式Paprika结构)；或(b)与(a)所述的核苷酸序列具有至少58％同一性的序列；其中N₁与N₂₉核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对，即N₁核苷酸序列的方向为5’-3’，N₂₉核苷酸序列的方向为3’-5’。当N₁与N₂₉至少一条核苷酸碱基长度≤4时，需要至少一对碱基形成互补配对；当N₁与N₂₉至少一条核苷酸碱基长度≥5时，需要至少两对碱基形成互补配对。其中N₉与N₁₁核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对，即N₉核苷酸序列的方向为5’-3’，N₁₁核苷酸序列的方向为3’-5’。当N₉与N₁₁至少一条核苷酸碱基长度≤4时，需要至少一对碱基形成互补配对；当N₉与N₁₁至少一条核苷酸碱基长度≥5时，需要至少两对碱基形成互补配对。其中N₁₀为任意长度任意组成的核苷酸碱基；或(c)在所述的核苷酸序列(a)的任一位置经过1-10个核苷酸的取代、缺失和/或增加。

核酸适配体分子包含对通式Paprika结构的核苷酸的取代，该取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、G3A、G3U、G3C、U4A、U4C、U4G、A5U、A5C、A5G、G6A、G6U、G6C、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、A18G、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、U25G、C26A、C26U、C26G、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。(即表1中的适配体分子结构)。这些突变体能特异性结合荧光团分子，并在结合之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度。其中核苷酸的位置序列对应于图1A中的位置。

上述的突变表示在通式Paprika结构的适配体核苷酸序列的相应位点发生核苷酸替换，如A5U表示Paprika的第5位腺嘌呤核苷酸A被取代为尿嘧啶核苷酸U，也即表1中的Paprika-A5U；Paprika-A5U/U25A表示Paprika第5位腺嘌呤核苷酸A被取代为尿嘧啶核苷酸U，同时Paprika的第25位尿嘧啶核苷酸U被取代为腺嘌呤核苷酸A，也即表1中的Paprika-A5U/U25A。

表1：Paprika通式结构经过5个、4个、3个、2个或1个核苷酸取代的适配体结构

适配体分子是单链核酸分子，它们有着一个或多个碱基配对区域(茎)以及一个或多个非配对的区域(环)构成的二级结构(图1A)。本发明所述的核酸适配体分子包含一个如图1A所预测的二级结构。该二级结构含有2个茎结构、2个环结构和1个茎-环结构，其中茎1是起到稳定整个核酸适配体分子结构的作用，可以被替换成其他可以形成茎结构的任意长度任意组成的核苷酸碱基对。所述茎1结构的5’端或3’端可以与任意目标RNA分子融合，用于细胞外或细胞内检测目标RNA分子。在本发明一优选的实施方案中，核酸适配体分子的5’端融合5S RNA序列(Genebank:NR_023377.1)；在本发明另一优选的实施方案中，核酸适配体分子的5’端融合ACTB RNA序列(ACCESSION NM_001101)。

图1A中的茎-环结构起到稳定整个核酸适配体分子结构的作用，可以被替换成其他可以形成茎-环结构的任意长度任意组成的核苷酸碱基对。本发明所述的适配体分子还可包含插入到N₉-N₁₀-N₁₁位置的其他核苷酸序列，该插入的核苷酸序列替换图1A中的茎-环结构，得到图1B中结构(SEQ ID NO：1)。所述核苷酸序列可以特异性识别/结合靶标分子。当靶标分子不存在时，所述适配体分子与荧光团分子的结合能力弱，导致荧光团分子显示弱荧光；当靶标分子存在时，靶标分子与所述适配体的结合会促进所述适配体与荧光团分子的结合，显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光。所述靶标分子可以是一种小分子、一种细胞表面的信号分子等。这些核酸适配体与特定的靶标分子通过非共价结合，这种非共价结合主要是依赖分子间的离子力、偶极力、氢键、范德华力、正负电子相互作用、堆积作用或者以上几种作用力的结合。所述茎-环结构可被替换成识别靶标分子的RNA序列，用于细胞外或细胞内检测靶标分子。

本发明优选的实施方案中，所述核酸适配体分子优选为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14，可以结合荧光团分子显著提高其在合适波长激发光下荧光的它们的突变序列。

本发明所述的核酸适配体分子还可包含一段增加其稳定性的核苷酸序列。在本发明的一优选的实施方案中，采用F30脚手架RNA(SEQ ID NO：2)，其与所述核酸适配体分子的连接方式如图2A所示；在本发明的另一优选的实施方案中，采用tRNA脚手架RNA(SEQ IDNO：3)，其与所述核酸适配体分子的连接方式如图2B所示。

本发明中所述的“核酸适配体分子”是一种RNA分子，或者部分核苷酸被替换成脱氧核糖核苷酸的DNA-RNA杂交分子。其中的核苷酸可以是它们的D和L对映体形式，同时也包含它们的衍生物，包括但不限于2’-F，2’-氨基，2’-甲氧基，5’-iodo，5’-溴-修饰的多聚核苷酸。核酸包含各种修饰的核苷酸。

同一性

“同一性”在本发明中描述两个核苷酸序列之间的相关性。本发明的两个适配体核苷酸序列的同一性计算中不包括(a)序列中的N₁、N₉、N₁₀、N₁₁、N₂₉。就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)的Needle程序，优选3.0.0版或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定。使用的任选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62取代矩阵(BLOSUM62的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”(使用-nobrief选项获得)的输出结果作为百分比同一性，并计算如下：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)。

如本发明表1中Paprika(U2A)和Paprika(U2C)的序列为Paprika(U2A)：N₁AGUAGUAN₉-N₁₀-N₁₁GGAAGAAUUGAUCUCGGN₂₉和Paprika(U2C)：N₁ CGUAGUAN₉-N₁₀-N₁₁GGAAGAAUUGAUCUCGGN₂₉，对它们同一性比对的时候，按照本发明的定义，应不包含N₁、N₉- N₁₀-N₁₁和N₂₉ 的核苷酸碱基，因此它们的序列同一性比对结果为96％(相差1个核苷酸)。

荧光团分子

本发明所述的“荧光团分子”也称为“荧光团”或“荧光分子”。“荧光团分子”在本发明中是一类可被条件性激活的荧光团分子。它们在没有核酸适配体的情况下显示出较低的量子产率。在具体的实施方式中，当没有与特定适配体结合时，荧光团的量子产率低于0.1，更优的低于0.01，最优的低于0.001；当荧光团被特定适配体结合后，荧光团的量子产率提高2倍以上，更优的提高10倍以上，最优的提高100倍以上。荧光团分子优选水溶性的，对细胞无毒且易穿透膜的。本发明的荧光团优选能够通过主动运输或者被动扩散通过细胞膜或细胞壁进入细胞浆或细胞周质。在本发明的实施方式中，荧光团可以透过革兰氏阴性菌的外膜和内膜，植物细胞的细胞壁和细胞膜，真菌和细胞壁和细胞膜，动物细胞的细胞膜，以及活体动物的GI和内皮细胞膜。

本发明所述的核酸适配体分子可以特异性结合一种荧光团，显著增加其在特定波长激发下的荧光值。所述荧光团分子选自结构(Ι)：

(Ι)其中：D-为X₁O-或N(X₂)(X₃)-,X₁、X₂、X₃各自独立地选自氢、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基，X₂、X₃任选相互连接为饱和或不饱和的环；R-选自氢、氰基、羧基、酰胺基、酯基、羟基、1-10个碳的直链或支链烷基或改性烷基；Ar₁、Ar₂各自独立地选自单环芳亚基、单环杂芳亚基，或由单环芳基、单环杂芳基中的一种或两种稠合组成的具有2-3个环结构的芳香亚基；

其中：Ar₁、Ar₂中的氢原子可以独立地被F、Cl、Br、I、羟基、硝基、醛基、羧基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、伯氨基、仲氨基、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基取代；

其中：以上所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自F、Cl、Br、I、-O-、-OH、-CO-、-NO₂、-CN、-S-、-SO₂-、-(S＝O)-、叠氮基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、环氧乙烷、琥珀酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氯、磺酰氯、饱和或不饱和的单环或双环亚环羟基、桥联酯杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1-10个碳原子，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；

可选地，上述荧光团分子含有的改性烷基为含有选自-OH、-O-、乙二醇单元、单糖单元、二糖单元、-O-CO-、-NH-CO-、-SO₂-O-、-SO-、Me₂N-、Et₂N-、-S-S-、-CH＝CH-、F、Cl、Br、I、-NO₂、氰基中的至少一种基团；

可选地，上述荧光团分子含有的芳香环选自下式(Ⅱ-1)～(Ⅱ-15)中的结构：

可选地，上述荧光团分子选自下式化合物：

本发明优选的实施方案中，所述荧光团分子包含III-1、III-2、III-3、III-4、III-5、III-6、III-7、III-8、III-9、III-10、III-11、III-12、III-13、III-14、III-15、III-16、III-17、III-18、III-19、III-20和Ⅲ-21。“提高荧光信号”、“荧光增加”、“提高荧光强度”、“增加荧光强度”在本发明中指合适波长激发光照射下荧光团量子产率的提高，或者荧光信号最大发射峰的迁移(相对乙醇或者水溶液中荧光团本身的发射峰)，或者摩尔消光系数的增加，或者以上的两种或更多。在本发明一优选实施方式中，量子产率的增加至少是2倍；在本发明另一优选实施方式中，量子产率的增加至少是5-10倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是20-50倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是100-200倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是500-1000倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是1000-10000倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加大于10000倍；用于激发荧光团产生荧光信号的光源可以是任意合适的光照设备，如包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光；激发光既可以是直接从这些设备中发出，也可以间接通过其他荧光团获取，如FRET的供体荧光团，或BRET的供体发光团。

靶标分子

本发明所述的靶标分子可以是任意的生物材料或者小分子，包括但不限于：蛋白质，核酸(RNA或者DNA)，脂质分子，碳水化合物，激素，细胞因子，趋化因子，代谢物金属离子等。靶标分子可以是与疾病或者病原菌感染相关的分子。

通过在本发明所述的适配体分子，如图1B所示的结构中，该插入的核苷酸序列替换了图1A中的N₉、N₁₀、N₁₁的茎-环结构，该核苷酸序列可以特异性识别/结合靶标分子。当靶标分子不存在时，适配体分子与荧光团分子不结合或结合能力弱，不能显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光；当靶标分子存在时，靶标分子与所述核苷酸序列的结合会促进适配体分子与荧光团分子的结合，显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光，实现对靶标分子的检测、成像和定量分析。

靶标分子也可以是整个细胞或表达在整个细胞表面的分子。典型的细胞包括但不限于癌症细胞、细菌细胞，真菌细胞以及正常动物细胞。靶标分子也可以是病毒颗粒。目前很多的上述靶标分子的适配体被鉴定出来，它们可以被整合本发明中的多价核酸适配体中。目前已报道的可以结合靶标分子的RNA适配体包括但不限于：T4 RNA聚合酶适配体，HIV逆转录酶适配体，噬菌体R17衣壳蛋白适配体。

目标核酸分子

“目标核酸分子”又称“靶标核酸分子”是指待检测的核酸分子，可以是细胞内的，也可以是细胞外的；包括目标RNA分子和目标DNA分子。本发明通过将目标核酸分子与所述核酸适配体分子连接，通过荧光团分子与核酸适配体分子结合，显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光值，进而实现检测目标核酸分子的含量与分布的目的。

“目标RNA分子”在本发明中包括任意的RNA分子，包括但不限于pre-mRNA，编码细胞本身或外源表达产物的mRNA，pre-rRNA，rRNA，tRNA，hnRNA，snRNA，miRNA，siRNA，shRNA，sgRNA，crRNA，长链非编码RNA，噬菌体衣壳蛋白MCP识别结合序列MS2 RNA、噬菌体衣壳蛋白PCP识别结合序列PP7 RNA，λ噬菌体转录终止蛋白N识别结合序列boxB RNA等。靶标RNA可以融合在本发明RNA适配体分子的5’端或3’端或N₂₅-N₂₆-N₂₇的位置。

“sgRNA”在本发明中指CRISPR/Cas9系统中将tracrRNA和crRNA经改造后形成的单一的引导RNA(single guide RNA,sgRNA)，其5’端20nt左右的序列通过碱基对互补来靶向DNA位点，促使Cas9蛋白在该位点诱发DNA双链断裂。

核酸适配体的串联体

本发明所述的核酸适配体分子进一步还可包含可以结合多个荧光团分子的串联体。所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，串联的Paprika-1结构的个数可以是2，3，4，5，6，7，8，9，10或者更多。串联体的形式可以有多种，在本发明一优选的实施方案中，串联的形式为“串联1”，如图6A所示，优选的核苷酸序列为SEQ ID NO：6和7；其中的2Paprika-4表示具有2个Paprika-4结构的串联体1；在本发明另一优选的实施方案中，串联的形式为“串联2”，如图6B所示，优选的核苷酸序列为SEQ ID NO：8和9；其中的2x Paprika-5表示具有2个Paprika-5结构的串联体2；在本发明另一优选的实施方案中，串联的形式为“串联3”，如图6C所示，优选的核苷酸序列为SEQ ID NO：10和11；其中的2x2 Paprika-4表示具有2个2Paprika-4结构的串联体3；无论何种形式，串联体之间的间隔序列可以进行更换。

本发明所述的单体形式的适配体是指仅含有1个Paprika-1结构的适配体，也就是含2个茎结构，2个环结构和1个茎环结构(图1B)的适配体。

多聚体形式的适配体是指含有1个以上Paprika-1结构的适配体，包含但不限于图6所示的几种串联形式构成的适配体。

适配体-荧光团复合物

本发明的适配体-荧光团复合物包含1个核酸适配体分子以及1个或多个荧光团分子。在本发明的一具体实施方式中，包含1个核酸分子以及1个荧光团分子的分子复合物为F30-Paprika-1-Ⅲ-21。

在本发明的另一具体实施方式中，串联体的核酸分子与多个荧光团分子的形成复合物，例如以“串联1”方式形成的包含4个适配体单元的F30-4Paprika-4与4个荧光体分子形成的复合物F30-4Paprika-4-4×(Ⅲ-21)。所述分子复合物可以在体外以单独的两种溶液形式存在，或者在同一种溶液中存在，也可以存在于细胞内。

核酸适配体功能

本发明的适配体功能指可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度，可以采用具体实施例中的常用实验方法(一)制备核酸适配体，并按照实施例中的常用实验方法(二)进行荧光值的检测。在本发明的一个优选实施方式中，荧光强度的增加至少是2倍；在本发明另一优选实施方式中，荧光强度的增加至少是5-10倍；在本发明另一更优选实施方式中，荧光强度的增加至少是20-50倍；在本发明另一更优选实施方式中，荧光强度的增加至少是100-200倍；在本发明另一更优选实施方式中，荧光强度的增加至少是200-2000倍。

核酸适配体二级结构

本专利中的核酸适配体的二级结构是利用mFold在线分析软件模拟预测得到的(http://www.unafold.org/RNA_form.php)。二级结构中的茎结构是指核酸适配体分子单链内某些区域靠氢键互补配对形成局部双链结构。一般情况下，双链结构的形成并不需要该段区域内的所有核苷酸均发生互补配对；一般情况下，N₁与N₂₉，以及N₉与N₁₁中其中一段序列的至少50％的核苷酸与另一片段发生发生互补配对即可形成茎结构。如果N₁与N₂₉是单个核苷酸，则需要N₁与N₂₉完全互补才能形成茎结构(如图1A所示)。

表达核酸适配体的DNA分子

所述DNA分子包含可以编码本发明的核酸适配体分子的DNA序列。所述DNA分子包含核苷酸序列R₁TGTAGTAR₉-R₁₀-R₁₁GGAAGAATTGATCTCGGN₂₉，以及其具有至少58％同一性的核苷酸序列。其中R₁编码通式Paprika结构中的N₁，R₉编码通式Paprika结构结构中的N₉，R₁₀编码通式Paprika结构结构中的N₁₀，R₁₁编码通式Paprika结构结构中的N₁₁，R₂₉编码通式Paprika结构结构中的N₂₉。所述DNA分子还可包含一个控制DNA转录的启动子，启动子与编码核酸适配体的DNA序列之间可操作性连接。在本发明的一具体实施方式中，DNA分子包含U6启动子；在本发明的另一具体实施方式中，DNA分子包含CMV启动子。DNA分子包含所述DNA分子进一步还可包含编码任意目标核酸分子的DNA序列。在本发明的一具体实施方式中，编码目标RNA的DNA分子包含编码纤维状肌动蛋白ACTB的DNA序列(嵌合RNA的序列分别为SEQ IDNo：14)。

启动子

“启动子”在本发明中包括真核细胞与原核细胞启动子。真核细胞的启动子序列与原核细胞的启动子序列完全不同。一般地，真核启动子不能被原核细胞中的RNA聚合酶所识别介导RNA的转录。同理，原核启动子也不能被真核细胞中的RNA聚合酶所识别介导RNA的转录。不同启动子的强度差别很大(强度指介导转录的能力)。根据实际应用的不同，可以使用强启动子达到高水平转录。比如当用于标记的话，高水平表达就比较好，而如果评估转录行为，较低水平的转录可以允许细胞及时的处理转录过程。根据宿主细胞的不同，可以选用一种或者多种合适的启动子。例如，当在大肠杆菌细胞中使用时，T7噬菌体启动子，lac启动子，trp启动子，recA启动子，核糖体RNA启动子，λ噬菌体中的PR和PL启动子，以及其他启动子，但不限于:lacUV5启动子，ompF启动子，bla启动子，lpp启动子等。此外，一个杂交的trp-lacUV5启动子(tac启动子)或者其他通过重组或合成DNA技术得到的大肠杆菌启动子，均可用于转录本发明所述的RNA适配体。细菌中本身的一些操作子序列可以与启动子序列结合在一起构成诱导型启动子，此时需要加入特定的诱导物才能诱导DNA分子的转录。比如lac操作子需要加入乳糖或者乳糖类似物(IPTG)诱导其表达，其他的操作子还有trp，pro等。

如上所述，DNA分子编码序列的5’端的调控序列是启动子。无论是体外转录获得RNA适配体，还是在培养的细胞或组织中表达适配体，都需要依据启动子的强度选择合适的启动子。由于体内表达适配体可以被遗传操作，另一类型的启动子就是响应特定环境诱导DNA转录的诱导型启动子，如表达在特定的组织，特定的时间，特定的发育阶段等。这些不同的启动子可以被RNA聚合酶I，Ⅱ或Ⅲ识别。

真核细胞中转录的启动也需要合适的启动子，包括但不限于β-球蛋白启动子，CAG启动子，GAPDH启动子，β-肌动蛋白启动子，肌动蛋白启动子，Cstf2t启动子，SV40启动子，PGK启动子，MMTV启动子，腺病毒Ela启动子，CMV启动子等。真核细胞中转录的终止依赖于RNA序列中特定的切割位点。同样的，RNA聚合酶转录基因的不同，其转录终止子也差别很大。然而，筛选合适的3’转录终止子区域是本领域人源日常的实验技能就能实现。

表达系统

本发明的“表达系统”，也称为“表达载体”，包含整合有表达核酸适配体的DNA分子。本发明的表达系统，可以是一个质粒，也可以是病毒颗粒。

“表达载体”重组病毒可以通过将质粒转染进入感染病毒的细胞中获得。合适的载体包括但不限于病毒载体如λ载体系统gt11，gt WES.tB，Charon 4，质粒载体包括pBR322，pBR325，pACYC177，pACYC184，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG399，pR290，pKC37，pKC101，pBluescript II SK+/-或KS+/-(见Stratagene克隆系统)，pET28系列，pACYCDuet1，pCDFDuet1，pRSET系列，pBAD系列，pQE，pIH821,pGEX，pIIIEx426RPR等。

大量的宿主表达系统可以用于表达本发明所述的DNA分子。主要地，载体系统必须要与所用的宿主细胞相容，宿主载体系统包括但不限于：转化的噬菌体DNA，或质粒DNA，或考斯质粒DNA的细菌；包含酵母载体的酵母；感染病毒的哺乳动物细胞(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒)；感染病毒的昆虫细胞(如杆状病毒)；感染细菌或者通过粒子轰击转化的植物细胞。所述的载体中的表达元件的强度和特性差异很大。根据使用的宿主-载体系统选用任意一种或多种合适的转录元件。

一旦构建的DNA分子被克隆到载体系统中，很容易将它们转入宿主细胞中。根据不同的载体或宿主细胞系统，方法包括但不限于转化，转导，接合，固定，电转等。

在本发明的一具体实施方式中，提供含编码F30-Paprika-1RNA的DNA分子的表达质粒pET28a-T7-F30-Paprika-1、pLKO.1-F30-Paprika-1。在本发明的另一具体实施方式中，提供含编码F30-2xPaprika-1RNA的DNA分子的表达质粒pLKO.1-F30-5x(F30-2xPaprika-1)。在本发明的另一具体实施方式中，提供含编码EGFP-F30-5x(F30-2xPaprika-1)和ACTB-F30-5x(F30-2xPaprika-1)的DNA分子的表达质粒pCDNA3.1/hygro(+)-EGFP-F30-5x(F30-2xPaprika-1)和pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB-F30-5x(F30-2xPaprika-1)。在本发明的另一具体实施方式中，提供含编码Paprika-1-MS2的DNA分子的表达质粒pLKO.1-Paprika-1-MS2。

本发明也提供整合了编码核酸适配体DNA分子，但目标RNA分子编码DNA序列空缺的表达载体，目标RNA分子的编码DNA序列空缺是让用户可以自行选择所需检测的目标RNA分子的DNA序列，例如GAPDH mRNA对应的编码DNA序列，用标准的重组DNA技术将DNA序列插入本发明的这种表达载体中，将获得的表达载体导入到(转染、转化、感染等)宿主细胞，检测目标RNA的含量及分布。

宿主细胞

“宿主细胞”在本发明中包括但不限于细菌，酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，斑马鱼细胞，果蝇细胞，线虫细胞。宿主细胞更优选培养的体外细胞或整个体内活体组织。本发明中的宿主细胞，其包含的哺乳动物细胞包括但不限于297T，COS-7，BHK，CHO，HEK293，HeLa，H1299，受精卵干细胞，诱导全能干细胞，从哺乳动物组织中直接分离的原代细胞等；其包含的大肠杆菌细胞包括但不限于BL21(DE3)、BL21(DE3，Star)、TOP10、Mach1、DH5α；其包含的酵母细胞包含但不限于BY4741，BY4742，AH109。

检测阵列

本发明所述的检测阵列包含一个或多个本发明的核酸适配体分子，其中核酸适配体分子被锚定在阵列表面的离散位置，阵列表面是由固体支撑物构成，包括但不限于玻璃、金属、陶瓷等。将本发明所述核酸适配体分子锚定到阵列表面可通过但不限于以下方法：(1)利用生物素标记所述核酸适配体分子的5’或3’端，将链霉亲和素包被在阵列表面，通过生物素与链霉亲和素的特异性结合将所述核酸适配体分子进行锚定；(2)将噬菌体衣壳蛋白MCP识别结合序列MS2、噬菌体衣壳蛋白PCP识别结合序列PP7或λ噬菌体转录终止蛋白N识别结合序列boxB RNA序列融合在所述核酸适配体分子的5’、3’或茎环结构，将它们识别结合的蛋白MCP、PP7或λ_N蛋白包被在阵列表面，通过MS2与MCP蛋白、PP7与PCP蛋白或boxB RNA与λ_N蛋白的特异性作用将所述核酸适配体分子进行锚定；(3)将一段RNA或DNA序列融合在所述核酸适配体分子的5’或3’端，将与该段RNA序列互补配对的RNA序列或与该段DNA序列互补配对的DNA序列锚定在阵列表面，通过分子杂交的原理将所述核酸适配体分子锚定在阵列表面。所述检测阵列可用于检测靶标分子的存在与否以及浓度高低，因此，只有在靶标分子存在下，所述核酸适配体分子才会与荧光团分子结合，显著提高其在合适激发光波长下的荧光强度，且在一定范围内，靶标分子的浓度越高，荧光强度越高。

试剂盒

本发明的试剂盒，包含本发明所述的核酸适配体分子和/或荧光团分子，及相应的说明书；或者包含表达所述核酸适配体分子的表达系统和/或荧光团分子，及相应的说明书；或者包含表达核酸适配体分子表达系统的宿主细胞和/或荧光团分子，及相应的说明书。试剂盒中的核酸适配体分子与荧光团分子分别存在于单独的溶液中，或者核酸适配体分子与荧光团分子在同一溶液中。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明。

实施例中所用的pCDNA3.1/hygro(+)质粒载体购自Invitrogen公司，pLKO.1-puro质粒载体购自Sigma公司，pET28a质粒载体购自Novagen公司，pYES2.1 TOPO TA质粒载体购自Invitrogen。实施例所用的PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例所用的Taq DNA聚合酶购自上海翊圣生物科技有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTPs。EcoRI、BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、SacI、XbaI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4 PNK)、T7 RNA聚合酶购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。卡那霉素(Kanamycin)购自Ameresco公司；氨苄青霉素(Amp)购自Ameresco公司。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由杰李测序公司完成。

实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，Hieff CloneTMOne Step克隆试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，Eastep Super总RNA提取试剂盒购自Promega公司。BL21(DE3,Star)菌株购自Invitrogen公司。293T/17细胞和COS-7细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。384孔和96孔荧光检测黑板购自Grenier公司。DFHBI-1T、DFHO购自Lucerna公司。实施例中所用的所有化学试剂都采购于化学试剂公司，如泰坦科技、毕得医药、乐妍等，并且不做进一步纯化，直接使用。实验过程中使用的干燥溶剂如甲醇，二氯甲烷等直接购买于泰坦科技并不做进一步处理，直接使用。

实施例中用到的主要仪器：Synergy Neo2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，活体成像系统(美国Kodak公司)，光度计(日本和光公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)，Bruker Avance 600(400MHz)型核磁共振仪，Micromass GCTTM型质谱仪，Micromass LCTTM型质谱仪，Leica SP8激光共聚焦显微镜和Zeiss Elyra PS.1超分辨成像显微镜。

缩写词意义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“s”指秒，“d”指天,“μL”指微升，“ml”指毫升，“L“指升，“bp”指碱基对，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔。

实施例中常用实验方法及材料

(一)核酸适配体分子制备：

利用含T7启动子的引物对待检测RNA对应的cDNA进行扩增，利用T7 RNA聚合酶(购自Fermentas公司)以回收得到的双链cDNA为模板转录获得RNA。在20μL的转录体系中加入10μL 3M NaAc,115μL DEPC水，混匀后加入150μL酚氯仿-异丙醇混合液(苯酚：氯仿：异丙醇＝25：24：1)，振荡混匀，10000rpm离心5min后取上清。加入等体积氯仿溶液，振荡混匀，10000rpm离心5min后取上清，反复一次。在上清中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃冰箱放置30min，4℃12000rpm离心5min，弃上清，利用75％预冷的无水乙醇清洗沉淀2次。待乙醇挥发完后，加入适当量的筛选缓冲液重悬沉淀，75℃处理5min，室温放置10min以上，用于后续实验。

(二)核酸适配体的功能检测

按照常用实验方法(一)制备Paprika或Paprika突变体核酸适配体分子，将2.5μM核酸适配体分子与0.5μM荧光团分子在检测缓冲液(40mM HEPES，pH 7.4，125mM KCl，5mMMgCl₂，5％DMSO)中孵育，利用Synergy Neo2多功能酶标仪检测获取核酸适配体-荧光团分子复合物荧光的最大激发峰和最大发射峰。再利用Synergy Neo2多功能酶标仪检测核酸适配体-荧光团分子复合物在其最大激发和发射条件下的荧光强度，对照样品(不含核酸适配体的1μM荧光团分子)也在相同的条件进行测定，计算荧光强度的比值。如2.5μM Paprika-1核酸适配体与0.5μMⅢ-21荧光团分子形成的复合物的荧光最大激发峰为566nm，最大发射峰为620nm。利用Synergy Neo2多功能酶标仪检测该复合物在566±10nm激发、620nm±10nm发射条件下的荧光强度为39480，而对照(0.5μMⅢ-21荧光团分子)在相同检测条件下的荧光强度为20，那么Paprika-1核酸适配体对Ⅲ-21荧光团分子的激活倍数为1974倍。

(三)基于同源重组方法的重组质粒构建

1.制备线性化载体:选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化，可采用酶切或反向PCR扩增制备线性化载体。

2.PCR扩增制备插入片段:通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25bp(不包括酶切位点)的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。

3.线性化载体与插入片段浓度测定:将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1μL进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子量标准(DNA Marker)比较条带亮度以确定其近似浓度。

4.重组反应

重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1：2-1：3，即最适插入片段使用量为0.06-0.09pmol。

X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用。体系配制完成后，混匀各组分，置于50℃反应20min。当插入片段＞5kb时，可将孵育时间延长至25min。待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5min。反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

(四)细胞培养及转染：

本实施例中的293T/17细胞均在CO₂培养箱中用含10％胎牛血清(FBS)及链霉素和青霉素高糖培养基(RPMI)培养，本实施例中的COS-7细胞均在CO₂培养箱中用含10％胎牛血清(FBS)及链霉素和青霉素高糖培养基(DMEM)培养，生长达到80-90％汇合度时将细胞传代培养。转染时，用

(购自Promega)按照说明书进行操作。

(五)荧光成像：

实施例中主要的成像实验是利用配置了白激光的Leica SP8共聚焦激光显微镜进行拍摄，使用HCXPL APO 63x 1.47油镜和HyD检测器。

实施例1.Paprika核酸适配体分子的二级结构

利用mFold在线RNA结构分析软件分析Paprika核酸适配体的二级结构。Paprika包含2个茎结构，2个环结构和1个茎环结构(图1A)。对于其中一种茎和茎环的序列，Paprika-1(SEQ ID NO：1)预测的二级结构(图1B)。

实施例2.不同Paprika-1突变体对Ⅲ-21荧光团分子的荧光激活效果。

为了检测不同Paprika-1突变体对Ⅲ-21荧光团分子的荧光激活效果，对Paprika-1中序列进行如表1所示的点突变，按照常用实验方法(一)制备含不同碱基突变的Paprika-1突变体RNA，将0.5μMⅢ-21分别与2.5μM不同的Paprika-1突变体RNA孵育，按照常用实验方法(二)它们对Ⅲ-21荧光团分子的荧光激活倍数。检测结果显示，大部分含单个碱基突变的Paprika-1突变体保留对Ⅲ-21的较强的荧光激活效果(≥2倍)(表2)。部分含2-5个碱基突变的Paprika-1突变体仍保留对Ⅲ-21的较强的荧光激活效果(>20倍)(表3)。综上，Paprika-1的很多单碱基和多碱基突变体仍可以保留激活Ⅲ-21荧光团分子的适配体功能。

表2含有单碱基突变的Paprika-1突变体对Ⅲ-21的激活效果

注：表2中的Paprika-1是序列为SEQ ID NO：1的核酸适配体；其它的适配体是在Paprika-1序列中与图1B的Paprika-1对应核苷酸位置做的点突变。

表3含有多碱基突变的Paprika-1突变体对Ⅲ-21的激活效果

实施例3.Paprika-1核酸适配体分子的二级结构

利用mFold在线RNA结构分析软件分析Paprika-1(SEQ ID NO：1)核酸适配体的二级结构(图1B)。采用F30脚手架RNA连接得到的F30-Paprika-1(SEQ ID NO：2)核酸适配体的二级结构(图2A)。采用tRNA脚手架RNA连接得到的tRNA-Paprika-1(SEQ ID NO：3)核酸适配体的二级结构(图2B)。

实施例4.Paprika-1-Ⅲ-21复合物光谱性质鉴定

为了检测Paprika-1-Ⅲ-21复合物是否可以被紫外光激活，按照常用实验方法(一)制备Paprika-1(SEQ ID NO：2)RNA。将2μMⅢ-21与10μM Paprika-1孵育。检测结果显示，单独的Ⅲ-21荧光团分子溶液，加了阴性对照RNA的Ⅲ-21荧光团分子混合溶液，或是含有RNase A的Paprika-1与Ⅲ-21荧光团分子混合溶液，在紫外光照射下均无明显荧光，而Paprika-1与Ⅲ-21荧光团分子结合后的混合溶液，在紫外光照射下发出明亮的红色荧光(图3A)。

为了检测Paprika-1-Ⅲ-21复合物的光谱性质，按照常用实验方法(一)制备Paprika-1(SEQ ID NO：1)RNA。将1μMⅢ-21与5μM Paprika-1孵育。检测结果显示，Paprika-1-Ⅲ-21复合物的最大激发光为566nm，最大发射光为620nm(图3B)。

为了检测Paprika-1-Ⅲ-21复合物的光吸收与Ⅲ-21荧光团分子自身光吸收的区别，将2μMⅢ-21与10μM Paprika-1孵育，或者单独的5μMⅢ-21，分别检测Ⅲ-21和Paprika-1-Ⅲ-21复合物的光吸收。检测结果显示，Ⅲ-21最大光吸收为534nm，而Paprika-1-Ⅲ-21复合物的最大光吸收相对Ⅲ-21自身发生了很大的红移，最大吸收光为562nm(图3C)。

为了检测Paprika-1与Ⅲ-21结合的结合常数，利用2nM的Paprika-1与不同浓度的Ⅲ-21孵育，检测它们的荧光值。检测结果显示Paprika-1与Ⅲ-21结合的结合常数为2.7±0.2nM(图3D)。

实施例5.Paprika-1-Ⅲ-21复合物稳定性鉴定

为了检测Paprika-1-Ⅲ-21复合物在不同pH下的稳定性，将Paprika-1-Ⅲ-21复合物置于不同pH环境下60min，检测荧光值。检测结果显示，Paprika-1-Ⅲ-21复合物在pH5-9的范围内均保持很高的荧光信号(图4A)，说明Paprika-1-Ⅲ-21复合物有着很好的pH稳定性。

为了检测Paprika-1-Ⅲ-21复合物对Mg²⁺离子的依赖性，分别将1μM Paprika-1和5μMⅢ-21在含不同镁离子含量的缓冲溶液中孵育。检测结果显示，镁离子浓度对Paprika-1-Ⅲ-21复合物的荧光几乎没有影响(图4B)，说明Paprika-1-Ⅲ-21复合物有着很好的镁离子稳定性。

为了检测Paprika-1的温度稳定性，在含有5mM Mg²⁺的检测缓冲溶液中，将10μMⅢ-21与1μM Paprika-1孵育，然后置于不同的温度下放置5min，检测荧光值。检测结果显示，Paprika-1-Ⅲ-21的Tm值为52.4℃(图4C)，说明Paprika-1-Ⅲ-21复合物有着很好的温度稳定性。

为了检测Paprika-1-Ⅲ-21复合物对K⁺离子的依赖性，分别将10μMⅢ-21与1μMPaprika-1在含100mM KCl或100mM LiCl的缓冲液中孵育，70℃处理5min后置于室温15min以上，检测不同条件下的荧光值。由先前的文献报道可知，G四联体结构的稳定非常依赖于K⁺离子的存在。实验结果显示，Paprika-1-Ⅲ-21复合物的荧光不依赖于K⁺离子的存在(图4D)，推测Paprika-1结构中不存在G四联体结构。

实施例6.Ⅲ-21类似物的性质鉴定

按照常用实验方法(一)制备F30-Paprika-1RNA适配体分子，利用其检测Ⅲ-21类似物与Paprika结合的基本性质，包括荧光光谱和荧光激活倍数，检测结果如表4所示，从表中数据可以看出，F30-Paprika-1可以不同程度地激活Ⅲ-21类似物的荧光。

表4：F30-Paprika-1RNA适配体分子与不同荧光分子结合的理化性质测定

实施例7.碱基修饰的Paprika-1对Ⅲ-21的激活效果

为了检测经碱基修饰的Paprika-1对Ⅲ-21的激活效果，合成含碱基修饰的Paprika-2(SEQ ID NO：4，该序列：GGUGUAGUAUGACGTTCGCGTCAGGAAGAAUUGAUCUCGGCC中带下划线的碱基为脱氧核糖核苷酸碱基)和Paprika-3(SEQ ID NO：5，该序列：GGUGUAGUAUGACGUUCGCGUCAGGAAGAAUUGAUCUCGGCC中带下划线的碱基为经2’-F修饰的碱基)(由上海吉玛制药技术有限公司合成)，它们分别含茎-环结构碱基替换为脱氧核糖核苷酸(图5A中阴影部分的碱基)和部分碱基经2’-F修饰(图5B中阴影部分的碱基)。按照常用实验方法(二)检测这些碱基修饰的Paprika-1对Ⅲ-21荧光团分子的荧光激活效果。检测结果显示，经碱基修饰的Paprika-2和Paprika-3依然可以显著激活Ⅲ-21荧光团分子的荧光(图5C)。

实施例8.Paprika-1串联体

为了检测Paprika-1串联体对Ⅲ-21荧光的激活效果，将Paprika-1按照不同的形式进行串联，包含以下三种：

(1)“串联1”方式(图6A)，将Paprika-1结构上的“头”和“尾”按照“头-尾”连接的方式进行连接，以此获得nPaprika-1(其中n为可为任意拷贝的Paprika-1)。在本实施例中，分别全基因合成F30-2Paprika-4和F30-4Paprika-4的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7)，PCR扩增后，按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA，将0.1μM RNA适配体与10μMⅢ-21孵育后，按照常用实验方法(二)检测荧光强度。检测结果显示，随着n的增加，nPaprika-4-Ⅲ-21的荧光也随之增加，虽然nPaprika-4-Ⅲ-21的荧光并不是等倍数增加，但依然比Paprika-1-Ⅲ-21的荧光要高很多(图6D)，说明可以通过“串联1”方式提高Paprika-1-Ⅲ-21复合物的荧光强度。

(2)“串联2”方式(图6B)，将Paprika-1作为一个结构单元进行串联，以此获得nxPaprika-1(其中n为可为任意拷贝的Paprika-1)。在本实施例中，分别全基因合成2xPaprika-5和4xPaprika-5的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO：8，SEQID NO：9)，按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA，将0.1μM RNA适配体与10μMⅢ-21孵育后，按照常用实验方法(二)检测荧光强度。检测结果显示，随着n的增加，nxPaprika-1-Ⅲ-21的荧光也随之增加(图6E)，说明可以通过“串联2”方式提高Paprika-1-Ⅲ-21复合物的荧光强度。

(3)“串联3”方式(图6C)，是将上述“串联1”与“串联2”结合起来，将“串联1”得到的nPaprika-1作为一个结构单元按照“串联2”的方式进行串联，以此获得n1 xn2Paprika-1(其中n1和n2为可为任意拷贝的Paprika-1)。在本实施例中，分别全基因合成2x2Paprika-4和4x2Paprika-4的编码cDNA(编码RNA适配体的序列分别为SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11)，按照常用实验方法(一)制备核酸适配体RNA，将0.1μMRNA适配体与20μMⅢ-21孵育后，按照常用实验方法(二)检测荧光强度。检测结果显示，这种通过“串联3”方式得到的Paprika-1串联体-Ⅲ-21复合物的荧光强度要显著高于Paprika-1-Ⅲ-21(图6F)，说明可以通过“串联3”方式提高Paprika-1-Ⅲ-21复合物的荧光强度。

实施例9.F30-Paprika-1-Ⅲ-21复合物用于细菌中RNA的标记

为了检测F30-Paprika-1-Ⅲ-21在细菌中的效果，首先构建表达F30-Paprika-1(SEQ ID NO：2)的细菌表达质粒。利用引物对实施例2中的F30-Paprika-1进行扩增，利用引物对pET28a进行扩增去除了启动子和多克隆位点区，将扩增得到的F30-Paprika-1DNA片段与pET28a线性化载体按照实验方法(三)进行连接，得到的重组质粒命名为pET28a-T7-F30-Paprika-1。

扩增F30-Paprika-1片段所用的引物为：

上游引物(P1)：

5’-TTGCCATGTGTATGTGGGTTCGCCCACATACTCTGATGATCCG-3’

上游引物(P2)：5’-CCACATACTCTGATGATCCGGTGTAGTAGGTCCTTCGGGACCGGAAGAATTGATCTCG-3’

下游引物(P3)：5’-TTGCCATGAATGATCCGGCCGAGATCAATTCTTCCGGTCCC-3’

扩增pET28a载体使其线性化所用的引物为：

上游引物(P4)：5’-GGCCGGATCATTCATGGCAATAGCATAACCCCTTGGGGCC-3’

下游引物(P5)：5’-GAACCCACATACACATGGCAACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’

将pET28a-T7-F30-Paprika-1重组质粒转化BL21(DE3,Star)大肠杆菌菌株，挑取单克隆37℃培养，在OD₆₀₀＝0.2左右时，加入1mM IPTG诱导F30-Paprika-1的表达，4h后收菌，利用含2μMⅢ-21的PBS溶液重悬。以转化了pET28a空载体的BL21(DE3,Star)大肠杆菌作为对照。结果显示，只有表达了F30-Paprika-1且在Ⅲ-21存在下，细菌才能显示出明亮的红色荧光(图7)，表明Paprika-1-Ⅲ-21复合物可以用于细菌中RNA的荧光标记。

实施例10.Circular-Paprika-1与Ⅲ-21及其类似物用于哺乳动物细胞中RNA的标记

为了检测circular-Paprika-1与Ⅲ-21在哺乳动物细胞中的表达，构建表达circular-Paprika-1(SEQ ID No：12)的哺乳动物细胞表达质粒。全基因合成circular-Paprika-1基因片段，利用引物P6和P7以其为模板进行扩增，扩增circular-Paprika-1片段所用的引物为：

上游引物(P6)：5’-GGGCCGCACTCGCCGGTCCC-3’

下游引物(P7)：5’-GCGTGGACTGTACCCTCCAC-3’

扩增pLKO.1puro载体使其线性化所用的引物为：

上游引物(P8)：

5’-GTGGAGGGTACAGTCCACGCTTTTTTTGAATTCTCGACCTCG-3’

下游引物(P9)：

5’-GGGACCGGCGAGTGCGGCCCTCTAGAGTTTCGTCCTTTCCAC-3’

利用实验方法(三)将这些片段插入到pLKO.1puro载体中，得到的表达载体命名为pLKO.1-circular-Paprika-1，该质粒表达circular-Paprika-1。

将pLKO.1-circular-Paprika-1质粒转染293T/17细胞，36h后加入1μMⅢ-21对circular-Paprika-1进行标记，以不表达相应适配体的细胞作为对照，利用实验方法(五)检测标记效果。结果显示，circular-Paprika-1-Ⅲ-21复合物展现出非常明亮的红色荧光(图8)。

实施例11.F30-Paprika-1与Ⅲ-21及其类似物用于哺乳动物细胞中RNA的标记

为了检测F30-Paprika-1与Ⅲ-21用于哺乳动物细胞中RNA的标记，构建表达F30-Paprika-1(SEQ ID NO：2)的哺乳动物细胞表达质粒。分别用引物P1、P2和P3扩增实施例9中的F30-Paprika-1。

扩增pLKO.1puro载体使其线性化所用的引物为：

上游引物(P10)：5’-CTCGGCCGGATCATTCATGGCAATTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAG-3’

下游引物(P11)：5’-GCGAACCCACATACACATGGCAATCTAGAGTTTCGTCCTTTCCAC-3’

利用实验方法(三)将这些片段插入到pLKO.1puro载体中，得到的表达载体命名为pLKO.1-F30-Paprika-1，该质粒表达F30-Paprika-1。

将pLKO.1-F30-Paprika-1质粒转染293T/17细胞，36h后加入1μMⅢ-21对F30-Paprika-1进行标记，以不表达相应适配体的细胞作为对照，利用实验方法(五)检测标记效果。结果显示，F30-Paprika-1-Ⅲ-21复合物展现出非常明亮的红色荧光(图9)。

实施例12.Paprika-1-Ⅲ-21作为标签在活细胞内对U6剪接体RNA进行标记

为了验证Paprika-1与Ⅲ-21作为标签在活细胞内对U6剪接体RNA进行标记，构建表达U6-Paprika-1(SEQ ID NO：13)的哺乳动物细胞表达质粒。全基因合成U6-Paprika-1基因片段。

扩增U6-Paprika-1片段所用的引物为：

上游引物(P12)：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCAC-3’

下游引物(P13)：5’-CAAAAATATGGAACGCTTCAC-3’

扩增pLKO.1puro载体使其线性化所用的引物为：

上游引物(P14)：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTTGTTTTTTTGAATTCTCGACCTCG-3’

下游引物(P15)：5’-GTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACTCTAGAGTTTCGTCCTTTCC-3’

利用实验方法(三)将这些片段插入到pLKO.1puro载体中，得到的表达载体命名为pLKO.1-U6-Paprika-1，该质粒表达U6-Paprika-1。将pLKO.1-U6-Paprika-1质粒与pCDN3.1/hygro(+)-SART3-BFP(Chen et al.Nature biotechnology 2019.37:1287-1293)质粒共同转染293T/17细胞，36h后分别加入0.5μMⅢ-21进行标记，利用实验方法(五)检测标记效果。结果显示，Paprika-1与SART3-BFP在卡哈尔体(Cajal body)上形成共定位，图中亮点即为卡哈尔体，证明利用Paprika-1-Ⅲ-21在U6与SART3-BFP相互作用指示卡哈尔体的功能，与文献报道一致(图10)(Chen et al.Nature biotechnology 2019.37:1287-1293)。

实施例13.Paprika-1-Ⅲ-21作为标签在活细胞内对mRNA进行标记

为了验证Paprika-1与Ⅲ-21作为标签在活细胞内对纤维状肌动蛋白ACTB mRNA进行标记，构建哺乳动物细胞表达质粒。根据已报道文献(Chen et al.Naturebiotechnology2019.37:1287-1293)，构建pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB和pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB-Paprika-1，这些质粒分别表达ACTB和ACTB-Paprika-1(SEQ ID NO：14)。

首先构建Paprika-1与不同RNA融合的嵌合RNA的表达质粒。因为Paprika-1片段较短，可以引物同源重组的方法将引物搭桥获得的Paprika-1基因片段插入到pCDNA3.1/hygro(+)载体，得到pCDNA3.1/hygro(+)-Paprika-1重组质粒。

扩增pCDNA3.1/hygro(+)-Paprika-1片段所用的引物为：

上游引物(P16)：

5’-GACGTTCGCGTCAGGAAGAATTGATCTCGGCCGCGGCTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCC-3’

下游引物(P17)：

5’-ATTCTTCCTGACGCGAACGTCATACTACACCGCGGCCTCGAGGGATCCGAGCTCGGTAC-3’

全基因合成ACTB基因片段(ACTB RNA序列：ACCESSION NM_001101)，利用引物对ACTB基因片段进行扩增，利用实验方法(三)将片段插入到经引物线性化的pCDNA3.1/hygro(+)-Paprika-1载体中，获得pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB-Paprika-1重组质粒，编码ACTB-Paprika-1嵌合RNA。

扩增ACTB片段所用的引物为：

上游引物(P18)：5’-ATGGATGATGATATCGCCGC-3’

下游引物(P19)：5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’

扩增pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB-Paprika-1载体使其线性化所用的引物为：

上游引物(P20)：

5’-CGTCCACCGCAAATGCTTCTAGCTCGAGGCCGCGGTGTAGTATG-3’

下游引物(P21)：

5’-GCGGCGATATCATCATCCATGGATCCGAGCTCGGTACCAAG-3’

将pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB和pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB-Paprika-1质粒分别转染进COS-7细胞，24h后分别加入0.5μMⅢ-21进行标记，利用实验方法(五)检测标记效果。结果显示，Paprika-1-Ⅲ-21可用于ACTB mRNA标记(图11)。

实施例14.Paprika-1用于RNA的提取与纯化的标签

为了检测Paprika-1用于RNA的提取与纯化，将实施例13中的pCDNA3.1/hygro(+)-ACTB-Paprika-1重组质粒转染COS-7细胞，24h后收集细胞，利用Eastep Super总RNA提取试剂盒(Promega)提取细胞的总RNA。将提取的总RNA溶解在含40mM HEPES,pH 7.4,125mMKCl,5mM MgCl₂的缓冲液中，70℃孵育10min后，室温放置30min以上。

取500uL Activated Thiol Sepharose 4B(GE Healthcare)经500μL PBS清洗两次后，加入含10mM TCEP(Sigma)的PBS室温孵育1h。利用500μL PBS清洗两次后，加入含马来酰胺的Ⅲ-21荧光团分子(Mal-Ⅲ-21)于室温反应30min，利用500μL PBS清洗三次。将经上述处理的总RNA与处理过的微珠室温孵育，30min后4000rpm离心2min，弃上清，利用40mMHEPES,pH 7.4,125mM KCl,5mM MgCl₂的缓冲液清洗琼脂糖微珠6次，每次均离心去上清。用DEPC水重悬微珠，70℃处理10min，4000rpm离心2min，收集上清。在收集的上清中加入1/10体积的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，-80℃冰箱放置20min，4℃条件下14000rpm离心10min，留沉淀，弃上清，利用预冷的70％乙醇溶液清洗沉淀，4℃条件下14000rpm离心10min，留沉淀，弃上清，如此反复一次。将沉淀置于室温下5min，待乙醇挥发完后，加入少量体积的DEPC水重悬沉淀。

分别检测细胞破碎后上清液，以及最终高温洗脱后的洗脱液，分别与荧光团Ⅲ-21孵育后的荧光，以空白细胞的破碎上清为对照。检测结果显示，洗脱液与Ⅲ-21孵育后的荧光显著高于上样前的破碎后上清液(图12)，说明ACTB-Paprika-1RNA得到很好的富集，表明Paprika-1可以作为一个标签用于RNA的分离与纯化。

实施例15.Ⅲ-21及其类似物的合成

化合物Ⅲ-1：

4-N,N-二甲基-苯甲醛(0.35g，2.3mmol)，4-氰基-苯乙腈(0.4g，2.8mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入40ml无水乙醇溶解，加入二滴哌啶，Ar保护条件下油浴加热回流2h，反应完毕，冷却至室温，大量固体析出，过滤，冷乙醇冲洗滤饼三次，真空烘干的橙色固体(0.60g，95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝3.05(s,6H),6.83(d,J＝9.2Hz,2H,),7.84-7.94(m,6H),8.02ppm(s,1H).HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₈H₁₆O₃[M+H]⁺:274.1344.Found:274.1345.

化合物Ⅲ-2：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.34g，89％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝1.23(t，J＝7.60Hz,6H),3.05(t，J＝7.60Hz,4H),6.84(d,J＝9.2Hz,2H,),7.84-7.95(m,6H),8.09ppm(s,1H).HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₂₀H₂₀O₃[M+H]⁺:302.1657.Found:302.1658.

化合物Ⅲ-3：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.33g，95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝7.96(s,1H),7.85(d,J＝16.0Hz,6H),6.81(d,J＝8.0Hz,2H),4.77(s,1H),3.55(d,J＝28.0Hz,4H),3.04(s,1H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₉H₁₈N₃O[M+H]⁺:304.1450.Found:304.1451.

化合物Ⅲ-4：

化合物Ⅲ-3(0.61g，2.0mmol)于40mL干燥DCM中，加入TEA(0.25g，2.2mmol)，0℃条件下缓慢加入对甲苯磺酰氯的(0.38g，2.0mmol)的10ml DCM溶液，Ar保护条件下缓慢升至室温，反应完毕，加入2mL水淬灭反应，分出有机相，Na₂SO₄干燥，减压条件下除去有机溶剂，残余物不经进一步处理，直接用于下一步。

残余物溶于20ml乙腈中，加入1ml甲胺的甲醇溶液，体系在Ar保护条件下油浴加热回流过夜，反应完毕，加压除去溶剂，体系溶于50ml DCM中，分别用水、饱和食盐水洗涤(2×100ml)，有机相用Na₂SO₄干燥，加压除去溶剂，残余物经柱色谱分离得橙红色固体(0.54g,82％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.88(d,J＝9.0Hz,2H),7.74–7.65(m,4H),7.48(s,1H),6.73(d,J＝9.1Hz,2H),3.60–3.55(m,2H),3.08(s,3H),2.57–2.52(m,2H),2.34(s,6H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₂₁H₂₃N₄[M+H]⁺:331.1923.Found:331.1925.

化合物Ⅲ-5：

4-羟基-3,5-二氟-苯甲醛(0.32g，2.0mmol)，4-氰基-苯乙腈(0.35g，2.4mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入40ml无水乙醇溶解，加入二滴哌啶，Ar保护条件下油浴加热回流2h，反应完毕，冷却至室温，大量固体析出，过滤，冷乙醇冲洗滤饼三次，真空烘干的橙色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.80(d,J＝9.0Hz,2H),7.74–7.66(m,4H),7.48(s,1H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₆H₉F₂N₂O[M+H]⁺:283.0683.Found:283.0684.

5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-吡嗪-2-甲醛：

4-N-甲基-N-羟乙基胺(2.6g，35mmol)，5-氯-吡嗪-2-甲醛(0.50g，3.5mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入20ml无水乙腈溶解，加入K₂CO₃(0.71g，5.3mmol)，Ar保护条件下油浴加热回流24h，反应完毕，冷却至室温，过滤，真空除去溶剂，残余物溶于100ml DCM中，分别用水、饱和食盐水洗涤(2×100ml)，有机相用Na2SO4干燥，除去有机溶剂，残余物经柱色谱分离得5-(N-甲基-N-羟乙基)-吡嗪-2-醛(0.48g，76％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ9.88(s,1H),8.62(d,J＝1.2Hz,1H),8.14(d,J＝1.1Hz,1H),3.92(m,2H),3.88–3.83(m,2H),3.28(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₈H₁₂N₃O₂[M+H]⁺:182.1.Found:182.1.

化合物Ⅲ-6：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.36g，96％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.39(s,1H),8.30(s,1H),7.80(d,J＝8.5Hz,2H),7.72(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(s,1H),3.93(t,J＝4.9Hz,2H),3.88–3.83(m,2H),3.29(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₇H₁₆N₅O[M+H]⁺:306.1355.Found:306.1357.

化合物Ⅲ-7：

参照化合物Ⅲ-4的合成方法，(0.21g，67％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.37(d,J＝5.2Hz,2H),8.06(s,1H),8.00–7.85(m,4H),3.77(t,J＝6.5Hz,2H),3.20(s,3H),2.56(m,2H),2.23(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₉H₂₁N₆[M+H]⁺:333.1828.Found:333.1829.

6-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-吡嗪-3-醛：

按照化合物5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-吡嗪-2-醛的合成方法，(0.45g，68％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ＝9.69(s,1H),8.43(d,J＝2.1Hz,1H),7.86(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),6.56(d,J＝9.1Hz,1H),3.86–3.79(m,4H),3.15(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.ForC₉H₁₃O₂N₂[M+H]⁺:181.1.Found:181.1.

化合物Ⅲ-8：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.39g，89％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.54(d,J＝4.0Hz,1H),8.30(dd,J＝9.3,2.5Hz,1H),8.03(s,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,2H),7.85(d,J＝8.0Hz,2H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),4.77(t,J＝5.4Hz,1H),3.67(t,J＝5.3Hz,2H),3.60(q,J＝5.4Hz,2H),3.15(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₈H₂₇ N₄O[M+H]⁺:305.1402.Found:305.1401.

化合物Ⅲ-9：

参照化合物Ⅲ-4的合成方法，(0.31g,92％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.55(d,J＝4.0Hz,1H),8.31(dd,J＝9.3,2.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,2H),7.84(d,J＝8.0Hz,2H),6.85(d,J＝8.0Hz,1H),4.78(t,J＝5.4Hz,1H),3.67(t,J＝5.3Hz,2H),3.60(q,J＝5.4Hz,2H),3.17(t,J＝8.0Hz,4H),1.17(t,J＝8.0Hz,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₂₂H₂₆ N₅[M+H]⁺:360.2188.Found:360.2187.

4-N,N-二甲基-6醛基-吡啶：

参照化合物4-N-甲基-N-(2-N’,N’-二甲基-乙基)-苯甲醛的合成方法，(0.31g，49％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.86(d,J＝0.6Hz,1H),8.17(d,J＝2.9Hz,1H),7.83(d,J＝8.9Hz,1H),6.94(dd,J＝8.8,2.9Hz,1H),3.10(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₈H₁₁ N₂O[M+H]⁺:151.1.Found:151.1.

化合物Ⅲ-10：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.36g，96％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.86(d,J＝0.6Hz,1H),8.26(s，1H),8.17(d,J＝2.9Hz,1H),7.83(d,J＝8.9Hz,1H),7.46(m,4H),6.94(dd,J＝8.8,2.9Hz,1H),3.10(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₇H₁₅ N₄[M+H]⁺:275.1297.Found:275.1298.

2-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-5-醛基-嘧啶：

参照化合物4-N-甲基-N-(2-N’,N’-二甲基-乙基)-苯甲醛的合成方法，(0.42g，72％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.89(s,1H),8.73(s，2H),3.64(t,J＝8.9Hz,2H),3.45(t,J＝8.8Hz,2H),3.10(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₈H₁₂ N₃O[M+H]⁺:182.1.Found:182.1.

化合物Ⅲ-11：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.36g，96％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.26(s,1H),8.73(s，2H),7.64(m,4H),3.64(t,J＝8.9Hz,2H),3.44(t,J＝8.8Hz,2H),3.11(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₇H₁₆ N₅O[M+H]⁺:306.1355.Found:306.1356.5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-2-醛基-嘧啶：

参照化合物4-N-甲基-N-(2-N’,N’-二甲基-乙基)-苯甲醛的合成方法，(0.42g，72％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.98(s,1H),8.21(s，2H),3.64(t,J＝8.9Hz,2H),3.44(t,J＝8.8Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₈H₁₂ N₃O₂[M+H]⁺:182.1.Found:182.1.

1-氰基-1-(4-苯乙腈)-2-2-(5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-)嘧啶-乙烯：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.56g，89％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.21(s，2H),7.99(s,1H),7.64(s,4H),3.64(t,J＝8.9Hz,2H),3.44(t,J＝8.8Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₇H₁₆ N₅O[M+H]⁺:306.1.Found:306.1.

化合物Ⅲ-12：

参照化合物Ⅲ-4的合成方法，(0.36g，96％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.21(s，2H),7.99(s,1H),7.64(s,4H),3.77(t,J＝6.5Hz,2H),3.20(s,3H),2.56(m,2H),2.23(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₉H₂₁ N₆[M+H]⁺:333.1828.Found:333.1829.

2-乙腈-5-氰基-吡啶：

2-溴甲基-5-氰基吡啶(0.50g，2.5mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入50ml THF溶解，Ar保护条件下加入10ml NaCN的2M的水溶液，油浴加热回流12h，反应完毕，体系冷却至室温，DCM萃取(3×100ml)，合并有机相，分别用水、饱和食盐水洗涤(2×100ml)，有机相用NaSO4干燥，减压除去溶剂，残余物经柱色谱纯化分离得2-乙腈-5-氰基吡啶(0.19g，56％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.78(s,1H),7.95(m,1H),7.56(m,1H),4.01(s,2H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₈H₆ N₃[M+H]⁺:144.1.Found:144.1.

化合物Ⅲ-13：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.45g，95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.78(s,1H),8.21(s,1H),7.94(m,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,2H),7.57(m,1H),6.80(d,J＝8.0Hz,2H),3.64(t,J＝8.9Hz,2H),3.44(t,J＝8.8Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₈H₁₇ N₄O[M+H]⁺:305.1402.Found:305.1403.

2-氰基-5-乙腈-吡嗪：

2-氯-吡嗪-5-乙腈(0.32g,2.0mmol)、CuCN(0.93g，10.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入30ml干燥DMSO溶解，Ar保护条件下80℃油浴加热12h，反应完毕，体系倒入100ml水中，DCM萃取(4×50ml)，合并有机相，分别用水、饱和食盐水洗涤(2×100ml)，有机相用Na2SO4干燥，减压除去有机溶剂，残余物经柱色谱分离得2-氰基-吡嗪-5-乙腈(0.20g，69％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.60(s,1H),8.48(s,1H),3.92(s,2H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₇H₅ N₄[M+H]⁺:145.1.Found:145.1.

化合物Ⅲ-14：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.25g，91％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.60(s,1H),8.48(s,1H),8.11(s,1H),7.81(d,J＝8.2Hz,2H),6.84(d,J＝8.2Hz,2H),3.60(t,J＝9.2Hz,2H),3.46(t,J＝9.2Hz,2H),3.12(s,3H).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₇H₁₆N₅O[M+H]⁺:306.1355.Found:306.1354.

化合物Ⅲ-15：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.25g，91％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.22(s,1H),8.00(d,J＝9.1Hz,1H),7.77–7.69(m,1H),7.43–7.34(m,1H),6.88(d,J＝9.1Hz,1H),4.81(t,J＝5.2Hz,1H),3.64–3.52(m,3H),3.09(s,1H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.ForC₁₉H₁₈N₃O₂[M+H]⁺:320.1399.Found:320.1397.

化合物Ⅲ-16：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.29g，94％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.11(2H,d,J＝10.4Hz),7.99(3H,dd,J＝8.6,3.0Hz),7.54(1H,dd,J＝8.0,8.0Hz),7.44(1H,dd,J＝8.0,8.0Hz),6.88(2H,d,J＝9.2Hz),4.82(1H,bt,t,J＝5.2Hz),3.60(2H,t,J＝5.2Hz),3.56(2H,t,J＝5.2Hz),3.09(3H,s).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₉H₁₈N₃OS[M+H]⁺:336.1171.Found:336.1170.

6-甲胺-苯并[b]噻吩-2-甲醛：

6-溴苯并[b]噻吩-2-甲醛(0.42g，1.7mmol)、二甲基乙胺(40％水溶液，1g，8.9mmol)、CuI(13.9mg，0.073mmol)、K₃PO₄·H₂O(155.4mg，0.73mmol)、甲胺(33％水溶液，1g)于100ml耐压瓶中，密封条件下60℃油浴加热12h，体系冷却至室温，加入50ml水，DCM萃取(3×100ml)，合并有机相，Na₂SO₄干燥，减压除去有机溶剂，残余物经柱色谱分离纯化(0.23g，68％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.92(1H,s),8.14(1H,s),7.82(1H,d,J＝9.1Hz),7.18(1H,d,J＝2.1Hz),7.01(1H,dd,J＝9.1,2.3Hz),3.05(3H,s).LR-MS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₀H₁₀NOS[M+H]⁺:192.0.Found:192.0.

化合物Ⅲ-17：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.29g，94％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.45(s,1H),7.92(d,J＝8.6Hz,2H),7.85(d,J＝8.3Hz,3H),7.73(dd,J＝8.6,3.9Hz,1H),7.21(d,J＝1.9Hz,1H),7.21(d,J＝1.9Hz,1H),6.96(dd,J＝9.1,2.3Hz,1H),3.05(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₉H₁₄N₃S[M+H]⁺:360.1171.Found:360.1173.

6-N-甲基-N-羟乙基-苯并[b]噻吩-2-甲醛：

参照化合物6-甲胺-苯并[b]噻吩-2-甲醛的合成方法，(0.54g，79％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.91(s,1H),8.14(s,1H),7.81(d,J＝5.2Hz,1H),7.17(d,J＝2.0Hz,1H),7.01(dd,J＝2.0,8.8Hz,1H),4.76(t,J＝5.6Hz,1H),3.58(t,J＝4.2Hz,2H),3.52(t,J＝4.2Hz,2H),3.04(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C₁₂H₁₄NO₂S,[M+H]⁺:235.1.Found236.1.

化合物Ⅲ-18：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.21g，95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.45(s,1H),7.92(d,J＝8.6Hz,2H),7.85(d,J＝8.3Hz,3H),7.73(dd,J＝8.6,3.9Hz,1H),7.21(d,J＝1.9Hz,1H),7.21(d,J＝1.9Hz,1H),6.96(dd,J＝9.1,2.3Hz,1H),3.63–3.57(m,2H),3.52(t,J＝5.7Hz,2H),3.05(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₂₁H₁₉N₃OS[M+H]⁺:360.1171.Found:360.1173.

5-N,N-二甲胺-2-醛基并二噻吩：

参照化合物6-N-甲基-N-羟乙基-苯并[b]噻吩-2-甲醛的合成方法，(0.54g，79％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.66(s,1H),8.05(s,1H),6.30(s,1H),4.88(bt,1H),3.07(s,6H).MS(ESI):m/z Calcd.For C₉H₁₂NOS₂[M+H]⁺:214.0；found 214.0.

化合物Ⅲ-19：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.31g，90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.34(s,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,2H),7.81(s,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),6.32(s,1H),4.88(t,J＝4.0Hz,1H),3.08(s,6H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₈H₁₄N₃S₂[M+H]⁺:336.0629.Found:336.0630.

5-N,N-二乙胺-2-醛基并二噻吩：

参照化合物6-N-甲基-N-羟乙基-苯并[b]噻吩-2-甲醛的合成方法，(0.44g，75％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.78(s,1H),8.09(s,1H),6.30(s,1H),4.87(bt,1H),3.27(t,J＝8.4Hz,4H),1.26(t,J＝8.4Hz,4H).MS(ESI):m/z Calcd.For C₉H₁₂NOS₂[M+H]⁺:214.0；found 214.0.

化合物Ⅲ-20：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.31g，90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.34(s,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,2H),7.81(s,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),6.32(s,1H),4.88(t,J＝4.0Hz,1H),3.27(t,J＝8.4Hz,4H),1.26(t,J＝8.4Hz,4H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₂₀H₁₈N₃S₂[M+H]⁺:364.0942.Found:364.0943.

5-(N-甲基-N-羟乙基)氨基-2-醛基并二噻吩：

参照化合物6-N-甲基-N-羟乙基-苯并[b]噻吩-2-甲醛的合成方法，(0.44g，75％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.66(s,1H),8.05(s,1H),6.30(s,1H),4.88(bt,1H),3.64(t,J＝5.6Hz,2H),3.44(t,J＝5.6Hz,2H),3.07(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC₁₀H₁₂NO₂S₂[M+H]⁺:241.0；found 242.0.

化合物Ⅲ-21：

参照化合物Ⅲ-1的合成方法，(0.31g，90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.34(s,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,2H),7.81(s,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),6.32(s,1H),4.88(t,J＝4.0Hz,1H),3.65(q,J＝5.5Hz,2H),3.44(t,J＝5.5Hz,2H),3.34(s,1H),3.08(s,3H).LR-HRMS(ESI-TOF):Calcd.For C₁₉H₁₆N₃OS₂[M+H]⁺:366.0735.Found:366.0736.

应该理解，本说明书各实施例中的用量、反应条件等除非特别注明均为近似值，可根据实际情况略作改变而获得类似结果。除专门定义外，本文所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所理解的含意相同。本文提及的所有文献都引入本申请作为参考。本说明书中描述的是作为示范用的优选实施方案，本领域技术人员可采用与本文所述相似的方法及材料实施本发明获得相同或相似的结果，对本发明所作的各种改动或修改仍属于本申请所附权利要求书限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种新型核酸分子检测与定量技术

<130> 2021-07-19

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 1

gguguaguau gacguucgcg ucaggaagaa uugaucucgg cc 42

<210> 2

<211> 100

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 2

uugccaugug uauguggguu cgcccacaua cucugaugau ccgguguagu agguccuucg 60

ggaccggaag aauugaucuc ggccggauca uucauggcaa 100

<210> 3

<211> 141

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 3

gcccggauag cucagucggu agagcagcgc uggguguagu agguguagua gguccuucgg 60

gaccggaaga auugaucucg gccggaagaa uugaucucgg cccagcgcgg guccaggguu 120

caagucccug uucgggcgcc a 141

<210> 4

<211> 42

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 4

gguguaguau gacguucgcg ucaggaagaa uugaucucgg cc 42

<210> 5

<211> 42

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 5

gguguaguau gacguucgcg ucaggaagaa uugaucucgg cc 42

<210> 6

<211> 138

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 6

uugccaugug uauguggguu cgcccacaua cucugaugau ccgguguagu agguccggug 60

uaguaggucc uucgggaccg gaagaauuga ucucggccgg accggaagaa uugaucucgg 120

ccggaucauu cauggcaa 138

<210> 7

<211> 214

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 7

uugccaugug uauguggguu cgcccacaua cucugaugau ccgguguagu agguccggug 60

uaguaggucc gguguaguag guccggugua guagguccuu cgggaccgga agaauugauc 120

ucggccggac cggaagaauu gaucucggcc ggaccggaag aauugaucuc ggccggaccg 180

gaagaauuga ucucggccgg aucauucaug gcaa 214

<210> 8

<211> 99

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 8

gguguaguag guccuucggg accggaagaa uugaucucgg cccaaaacaa aacaaaaggu 60

guaguagguc cuucgggacc ggaagaauug aucucggcc 99

<210> 9

<211> 213

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 9

gguguaguag guccuucggg accggaagaa uugaucucgg cccaaaacaa aacaaaaggu 60

guaguagguc cuucgggacc ggaagaauug aucucggccc aaaacaaaac aaaaggugua 120

guagguccuu cgggaccgga agaauugauc ucggcccaaa acaaaacaaa agguguagua 180

gguccuucgg gaccggaaga auugaucucg gcc 213

<210> 10

<211> 185

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 10

gguguaguag guccggugua guagguccuu cgggaccgga agaauugauc ucggccggac 60

cggaagaauu gaucucggcc caaaacaaaa caaaacaaaa caaaaggugu aguagguccg 120

guguaguagg uccuucggga ccggaagaau ugaucucggc cggaccggaa gaauugaucu 180

cggcc 185

<210> 11

<211> 395

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 11

gguguaguag guccggugua guagguccuu cgggaccgga agaauugauc ucggccggac 60

cggaagaauu gaucucggcc caaaacaaaa caaaacaaaa caaaaggugu aguagguccg 120

guguaguagg uccuucggga ccggaagaau ugaucucggc cggaccggaa gaauugaucu 180

cggcccaaaa caaaacaaaa caaaacaaaa gguguaguag guccggugua guagguccuu 240

cgggaccgga agaauugauc ucggccggac cggaagaauu gaucucggcc caaaacaaaa 300

caaaacaaaa caaaaggugu aguagguccg guguaguagg uccuucggga ccggaagaau 360

ugaucucggc cggaccggaa gaauugaucu cggcc 395

<210> 12

<211> 201

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 12

gggccgcacu cgccgguccc aagcccggau aaaaugggag ggggcgggaa accgccuaac 60

caugccgagu gcggccgcgg uguaguaggu ccuucgggac cggaagaauu gaucucggcc 120

guggccgcgg ucggcgugga cuguagaaca cugccaaugc cggucccaag cccggauaaa 180

aguggagggu acaguccacg c 201

<210> 13

<211> 159

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 13

gugcucgcuu cggcagcaca uauacuaaaa uuggaacgau acagagaaga uuagcauggc 60

cccucgaaga ggguguagua gguccuucgg gaccggaaga auugaucucg gcccucuucg 120

aggaugacac gcaaauucgu gaagcguucc auauuuuug 159

<210> 14

<211> 1186

<212> RNA

<213> Synthetic Sequence

<400> 14

auggaugaug auaucgccgc gcucgucguc gacaacggcu ccggcaugug caaggccggc 60

uucgcgggcg acgaugcccc ccgggccguc uuccccucca ucguggggcg ccccaggcac 120

cagggcguga uggugggcau gggucagaag gauuccuaug ugggcgacga ggcccagagc 180

aagagaggca uccucacccu gaaguacccc aucgagcacg gcaucgucac caacugggac 240

gacauggaga aaaucuggca ccacaccuuc uacaaugagc ugcguguggc ucccgaggag 300

caccccgugc ugcugaccga ggccccccug aaccccaagg ccaaccgcga gaagaugacc 360

cagaucaugu uugagaccuu caacacccca gccauguacg uugcuaucca ggcugugcua 420

ucccuguacg ccucuggccg uaccacuggc aucgugaugg acuccgguga cggggucacc 480

cacacugugc ccaucuacga gggguaugcc cucccccaug ccauccugcg ucuggaccug 540

gcuggccggg accugacuga cuaccucaug aagauccuca ccgagcgcgg cuacagcuuc 600

accaccacgg ccgagcggga aaucgugcgu gacauuaagg agaagcugug cuacgucgcc 660

cuggacuucg agcaagagau ggccacggcu gcuuccagcu ccucccugga gaagagcuac 720

gagcugccug acggccaggu caucaccauu ggcaaugagc gguuccgcug cccugaggca 780

cucuuccagc cuuccuuccu gggcauggag uccuguggca uccacgaaac uaccuucaac 840

uccaucauga agugugacgu ggacauccgc aaagaccugu acgccaacac agugcugucu 900

ggcggcacca ccauguaccc uggcauugcc gacaggaugc agaaggagau cacugcccug 960

gcacccagca caaugaagau caagaucauu gcuccuccug agcgcaagua cuccgugugg 1020

aucggcggcu ccauccuggc cucgcugucc accuuccagc agauguggau cagcaagcag 1080

gaguaugacg aguccggccc cuccaucguc caccgcaaau gcuucuagcu cgaggccgcg 1140

guguaguaug acguucgcgu caggaagaau ugaucucggc cgcggc 1186

Claims (25)

1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：

(a)核苷酸序列为：N₁UGUAGUAN₉-N₁₀-N₁₁GGAAGAAUUGAUCUCGGN₂₉，其中N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉代表长度≥1个的核苷酸片段，并且N₁和N₂₉核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，N₉和N₁₁核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；

(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少58％同一性的核苷酸序列；

(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的Paprika结构核苷酸序列具有至少58％，63％，67％，71％，75％，79％，83％，94％，96％，98％或100％同一性的序列。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的Paprika结构核苷酸序列中不包括N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉的位置，经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。

4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N₁、N₉、N₁₀、N₁₁和N₂₉的位置，经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。

5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N₁与N₂₉互补配对时，N₁核苷酸序列的方向为5’-3’，N₂₉核苷酸序列的方向为3’-5’；N₉与N₁₁互补配对时，N₉核苷酸序列的方向为5’-3’，N₁₁核苷酸序列的方向为3’-5’。

6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当N₁与N₂₉中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N₁与N₂₉核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当N₉与N₁₁中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N₉与N₁₁核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。

7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、G3A、G3U、G3C、U4A、U4C、U4G、A5U、A5C、A5G、G6A、G6U、G6C、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、A18G、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、U25G、C26A、C26U、C26G、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。

8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、U4A、U4C、U4G、A5C、A5G、G6U、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、C26A、C26U、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。

9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、U4A、U4C、U4G、A5C、A5G、G6U、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、U19A、U19C、U20A、U20C、U20G、G21U、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24G、U25C、C26U、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。

10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N₁与N₂₉处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。

11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是RNA分子或经碱基修饰的RNA分子。

12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是DNA-RNA杂交分子或经碱基修饰的DNA-RNA分子。

13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5-10倍，至少20-50倍，至少100-200倍，至少200-1000倍或者至少1000-5000倍。

14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。

15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1-14任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(I)所述的结构：

其中：D-为X1O-或N(X2)(X3)-；X1、X2、X3各自独立地选自氢、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基，X2、X3任选相互连接为饱和或不饱和的环；R-选自氢、氰基、羧基、酰胺基、酯基、羟基、1-10个碳的直链或支链烷基或改性烷基；Ar1、Ar2各自独立地选自单环芳亚基、单环杂芳亚基，或由单环芳基、单环杂芳基中的一种或两种稠合组成的具有2-3个环结构的芳香亚基；

其中：Ar1、Ar2中的氢原子可以独立地被F、Cl、Br、I、羟基、硝基、醛基、羧基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、伯氨基、仲氨基、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基取代；

其中：以上所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自F、Cl、Br、I、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S＝O)-、叠氮基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、环氧乙烷、琥珀酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氯、磺酰氯、饱和或不饱和的单环或双环亚环羟基、桥联酯杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1-10个碳原子，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；

其中，复合物中的核酸适配体分子与荧光团分子分别存在于单独的溶液中，或者核酸适配体分子与荧光团分子在同一溶液中。

16.根据权利要求15所述的荧光团分子的复合物，所述改性烷基含有选自-OH、-O-、乙二醇单元、单糖单元、二糖单元、-O-CO-、-NH-CO-、-SO₂-O-、-SO-、Me₂N-、Et₂N-、-S-S-、-CH＝CH-、F、Cl、Br、I、-NO₂和氰基中的至少一种基团；

可选地，荧光团分子含有的芳香环选自下式(Ⅱ-1)～(Ⅱ-15)中的结构：

可选地，荧光团分子选自下式化合物：

。

17.根据权利要求16所述的复合物，其中的荧光团分子选自III-1、III-2、III-3、III-4、III-5、III-6、III-7、III-8、III-9、III-10、III-11、III-12、III-13、III-14、III-15、III-16、III-17、III-18、III-19、III-20和Ⅲ-21。

18.根据权利要求15-17任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。

19.一种权利要求15-18任一项所述的复合物用于体外或体内目标核酸分子的检测或标记。

20.一种DNA分子，其转录权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子。

21.一种表达载体，其包含权利要求20所述的DNA分子。

22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的表达系统。

23.一种试剂盒，包含权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求21所述的表达载体和/或权利要求22所述的宿主细胞和/或权利要求15-18任一项所述的复合物。

24.一种检测靶标分子的方法，包括步骤：

a)在包含靶标分子的溶液中加入权利要求15-18任一项所述的复合物；

b)用合适波长的光激发复合物；

c)检测复合物的荧光。

25.一种提取与纯化RNA的方法，包含利用权利要求15-18任一项所述复合物提取与纯化RNA。

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