CN115927346B - 一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT-Tan及其应用 - Google Patents
一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT-Tan及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT‑Tan及其应用，该适配体为单链DNA结构，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1‑7所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体能特异性进入活化肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）。本发明可用于肝纤维化的诊断，以及携带microRNA、siRNA等生物活性分子用作细胞内的药物运输载体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种核酸适配体及其用途。
背景技术
核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment technology，SELEX)，在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。目前核酸适配体作为一类新型的、广受关注的检测和治疗工具，在人类医学研究、疾病诊断、病毒侵染机制研究等领域展现出广阔的应用前景。近20年，大量与肿瘤以及其他疾病相关的重要分子的适配体已被筛选出来应用于生物医学基础研究、疾病诊疗和药物研发之中。Pegaptanib(商品名Macugen)是第一个被美国FDA批准上市用于治疗老年性黄斑变性的适配体药物。还有Aptamera公司研制的核酸适配体药物AS1411，经临床试验研究表明，AS1411对乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞有较强的抑制作用。这些都表明核酸适配体具有很好的临床应用前景。在传统基础上发展起来的Cell-SELEX技术，是将整个活细胞作为靶标来获取能与目的细胞相结合的适配体技术。该技术可以使细胞更接近自然状态，不仅可以获得未知目标信息的适配体，还可以区分细胞的某种状态，如分化或未分化细胞、正常细胞、癌细胞等。因此，该技术在肿瘤诊断、治疗和肿瘤标志物的发现方面具有巨大的应用潜力。
肝纤维化是以肝内结缔组织异常增生沉积为特征，是多种原因所致慢性肝病的共同病理改变。全球肝病的发病率正在增加，肝纤维化及其末期肝硬化在全世界构成巨大的卫生保健负担。2015年，全球约130万人死于慢性肝病(chronic liver disease，CLD)和肝硬化。CLD的病因包括慢性病毒性肝炎、酒精、非酒精性脂肪肝(non alcoholic fattyliver disease，NAFLD)、血色素沉着、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、胆汁淤积和自身免疫性疾病。不论病因为何，未经治疗的CLD的最终结果是炎症、肝实质丧失、纤维化和再生愈合。肝星状细胞(HSC)是定位于肝脏窦周隙的非实质细胞，也曾叫作Ito细胞，贮脂细胞和维生素A储存细胞。在正常肝脏中，HSC处于静止状态，其特点是能够在细胞浆内的脂滴中储存视黄醇酯，并具有血管周细胞的超微结构特征。在肝损伤愈合过程中，尽管其他细胞也做出重要贡献，但关键的纤维化效应细胞类型是活化的HSC。多病因导致的肝损伤，使静止的HSC被激活，失去储存的维生素A，从而转化为α-SMA表达阳性的肌成纤维细胞，进而分泌纤维胶原蛋白、弹性蛋白和基质蛋白，分泌促纤维化介质，导致肝纤维化。因此，采取切实可行的手段抑制HSC的活化被认为是阻止甚至逆转肝纤维化进程，达到预防、治疗肝硬化发生的关键。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“生物分子”是指，存在于生物体中的分子的总称，包括但不限于，核酸、寡肽、多肽、纳米颗粒、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。
术语“适配体”通常是指是一小段经体外筛选得到的能与蛋白质或代谢物等配体特异和高效结合的RNA或DNA片段。术语“肝纤维化”通常指的是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织的异常增生。
本发明的目的是提供一种新的核酸适配体，本发明提供的核酸适配体是外源合成的核苷酸链，其具有特异结合活化的HSC，并进入这种细胞的能力，所述细胞来源为肝星状细胞，肝脏正常细胞，及其他正常组织细胞。核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1-7所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体能特异性进入活化HSC细胞。
所述用作标记的荧光为FAM。
作为优选方案本发明所述的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示的序列，即GGTTTGCTGT ATGGTGGGCG TTGAAAGAGG GGTGGACACG GTGG(SEQ ID NO：7)，命名为2(31-74)，本发明所述的其为经SEQ ID NO：2截短后的。
所述适配体至少包括一个化学修饰：对所述适配体核酸序列中的磷酸二酯键的修饰，包括硫代化修饰；对所述适配体核酸序列中核糖的修饰，包括2’-H被F、NH2、OMe的取代；对所述适配体核酸序列中的任意碱基进行氨基、羧基、巯基、生物素、胆固醇、聚乙二醇基团的修饰；对所述适配体的核苷酸序列中5’端的聚乙二醇(PEG)的修饰以及3’端的脱氧尿嘧啶(dU)、脱氧胸腺嘧啶(dT)以及脱氧次黄嘌呤(dL)的修饰；所述适配体的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。
所述的核酸适配体在制备生物分子运输载体的药物上的应用，所述的生物分子包括核酸、寡肽、多肽、糖类、脂质、纳米颗粒、纳米嵌段或小分子化合物中的一种或任意的复合物，所述的核酸选自抗肝纤维化的si-RNA、或Micro-RNA。
本发明还提供了筛选所述核酸适配体的方法，其包括：筛选文库的选择，阴性和阳性筛选，PCR扩增及高通量分析，流式细胞术检测得到一条荧光量最强的适配体后，在该适配体基础上进行截短，最终获得最优适配体，包括如下步骤：
(1)提供随机单链DNA文库，所述单链DNA文库包括下式表示的单链5'ATCCAGAGTGACGCAGCA(45N)TGGACACGGTGGCTTAGT3'，其中N45表示中间为45bp随机序列；以SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列的引物对制备次级文库；
(2)单链DNA文库经变性后依次经正常肝脏其他细胞(肝细胞、肝窦内皮细胞、HSCs和枯否细胞)进行阴性筛选、活化HSC细胞进行阳性筛选，获得第一轮筛选产物；
(3)以上游引物-FAM、下游引物-Biotin所示的核苷酸序列的引物对第一轮筛选产物进行PCR扩增，获得第二轮筛选产物；
(4)以此类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、正常肝脏其他细胞阴性筛选、HSC进行阳性筛选获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行PCR扩增获得下一轮核酸适配体文库，再进行下一轮筛选，共筛选11轮，最终获得核酸适配体，所述的核酸适配体的核苷酸序列为表2前18条序列的高通量测序结果所示的DNA片段的核苷酸序列。
所述的核酸适配体再经截短后得到2(31-74)。
所述的阴性筛选过程中在37℃的恒温摇床下，以120-150rpm孵育30-60min。
阳性筛选过程中，活化HSC细胞经洗涤，加结合缓冲液后，在37℃的恒温摇床下，以120-150rpm孵育60-30min。
所述PCR扩增条件为：95℃5min；94℃30s，56-66℃30s，72℃30s，72℃5min；所述PCR循环条件为：95℃5min；94℃30s，55-66℃30s，72℃30s，21-35次循环后延伸；72℃5min。
本发明的又一技术方案是将所述的核酸适配体在制备生物分子运输载体的药物上的应用，所述的生物分子包括核酸、寡肽、多肽、糖类、脂质、纳米颗粒、纳米嵌段或小分子化合物中的一种或任意的复合物。
所述的核酸选自抗肝纤维化的si-RNA、或Micro-RNA。
所述的复合物包含药物运输载体与可用作药物的分子，所述药物运输载体直接或者间接通过接头与可用作药物的分子连接；
其中，所述的药物运输载体为所述的核酸适配体；所述的可用作药物的分子包括核酸、寡肽、多肽、糖类、脂质、纳米颗粒、纳米嵌段或小分子化合物中的一种或任意的复合物。
所述的复合物在制备治疗肝纤维化癌症疾病或诊断肝纤维化癌症疾病的药物上的应用。
本发明的技术方案首次发现筛选得到的这一核酸序列具有特异结合活化HSC的功能，并可携带RNA等生物分子跨膜进入细胞内，是一种极具开发前景的核酸、靶向药物等生物活性分子的跨膜运输载体。
本发明的优点在于，与其它穿膜生物活性物质相比，高效，靶向，对细胞基本无毒副作用，潜在的不安全因素相对较少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更为广阔的应用前景。
本发明旨在通过Cell-SELEX技术，将活化HSC作为阳性筛选细胞，正常肝细胞、肝窦内皮细胞、HSCs和枯否细胞作为阴性筛选细胞。先把随机文库和阴性细胞进行孵育，收集未结合文库后，再与靶细胞进行孵育，最后将与靶细胞结合的序列洗脱下来作为PCR的模板进行扩增，作为下一轮筛选的次级文库，经过多轮循环筛选，弃掉与阴性细胞结合的序列，最终筛选出特意识别活化HSC的适配体(图1)。继而将得到的核酸适配体根据Mfold推算出其二级结构，选择吉布斯自由能ΔG最低的结构，由QGRS Mapper计算核酸适配体的G-四联体结构，在G-四联体存在维持稳定结构，不改变固有的茎环结构条件下，对游离末端和茎环结构逐一截短，以分子仿真对接参考寻找可能的结合结构域。对截短适配体的二级结构Vienna格式作为构建三级结构的模板，在RNAComposer网站中，生成三级结构。并将RNA三级结构在Discovery Studio中转化为DNA 序列，即得到预测的核酸适配体三级结构，将其命名为APT-Tan。观察了APT-Tan对培养的活化HSC、HSC、其他一些正常细胞和肿瘤细胞的亲和性，并进一步检测了APT-Tan的特异性、浓度和时间梯度及其它相关性质，为进一步将其作为治疗肝纤维化药物递送载体，靶向干预肝纤维化进程提供了科学依据。
附图说明
图1是cell-SELEX筛选流程。
图2是筛选退火温度及循环次数凝胶电泳图。
图3 1-18条细胞亲和力及流式分析，A：1-9条在活化HSC-T6、LX-2细胞亲和力荧光图；B：10-18条在活化HSC-T6、LX-2细胞亲和力荧光图；C：1-18条在活化HSC-T6流式分析荧光定量。
图4是核酸适配体2浓度梯度分析。
图5是核酸适配体2及截短序列三级结构。
图6是核酸适配体2原长及截短序列在活化HSC-T6亲和力分析。
图7是第2条原长及截短序列流式细胞图，A：核酸适配体1与截短序列亲和力比较；B：核酸适配体2与截短序列亲和力比较。***p<0.005。
图8是APT-Tan不同浓度梯度亲和力曲线。
图9是APT-Tan在HSC-T6胞内和血清稳定性，A：APT-Tan在HSC-T6细胞内稳定时间；B：APT-Tan在血清中稳定时间。
图10是适配体APT-Tan的细胞特异性实验图，A：APT-Tan在293FT、H9C2、LSEC和RAW264.7细胞流式峰图；B：APT-Tan在293FT、H9C2、LSEC和RAW264.7细胞流式统计结果。nsp>0.05。
图11是APT-Tan温度及孵育缓冲液比较实验图，ns p>0.05，**p<0.01。
图12APT-Tan孵育温度，*p<0.05，***p<0.005。
图13APT-Tan入胞抑制剂实验，***p<0.005。
图14胰酶消化靶标实验。A：APT-Tan、2经胰酶处理和未处理细胞流式峰图；B：APT-Tan、2靶标蛋白PAGE电泳凝胶图。*p<0.05，***p<0.005。
图15为将APT-Tan-miR-23b-5p分别与活化和未活化的HSC-T6进行孵育，荧光显微镜下观察的亲和力图。
图16为收细胞进行Western-blot检测图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量定性试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。
主要试剂：
(1)DMEM培养基：美国Gibco公司。
(2)胰酶：灏洋生物制品(天津)科技有限公司。
(3)链霉素/青霉素(P/S)试剂：灏洋生物制品(天津)科技有限公司。
(4)PBS粉末：武汉博欧特生物科技有限公司。
(5)胎牛血清：美国Gibco公司。
(6)新生牛血清：四季青生物工程材料有限公司(杭州)。
(7)Turbofect转染试剂：美国赛默飞(Thermo)世尔科技公司。
(8)适配体文库和引物：生工生物工程(上海)股份有限公司。
(9)Streptavidin Separopore 4B：默瑞(上海)生物科技有限公司。
(10)牛血清白蛋白：生工生物工程(上海)股份有限公司。
(11)小提质粒和DNA纯化回收试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司。
(12)感受态制备试剂盒：宝日医(Takara)生物技术有限公司。
(13)转移核糖核酸(酵母)：默瑞(上海)生物科技有限公司。
(14)溴化乙锭(EB)、二甲基亚砜(DMSO)：美国西格玛奥德里奇(Sigma-aldrich)公司。
(15)UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。
(16)AGAROSE(琼脂糖)：BioFroxx(德国)。
(17)TRYPTONE(胰蛋白胨)和YEAST EXTRACT(酵母提取物)：OXOID LTD公司(英国)。
(18)亲和层析柱：生工生物工程(上海)股份有限公司。
(19)100bp DNA Ladder和DL5000 DNA Marker：南京诺唯赞生物科技有限公司。
(20)Pronase，DNase和IV型胶原酶：美国西格玛奥德里奇(Sigma-aldrich)公司。
(21)Tris-base和甘氨酸(Glycine)：上海麦克林生化科技有限公司。
(22)十二烷基硫酸钠(SDS)：河南华美生物工程公司。
(23)Taq PCR master Mix：南京诺唯赞生物科技有限公司。
(24)碳酸氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠和氯化钙：生工生物工程(上海)股份有限公司。
(25)无酶水(DNase/RNase-Free Water):北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司。
(26)乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)：Amresco公司(美国)。
(27)4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)：美国西格玛奥德里奇(Sigma-aldrich)公司。
(28)异丙醇、冰乙酸、氢氧化钠、氯化镁：国药集团化学试剂有限公司(上海沪试)。
(29)琼脂A(Agar A)：上海生工生物工程有限公司。
(30)XhoΙ、SalΙ、EcoRΙ：美国赛默飞(Thermo)世尔科技公司。
(31)75％酒精：武汉飞扬试剂有限公司。
(32)水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司。
(33)OptiPrep密度梯度分离液：挪威Axis-shield公司
(34)4％多聚甲醛、DAPI染色液：武汉塞维尔生物科技有限公司
(35)高通量测序：生工生物工程(上海)股份。
(36)链霉亲和素标记磁珠：美国MedChemExpress公司
(37)EIPA：美国MedChemExpress公司
(38)Dynasore：美国Abcam Plc公司
(39)FilipinⅢ：美国GLPBIO公司
细胞系：
(1)大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)：由华中科技大学同济医院宋宇琥教授所赠。
(2)肝细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞：本课题组从成年雄性SD大鼠肝脏中分离提取。
(3)大鼠心肌细胞系(H9C2)：由三峡大学心血管药理研究室张世忠教授所赠。
(4)小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)：由三峡大学感染与炎症损伤研究所王德成教授所赠。
(5)人肾上皮细胞(293T)和人胚肾细胞(293FT)：由本课题组保存。
(6)人肝癌细胞(HepG2)：由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室传代保存。
(7)人乳腺癌细胞(MCF7)：由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室传代保存。
(8)人肺腺癌细胞(A549)：由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室传代保存。
(9)宫颈癌细胞(Hela)：由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室传代保存。
(10)人肝星状细胞(LX-2)：由本课题组保存。
菌株和质粒：
(1)大肠杆菌XL-Blue菌株:由三峡大学第一人民医院细胞治疗研究所查运红博士所赠。
(2)质粒PCDNA3.1(+)、PCDNA3.1-ALK3、PCDNA3.1-ALK5：三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗重点实验室柳长柏教授所赠。
实验动物：
SD雄性大鼠：体重450-550g，由三峡大学实验动物中心提供。
细菌培养试剂的配制：
(1)CaCl2溶液：11.1g CaCl2粉末，加入80mL ddH2O充分溶解，最后定容至100mL，即配制成浓度为1M的CaCl2溶液。高压灭菌后，置于4℃保存备用。
(2)氨苄苄青霉素溶液(Amp，100μg/μL)：1g Amp粉末，加入7mL ddH2O充分溶解，最后定容至10mL，0.22μm滤膜透析后，置于于-20℃保存备用。
(3)液体培养基(LB(-),不含Amp)：4g氯化钠，2g酵母提取物，4g胰蛋白胨，加入300mL ddH2O充分溶解，最后定容至400mL，高压灭菌后，置于4℃保存备用。
(4)液体培养基(LB(+)，含Amp)：向400mL LB(-)液体培养基中加入400μl浓度为100μg/μL Amp，充分混匀，置于4℃保存备用。
(5)固体培养基(不含Amp)：称取4g氯化钠，2g酵母提取物，4g胰蛋白胨，6g琼脂粉(1.5％)，加入300mL ddH2O充分溶解，最后定容至400mL。高压灭菌，待温度降至50℃时，快速均匀倒在无菌培养皿中，待温度冷却至
室温，培养基凝固后密封置于4℃保存备用。
(6)固体培养基(含Amp)：配制400mL不含Amp的固体培养基，高压灭菌，待温度降至50℃时，加入400μL浓度为100μg/μL Amp，充分混匀，快速均匀倒入无菌培养皿中，待温度冷却至室温，培养基凝固后密封置于4℃保存备用。
质粒提取相关试剂：
(1)1×TE Buffer：0.121g的Tris-Base粉末、0.037g EDTANa2.2H2O粉末，加入70mLddH2O充分溶解，最后定容至100mL。高压灭菌后，待温度冷却至室温，分装置于-20℃保存备用。
(2)氯化锂：21.2g氯化锂粉末，加入70mL ddH2O充分溶解，最后定容至100mL，4℃保存备用。
(3)10％SDS：10g SDS粉末，加入60mL ddH2O充分溶解，最后定容至100mL，置于室温保存备用。
(4)氯仿-苯酚：100mL氯仿，100mL Tris饱和酚充分混匀，待其静置分层后，4℃避光保存备用。
(5)溶液Ι：取已配制成1M的Tris-HCl溶液10mL、1M的葡萄糖溶液25mL和0.5M的EDTA溶液10mL，加入300mL ddH2O充分溶解混匀，最后定容至500mL。高压灭菌后，4℃保存备用。
(6)溶液Ⅱ：取10％的SDS溶液50mL，2M的NaOH溶液50mL，加入300mL ddH2O充分混匀，最后定容至500mL，置于室温保存备用。
(7)溶液Ⅲ：量取已配制成5M的醋酸钾溶液330mL和57.5mL的冰醋酸，加入300mLddH2O充分混匀，最后定容至500mL。高压灭菌后，4℃保存备用。
琼脂糖凝胶电泳相关试剂配方：
(1)溴化乙锭溶液(EB，10mg/mL)：1g EB粉末，加入70mL ddH2O充分溶解，最后定容至100mL，分装避光置于4℃保存备用。
(2)50×TAE储存液：242g Tris-Base粉末，37.2g EDTANa2·2H2O粉末和57.1mL的冰醋酸，加入600mL ddH2O充分溶解，最后定容至1000mL，调pH＝8.5，置于室温保存备用，使用时稀释50倍。
(3)2％琼脂糖凝胶：0.8g琼脂糖粉末和40mL稀释50倍的TAE置于锥形瓶中，放入微波炉中加热至粉末完全溶解，待溶液温度降至50℃时，快速加入1.8μL EB，混合均匀，立即倒入模具槽内，将18孔齿梳插入，待溶液冷却凝固后，方可使用。
核酸适配体筛选相关试剂配方：
(1)洗涤缓冲液(WB)：1.237g葡萄糖，0.254g MgCl.6H2O，溶解于250mL无菌PBS中(pH＝7.4)，冷却至室温，0.22μm滤膜透析，分装置于4℃保存备用。
(2)结合缓冲液(BB)：0.025g tRNA，0.25g BSA，溶解于250mL WB溶液中，0.22μm滤膜透析，分装置于4℃保存备用。
(3)0.2M氢氧化钠溶液(NaOH):0.8g NaOH粉末置于烧杯中，加入80mL ddH2O置烧杯中充分溶解，最后定容至100mL，并转移至玻璃容器中，常温保存备用。
细胞培养相关试剂配方：
(1)PBS磷酸盐缓冲溶液：0.2g KCl、0.2g KH2PO4、8g NaCl、2.886gNa2HPO4，加入700mL ddH2O充分溶解，最后定容至1000mL。调PH＝7.4，高压灭菌后置于4℃保存备用。
(2)DMEM(+)：取1％的P/S双抗溶液3mL，10％胎牛血清30mL，加入到267mL DMEM(-)中混匀，即得300mL 10％DMEM(+)培养基，置于4℃保存备用。
(3)细胞冻存液(含血清)：按FBS:DMSO＝9:1的溶液体积配制10mL冻存液，将三者充分混匀后于4℃避光保存备用。
分离提取大鼠肝细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞相关试剂配方：
(1)酶配置液：称取0.9g葡萄糖、8g NaCl、0.566g CaCl2、0.4g KCl、0.4g NaHCO3、0.06g Na2HPO4、0.19g EGTA和2.38g Hepes，加入600mL ddH2O充分溶解，定容至1000mL。高压灭菌后，调PH＝7.4，置于4℃保存备用。
(2)D-Hanks平衡盐溶液：称取0.4g NaHCO3、0.053g Na2HPO4、0.4g KCl、0.06gKH2PO4、0.19g EGTA、2.38g Hepes和8g NaCl，加入700mL ddH2O充分溶解，定容至1000mL。高压灭菌后，调PH＝7.4，置于4℃保存备用。
(3)格式平衡盐溶液(GBSS)：称取1.0g葡萄糖、0.21g MgCl2.6H2O、4.8g Hepes、0.07g MgSO4·7H2O、0.133g Na2HPO4·12H2O、0.227g NaHCO3、0.37g KCl和0.03g KH2PO4，加入600mL ddH2O充分溶解，最后定容至1000mL。高压灭菌，调PH＝7.4，置于4℃保存备用。
(4)高浓度链蛋白酶溶液(Pronase)：称取150mg Pronase粉末置于150mL酶配置液中充分溶解，0.22μm滤膜透析后使用。
(5)低浓度链蛋白酶溶液(Pronase)：称取10mg Pronase粉末置于50mL的酶配置液中充分溶解，0.22μm滤膜透析后使用。
(6)IV型胶原酶溶液：称取18mg IV型胶原酶粉末置于150mL酶配置液中充分溶解，0.22μm滤膜透析后使用。
(7)酶消化液：称取2.5mg DNase粉末置于50mL低浓度Pronase溶液与50mL IV型胶原酶溶液混合液中充分溶解，0.22μm滤膜透析后使用。
(8)红细胞裂解液：称取1g KHCO3、0.037g EDTA和8.29g NH4Cl，加入600mL ddH2O充分溶解，最后定容至1000mL，0.22μm滤膜透析后置于4℃保存备用。
实施例1
Cell-SELEX技术筛选靶向活化HSC的核酸适配体
1.核酸文库的合成：设计合成单链DNA文库(ssDNA文库，共81碱基)及上、下游引物。该文库为中间的随机序列与两端恒定序列，可以在实验室水平进行化学合成(表1)。
表1文库及引物序列名称
2.特异性核酸适配体的筛选
2.1体外化学合成的方法构建以上单链DNA文库(ssDNA文库)，以及上下游引物后，以活化HSC-T6作为阳性筛选细胞，正常大鼠的肝细胞、肝窦内皮细胞、HSCs和枯否细胞作为阴性筛选细胞。
2.2文库和引物溶解前在4℃，4000g，离心1min(引物和随机文库呈干粉状，离心后会使其沉降与管底)，制备成储备液(即文库每OD加13ul ddH2O)，于-20℃冻存备用。
2.3正常大鼠肝脏上灌洗消化提取细胞。
2.4从步骤2.2中取出文库的储备液，用双蒸水进行10倍稀释得到原液(即从步骤2中取1μL贮存液稀释10倍)。
2.5预变性：取全部文库原液，加入500μL结合缓冲液，吹匀，将ssDNA文库溶液置于95℃金属浴中5min(使DNA变性)，后立即取出并置于冰上10min。
2.6阴性筛选(在第3轮加入)：把已经处理好的正常大鼠的肝脏混合细胞液加入到15mL管中，120g，离心3min，弃上清，重复洗涤多次后，加500uL结合缓冲液重悬，再加入到变性处理过的ssDNA文库中，吹匀，置于台式恒温摇床37℃，120rpm，30min(随着筛选轮数增多，筛选压力增大，阴性孵育时间增×长)，为防止细胞下沉，每隔10min晃动一次EP管，使细胞处于混悬状态。与细胞悬液孵育30-60min后，置于离心机4000g，4℃，4min，弃沉淀，取上清进行阳性筛选(没有与正常肝脏细胞结合的ssDNA)
2.7阳性筛选：
(1)37℃恒温培养箱中取出前一天传代的HSC-T6细胞，置于显微镜下观察细胞的形态，细胞数量，取细胞密度达80％-90％左右的培养皿。
(2)pcDNA3.1-ALK5质粒转染HSC-T6细胞24h-36h。
(3)弃培养基，洗涤缓冲液洗涤细胞3次，再加入结合缓冲液(在第一、二轮时细胞培养皿为100×20mm2，结合缓冲液为5mL。第三轮以后为60×15mm2，结合缓冲液为2mL)，加阴性筛选上清，37℃恒温培养箱孵育60-30min。
2.8洗涤：
(1)上清收集于EP管，加洗涤缓冲液洗涤3次，再加200uL胰酶消化5min，加37℃预热后的完全培养基中止消化，收集细胞悬液于1.5mL EP管。
(2)细胞悬液120g离心3min，弃上清，加入1mL洗涤缓冲液重悬洗涤，120g，3min弃上清，重复该步骤5次。
2.9洗脱
(1)向细胞中加入500uL结合缓冲液(第一轮加入ddH2O)，于95℃金属浴加热15min(DNA变性，细胞裂解)，冷冻离心机高速离心(12000g，4℃，10min)，弃沉淀，取上清作为模板进行PCR扩增。
2.10引物
引物按说明制备成100uM贮存液，按需求稀释成10μM，于-20℃保存。PCR过程中工作浓度为1μM。
2.11PCR扩增体系及程序
(1)退火温度优化
反应体系包括模板(筛选片段)1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×powerTaq PCR mastermix12.5μL，水10.5μL，共计25μL。所述PCR扩增条件为：95℃5min预变性；然后按照94℃30s，56-66℃(55.0℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃)30s，72℃30s循环35次；最后72℃5min延伸。
PCR反应程序完后，3％的琼脂糖凝胶，120v，55min电泳，凝胶成像仪上观察条带是否处于正确位置，选择亮度最高，非特异性扩增少的温度为该轮筛选时PCR退火温度。
(2)循环数优化
反应体系包括模板(筛选片段)1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×powerTaq PCR mastermix12.5μl，水10.5μL，共计25μL。PCR循环条件为：95℃5min预变性；然后按照94℃30s，55-66℃(55.0℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃)30s，72℃30s循环19-35次；最后72℃5min延伸。
按优化后退火温度做PCR，设置循环数为19、21、23、25、27、29、31、33、35。
PCR完后，3％的琼脂糖凝胶，100v，55min，电泳，凝胶成像仪上观察最佳循环数，选目的条带最亮，非特异性扩增少的循环数。
2.12确定最佳温度和循环后，扩增筛选片段，按照前面的反应体系。一共40管，每管25uL，一共所得PCR产物1000μL，分装成2个大EP管，每管500uL(第一轮筛选模板全部做PCR)。
2.13PCR产物纯化
(1)向每个EP管中加入500μL的结合缓冲液，再加入500μL异丙醇，静置5min。
(2)将(1)中混合液分多次加入纯化柱，静置5min，12000g离心1min，弃下端废液。
(3)往每个纯化柱中加入700μL漂洗缓(PW)冲液，静置2min，12000g离心2min，弃下层废液。
(4)再次离心2min
(5)将柱子移至新的EP管中，在超净台中避光风干5min。
(6)向每个柱子中加入50uL RNA see free ddH2O，静置5min。
(7)12000g离心1min后收集液体，一共100uL。
2.14碱变性亲和柱层析法分离双链DNA，转变成单链DNA
(1)取200uL strepeividin sepharose添加到亲和层析柱中。
(2)DPBS(或PBS)平衡层析柱后加入PCR扩增的双链DNA。
(3)DPBS清洗层析柱
(4)用500uL 0.2M NaOH分离并洗脱正链ssDNA
2.15脱盐
UNIQ-10柱纯化(按说明书步骤进行)，由此获得次级文库(FAM-SSDNA)。第一轮筛选完毕。
由此完成第一轮的筛选。按照上面的步骤重复完成第2轮、第3轮、第4轮…的阴性筛选和阳性筛选。每一轮筛选前都要优化PCR的循环数(图1-2)。
图2是核酸适配体11轮温度及循环筛选结果，其中第一轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为19、21、23、25、27、29、31、33、35个循环；
第二轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为17、19、21、23、25、27、29、31、33、35个循环；
第三轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为19、21、23、25、27、29、31、33、35个循环；
第四轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55.0℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为19、21、23、25、27、29、31、33、35个循环；
第五轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为19、21、23、25、27、29、31、33、35个循环。
第六轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为23、25、27、29、31、33、35个循环。
第七轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为23、25、27、29、31、33、35个循环。
第八轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为23、25、27、29、31、33、35个循环。
第九轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为23、25、27、29、31、33、35个循环。
第十轮温度及循环筛选，温度在56℃-66℃之间，退火温度从左往右为55.0℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为23、25、27、29、31、33、35个循环。
第十一轮温度及循环筛选，温度在55-66℃之间，退火温度从左往右为55℃、55.2℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66℃，循环从左往右依次为23、25、27、29、31、33、35个循环。
2.16高通量测序
按照第11轮循环筛选的条件大量扩增，切胶回收PCR目的条带，送高通量测序，筛选出富集含量最高的前18条进行后续实验。
表2前18条序列的高通量测序结果
共进行两次筛选活化肝星状细胞核酸适配体，共12轮。在第3轮加入阴性筛选。
预处理
取DNA文库，在95℃高温变性下5min，取出后在冰上10min复性。
阴性筛选
(1)取原代肝细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、库弗细胞于1.5ml EP管，向其中加入经过预处理的DNA文库，充分混匀后，在37℃恒温金属浴中孵育，每5min混匀一次，孵育时间为30min-60min，随着筛选轮次的增加，阴性孵育时间逐渐增加，阴性筛选细胞数量逐渐增加。
(2)孵育完成后，4℃，110g离心3min，取上清于另一洁净EP管，多次离心完全去除其中残留细胞和组织碎片。
(3)取最后留下的上清，作为阳性筛选的文库。筛选共进行两次，阴性筛选在第三轮加入。
阳性筛选
(1)阳性筛选以活化HSC-T6为靶细胞，以pcDNA3.1-ALK5刺激活化24-36h。
(2)弃去刺激活化后HSC-T6细胞原培养基，以WB洗涤3次，加入BB后，加入预处理的阴性筛选上清，充分混匀后，于37℃培养箱孵育30-60min，每5min轻轻晃动一次。随着筛选轮次的增加，阳性孵育时间逐渐减少，阳性筛选细胞数量逐渐减少。
(3)弃掉孵育上清液，加入WB洗涤3次，以胰酶消化处理5min，细胞培养基中止消化，收集细胞悬液于1.5ml EP管。
(4)4℃，110g离心3min，弃上清后，1ml WB重悬洗涤，重复5次。
(5)弃上清后，加入500ul BB重悬(第一轮筛选加500ul蒸馏水)，95℃下10min，充分裂解细胞，在4℃，12000g离心15min，取上清液为PCR模板。
PCR扩增
(1)
PCR扩增体系
(2)PCR扩增退火温度的选择：按PCR扩增体系，扩增条件为：95℃5min预变性；然后按照94℃30s，55-66℃30s，72℃30s循环35次；最后72℃5min延伸。其中，退火温度分别为55.0℃、55.8℃、56.6℃、57.9℃、59.5℃、61.5℃、63.1℃、64.4℃、65.2℃、65.8℃、66.0℃。PCR反应完成后，3％的琼脂糖凝胶以120v，55min电泳，凝胶成像仪上观察条带是否处于正确位置，选择亮度最高，非特异性扩增少的温度为该轮筛选时PCR退火温度。
(3)PCR扩增循环次数的选择：按PCR扩增体系，退火温度为步骤(2)确定。扩增条件为：95℃5min预变性；然后按照94℃30s，55-66℃30s，72℃30s循环19-35次；最后72℃5min延伸。其中设置循环数为19、21、23、25、27、29、31、33、35。PCR程序完成后，3％的琼脂糖凝胶以120v，55min电泳，凝胶成像仪上观察条带是否处于正确位置，选择亮度最高，非特异性扩增少的循环数为该轮筛选时PCR大量扩增的循环。
(4)选择筛选的最佳退火温度和循环次数后，扩增筛选片段，按步骤(1)的反应体系。每轮扩增40管(第一轮筛选模板全部做PCR)。
PCR双链DNA回收
(1)取洁净1.5ml EP管，向其中加入500ul PCR产物，再加入500μl的BB和500μl异丙醇，冰上静置5min。
(2)将步骤(1)中混合液分多次加入纯化柱CP2，静置5min，12000g离心1min，弃下端废液。
(3)往每个纯化柱中加入700μl漂洗缓(PW)冲液，静置2min，12000g离心2min，弃下层废液。
(4)再次离心2min，彻底甩干残留液体。
(5)将纯化柱移至新的1.5ml EP管中，于室温下避光风干5min。
(6)向纯化柱滤膜中间滴加50ul无酶蒸馏水，室温下静置5min。
(7)12000g离心1min后收集液体，重复步骤(6)一次，以增加DNA回收效率。
(8)第一次在11轮，第二次在12轮时将所得的DNA送高通量测序。
亲和层析柱碱变性法分离单链DNA
(1)预装亲和层析柱，加入200ul链霉亲和素标记的琼脂(strepeividinsepharose)。
(2)DPBS平衡亲和层析柱6h以上，保证液面高于琼脂，使琼脂保持湿润。
(3)沿管壁缓慢加入PCR回收产物，使PCR产物缓慢通过亲和层析柱，并多次重复，使生物素和链霉亲和素尽可能结合，整个过程约30min。
(4)以5倍于琼脂体积的DPBS多次清洗亲和层析柱。
(5)向清洗后的亲和层析柱加入500ul 0.2M的NaOH，对双链DNA进行碱变性，收集流出的液体。再将收集液体多次通过亲和层析柱，整个过程约30min。
(6)收集流出的液体，即为单链DNA。
单链DNA脱盐回收
(1)使用UNIQ-10柱试剂盒进行回收。
(2)取1.5ml灭菌EP管4个，分别加入100ul ssDNA上清，向其中再加入1ml BindingBufferⅠ混匀。
(3)将混匀液分多次转移到吸附柱中，在室温下静置2min，以8000rpm离心2min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱再放回收集管。
(4)向每个吸附柱中加入500ul Wash Solution(使用前按瓶身标记加入相应体积的无水乙醇)，10000rpm离心1min。
(5)重复步骤(4)一次，倒掉下层废液。
(6)将吸附柱放回收集管，在10000rpm离心2min，彻底甩干残留的液体(除去残留的乙醇，否则乙醇会影响ssDNA回收效率和后续实验)。
(7)将吸附柱放入新的洁净1.5ml EP管，室温下开盖5min。
(8)向吸附柱膜中间位置加入50ul无酶ddH2O，室温下静置5min，在12000rpm离心2min。
(9)重复步骤(8)一次，提高回收效率。
(10)收集所得的ssDNA液体，即为下一轮筛选文库。
处于对数生长期的HSC-T6细胞接种于24孔板中，质粒pcDNA3.1-ALK5刺激HSC-T6活化，在细胞密度约70％-80％时，用pcDNA3.1-ALK5处理细胞24h-36h，将18条序列分别以100nM终浓度与细胞共孵育，为刺激活化作为对照，孵育1h后于倒置荧光显微镜下观察细胞荧光。结果显示，第1、2、14条适配体进入活化HSC-T6细胞数量最多(pcDNA3.1-ALK5刺激组)(图3)。流式细胞检测结果与荧光结果一致，第1、2、14条适配体组的平均荧光强度最强(图3)。本发明将第2条适配体命名为核酸适配体2，并选择其进行后续实验。
2.将浓度为50、100、150、200、250、300nM的核酸适配体2分别与活化HSC-T6在结合缓冲液中孵育1h，流式细胞仪检测核酸适配体2不同浓度下的荧光强度。结果显示，核酸适配体2在100nM处达最大(图4)。
3.用Discovery Studio软件对核酸适配体2根据核苷酸序列进行三级结构模拟，以便后续进一步对适配体进行截短，有效提高其入胞效率(图5)。
实施例2核酸适配体2优化亲和力实验分析
1.结构预测核酸适配体2二级、三级结构及可能形成的G-四链体结构，不改变二级、三级结构和G-四链体结构条件下对核酸适配体2依次进行截短
表3 2截短后的适配体序列
注：黑色序列表示保留序列，灰色序列表示截去的序列。
2.用Discovery Studio模拟出核酸适配体2及其截短适配体的空间构象，如图5所示。
3.截断序列的定性及定量实验。
3.1将截短后的序列标记FAM荧光基团。处于对数生长期的HSC-T6细胞接种于24孔板中，质粒pcDNA3.1-ALK5处理的活化24h，加入截短后的序列，以50uM终浓度，孵育1h后于倒置荧光显微镜下进行观察。结果显示适配体2原长，2(31-74)，2(1-51+38-80)，2(10-15+38-52)，2(59-71)，2(59-74)，2(61-74)这7条序列荧光最强(图6)。
3.2将1×105个处于对数生长期的HSC-T6细胞接种于24孔板中，处理方式同3.1，分别加入以上6条荧光量最强的序列孵育1h后收集细胞，流式细胞术检测其平均荧光强度，2(31-74)的平均荧光强度最强(图7)，说明其进入活化HSC-T6量较多，其他条带均较少。选取2(31-74)继续后续研究，并将其命名为APT-Tan。
实施例3
APT-Tan浓度依耐性、稳定性、特异性、孵育体系及温度的研究
1.APT-Tan的饱和性实验。
1.1将1×105个HSC-T6细胞接种至24孔板，1μg pcDNA3.1-ALK5转染24-36h。
1.2将浓度为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM的APT-Tan 95℃加热5min后，立即冰置10min，避光加到相应的24孔板中，以结合缓冲液孵育1h，然后流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度。结果如图8所示，APT-Tan在0-200nM浓度下平均荧光强度持续增长，在200nM浓度下基本达到饱和。
2.稳定性
2.1APT-Tan细胞稳定性
将浓度为200nM的APT-Tan与活化的HSC-T6进行孵育，方法同上。分别于10％FBS血清中孵育0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h后，收集细胞，流式细胞仪分析APT-Tan与HSC-T6的亲和性，APT-Tan在0.5h-4h荧光保持不变，随后6-10h继续升高，且在24h时，仍保存与0.5h相近的荧光强度，说明APT-Tan可在细胞中稳定存在24h以上(图9A)。
2.2血清稳定性
取c57BL小鼠眼球血，分离血清，取10uM浓度的APT-Tan与同体积的血清共孵育，取孵育0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h后的样品，于10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)电泳4h，以gelred染料室温泡染30min后凝胶成像，APT-Tan在0.5h即开始降解，2h后基本降解完全(图9B)。
3.APT-Tan细胞特异性将实施例2筛选得到的APT-Tan分别与对大鼠心肌细胞(H9C2)、小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)、人胚肾细胞(293FT)、大鼠肝窦内皮细胞(LSEC)等细
胞系进行孵育，观察APT-Tan对这些细胞的亲和力，结果如图10所示，APT-Tan与这些细胞结合力均不佳。
4.APT-Tan孵育体系及温度的选择
4.1APT-Tan孵育体系
将浓度为200nM的APT-Tan与活化HSC-T6在缓冲体系为DMEM、DMEM+10％FBS、BB和PBS条件下孵育1h后，收集细胞进行流式细胞仪检测，结果如图11所示，BB和DMEM+10％FBS荧光强度接近，DMEM和PBS荧光强度较弱，说明不同的孵育体系对APT-Tan进入活化HSC-T6影响较大。
4.2APT-Tan孵育温度
将浓度为200nM的APT-Tan与活化HSC-T6在4℃和37℃条件下孵育1h，收集细胞进行流式细胞仪检测，结果如图12所示，不同的孵育温度对APT-Tan进入活化HSC-T6影响较大，低温条件下会降低穿膜效率。
5.APT-Tan细胞内吞抑制实验
将1×105个HSC-T6细胞接种至24孔板，1μg pcDNA3.1-ALK5转染24-36h。加入内吞抑制剂dynasore(80uM)、EIPA(50uM)、filipinⅢ(2ug/ml)、NaN3(40uM)、NH4Cl(50uM)、Heparin(50ug/ml)、wartmannin(5uM)及Chlorpromazine(30uM)预处理30min，再加入浓度为200nM的APT-Tan孵育1h后收取细胞进行流式细胞仪检测，结果如图13所示，结果显示dynasore、filipinⅢ及Heparin均有抑制效果，说明APT-Tan可能是通过受体蛋白介导的内吞作用和巨胞饮两种方式进入细胞，且受体蛋白介导的内吞占主要作用。
实施例4优化本发明核酸适配体的稳定性和有效性
由于核酸适配体对温度，离子及PH值等敏感，这些会影响其结构上的疏水作用和氢键的扭曲，导致核酸分子骨架发生改变而丧失结合能力，同时灵活的核苷酸构象会使得它们的单链结合区域暴露在核酸酶下而发生降解。所以，未加修饰的核酸适配体血清稳定时间非常短，而经过修饰后则可明显延长其降解时间。目前常用的对核酸适配体的修饰有磷酸二酯键的修饰，如硫代化修饰等；对所述适配体核酸序列中核糖的修饰，如2’-H被F、OMe等的取代；对所述适配体核酸序列中的任意碱基进行氨基、羧基、巯基等的修饰；对所述适配体的核苷酸序列中5’端的聚乙二醇(PEG)等修饰以及3’端的脱氧尿嘧啶(dU)等修饰。
适配体核酸序列中核糖的修饰，如2’-H被F、NH、OMe等的取代；对适配体核酸序列中的任意碱基进行的修饰，如氨基、羧基、巯基、生物素、胆固醇、聚乙二醇基团等的修饰；对适配体核酸序列中3’端的脱氧尿嘧啶(dU)、脱氧胸腺嘧啶(dT)以及脱氧次黄嘌呤(dL)等修饰(参见Eckstein et al.,International Publication PCT No 92/07065；Usman etal.,International Publication PCT No.WO 93/15187；Sproat,U.S.Pat.No.5,334,711；Beigelman et al.,国际PCT公开WO 97/26270；Beigelman et al.,U.S.Pat.No.5,716,824；Usman et al.,U.S.Pat No.5,627.053；Woolf et al.,国际公开WO 98/13526；J.Org.Chem.47(1982),3623-3628；Verheyden et al.(1971),supra；J.Org.Chem.40(1975),1659)。核酸适配体的脱氧氟化反应：将溶解有(R)-N-Cbz-3-hydroxypyrrolidine(221mg,1.0mmol,ee>99.9％)的二氯甲烷(3.0mL)冷却至-78℃，依次加入DBU(224μL,1.5mmol)和XtalFluor-E(344毫克，1.5毫摩尔)。氮气下搅拌30分钟后，让反应混合物升温至室温，继续搅拌24小时。反应混合物用5％碳酸氢钠水溶液淬灭，搅拌15分钟，将所得混合物用二氯甲烷萃取两次，使有机相结合，用硫酸镁干燥，并通过滤垫过滤蒸发溶剂，得到粗品。再使用hexanes/EtOAc(3/1)通过硅胶快速色谱纯化，得到混有N-Cbz-2,5-dihydropyrrole(6.9:1ratio respectively)的目标化合物(192mg,86％)。在核酸适配体的3’通过共价键连接C7间接臂(-(CH2)7-)，然后在C7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体；核苷酸序列中5’端的聚乙二醇(PEG)修饰：(1)将PEG5000、0.4M的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)以及0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比6：6：1(各50μL)混合后，在转速80rpm条件下震荡25min，(2)将与PEG体积比例为1:100的核酸适配体，加到50μLpH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)中，再加到步骤1制备的混合液，在转速为80rpm条件下震荡5h，反应结束后进行凝胶电泳检测，得到5’端的聚乙二醇(PEG)修饰的核酸适配体；2’-H被OMe的取代：用标准磷酰胺化学合成的方法将2’-O-methyl RNA连于核酸适配体的5’端，并用反相高效液相色谱纯化；将硫代单体dATP，dTTP，dGTP与dNTP进行PCR反应，得到硫代磷酸酯修饰的适配体；本发明的核酸分子还包括至少一个LNA(锁核酸)核苷酸，例如2’,4’-C亚甲基双环核苷酸(参见Wengel etal.,国际PCT公开WO 00/66604和WO 99/14226)。进行了这些修饰的适配体，其平均荧光强度与APT-Tan相比没有降低，一般分布在450-550之间。
实施例5
APT-Tan载药的特异性、浓度依赖性、时间依赖性及功能检测
将APT-Tan 3’端通过C6连接miR-23b-5p合成APT-Tan-miR-23b-5p：
GGTTTGCTGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGG/C6/GGGUUCCUGGCAUGCUGAUUU
1.将APT-Tan-miR-23b-5p分别与活化和未活化的HSC-T6进行孵育，荧光显微镜下观察其亲和力，结果如图15所示，APT-Tan在携带miR-23b-5p后仍能较多的进入活化的HSC-T6。
2.APT-Tan-miR-23b-5p的功能检测
2.1将4×105个HSC-T6细胞接种至6孔板中，3μg PCDNA3.1-ALK5转染24h。
2.2将200nM的APT-Tan-miR-23b-5p避光加到相应的6孔板中孵育一小时，更换培养基后继续培养24h。
4.3收细胞进行Western-blot检测，结果如图16所示，APT-Tan-miR-23b-5p具有靶向下调纤维化相关蛋白Itga5、Tgfb2、α-SMA的作用。
在与本申请的APT-Tan适配体的构型相同的情况下，将SEQ ID NO：1-6序列的3’端通过C6连接miR-23b-5p合成SEQ ID NO：1-6序列的-miR-23b-5p，同样具有靶向下调纤维化相关蛋白Itga5、Tgfb2、α-SMA的作用。
在与本申请的APT-Tan适配体的构型相同的情况下，将实施例2-1制备得到的硫代磷酸脂修饰的APT-Tan核酸适配体序列的3’端通过C6连接miR-23b-5p合成得到硫代磷酸脂修饰的APT-Tan-miR-23b-5p，同样具有靶向下调纤维化相关蛋白Itga5、Tgfb2、α-SMA的作用。
本发明运用Cell-SELEX技术，首先筛选出一条能高亲和力、高特异性进入活化HSC-T6细胞的适配体APT-Tan。本发明运用Discovery Studio软件模拟出适配体2的空间构象，在不改变空间结构的基础上，不断对适配体2进行优化截短，得到最短适配体APT-Tan，这为后续的药物靶向递送奠定了良好的实验基础。同时，本发明对APT-Tan浓度依耐性、稳定性、特异性、孵育体系及温度、穿膜机制检测，结果显示APT-Tan对HSC-T6具有较好的亲和性，而对其他一些正常细胞的结合性不强。该适配体在浓度200nM处基本达到饱和，同时，其在0.5h平均荧光强度即达到最大，说明其能快速进入细胞并达到饱和状态。这些结果显示APT-Tan作为一种新的靶向活化HSC-T6细胞的工具，能特异性的进入活化HSC-T6细胞。APT-Tan的开发将为科研(体外培养细胞的靶向给药)、临床疾病的诊断和治疗(携带microRNA，siRNA等生物活性分子以及药物运输载体)提供又一靶向高效的运输工具。
Claims (6)
1.核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体能特异性进入活化HSC细胞。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述适配体至少包括一个化学修饰：对所述适配体核酸序列中的磷酸二酯键的修饰，包括硫代化修饰；对所述适配体核酸序列中核糖的修饰，包括2’-H被F、NH2、OMe的取代；对所述适配体核酸序列中的任意碱基进行氨基、羧基、巯基、生物素、胆固醇、聚乙二醇基团的修饰；对所述适配体的核苷酸序列中5’端的聚乙二醇的修饰以及3’端的脱氧尿嘧啶、脱氧胸腺嘧啶以及脱氧次黄嘌呤的修饰；所述适配体的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。
3.权利要求1或2所述的核酸适配体在制备生物分子运输载体的药物上的应用，所述的生物分子为核酸，所述的核酸选自抗肝纤维化的si-RNA、或Micro-RNA。
4.包含药物运输载体的复合物，其特征在于，所述的复合物包含药物运输载体与可用作药物的分子，所述药物运输载体直接或者间接通过接头与可用作药物的分子连接；
其中，所述的药物运输载体为权利要求1或2所述的核酸适配体；所述的可用作药物的分子为核酸。
5.根据权利要求4所述的复合物在制备治疗肝纤维化的细胞的药物上的应用，所述可用作药物的分子为APT-Tan-miR-23b-5p： GGTTTGCTGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGG/C6/GGGUUCCUGGCAUGCUGAUUU。
6.根据权利要求5项所述的应用，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。
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