JP2003531820A

JP2003531820A - 細胞内タンパク質送達のためのカチオン性脂質の使用

Info

Publication number: JP2003531820A
Application number: JP2001544914A
Authority: JP
Inventors: フィリップエル．フェルグナー; オリビエゼルファチ
Original assignee: ジーンセラピーシステムズインコーポレーテッド
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2003-10-28
Also published as: US20030054007A1; EP1237581A1; AU2102101A; WO2001043778A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞内タンパク質送達のための組成物および方法に関する。該組成物は、カチオン性脂質による該タンパク質の細胞内送達を促進するような様式で、例えば、それをカチオン性脂質と直接結合させること、それをカチオン性リポソームに封入すること、該タンパク質をカチオン性脂質および核酸を含むリポプレックスと結合させること、または該タンパク質をカチオン性脂質と結合したアニオン性ポリマーと結合させることによって、カチオン性脂質と作動可能に結合したタンパク質を含む。これらの組成物は、抗体を細胞内タンパク質へ送達してそれらの活性を中和することにおいて、および治療学的に有用なタンパク質、ペプチドまたは低分子を導入するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、機能性タンパク質を生細胞へ送達するための組成物及び方法に関す
る。

【０００２】従来技術最近の15年間、転写的に活性なDNAを培養細胞に送達するためのますます効果
的なトランスフェクション試薬の開発が非常に進歩してきた（Felgner et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413-7417,1987; Felgner et al., J.Biol.Chem.
269:2550-2561,1994; Zelphati et al., Pharm.Res.13:1367-1372,1996）。更に
、合成の送達システム内での核酸の送達の機械的な面の理解が増大してきた（Ze
lphati et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:11493-11498,1996; Tseng et al
. J.Biol.Chem. 272:25641-25647,1997）。特に、カチオン性脂質が核酸を細胞
に送達するための非常に効果的な試薬であることが示されており、この目的のた
めに利用できる、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）及びリポフェクタ
ミン（LipofectAMINE）（登録商標）（Gibco RBL）を含む多くの市販の試薬があ
る。そのような試薬を使用するプラスミドトランスフェクションは、今では多く
の生物医学の研究室において一般に使用されるルーチンな研究室の手順である。
トランスフェクションの処方のためのリポソームを調製する手順は、米国特許第
5,264,618号及び5,459,127号、及びFelgnerら（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7
413-7417,1987）に記載されている。

【０００３】驚くべきことに、機能的な組換えタンパク質を細胞に送達するための試薬の同
定はあまり進んでいなかった。これは組換えタンパク質及びモノクローナル抗体
を作るのに専心したバイオテクノロジー企業及び大学の研究室の相当な努力にも
かかわらずである。従来、多くの製薬企業での創薬プログラムは、細胞外の標的
、即ち、細胞表面のレセプター又は細胞によって産生され、分泌されたタンパク
質に向けられていた。結果として、現在各種疾患の治療のための承認された治療
タンパク質は、全て、分泌タンパク質である（代表例を表１に示す；ヒトの使用
に最近承認されたタンパク質及び抗体の最近のレビューは、Glennie及びJohnson
, Immunol.Today 21:403-410[2000]; Reichert, Trends Biotechnol. 18:364-36
9[2000]を参照。）。主要なゲノム企業で進行中のプログラムもまた、医薬品開
発のための可能性のある候補としての分泌又は膜タンパク質をコードするヒト遺
伝子の同定に向けられている。もし、タンパク質を細胞に導入する効率的な方法
があるなら、可能性のある治療薬候補を分泌及び膜タンパク質に制限する必要は
ないであろうし、可能性のある医薬品候補として考えられ得る組換えタンパク質
のより大きなプールも存在するであろう。

【０００４】

【表１】

【０００５】モノクローナル抗体の生細胞への直接送達は、細胞内の標的を特異的に阻害す
るために使用され得る。実際、何人かの研究者は、細胞内に抗体を導入するため
にDNAトランスフェクションを使用した。細胞内抗体（“Intrabodies（イントラ
ボディー）”）は、親のモノクローナル抗体由来の一本鎖の抗体であり、そこで
は、軽鎖及び重鎖の可変ドメインがフレキシブルペプチドリンカーによって結合
している。得られる組換え遺伝子産物は、親の抗体が標的の抗原に結合し、中和
する能力を保持する。完全なイントラボディーの配列は、発現プラスミド上でコ
ードされ得、該プラスミドは培養細胞に導入されて、イントラボディータンパク
質の細胞内発現及び細胞内タンパク質抗原の中和を導き得る。イントラボディー
の効果は、標的として、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）の構造、調節、及び酵
素のタンパク質を用いて研究されてきた（Mhashilkar, et al., EMBO J. 14:154
2-1551[1995]；Mhashilkar, et al., J.Virol. 71:6486-6494[1997]；Mhashilka
r, et al., Hum.Gene Ther. 10:1453-1467[1999]）。イントラボディーの使用は
、概念的には魅力的であるが、該方法は時間がかかり、大きな労力を要する。更
に、モノクローナル抗体タンパク質は、得ることがずっとより容易である。効率
的にタンパク質を細胞に送達できる試薬が開発されれば、細胞内の抗原に対する
モノクローナル抗体を用いた研究が非常に便利になる。イントラボディーを使用
することにより証明された同じ細胞内の標的のいくつかは、抗体を細胞に直接送
達する試薬にアクセス可能であるべきである。

【０００６】最近いくらか注目を浴びているタンパク質を細胞に送達する他の方法は、Dros
ophila Antennapediaホメオボックス遺伝子（Antp）の第3へリックス、HIV Tat
、及びヘルペスウイルスVP22のような“タンパク質形質導入ドメイン（protein
transduction domeins）（PTDs）”を使用し、これらは全て、アルギニン及びリ
ジン残基が豊富な正に帯電したドメインを含む（Schwarze, et al., Trends Cel
l Biol. 10:290-295[2000]；Schwarze, et al., Science 285:1569-1572[1999]
）。いくつかの場合において、シグナル配列由来の疎水性のペプチドは、同じ目
的のために首尾よく使用された（Rojas, et al. J.Biol.Chem. 271:27456-27461
[1996]；Rojas, et al., Nature Biotechnol. 16:370-375[1998]；Du, et al.,
J.Pept.Res. 51:235-243[1998]）。これらのペプチドのβ−ガラクトシダーゼの
ようなマーカータンパク質への結合が、マーカータンパク質の細胞への効率のよ
いインターナリゼーションを与えることを示した。より最近、これらのPTDsを含
むキメラ、インフレーム（in-frame）融合タンパク質が、タンパク質をインビボ
及びインビトロ両方の広範な細胞タイプに送達するために使用されてきた。しか
し、この方法は、タンパク質の生物活性に悪影響を与え得る更なる複合のステッ
プが必要である。例えば、タンパク質の構造を歪めるかもしれないし、又はタン
パク質の機能を立体的に妨げるかもしれない。

【０００７】前述の議論からも明らかなように、タンパク質、ペプチド及び抗体を細胞に送
達できる便利で信頼できる試薬を開発する必要がある。抗体又は組換えタンパク
質の送達によって、特に生細胞において標的とされた細胞内の機能を直接阻害又
は開始する能力は、細胞生物学及び機能ゲノム科学の全ての面において多大な利
益となり得る。多くの細胞のタイプ及び幅広い状況下で使用され得る一般の方法
論は、確かに、複雑な表現形の解析に非常に貢献し得る。最後に、この種の有効
な試薬の適用は、細胞内の組換えタンパク質及びモノクローナル抗体の送達を成
し遂げ、癌、炎症性疾患、及び感染症のような様々な疾患に対する新たな治療の
モダリティーの発見及び開発に貢献するかもしれない。例えば、転写を制御する
因子の機能的な送達は、癌及び炎症性疾患のような状態に特徴的である細胞の制
御されていない増殖を潜在的に調節し得る。同様に、情報伝達に関わる成長因子
、成長因子レセプター、サイトカイン及び調節タンパク質をコードする遺伝子の
ような特定の遺伝子の過剰発現が、転写を調節するタンパク質の細胞内送達によ
って制御され得る。逆に、腫瘍サプレッサー及び成長因子のような重要な遺伝子
の低発現状態が、関連するタンパク質の細胞内送達によって解決され得る。

【０００８】本発明は、この目的のために、あらゆる所望のタンパク質の送達のために速く
調製され得る、便利で再現可能な試薬を提供することによって、細胞内タンパク
質送達の必要性を扱う。これらの試薬は、様々な疾患の治療処置として、インビ
ボの細胞にタンパク質を送達するために最適化され、再処方化され得る。

【０００９】発明の要旨本発明の１実施形態は、タンパク質の細胞内送達のための組成物であって、カ
チオン性脂質を含むカチオン性細胞内送達ビヒクルと作動的に結合した（in ope
rative association with）タンパク質を含み、ここで、該細胞内送達ビヒクル
が細胞膜と融合するように適合されており、それによって結合タンパク質の細胞
内送達を行う、組成物である。好ましくは、前記タンパク質は、直接またはリン
カーを介してカチオン性脂質へ結合される。これは、例えば該タンパク質をポリ
ヌクレオチドへ結合させ、そして、ＰＮＡリンカーを介してまたはカチオン性脂
質へ結合されたリンカー分子を介しするような、該ポリヌクレオチドをカチオン
性脂質と結合させることによってなされ得る。１つの好ましいリンカー分子はマ
レイミドである。好ましくは、前記タンパク質−リンカーおよびリンカー−カチ
オン性脂質結合の少なくとも１つが共有結合である。必要に応じて、前記タンパ
ク質−リンカーおよびリンカー−カチオン性脂質結合の少なくとも１つがイオン
性である。

【００１０】送達ビヒクルの組成に関わらず、タンパク質は、有利には、治療タンパク質、
診断タンパク質、抗原タンパク質、予防（prophylactic）タンパク質（例えば、
ワクチン）、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメントもし
くは設計された（engineered）抗体、または別の特異的結合タンパク質であり得
る。

【００１１】本発明の１実施形態において、細胞内送達ビヒクルは、カチオン性脂質、カチ
オン性リポソーム、カチオン性脂質および核酸を含むリポプレックス（lipoplex
）、またはカチオン性脂質と結合したアニオン性ポリマーを含む。送達ビヒクル
がカチオン性脂質と結合したアニオン性ポリマーを含む場合、該アニオン性ポリ
マーは該タンパク質へカップリングされた反応性基（reactive group）を含み得
る。１実施形態において、アニオン性ポリマーは、核酸のような生体ポリマーで
ある。別の実施形態において、該ポリマーは合成ポリマーである。

【００１２】本発明はまた、タンパク質を細胞へ送達するための方法であって、細胞内送達
組成物を形成するような様式でカチオン性脂質と結合されたタンパク質を提供す
ること、および該送達組成物を細胞の細胞膜と接触させて、該カチオン性脂質が
該細胞膜と結合を形成し、そしてそれによって該タンパク質を該細胞へ送達する
ことを含む方法を含む。典型的に、カチオン性脂質は、細胞膜と融合し、それに
よって結合タンパク質が細胞へ入ることを可能にする。本発明の方法は、送達組
成物、タンパク質、またはここで意図されるビヒクルのいずれかとともに使用さ
れ得る。従って、１実施形態において、送達組成物は、核酸を含む。好ましくは
、核酸は、直接的に、またはＰＮＡのようなリンカーを介して間接的に、タンパ
ク質へ結合される。別の実施形態において、送達組成物は、タンパク質を封入す
るカチオン性リポソーム、または共有結合リンカーを介してタンパク質へ結合さ
れたカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、細胞
内プロセス（intracellular process）を阻害し、または治療剤（therapeutic）
であり、あるいはタンパク質は抗体または抗体フラグメントである。

【００１３】本発明の他の特定の実施形態は、カチオンリポソームによって封入されたタン
パク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチド送達組成物を含む。１
実施形態において、カチオン性脂質はＸＧ４０である。カチオン性リポソームは
、必要に応じて、共脂質（co-lipid）を含む。好適な共脂質としては、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ポリエチレングリコール−
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジフィタノイル−ＰＥ、コ
レステロールおよびモノオレオイルグリセロールが挙げられる。

【００１４】本発明はまた、乾燥カチオン性脂質フィルムおよびタンパク質またはペプチド
溶液を混合する工程を包含する、カチオン性リポソームによって封入されたタン
パク質またはペプチドを形成する方法を含む。

【００１５】さらに、本発明は、タンパク質またはペプチドの溶液を乾燥カチオン性脂質フ
ィルムと混合することにより形成されたカチオン性リポソーム封入化タンパク質
を提供する工程；及び細胞をカチオン性リポソーム封入化タンパク質と接触させ
る工程を含む、タンパク質またはペプチドを細胞へ送達するための方法を包含す
る。

【００１６】本発明の別の実施形態は、ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドへ結合され
たペプチド核酸（ＰＮＡ）［ここで、ＰＮＡは、タンパク質へ結合し得る反応性
化学基を含む］、反応性化学基へ結合されたタンパク質、およびカチオン性脂質
を含むタンパク質またはペプチド送達組成物である。

【００１７】本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体、抗体フラグメン
ト、あるいは代謝経路における工程を阻害するかまたは細胞内抗原へ結合する他
の特異的結合分子であり得る。

【００１８】本発明のなお別の局面は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドへ結合された
ペプチド核酸（ＰＮＡ）［ここで、ＰＮＡは、タンパク質へ結合し得る反応性化
学基を含む］、反応性化学基へ結合されたタンパク質、およびカチオン性脂質を
含む組成物と細胞とを接触させる工程を含む、タンパク質またはペプチドを細胞
へ送達するための方法である。

【００１９】なお別の実施形態は、タンパク質、該タンパク質に結合し得る反応性化学基を
有する負に帯電したポリマー、および該負に帯電したポリマーと相互作用するカ
チオン性リポソームを含む、タンパク質またはペプチド送達組成物である。該負
に帯電したポリマーは、例えば、オリゴヌクレオチドであり得る。

【００２０】本発明は、タンパク質、該タンパク質とカップリングし得る反応性化学基を有
する負に帯電したポリマー、および該負に帯電したポリマーと相互作用するカチ
オン性リポソームを合わせる工程を含む、タンパク質またはペプチド送達組成物
の作製方法を包含する。

【００２１】それはまた、タンパク質、該タンパク質にカップリングし得る反応化学基を有
する負に帯電したポリマー、および該負に帯電したポリマーと相互作用するカチ
オン性リポソームを含む組成物と細胞とを接触させる工程を含む、タンパク質ま
たはペプチドを細胞へ送達するための方法を包含する。

【００２２】本発明のなお別の局面は、カチオン性リポソーム［ここで、該リポソームはタ
ンパク質と結合し得る反応性化学基を含む］、および該反応性化学基へ結合され
たタンパク質を含む、タンパク質またはペプチド送達組成物である。マレイミド
は、好適な反応性化学基の１例である。

【００２３】本発明は、カチオン性リポソーム［ここで、該リポソームはタンパク質と結合
し得る反応性化学基を含む］、および該反応性化学基へ結合されたタンパク質を
含む組成物と細胞とを接触させる工程を含む、タンパク質またはペプチドを細胞
へ送達するための方法において、具体化され得る。

【００２４】好ましい実施形態の詳細な説明他に定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本
発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を
有する。例えば、Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecu
lar Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook, et a
l., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (C
old Springs Harbor, NY, 1989); Ausbel, et al., Current Protocols in Mole
cular Biology, Volume 1 and 2, Greene Publishing Association and Wiley-I
nterscience, New York, 1991; Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory M
anual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY, 1999) を参照
のこと。当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書中で記載され
るものと類似または等価の多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は
記載される特定の方法に限定されないことが理解される。本明細書で使用される
用語は、特定の実施形態のみを記載するためであり、そして限定であるとは意図
されず、何故ならば本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され
るからである。

【００２５】本発明は、ＤＮＡトランスフェクション試薬と同じぐらい効果的かつ使用する
に便利な、培養細胞へのタンパク質、ペプチドおよび他の小分子の送達のために
便利かつ再現性のある（reproducible）試薬を提供する。これらの試薬は、シグ
ナル伝達経路に影響を与え、細胞周期を調節し、アポトーシスを制御し、腫瘍形
成を決定し、そして転写を調節する、細胞内組換えタンパク質の役割が、細胞内
で直接的に評価されることを可能にする。該試薬はまた、特異的細胞内タンパク
質の機能を遮断しそして細胞代謝、細胞生存度またはウイルス複製に影響を与え
る抗体またはペプチドのインビトロまたはインビボ送達のために使用され得る。
例えば、望まれない遺伝子の転写を促進する転写因子に対する抗体が、これらの
タンパク質の活性を阻害するために使用され得る。これらのタンパク質送達試薬
は、細胞内標的に向けられそして細胞内代謝経路に影響を与える治療学的に有用
なモノクローナル抗体および組換えタンパク質の同定を容易にする。

【００２６】特に生存細胞において標的化細胞内機能を直接的に阻害する能力は、細胞生物
学および機能遺伝学（functional genomics）の全ての局面において、非常に有
益である。さらに、多数の細胞タイプを用いそして広範な条件下で使用され得る
一般的な方法は、複雑な表現型の分析に著しく寄与する。特定のウイルスまたは
細菌産物を標的化する抗体を設計することによる新規の抗生物質の処方はまた、
感染性疾患の制御において助けとなり得る。

【００２７】細胞内タンパク質送達試薬の４つのクラスが、本発明において開示される：試
薬Ｉ〜ＩＶ。これら４つの試薬コンフィギュレーション（configurations）は、
以下に論ぜられる。

【００２８】好ましい実施形態において、全ての４つの試薬について、共脂質（co-lipid）
またはヘルパー脂質（helper lipid）と呼ばれる第二脂質が、カチオン性脂質製
剤に含まれる。ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）は最
も広範に使用されるヘルパー脂質であるが、他の中性脂質分子（ポリエチレング
リコール−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジフィタノイル
−ＰＥ（diphytanoyl-PE）、コレステロールおよびモノオレオイルグリセロール
）がまた使用され得る。

【００２９】本明細書で開示される試薬は、治療学的に有用なタンパク質（例えば、腫瘍抑
制（suppressor）タンパク質、嚢胞性線維症貫膜レギュレーター（ＣＦＴＲ）、
アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）（ＡＤＡ）、ヘキソサミニダ
ーゼＡ（hexoseaminidase A）、ペプチド、突然変異タンパク質の野生型タンパ
ク質対応物（counterparts）、およびサイトカイン（例えば、インターロイキン
、インターフェロン、コロニー刺激因子）についてのもののような細胞表面レセ
プターおよびペプチドホルモンを含む、関心のある任意のタンパク質を送達する
ために使用され得る。

【００３０】タンパク質送達試薬の調製試薬Ｉ第一のタンパク質送達試薬（試薬Ｉ）は、カチオン性脂質製剤が、抗体溶液を
乾燥カチオン性脂質と混合することによって細胞中へ抗体を送達し得るという驚
くべき結果を利用する（図１）。手順は、乾燥カチオン性脂質フィルムを、送達
されるタンパク質の溶液で懸濁させることを包含する。この脂質水和工程の間、
リポソームが形成し、そして水和媒体中に溶解されるタンパク質のいくらかが該
リポソームに封入される。大部分のタンパク質が、遊離（封入されていない）形
態で存在する。混合物は、培養細胞へ添加されるか、またはインビボで導入され
、そして封入タンパク質を含むカチオン性リポソームは、負に帯電する細胞表面
へ付着する。細胞表面付着に続いて、リポソームは、直接、原形質膜と融合し、
そしてそれらの封入タンパク質を細胞へ送達する（図１）。あるいは、リポソー
ムはエンドサイトーシスされ得、そして次いでエンドソームと融合し、リポソー
ムに封入されたタンパク質を細胞質へ放出する。この手順の有効性は、リポソー
ムの脂質組成に依存する。

【００３１】特定のカチオン性リポソーム封入タンパク質のタンパク質を細胞へ送達する能
力は、本明細書で記載される方法を使用して、当業者によって容易に測定され得
る。試薬Ｉを作製するために使用されるカチオン性脂質フィルムは、種々の量の
カチオン性脂質および、好ましくは、ジオレオイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ）のような共脂質（co-lipid）を含む。本発明における使用のた
めのカチオン性脂質としては、例えば、米国特許4,897,355、5,264,618および5,
459,127に記載されるものが挙げられる。ＸＧ４０と呼ばれる、１つの特に好ま
しいカチオン性脂質組成物は、"Amphiphilic Polyamide Compounds"という表題
の同時係属出願シリアル番号09/448,876（1999年11月24日出願）に記載される。
ＸＧ４０の構造および合成は、以下に記載される。好適な共脂質は、リゾホスフ
ァチド（lysophosphatides）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルコリン、コレステロール誘導体、脂肪酸、中性ヘッド基（neutral headgroup
）を有するモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドホスホリピドを含むが、これら
に限定されない（Liu, et al., Nature Biotech. 15: 167-173 [1997]; Hong, e
t al., FEBS Lett. 400: 233-237 [1997]）。他の好適な一本鎖リゾ脂質（lyso
lipids）は、Felgnerらの米国特許5,264,618および5,459,127に開示されるロー
ゼンタール(Rosenthal)インヒビターエステルおよびエーテル誘導体を含む。

【００３２】本明細書で記載される実験において、試薬Ｉのカチオン性脂質組成物は、ＸＧ
４０および共脂質ＤＯＰＥを含む。

【００３３】１８−１−Ｌｙｓ−５Ｔεの合成工程１：１００ｍｌＣＨ₂Ｃｌ₂：メタノール（１：１）中に１０．４グラ
ム（２０ミリモル）のジオクチルアミンを含有する溶液へ、５０ｍｌアクリロニ
トリルを添加した。混合物を短時間６０℃へ加熱し、そして室温へ１２時間冷却
した。溶媒および過剰なアクリロニトリルを、ロトベーパー（rotovapor）続い
て高真空によって除去した。固体をヘキサンに溶解し、そして順相シリカゲルク
ロマトグラフィー精製へ供した。得られたＮ−プロピルニトリル−Ｎ−ジオクタ
デシルアミンを１００ｍｌジオキサンへ溶解し、そして４℃へ冷却し、次いでＬ
ｉＡｌＨ₄を使用してＮ−プロピルアミン−ジオクタデシルアミン（１８−１）
（反応スキームを参照のこと）へ還元した。過剰のＬｉＡｌＨ₄を希ＮａＯＨで
中和した。有機相を濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、そして水で洗浄した。高収率
の１８−１を白色固体として回収し、そしてＮａ₂ＳＯ₄で空気乾燥し、溶媒を蒸
発させ、そして高真空下で乾燥させた。得られた１８−１を、さらなる精製なし
に次の工程において使用した。

【００３４】工程２：１：１比のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を含有する１８−１の溶液
へ、ジ−Ｂｏｃ−リシンＮＨＳエステルを、アミンに対して１：２：１比で添加
した。室温で２時間反応後、得られた１８−１のジ−ｂｏｃ−リシンアミドを、
シリカゲルを使用して精製した。ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂でのジ−ｂｏｃ−リシンの
脱保護によって、１８−１−ｌｙｓ−１を得た。慣用的なワークアップ(work-up
)および溶媒の除去後、１８−１−リシンアミンが高収率で生成され、そしてさ
らなる精製なしに次の反応において使用した。

【００３５】工程３：ＴＥＡを含むＣＨ₂Ｃｌ₂中の１８−１−リシン−１の溶液へ、前も
ってジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシン
アミド（ＮＨＳ）でアセチル化したα−ＣＢＺ−ε−Ｂｏｃ−リシンを、該リシ
ンアミドに対して２：４：１比で添加した。反応を、その完了まで、ニンヒドリ
ン反応でモニターした。得られたｂｉｓ（Ｚ−Ｂｏｃ−ｌｙｓｙｓ）リシンアミ
ドを、ワークアップ後、シリカゲルで精製した。Ｂｏｃ基を除去し、そしてビス
−Ｚｌｙｓ３−１８−１を、次の反応のために使用した。

【００３６】工程４：ＢｉｓＺ−ｂｏｃ−ｌｙｓｙｌ（Ｂｉｓ（Ｚ）ｌｙｓ−３−１８
−１）を工程３と同様に得て、そしてＺ−Ｂｏｃ−リシルリシンアミド(Z-Boc-l
ysyl lysine amide)と同様にシリカゲルによって精製した。ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ での中間体の脱保護により、Ｂｏｃ基が除去された。ＥｔＯＨ中のＰｄ／Ｈ₂で
のさらなる脱保護によって、最終生成物１８−１−ｌｙｓ５Ｔεを得た。

【００３７】

【化１】

【００３８】１８−１−Ｌｙｓ−５Ｔのトリフルオロアセチル化誘導体の合成アセテートまたはトリフルオロアセテート基を、該精製生成物を酢酸またはト
リフルオロ酢酸と反応させることによって、極性ヘッド基（polar headgroup）
における脱保護第一級アミノ基へ結合させた。ＸＧ４０のランダムにトリフルオ
ロアセチル化された誘導体の合成を、以下に示す：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
中、１：１．１：１．１のモル比で、ＴＦＡ、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドお
よびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）から調製し、室温で２０分間
インキュベートし、次いで濾過してジシクロヘキシルウレアを除去した。１ｇの
ＸＧ４０を１０ｍｌの乾燥メタノールへ溶解し、そして１０モル過剰のトリエチ
ルアミン（ＴＦＡ）を添加した。活性化ＴＦＡをＸＧ４０へ好適なモル比で添加
し、所望のレベルのトリフルオロアセチル化を得、そして混合物を室温で２時間
インキュベートした。溶媒を真空下で蒸発させ、５ｍｌのメタノールに再溶解し
、そして−７０℃２００ｍｌエーテルを用いて沈殿させた。沈殿物を遠心分離に
よって回収し、そして該プロセスを１度繰り返した。生成物を５ｍｌの乾燥メタ
ノールに溶解し、そしてアミノ基に対して２モル過剰のＭｅＳとの反応によって
、メタンスルホン酸（ＭｅＳ）塩形態へ変換させた。過剰のＭｅＳを反復エーテ
ル析出によって除去した。最終生成物を真空下で乾燥し、白色粉末とした。

【００３９】カチオン性リポソームの調製カチオン性脂質フィルムを、Ｉ型ボロシリケートガラスバイアル中で該脂質の
有機（好ましくはクロロホルム）溶液を混合し、そして周囲条件下、好ましくは
滅菌フード中での蒸発によって有機溶媒を除去することによって、調製した。バ
イアルを真空下で一晩静置して、溶媒痕跡を除去した。カチオン性リポソームを
製造するために、好適な量の滅菌したパイロジェンを含まない水（sterile pyro
gen-free water）または他の水性ビヒクルを添加し、そしてバイアルをトップス
ピードで１〜２分間室温にてボルテックスした。特定のカチオン性脂質化合物を
スクリーニングするために、種々の溶媒を評価して、蒸発工程の間にカチオン性
脂質および共脂質（存在する場合）の両方が溶解されたままであることを確認し
た。例えば、８０％クロロホルムおよび２０％メタノールの溶媒混合液が使用さ
れ得る。次いで、脂質溶液を乾燥させて、均一な脂質フィルムを得た。乾燥工程
は、ロータリーエバポレーターにおける蒸発、周囲条件下での蒸発、または窒素
ガス流下でのブロー乾燥を含む、種々の様式で行われ得る。トランスフェクショ
ン処方のためのリポソームを調製するための手順は、上述の'618および'127特許
に開示される。リポソーム処方のための他の手順は、Felgner, et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987) に開示される。

【００４０】試薬ＩＩ第二のタンパク質送達試薬（試薬ＩＩ）は、問題のタンパク質をポリヌクレオ
チド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）（好ましくはプラスミド）へ結合させること、およ
び慣用ＤＮＡトランスフェクション試薬で細胞中へプラスミドをトランスフェク
トすることに関与する（図２）。これらのタイプの複合体は、リポプレックス（
lipoplexes）と呼ばれ、何故ならばタンパク質が核酸−カチオン性脂質複合体中
に捕捉されるからである。用語「リポプレックス（lipoplex）」は、通常のリポ
ソームで生じる封入と、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬がＤ
ＮＡと混合されて生じる異なるタイプの組織化とを区別するために定義された（
Felgner et al., Hum. Gene Ther. 8: 511-512, 1997）。ＤＮＡおよびカチオン
性リポソームの両方がリアレンジし（rearrange）、そして一緒にコンパクトし
（compact）て、「リポプレックス」と呼ばれる複合体を形成する。１００％の
ＤＮＡが、カチオン性脂質−ＤＮＡリポプレックス中に捕捉される。リポプレッ
クスは、リポソームが有するような内部流体容積（internal fluid volume）を
有さない。リポプレックスが適切に処方される場合、それらは、インビトロで培
養細胞中へそしてインビボで組織中へ機能性（functional）ＤＮＡを送達し得る
ウイルス様粒子を形成し得る。この方法において使用されるＤＮＡは、直鎖二本
鎖ＤＮＡ、直鎖一本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡまたは環状一本鎖ＤＮＡであり
得る。

【００４１】１実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプ技術（clamping techn
ology）が、タンパク質をプラスミドＤＮＡに結合するために使用される。ＰＮ
Ａクランプは、タンパク質およびペプチドを含む種々のリガンドをＤＮＡ上に結
合させるために使用され得る。この技術は、「ＰＮＡ依存遺伝子化学（PNA depe
ndent gene chemistry）（ＰＤＧＣ）」と呼ばれ、そしてZelphati, et al., Bi
o Techniques 28: 304-310 (2000) によって、PCT WO98/19503において、そして
同時係属米国特許出願シリアル番号09/224,818において記載される。ＰＮＡは、
ペプチド骨格によって置換されたＤＮＡのデオキシリボース−ホスフェート骨格
を有するポリヌクレオチドアナログである（図３）。ＰＮＡクランプは、プラス
ミド上のその相補的結合部位とハイブリダイズして、高度に安定なＰＮＡ−ＤＮ
Ａ−ＰＮＡトリプレックスクランプ（triplex clamp）を形成する。

【００４２】プラスミド、ｐＧｅｎｅＧｒｉｐ^TMは、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＳｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能であり、これは、
図３に示されるようなＰＮＡ結合部分を含む。ビオチン、反応性化学基（例えば
、マレイミド）、および蛍光標識（例えば、ローダミンおよびフルオレセイン）
で標識化されたＰＮＡを含む、いくつかの異なる標識化ＰＮＡクランプが、使用
され得る。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターベースの
プラスミド（immediate early gene promoter-based plasmid）のターミネ−タ
ー後で、８０塩基対ポリプリン−ＡＧ−繰り返し配列（ｐＧｅｎｅＧｒｉｐ部位
）を、クローン化された。プラスミドのこの領域は、それは転写に関与せずそし
てこの領域へのＰＮＡ結合は発現に影響を与えないので、結合部位の挿入のため
に選択された（Zelphati et al., Hum. Gene Ther. 10: 15-24, 1999）。８塩基
−ＣＴ−繰り返し、３ユニットフレキシブルリンカー（８−アミノ−３，６−ジ
オキサオクタン酸）、および８塩基−ＪＴ−繰り返しからなる相補的ＰＮＡクラ
ンプを合成し、ここで、Ｊは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎトリプレックスハイブリッド
（Hoogsteen triplex hybrid）の形成を促進する、シュードイソシトシン（pseu
doisocytosine）（Ｃのアナログ）である（Zelphati et al., 1999、前出；Egho
lm et al., Nucl. Acids Res. 23:217-222, 1995）。−ＣＴ−ストレッチ（stre
tch）は、逆平行ワトソン−クリック様式で、プラスミド上の−ＡＧ−繰り返し
へハイブリダイズし、そして−ＪＴ−ストレッチは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作
用によってＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの主溝（major groove）において結合し
、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡトリプレックスクランプを形成する（Egholm et al.
、前出）。非標的ＤＮＡ鎖が取り出され、ハイブリダイズされていない「Ｄ−ル
ープ」を形成する（Bukanov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 5516
-5520, 1998; Cherny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 1667-1670,
1993）。

【００４３】１実施形態において、ビオチン−ストレプトアビジンシステムを使用して、タ
ンパク質をＤＮＡにカップリングする。ストレプトアビジンは、ＤＮＡ−ＰＮＡ
−ビオチンハイブリッドによって捕捉される。ペプチドおよびタンパク質をスト
レプトアビジンへ共有結合させるためのいくつかの周知の化学方法が、使用され
得る。例えば、遊離スルフヒドリル基を含む任意のリガンドが、複合化されたマ
レイミド部分を含むストレプトアビジンと反応する。ペプチド−ストレプトアビ
ジン複合体を、ビオチン−ＰＮＡ−ＤＮＡへ直接添加する。ストレプトアビジン
標識化プラスミドＤＮＡの調製を、図４に示す。第一に、ビオチン−ＰＮＡをｐ
ＧｅｎｅＧｒｉｐ^TMへ添加し、そして結合されていないビオチン−ＰＮＡをエタ
ノール沈殿によって除去した。ストレプトアビジンをビオチン−ＰＮＡ標識化プ
ラスミドへ添加し、そしてこの生成物をゲル濾過によって精製し、結合されてい
ないストレプトアビジンを除去した。ゲル濾過データの定量分析は、各プラスミ
ドについて約１の結合されたストレプトアビジンが存在することを示した。スト
レプトアビジン標識化後、ＰＮＡ結合部位から３１０塩基対の単一ＢａｍＨＩ部
位を含むプラスミドを、ＢａｍＨＩ酵素で制限した。ストレプトアビジン標識
化ＤＮＡのクリオ−原子力顕微鏡（Cryo-atomic force microscopy）画像は、鎖
状ＤＮＡ、およびストレプトアビジン分子の位置を示す各鎖における白色ドット
を明らかにした。実質的に全ての鎖が、ＰＮＡ結合部位の予想される位置で、各
鎖の末端から正確に３１０塩基対離れて位置する単一ストレプトアビジンを有し
た。これらの結果は、プラスミドＤＮＡを標識するためのこのアプローチの精巧
な特異性および選択性を示し、そしてまた、ＰＮＡアプローチはＤＮＡ上へタン
パク質を結合させるために使用され得ることを示す。この方法は、任意のタンパ
ク質またはペプチドの細胞内送達のために好適である。

【００４４】試薬ＩＩＩ第３のタンパク質送達試薬（試薬ＩＩＩ）は、確立された複合体化学、続いて
慣用カチオン性脂質トランスフェクション試薬の使用による、タンパク質へのポ
リヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、好ましくはオリゴヌクレオチドの結合
に関与する。ＤＮＡは、直鎖二本鎖ＤＮＡ、直鎖一本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮ
Ａ、または環状一本鎖ＤＮＡであり得る。試薬ＩＩＩを使用してのタンパク質送
達のコンセプトが、図５に示される。オリゴヌクレオチドおよび抗体がこの例示
に示されるが、該方法は、細胞への任意のタンパク質またはペプチドの送達に好
適である。さらに、該方法は、ポリヌクレオチドの使用に限定されない。カチオ
ン性リポソームと相互作用し得る負に帯電した生適合性ポリマーは、本発明の範
囲内である。これらのポリマーとしては、例えば、ヘパリン、デキストランスル
フェート、ポリグルタミン酸などが挙げられる。オリゴヌクレオチドが、送達さ
れるタンパク質と反応し得る化学基を標準方法によって細胞へ結合させることに
よって、活性化される。１実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＮＨＳ−
活性化オリゴヌクレオチドを使用することによって、関心のあるタンパク質上の
利用可能なアミノ基へ複合化される（図５）。タンパク質を、乾燥ＮＨＳ−活性
化オリゴヌクレオチドを含有するバイアルへ添加し、そして得られるタンパク質
オリゴヌクレオチド複合体を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０スピンカラムを使用し
て、未反応オリゴヌクレオチドから精製する。次いで、得られたタンパク質オリ
ゴヌクレオチド複合体を、慣用カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用
して、細胞中へトランスフェクトする。オリゴヌクレオチドをタンパク質へカッ
プリングするための別の方法が、以下に記載される。

【００４５】オリゴヌクレオチドの活性化種々の反応性化学基が、オリゴヌクレオチドまたは他の負に帯電したポリマー
へまたはＰＮＡ分子へ、当該分野において周知の方法を使用して、結合され得る
。種々の架橋剤が、タンパク質上の異なる化学基（アミノ、カルボキシル、スル
フヒドリル、アリール、ヒドロキシルおよび炭化水素）を標的化するために使用
され得る。これらの架橋剤の多くは、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．
（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能であり、そしてＰｉｅｒｃｅカタログ
に記載される。ヘテロ二官能性架橋剤（heterobifunctional crosslinkers）は
、タンパク質の特定の基との連続的複合化（sequential conjugations）を可能
にし、望まれない重合または自己複合化を最小にする２以上の異なる反応性基を
含む。第１級または第２級アミンと反応するヘテロ二官能性架橋剤としては、イ
ミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル（例え
ば、ＳＭＣＣおよびスクシミジル(succimidyl)−４−（ｐ−マレイミドフェニル
）−ブチレート（ＳＭＰＢ））が挙げられる。スルフヒドリル基と反応する架橋
剤としては、マレイミド、ハロアセチルおよびピリジルジスルフィドが挙げられ
る。カルボジイミド架橋剤は、カルボキシルを第１級アミンまたはヒドラジドと
カップリングさせて、アミドまたはヒドラゾン結合を形成させる。１つの広範に
使用されるカルボジイミド架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）ヒドロクロリドである。

【００４６】例えば、マレイミド−標識化ＰＮＡは、ＰＮＡをＳＭＣＣと反応させることに
よって得られ、そしてピリジルジチオール標識化ＰＮＡは、ＰＮＡを（［Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＳＰＤＰ））と
反応させることによって得られる。これらの基の両方は、タンパク質スルフヒド
リル基と反応する。任意の所望の化学基が、慣用化学方法を使用してＰＮＡへ結
合され得る。

【００４７】タンパク質へのオリゴヌクレオチドのカップリングＦＩＴＣまたはローダミン結合された、アミン修飾オリゴヌクレオチドを、０
．１Ｍホウ酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．２５に、１５μｌ中９ｎ
ｍｏｌの濃度で溶解させた。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）を、乾燥
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、１ｍｇ／１００μｌの濃度で溶解した（
新たに調製した）。６０μｌのＤＳＳ溶液をオリゴヌクレオチドへ添加し、溶液
を十分に混合し、そして暗所中室温で１５分間インキュベートした。溶液を激し
くボルテックスし（vortexed）、そして１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し
、２相に分離した。上相を注意深く除去し、そして廃棄した。抽出をｎ−ブタノ
ールでさらに２回行った。残りのサンプルを、ドライアイス上で冷却し、そして
１５〜３０分間凍結乾燥させて、液体の最後の痕跡を除去した。４００μｇのヤ
ギＩｇＧ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＳ
）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２に、２０
ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。１０μｌのＩｇＧ溶液を、乾燥させたＤＳＳ−活
性化オリゴヌクレオチドへ添加し、穏やかに混合して溶解させ、そして１時間室
温で暗所にて反応させた。結合していないオリゴヌクレオチドを、Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘＧ−７５スピンカラム（３，０００ｒｐｍで３分）を使用して除去した。
複合体を、慣用カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用してトランスフ
ェクトした。

【００４８】試薬ＩＶタンパク質をカチオン性リポソームへ結合させる別の方法は、図６に示される
ような、カチオン性リポソームに含まれる脂質へのタンパク質の化学的複合化に
よる。ペプチドまたはタンパク質上へ疎水性部分をカップリングするための、当
該分野において利用可能な多くの方法がある。詳細な方法は、"Bioconjugate Te
chiniques", Greg T Hermason, Academic Press Inc. or "Liposome Technology
", volume I, II and III, 2^nd edtion, G. Gregoriadis, CRC pressを含むいく
つかの本に編集されている。種々の反応性化学基が、オリゴヌクレオチド部分の
活性化において試薬ＩＩについて上記に記載されるように、当該分野において周
知の方法を使用して、脂質および／またはタンパク質へ結合され得る。ヘテロ二
官能性架橋剤（ＳＰＤＰ、ＳＭＰＢ、ＮＨＳ、ＳＡＴＡ、ＳＭＣＣなど）を含む
種々の架橋剤が、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、アリール、ヒドロキ
シルおよび炭水化物を含む、タンパク質および／または脂質上の異なる化学基を
標的化するために使用され得る。多くのこれらの架橋剤は、ＰｉｅｒｃｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能であり、そして
Ｐｉｒｃｅカタログに記載される。

【００４９】他のアプローチは、アミン反応性試薬Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の使用を包含する。ＳＰＤＰを、抗体
とインキュベートし、５：１のＳＰＤＰ／タンパク質モル比を室温での２０分間
インキュベーション後に得た。生成物をゲル濾過によって単離し、その後、サン
プルをジチオスレイトールで還元して、反応性−ＳＨ基を生成させた。チオール
化生成物をゲル濾過によって単離した。リポソームへのチオール化抗体のカップ
リングを、脂質７５０μｇ当たりタンパク質７５μｇの割合でチオール化抗体を
室温でマレイミド−リポソームとインキュベートすることによって行った。脂質
へのＳＰＤＰのカップリングを、公開された手順（例えば、Hermason、前出；Le
serman and Barbet, Nature 288: 602-604 [1980]）に従って行った。アミン修
飾抗体のカップリングは、典型的に、１５〜２５μｇ抗体／７５０μｇ脂質を生
じさせた。

【００５０】薬学的組成物本発明の１局面は、インビトロでの、直接細胞への、本明細書中で開示される
送達組成物の投与に関する。本発明の別の実施形態において、組成物はインビボ
で細胞へ送達される。特に、組成物は、ほとんど任意のタイプの動物細胞（鳥類
、魚類、哺乳動物、および両生類）において細胞内にタンパク質を送達するため
に使用され得る。本発明に従うタンパク質で処理された哺乳動物は、非ヒトまた
はヒトであり得る。現在知られているか、治療的価値を有するものとして後で発
見される任意のタンパク質が本発明において使用され得る。さらに、細胞内プロ
セス（intracellular processes）に特異的に影響を与えるタンパク質は、本発
明に特に好適である。本発明は、いずれの特定のタンパク質に限定されずまたこ
れに焦点を合わせず；むしろ、任意のタンパク質を細胞へ送達するに好適な特定
の方法および組成物に焦点が合わせられる。

【００５１】本発明の実施における使用に意図される薬学的に許容される組成物は、固体、
溶液、エマルジョン、ディスパージョン（dispersion）、ミセル、リポソームな
どの形態で使用され得、ここで、得られる組成物は、その有効成分として本明細
書中で使用が意図される１以上の活性化合物を、鼻、腸または非経口適用に好適
な有機または無機の担体または賦形剤と混合して含有する。有効成分は、例えば
、錠剤、ペレット、カプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ（lozenges）、水性また
は油性懸濁剤、分散性散剤または顆粒剤、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁剤、
硬または軟カプセル剤、キャプレット（caplets）またはシロップ剤またはエリ
キシル剤ならびに使用に好適な他の任意の形態についての、通常の非毒性の薬学
的または生理学的に許容される担体と配合され得る。使用され得る担体としては
、グルコース、ラクトース、ガムアカシア、ゼラチン、マンニトール、スターチ
ペースト、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、
コロイダルシリカ、ポテトスターチ、ウレア、中鎖長トリグリセリド（medium c
hain length triglycerides）、デキストラン、および固体、半固体（semisolid
）または液体形態の調製物を製造する際に使用に好適な他の担体が挙げられる。
さらに、助剤、安定剤、濃稠化剤および着色剤が使用され得る。本明細書で使用
に意図される活性化合物は、薬学的組成物中に、標的プロセス、症状または疾患
に所望の効果を与えるに十分な量で含まれる。

【００５２】さらに、このような組成物は、薬学的に上品（elegant）かつ口に合う（palat
able）調製物を提供するために、矯味矯臭剤（flavoring agents）（例えば、ペ
パーミント、ウインターグリーンまたはチェリーのオイル）、着色剤、保存剤な
どから選択される１以上の剤を含み得る。非毒性の薬学的に許容される賦形剤と
合わせて活性成分を含有する錠剤はまた、公知の方法によって製造され得る。使
用される賦形剤は、例えば、（１）不活性希釈剤（例えば炭酸カルシウム、ラク
トース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなど）；（２）造粒剤および崩壊
剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など）；（３）結合
剤（例えば、トラガントガム、コーンスターチ、ゼラチン、アカシアなど）；お
よび（４）滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク
など）であり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、またはそれらは
、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させてそれによって長期間にわたって持
続性作用を提供するように、公知の技術によってコーティングされていてもよい
。例えば、グリセリルモノステアレートのような時間遅延材料（time delay mat
erial）が使用され得る。錠剤はまた、制御された放出のための浸透性治療錠剤
（osmotic therapeutic tablets）を形成するように、米国特許4,256,108；4,16
0,452；および4,265,874に記載される技術によってコーティングされ得る。

【００５３】経口使用のための製剤が硬カプセル剤の形態である場合、有効成分は、不活性
固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどと混合さ
れ得る。それらはまた、有効成分が水または油媒体（例えば、ピーナッツ油、流
動パラフィン、オリーブオイルなど）と混合されている、軟カプセル剤の形態で
あり得る。

【００５４】当然ながら、経口製剤は、胃処理（gastric process）から好適な保護を必要
とし得、そして、当該分野で周知であるような、緩衝化組成物、時間放出（time
release）組成物、腸溶コーティング（enteric-coated）組成物などの形態であ
り得る。タンパク質全てが経口経路を介して有効に送達され得ないこと、および
本明細書で記載される特定の他の経路がまた特定のタンパク質送達組成物につい
て好適でないかもしれないことが、理解される。

【００５５】製剤はまた、滅菌注射可能懸濁液の形態であり得る。このような懸濁液は、好
適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して公知の方法に従って処方され得
る。滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶
媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液（例えば、１，４−ブタンジオール中の溶
液として）であり得る。滅菌不揮発性油が、慣用的に、溶媒または懸濁媒体とし
て使用される。この目的ために、合成モノ−またはジグリセリド、脂肪酸（オレ
イン酸を含む）、天然植物油（例えば、ゴマ油、ココナッツオイル、ピーナッツ
油、綿実油など）、または合成脂肪ビヒクル（例えば、オレイン酸エチルなど）
を含む、任意の刺激の少ない（bland）不揮発性油が、使用され得る。緩衝剤、
保存料、抗酸化剤などが、必要であれば含まれ得る。

【００５６】本発明の実施における使用が意図される製剤はまた、有効成分の直腸投与のた
めの坐薬の形態で、投与され得る。これらの組成物は、有効成分を好適な非刺激
性賦形剤（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールの合成グリセリドエ
ステル（これらは、常温で固体であるが、直腸キャビティにおいて液化および／
または溶解して有効成分を放出する）など）を混合することによって、調製され
得る。

【００５７】さらに、造形品（shaped articles）（例えば、フィルムまたはマイクロカプ
セル）の形態の半浸透性ポリマーマトリックスを含む、持続性放出システムがま
た、本発明のタンパク質送達試薬の投与のために使用され得る。

【００５８】脊椎動物、好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ヒツジ
、ウシ）、より好ましくはヒトへ投与される本発明のタンパク質送達組成物の量
は、処置される症状、症状の重篤度、および処置への患者の応答に依存して変化
する。一般的に、投与される量は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは
約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。投薬量最適化は、当業者に公知の標準
の用量−応答曲線を使用して行われ得る。

【００５９】本発明はまた、医薬がタンパク質の細胞内送達のためでありそして本明細書で
記載されるタイプの製剤を含む、ヒトまたは動物の処置のための医薬の製造を含
む。本発明の１局面において、医薬は、細胞内成分を有する疾患の処置のためで
ある。医薬は、細胞内プロセス（intracelluar process）を阻害または促進する
ことによって疾患を処置するためであり得る。本発明の焦点は、いずれの特定の
疾患の処置よりもより広範であり；むしろ、焦点は、タンパク質の細胞内送達に
よって利益を得ることができる、細胞内プロセスに影響を与えるかまたはこれに
よって影響を与えられる広範な症状の処置にある。

【００６０】実施例以下の実施例は、限定ではなく実例として提示される。実施例は、当業者に本
発明の化合物、組成物、及び方法の製造方法及び使用方法の完全な開示及び記載
を提供するために記述され、発明者が発明であるとみなす範囲を限定しようとす
るものではない。

【００６１】実施例１タンパク質の細胞内送達のための試薬Ｉの使用カチオン性脂質が媒介するDNA送達（即ち、リポフェクション）のために、脂
質は通常水中で懸濁され、リポソームを形成し、その後、DNAを添加する。正に
荷電したリポソームは、負に荷電したDNAと自発的に相互作用し、実質的に100%
のDNAが、リポプレックス（lipoplexes）と呼ばれるカチオン性脂質−DNA複合体
を形成する。正に荷電したリポプレックスは、閉じ込められたDNAを運び、負に
荷電した細胞表面と相互作用し、一連の手段を通して、閉じ込められたDNAが細
胞質に入り、最終的に転写され得る核に入る。

【００６２】標準のリポフェクション技術は、高度に正に荷電したリポソーム及び負に荷電
したDNAとの間の相互作用に基く。タンパク質はDNAと同じ物理的性質を共有して
いないので、この技術は、まだタンパク質送達には直接適用されていない。タン
パク質は、DNAと同じような高度な負電荷密度を有していないので、リポプレッ
クス形成は、自発的には起こらない。更に、異なるタンパク質は、正味の正又は
負の電荷のいずれを有しているかに依存して非常に異なってカチオン性脂質と相
互作用する。種々のタンパク質の電荷特性は広く変化するので、この方法を用い
た一般的なタンパク質送達試薬を調製するのは困難であった。

【００６３】ある両親媒性の脂質分子は、水中で懸濁すると自発的に二層膜を形成する（Gr
egoriadis et al., FEBS Lett. 402:107-110[1997]；Gregoriadis et al., Meth
ods 19:156-162,1999）。脂質を有機溶媒に可溶化し、その後溶媒を蒸発させ、
これらの二層形成脂質の非晶質混合物からなる乾燥フィルムを作る。乾燥脂質フ
ィルムに水を添加すると、脂質は自発的に二層を形成し、振盪すると、内容積を
含むリポソームと呼ばれる閉じられた小胞を形成する。水和バッファー中に存在
する溶質のフラクションは、リポソームの形成中に封入される；しかし、溶質の
バルクは封じ込められないままである。リポソームの物理的な挙動はよく研究さ
れており、可能性のある薬物送達ビヒクルとして広範囲に研究されている。リポ
ソームの薬物封入能力の利益を有する承認されたヒトの臨床製品がいくつかある
。

【００６４】本発明のタンパク質送達試薬Ｉは、封入によってタンパク質をカチオンリポソ
ームに取り込む。いくつかの蛍光性の抗体は、タンパク質カーゴの送達のための
試薬Ｉの有用性を実証するために使用された。テロメア繰り返し結合因子2（TRF
-2）に対するFITC標識されたモノクローナル抗体はImGeneX（サンディエゴ、カ
リフォルニア）から入手し、FITC標識されたヤギIgG及び抗アクチン抗体は、シ
グマから購入した。蛍光性抗体の細胞による取り込みの可視化のために、実験の
前の日に、NIH3T3細胞を22mmのカバースリップ(coverslip)の上に播き、実験の
日に50-90%コンフルエントになるようにした。XG40カチオン性脂質（1.224mg）
及び0.254mgのDOPEを750μlのクロロホルムに溶解した。約5μgの脂質を含むXG4
0/ DOPE混合物（2.5μl）をポリプロピレンチューブに調合した。クロロホルム
を窒素気流下で除去した。蛍光標識された抗体は、10mMのHEPES、pH7、150mM Na
Cl（HBS）中で、10-160μg/ml、好ましくは80-100μg/mlに希釈した。希釈した
抗体を乾燥フィルムに添加し、直ちに溶液を中ぐらいの速さで10秒間ボルテック
スした。血清を含まないメディウムをチューブに添加し、最終容量を200μlにし
た。カバースリップをブロットして乾燥し(blotted dry)、35mmのペトリディッ
シュに置いた。カチオン性脂質／抗体複合体を細胞の上に移し、37℃、5%CO₂で4
時間以上インキュベートした。より長いインキュベーション時間が望ましい場合
は、更なる成長メディウムを添加した。抗体の取り込みは、蛍光顕微鏡で可視化
した。

【００６５】バックグラウンドの蛍光は、蛍光標識された抗体のみを用い、試薬Ｉを用いな
いでインキュベートしたNIH-3T3細胞を使用して測定した。抗体のみで生じたご
く少量の取り込みに比べて、試薬Ｉは、NIH-3T3細胞中の蛍光標識された抗体の
取り込みを非常に促進した。細胞内のいくつかの抗体は細胞質に均質に分配され
ているように見え、いくつかは細胞の表面に集中し、明らかに細胞表面に結合し
たいくつかの明るく蛍光性の凝集物があった。ほとんどの核は、細胞質よりも暗
かったので、抗体は核から排除されていたと推測される。細胞の試薬Ｉを用いた
処理は、細胞の外観に基いて毒性はないように見える。24時間後でさえも蛍光の
強度の減少は見られなかった。

【００６６】 Jurkat、HeLa S3、BHK-21、CHO-K1、B16-FO及び293細胞を用いて同じ結果が得
られたが、蛍光の強度、陽性細胞の割合及び細胞内蛍光のパターンにおいて、細
胞タイプ間で相違があった。全ての細胞タイプの、試薬Ｉ非存在下のバックグラ
ウンドの蛍光は、NIH-3T3と同じであった。異なる抗原に対して向けられ、異な
る商業上の供給者から得られた2つの異なるモノクローナル抗体によって、本質
的に同じ結果が得られ、この方法が細胞内タンパク質送達に一般的に適用できる
ことを示している。

【００６７】試薬Ｉが広範なタンパク質を送達する能力は、更に試験された。この目的のた
めに、FITC標識された高又は低分子量デキストラン、ヤギIgG及び抗アクチン抗
体が使用された。試薬Iは、全てのタンパク質を細胞内に送達することが見出さ
れた。低分子量デキストラン（10,000MW）は、導入された細胞の核内に入ること
ができ、他方、高分子量デキストラン（70,000MW）は、核に入らなかった。ヤギ
IgGは及び抗アクチン抗体もまた、導入された細胞の核から排除された。抗アク
チン抗体は、細胞内アクチンフィラメントに蓄積するといういくつかの証拠が示
されているが、驚くべきことではないが、着色パターンは、固定されて透過され
た細胞に観察されるものとは異なる。

【００６８】細胞内に導入されたタンパク質が生物活性を保持しているかを試験するために
、試薬Ｉは、カスパーゼ-3（Dr. Guy Salvensenからの親切な贈り物）、シトク
ロムc（Sigma）、グランザイム-B（CalBiochem）及びカスパーゼ-8（Biovision
）をJurkat細胞に送達するために使用され、アポトーシスの誘導がモニターされ
た。細胞を、各ウェルに0.5×10⁶細胞の細胞濃度で24ウェルプレートに播いた。
種々のタンパク質をPBSで40-160μg/mlに希釈した。次いで、カスパーゼ-3（100
nモル）、カスパーゼ-8（1単位）、シトクロムc（100μg/ml）及びグランザイム
B（200単位）の溶液を、前述のように試薬Ｉを水和するために使用した。カチオ
ン性脂質／タンパク質複合体を細胞上に移し、37℃、5%CO₂で4時間以上インキュ
ベートした。より長いインキュベーション時間を望む場合は、更なる成長メディ
ウムを添加した。細胞は、BSA-フィコエリトリン（BSA-PE）単独又はカスパーゼ
-3、シトクロム-c、グランザイム-B又はカスパーゼ-8と共にBSA-PEが導入された
。フローサイトメトリーは、タンパク質の取り込みの指標として、BSA-フィコエ
リトリン（BSA-PE）の蛍光をモニターするために使用され、他方、アポトーシス
誘導の程度は、導入されたタンパク質の機能的活性の指標として、CaspaTagアッ
セイによってモニターされた。CaspaTag蛍光カスパーゼ活性キットは、Intergen
（ニューヨーク）から購入した。つまり、300μlの細胞を新しいチューブに移し
、30×ワーキングダイリュ−ションFAM-VAD-FMK（10μl）を細胞懸濁液に添加し
た。細胞を、チューブを少したたくことにより混合し、5% CO₂下で遮光して1時
間インキュベートした。次いで、2mlの1×ワーキングダイリュ−ション洗浄バッ
ファーを標識ミックスに添加し、細胞を室温で400×gで5分間沈殿させた。上清
を捨て、細胞のペレットを優しくボルテックスし、細胞の塊をばらばらにした。
細胞のペレットを1×ワーキングダイリュ−ション洗浄バッファー中で再懸濁し
、サンプルをFACSで分析した。

【００６９】図７に示すように、カスパーゼ-3は、細胞の約40%をアポトーシスの誘導に導
く最も強いアポトーシス誘導物質であった。シトクロム-c、グランザイム-B及び
カスパーゼ-8は、約20%のアポトーシス細胞を生じ、他方、バックグラウンドレ
ベルは約7%であった。試薬Ｉは、タンパク質の細胞内送達を促進するだけでなく
、送達されたタンパク質の機能的な完全さも保つことが、結果から証明された。
従って、本明細書中に記載されているタンパク質送達試薬は、任意のタンパク質
の機能的な送達に使用され得る。

【００７０】実施例2 試薬IIを用いたストレプトアビジン（streptavidin）の細胞内送達コロイド状の金（10nm直径）標識されたストレプトアビジン（Sigma、セント
ルイス、ミズーリ）を、ビオチン-PNA標識プラスミドと10:1のモル比過剰で混合
し、37℃で1時間インキュベートした。混合物をSephacryl-500-HRカラム上を通
し、遊離のストレプトアビジン−金を取り除き、金標識プラスミドを、GenePORT
ER（登録商標）（Gene Therapy Systems,Inc.,サンディエゴ、カルフォルニア）
トランスフェクション試薬を用いてCOS7細胞にトランスフェクトした。ストレプ
トアビジン−金標識プラスミドが、ストレプトアビジン−金が依然として付着し
ながら細胞にトランスフェクトされ得ることを結果が示した。トランスフェクト
された細胞における細胞内プラスミドは、透過型電子顕微鏡によって示された。
ストレプトアビジン−金は、ストレプトアビジンがプラスミド上に結合すること
によって細胞内に送達され得ることも結果は示した。ストレプトアビジン−金標
識プラスミドDNAは、細胞外の空間及び細胞質内に見られた。金粒子もまた、細
胞表面に接着して及びエンドサイト−シス小胞内にあるのが見られた。

【００７１】他のPDGC法では、マレイミド部分が直接PNAに結合された。スクシミジル4-（N
-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）の末端のN-ヒ
ドロキシスクシンイミド（NHS）は、最初にPNAクランプの5'第一級アミンと反応
し、安定なアミド結合を形成した。次いで、マレイミド−PNA複合体が、プラス
ミド上の結合部位にハイブリダイズされた。PNA結合部位を含むプラスミドDNAを
、ハイブリダイズできるようにSMCC-PNAと共にインキュベートし、混合物をエタ
ノールで沈殿し、遊離のPNAを除去した。末端システイン残基を含む核局在シグ
ナルペプチドを還元し、マレイミド−PNA標識プラスミドと混合した。混合物を
エタノール沈殿により精製し、アガロースゲル電気泳動によって試験した。反応
性のマレイミドを含むプラスミドはNLSペプチドで標識されたが、ビオチン−PNA
を含むプラスミドは標識されなかったことを結果は示した。これらの結果は、ペ
プチド複合体が、還元されたメルカプト基及びPNA上のマレイミド部分の間の反
応に依存することを実証する。DNA/PNAフルオレセインは、DNAがゲル中のどこを
移動したかを示すためのコントロールとして使用された。

【００７２】他の実施態様において、マレイミド標識PNAを含むプラスミド（Gene Therapy
Systems）が使用された。部分的に還元されたフルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）標識抗体は、3mgの2-メルカプトエチルアミンを0.5mlのリン酸緩衝生
理食塩水（PBS）、pH7.4中250μgのタンパク質に添加することによって調製され
た。混合物を37℃で90分間インキュベートし、還元された抗体をSephadex G-25
カラム上でゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、過剰の還元剤を除去した
。還元された抗体は、37℃で90分間プラスミド1モルに対して2モルの抗体をイン
キュベートすることによって、マレイミド−PNA標識プラスミドと結合され、生
成物は、更なる精製を行わないで、直接トランスフェクションアッセイに使用さ
れた（図2）。あるいは、未反応の抗体は、抗体−プラスミド複合体からSephacr
yl 500 HRカラムクロマトグラフィーによって除去され得る。プラスミド／タン
パク質複合体は、慣用のDNAトランスフェクション試薬及びプロトコールを使用
して細胞にトランスフェクトされた。細胞内蛍光は、細胞による標識された抗体
の成功した取り込みを示した。

【００７３】抗体の場合、遊離のスルフヒドリル基は2-メルカプトエチルアミンとの還元に
さらされ得、過剰の還元剤はSephadex G-50カラムクロマトグラフィーによって
除去されることができ、得られた還元された抗体は、マレイミド標識されたプラ
スミドに添加し、DNA-抗体複合体を作ることができ、トランスフェクション試薬
を用いて細胞にトランスフェクトされ得る。

【００７４】実施例3 試薬IIIを用いたタンパク質の細胞内送達商業的供給者（GeneBase,Inc.）から入手でき、5'末端NH2基及び3'末端ローダ
ミン部分を含むオリゴヌクレオチド（5'-NH2-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-ローダミ
ン-3'）は、ヤギIgG（Sigma）に結合され、慣用のカチオン性脂質トランスフェ
クション試薬を用いて細胞に導入された。方法の2つのバリエーションが試験さ
れた。1つは、脂質の処方を水和バッファー中で最初に再懸濁してリポソームを
形成し、次いで、抗体−オリゴヌクレオチド複合体をリポソーム製剤に添加した
。この方法はリポプレックスの形成に導く。他のバリエーションは、抗体−オリ
ゴヌクレオチド複合体を、直接BioPORTER試薬の乾燥フィルムに添加した。この
方法は、リポプレックスの形成だけでなく、タンパク質−オリゴヌクレオチド複
合体の封入を導く。どちらの方法も、抗体−オリゴヌクレオチド複合体の細胞内
送達に成功したことが見出された。

【００７５】前述の発明は、理解の明瞭の目的で、例証と実施例によっていくらか詳細に記
載されたが、本発明の技術の点から、いくらかの変更と変形とを記載されクレー
ムされたものの精神及びその範囲から逸脱することなく行うことができることは
、当業者にとって明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、乾燥カチオン性脂質フィルム及びモノクローナル抗体からの
第1のタンパク質送達試薬（試薬I）の形成、封入された抗体の細胞膜への結合、
及び封入された抗体の細胞内送達を示す概念図である。

【図２】図２は、第2のタンパク質送達試薬（試薬II）の概念図である。マレ
イミド標識されたペプチド核酸（PNA）クランプは、プラスミドと結合され、マ
レイミド標識プラスミドを生成する。次いで、還元された抗体は、マレイミド標
識プラスミドと結合され、慣用のDNAトランスフェクション試薬を用いて細胞に
トランスフェクトされる。

【図３】図３は、プラスミド上のPNA結合部位に結合したPNAクランプを示す、
pGeneGrip（登録商標）ベクターの概念図である。

【図４】図４は、ビオチン標識されたPNAクランプを用いたストレプトアビジ
ン標識プラスミドDNAの製造方法の概念図である。

【図５】図５は、第3のタンパク質送達試薬（試薬III）の概念図である。活性
化されたオリゴヌクレオチドは、モノクローナル抗体に結合して抗体／オリゴヌ
クレオチド複合体を形成し、次いでカチオン性リポソームと結合する。該複合体
を、慣用のDNAトランスフェクション試薬を用いて細胞にトランスフェクトする
。

【図６】図６は、第4のタンパク質送達試薬（試薬IV）の概念図である。SPDP
のような二官能性架橋試薬は、関心のあるタンパク質をマレイミド活性化カチオ
ン性脂質と結合するために使用される。次いで、混合物を細胞上に添加し、タン
パク質リポソーム複合体の細胞の取り込みを導く。

【図７】図７は、Jurkat細胞への種々のタンパク質の送達及びアポトーシスの
誘導を媒介する試薬Ｉを示す。ヒストグラムは、BSA-フィコエリトリン複合体（
BSA-PE）、又は、BSA-PEとグランザイム-B、カスパーゼ-3、シトクロムc又はカ
スパーゼ-8との混合物で処理された細胞のFACS分析を示す。これらのヒストグラ
ムのy軸は、細胞に入った蛍光BSA-フィコエリトリンの量を定量化し、x軸は、Ca
spaTagアッセイを用いたアポトーシスの量を定量化する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月１７日（２００１．７．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ゼルファチオリビエアメリカ合衆国カリフォルニア 92037 ラヨーラビアラヨーラドライブ 8840 ＃2210 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 EE59 FF34 FF68 GG22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質の細胞内送達のための組成物であって：カチオン性脂質を含むカチオン性細胞内送達ビヒクルと作動的に結合したタン
パク質を含み、ここで、該細胞内送達ビヒクルが細胞膜と融合するように適合さ
れており、それによって結合タンパク質の細胞内送達を行う、組成物。
【請求項２】前記タンパク質が、直接またはリンカーを介してカチオン性
脂質へ結合されている、請求項１の組成物。
【請求項３】前記タンパク質が、該タンパク質をポリヌクレオチドへ結合
させそして該ポリヌクレオチドをカチオン性脂質と結合させることによって、カ
チオン性脂質へ結合されている、請求項１または２の組成物。
【請求項４】前記タンパク質が、ＰＮＡリンカーを介して前記ポリヌクレ
オチドへ結合されている、請求項１〜３のいずれかの組成物。
【請求項５】前記タンパク質が、カチオン性脂質へ結合されたリンカー分
子へ結合されている、請求項１の組成物。
【請求項６】前記リンカー分子がマレイミドである、請求項５の組成物。
【請求項７】前記タンパク質−リンカー結合およびリンカー−カチオン性
脂質結合の少なくとも１つが共有結合である、請求項５〜７のいずれか１項の組
成物。
【請求項８】前記タンパク質−リンカー結合およびリンカー−カチオン性
脂質結合の少なくとも１つがイオン性である、請求項５〜７のいずれか１項の組
成物。
【請求項９】前記タンパク質が、治療または予防タンパク質である、請求
項１〜８のいずれか１項の組成物。
【請求項１０】前記タンパク質が特異的結合タンパク質である、請求項１
〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】前記特異的結合タンパク質が抗体または抗体フラグメント
である、請求項１０の組成物。
【請求項１２】前記細胞内送達ビヒクルが、カチオン性脂質、カチオン性
リポソーム、カチオン性脂質および核酸を含むリポプレックス（lipoplex）、ま
たはカチオン性脂質と結合したアニオン性ポリマーを含む、請求項１および９〜
１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】前記細胞内送達ビヒクルがカチオン性脂質と結合したアニ
オン性ポリマーを含み、そして該アニオン性ポリマーが前記タンパク質へカップ
リングされた反応性基を含む、請求項１２の組成物。
【請求項１４】タンパク質を細胞へ送達するための方法であって：細胞内送達組成物を形成するような様式でカチオン性脂質と結合された該タン
パク質を提供すること、および該送達組成物を細胞の細胞膜と接触させて、該カチオン性脂質が該細胞膜と結
合を形成し、そしてそれによって該タンパク質を該細胞へ送達すること、を含む、方法。
【請求項１５】前記送達組成物が、請求項１〜１３のいずれか１項の組成
物である、請求項１４の方法。
【請求項１６】前記送達組成物がさらに核酸を含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】前記核酸が前記タンパク質へ結合されている、請求項１６
の方法。
【請求項１８】前記核酸がＰＮＡを介して前記タンパク質へ結合されてい
る、請求項１６の方法。
【請求項１９】前記送達組成物が、前記タンパク質を封入するカチオン性
リポソームを含む、請求項１４の方法。
【請求項２０】前記送達組成物が、共有結合リンカーを介して前記タンパ
ク質へ結合したカチオン性脂質を含む、請求項１４の方法。
【請求項２１】前記タンパク質が細胞内プロセス（intracellular proces
s）を阻害する、請求項１４の方法。
【請求項２２】前記タンパク質が治療剤である、請求項１４の方法。
【請求項２３】前記タンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請
求項１４の方法。
【請求項２４】治療または予防タンパク質の細胞内送達のための医薬の製
造における、請求項１〜１３のいずれか１項の組成物の使用。