DE69918711T2

DE69918711T2 - Amphiphile polyamin verbindungen

Info

Publication number: DE69918711T2
Application number: DE69918711T
Authority: DE
Inventors: L. Philip FELGNER; Xiang Gao; Jing Ling
Original assignee: Gene Therapy Systems Inc San Diego; Gene Therapy Systems
Current assignee: Gene Therapy Systems Inc San Diego; Gene Therapy Systems
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-11-25
Also published as: AU1828100A; ATE271032T1; CA2352279A1; DE69918711D1; JP2002530364A; US6433017B1; EP1133465A1; EP1133465B1; WO2000031022A1; US6348499B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf kationische Lipide, die nützlich sind in Zufuhrsystemen für synthetische Gene. Sie bezieht sich insbesondere auf amphiphile kationische Lipide mit konjugierten Polyamin-Gruppen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Plasmid-basierte Zufuhrsysteme für nicht-virale Gene stellen einen vielversprechenden Ansatz für die Behandlung von Erb- und Ansteckungskrankheiten und für die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Impfung dar.^1-8 Jedoch sind ihre Wirksamkeiten und klinische Wirkung heute begrenzt wegen niedriger in vitro- und in vivo-Genproduktexpressionsspiegel.^6,9 Die üblicherweise verwendeten Ansätze zur Erhöhung der Expression von synthetischen Gen-Zufuhrsystemen beinhalten entweder eine Verbesserung des DNA-Zufuhrsystems ^3,4,9 oder die Optimierung der DNA-Sequenz entweder auf dem Niveau des Promotors, Enhancers, Introns oder Terminators mit sich.^10-13
DNA-Zufuhrsysteme enthalten kationische Lipide, die fähig sind, den Transport biologisch aktiver Mittel, einschließlich Plasmiden, in die Zelle sowohl in vitro als auch in vivo zu erleichtern, zum Beispiel, wie im US-Patent Nr. 4,897,355 für Eppstein et al. und US-Patent Nr. 5,264,618 für Felgner et al. offanbart. Synthetische Gen-Zufuhrsysteme umfassen auch die Verwendung von kationischen Lipiden auf Cholesterol-Basis. Es wurde gezeigt, dass Lipide, wie DC-Cholesterol, sowohl in vivo- als auch in vitro- Transfektions-Aktivität gezeigt haben^4,14-18 und die ersten kationischen Lipid-Moleküle zur Anwendung in klinischen Versuchen bei der Gentherapie am Menschen waren. Es ist medizinisch und wirtschaftlich wichtig, verbesserte Arten von kationischen Lipiden zu entwickeln, die eine erhöhte Transport- oder Transfektionsfähigkeit aufweisen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die allgemeine Struktur von Verbindungen der XG39-Spezies. X ist eine Acetat- oder Trifluoracetat-Gruppe und sp ist der Alkyl-Spacer zwischen den Amidin enthaltenden Gruppen.
2 zeigt die allgemeine Struktur von Verbindungen der XG40-Gruppe.
Die verschiedenen Felder von 3 vergleichen die in vitro-Transfektionsaktivität der "Alten XG40-Charge" (3A, 3B und 3C) mit derjenigen der "Neuen XG40-Charge" (3D, 3E und 3F) in den Zelltypen B16-F0, COS-7 und BJK-21.
4A und 4B vergleichen die Massenspektralanalysen der "Neuen Charge" (4A)-Verbindungen mit denen der "Alten Charge" (4B)-Verbindungen, auf die in 3 Bezug genommen wird.
5A, 5B und 5C zeigen die Massenspektralanalysen von Verbindungen der Erfindung, wenn sie mit zunehmender Zahl von Trifluoressigsäure-Molekülen konjugiert werden: 5A = TFA1, 5B = TFA2, 5C = TFA3.
Die Felder der 6 zeigen, dass die TFA-Konjugation der neuen XG40-Charge die Transfektionsfähigkeit wiederherstellt, wenn sie in den Zelltypen B16-F0, Cos-7 und BHK-21 getestet werden. Somit beziehen sich die Felder 6A, 6B, 6C und 6D auf Studien, die den B16-F0-Zelltyp verwenden, die Felder 6E, 6F, 6G und 6H beziehen sich auf Studien, die den COS.7-Zelltyp verwenden und die Felder 6I, 6J, 6K und 6L beziehen sich auf Studien, die den BHK-21-Zelltyp verwenden.
Die Felder von 7 vergleichen die Transfektions-Wirksamkeiten einer Reihe an trifluoracetylierten XG40-Derivaten, die zunehmende Mengen von Trifluoracetat enthalten, die mit den primären Amin-Gruppen mit der "Alten Charge" in 8 zusätzlichen Zelltypen konjugiert sind. Somit beziehen sich die Felder 7A, 7B, 7C und 7D auf Studien, die HeLa-S3-Zellen verwenden, die Felder 7E, 7F, 7G und 7H beziehen sich auf Studien, die Jurkat-Zellen verwenden, die Felder 7I, 7J, 7K und 7L beziehen sich auf Studien, die PC12-Zellen verwenden, die Felder 7M, 7N, 7O und 7P beziehen sich auf Studien, die COS.1-Zellen verwenden, die Felder 7Q, 7R, 7S und 7T beziehen sich auf Studien, die NIH-3T3-Zellen verwenden, die Felder 7U, 7V, 7W und 7X beziehen sich auf Studien, die CHO-Zellen verwenden, die Felder 7Y, 7Z, 7AA und 7BB beziehen sich auf Studien, die 293 Zellen verwenden, und die Felder 7CC, 7DD, 7EE und 7FF beziehen sich auf Studien, die CV-1-Zellen verwenden.
8A und 8B vergleichen die Aktivität des trifluoracetylierten XG40-Produkts (8B) mit LipofectAMINE^® (Life Technologies, Inc.) (8A).
Die Felder von 9 stellen ein Mehrschritt-Syntheseschema für die Herstellung von 18-1-lys 5Tε vor. Somit stellt 9A die Schritte 1 und 2 des Schemas vor; 9B stellt Schritt 3 des Schemas vor; und 9C stellt Schritt 4 des Schemas vor.
10 stellt das Synthese-Schema für die Herstellung von 18-1-lys 5Tε-Analoga mit unterschiedlichen Fett-Ketten (10A) und unterschiedlichen Lysin-Gruppen (10B) vor.
11A-11D stellen Prüfungsergebnisse für die Aktivität von N-Arg(Tos)-18-1-HCl auf die Zelltypen NIH-3T3 und HeLa-S3 vor.
12A-12D stellen Prüfungsergebnisse für die Aktivität von (lys-5-18-1;Tfa(2)] auf die Zelltypen NIH-3T3 und HeLa-S3 vor.
13A-13D stellen Prüfungsergebnisse für die Aktivität von [lys-5-18-1-Tfa(1)] + lys-5-18-1-Tfa(2)] auf die Zelltypen NIH-3T3 und HeLa-S3 vor.
14A-14D stellen Prüfungsergebnisse für die Aktivität von [lys-5-18-1-Tos(2)] auf die Zelltypen NIH-3T3 und HeLa-S3 vor.
15A-15F stellen Prüfungsergebnisse für die Aktivität von [XG40-A1] + [XG40-A2] auf die Zelltypen Jurkat und NIH-3T3 vor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
Bestimmte amphipathische Polyamin-Verbindungen wurden als den bekannten kationischen Amphiphilen in ihrer Fähigkeit überlegen befunden, Zellen zu transfizieren und Gene intrazellulär zuzuführen. Die Verbindungen sind gekennzeichnet durch ein Dialkylamin, das durch einen Amid-Linker einer derivatisierten Polyamidin-Kette verbunden ist. Diese Verbindungen haben die allgemeine Struktur (I):
wobei X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Aminschützenden oder Amin-blockierenden Gruppen besteht, das jedes Molekül enthalten kann, das eine Carboxyl- oder Sulfonyl-Gruppe enthält, die in der Lage ist, eine Amid-Bindung mit den zugänglichen Amin-Gruppen der Verbindung zu bilden. Solche X-Gruppen können, müssen aber nicht beschränkt sein auf zum Beispiel Aminosäuren, Tosylat (Tos), Benzyloxycarbonyl (Cbz), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Acetat, und Trifluoracetat-Gruppen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung sind X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:
H;
Tosylat (Tos);
Benzyloxycarbonyl (Cbz);
t-Butyloxycarbonyl (Boc);
H₃C-HC(=O); und
F₃C-HC(=O);
wobei
r eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist;
n eine ganze Zahl von 7 bis 21 ist; und
jedes t jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel haben die amphipathischen Polyamine der Erfindung die Struktur (II):
wobei X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:
H;
Tosylat (Tos);
Benzyloxycarbonyl (Cbz);
t-Butyloxycarbonyl (Boc);
H₃C-HC(=O); und
F₃C-HC(=O);
wobei
jedes t jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist;
r eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; und
n eine ganze Zahl von 7 bis 21 ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen umfasst die Polyamidin-Kette Lysin-Reste, wobei r 3 ist; t 4 ist, und n 17 ist. In abweichenden bevorzugten Ausführungsbeispielen haben Fettsäuren der Dialkyl-Kette dieser Verbindungen die Formel -N-((CH₂)_n-CH₃)₂, wobei n eine ganze Zahl von 7 bis 21 ist, und 1 bis 6 Doppelverbindungen enthalten kann. Die Verbindungen können X-Gruppen in beliebiger Kombination von Amin-schützenden oder Amin-blockierenden Gruppen enthalten. In einem bevorzugtesten Ausführungsbeispiel können die Verbindungen X-Gruppen in beliebiger Kombination von Tosylat und Trifluoracetat-Konjugatarten und in jeder beliebigen Kombination an X-Positionen enthalten. Zum Beispiel sind X₁, X₃ und X₆ Fluoracetat, oder X₁ ist Tosylat, X₂ ist Fluoracetat, X₅ ist Tosylat.
Beispiele einer bevorzugten Lysin-3-Art (XG39) sind in 1 dargestellt, und eine bevorzugte Lysin-5-Art (XG40) ist in 2 dargestellt.
Transfektionsformulierungen
Die Verbindungen der Erfindung können verwendet werden, um Polynukleotide und Peptide in Zellen zu transfizieren. Transfektionsformulierungen enthalten neuartige kationische Lipide der Erfindung, die die hier bekannt gegebene Struktur haben, wahlweise zusammen mit einer wirkungsvollen, die Transfektion fördernden Menge anderer neutraler Co-Lipide formuliert. Es hat sich herausgestellt, dass verbesserte Transfektionsformulierungen amphipathische Lipide umfassen, die eine polare Kopfgruppe und aliphatische Komponenten haben, die imstande sind, die Transfektion zu fördern, während sie die Fähigkeit der Lipid-Vesikel, angeordnet von der Formulierung, erhalten, das Verschmelzen mit Zellmembranen zu erreichen. Geeignete Co-Lipide umfassen, aber sind nicht begrenzt auf Lysophosphatid, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Cholesterol-Derivate, Fettsäuren, Mono-, Di- und Triglycerid-Phospholipide, die eine neutrale, negativ, oder positiv geladene Kopfgruppe haben. Phospholipide, die eine neutrale Kopfgruppe haben, werden bevorzugt. Andere geeignete Einzelketten-Lysolipide umfassen den Rosenthal-Inhibitor Ester und Ether-Derivate, wie im US-Patent Nr. 5,264,618 für Felgner et al. und US-Patent Nr. 5,459,127 für Felgner et al. offenbart.
Die kationischen Lipidansätze können sich allein, oder wenn sie zumindest ein amphipathisches Lipid enthalten, spontan verbinden, um in der Größe heterogene Primär-Liposome zu bilden. Daher können die Lipid-Reagenzien der Erfindung als Liposome dargestellt werden. Verfahren zur Darstellung von Liposomen für Transfektionsformulierungen werden in den oben zitierten '618 und '127 Patenten an Felgner et al., offenbart und beispielhaft belegt. Andere Verfahren zur Liposom-Formation werden in Felgner, P.L. et al., Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7417 (1987) offenbart.
Screening-Verfahren
Diese hochpotenten Transfektionsmittel der Erfindung wurden während des Screenings von 13 neuartigen amphipathischen kationischen Lipiden entdeckt, die aus einer größeren Bibliothek von 144 Verbindungen entnommen wurden. Auf der Basis von vorläufigen Screening-Ergebnissen der Transfektionsfähigkeit wurde eine hochaktive Verbindung, die Verbindung XG40, entdeckt und für die weitere Untersuchung ausgewählt. Eine größere Charge der Verbindung wurde synthetisiert. Überraschenderweise war eine größere synthetische Charge des vorhergesagten Produkts "Neue Charge" während der Transfektionstests weit weniger aktiv als das Ausgangsmaterial "Ausgangscharge", als die Transfektionsaktivitäten der beiden Chargen in drei verschiedenen Zelltypen verglichen wurden (vgl. 3A, 3B und 3C mit. 3D, 3E bzw. 3F).
Analyse mittels Massenspektroskopie
Um die Quelle dieses Unterschiedes zu bestimmen, wurden die Chargen mittels Massenspektometrie analysiert. Diese Analyse zeigte, dass die zwei Chargen sich chemisch unterschieden (vgl. 4A und 4B). Die "Neue Charge" ergab ein Spektrum, das ein molekulares Ion bei 1220 zeigt, passend zu dem errechneten Molekulargewicht der vorhergesagten XG40-Verbindung. Jedoch war in der "Ausgangscharge" der 1220-Peak lediglich eine geringere Komponente, und es gab eine Anzahl von molekularen Ionen mit höherer Masse. Diese Arten mit höherem Molekulargewicht (Peaks 1316, 1412, 1508) waren um ein Vielfaches von 96 größer als der 1220-Peak. Dies veranlasste uns zu bedenken, wie die ursprüngliche Synthese zu einer Familie von Verbindungen hat führen können, die um ein Vielfaches von 96 größer waren als die vorhergesagte Verbindung.
Trifluoressigsäure (TFA) wird beim letzten Schritt verwendet, der zur Synthese von XG40 führt. Falls TFA mit den primären Aminogruppen in der polaren Kopfgruppe reagiert hätte, um TFA-Amide zu bilden, wären die daraus resultierenden Derivate um ein Vielfaches von 96 größer als die Eltern-Verbindung. (Das Molekulargewicht von TFA ist 114. Amidbilden ist eine Dehydrationsreaktion, die zur Entfernung von Wasser führt, das ein Molekulargewicht von 18 hat. Somit ist 1220 + n(114-18) = 1220 + 96n, wobei n der Anzahl von TFA-Amiden entspricht, die mit den zugänglichen primären Aminen konjugiert sind.) Dieses Argument legte nahe, dass die Ausgangscharge von XG40 eine Verbindung von Verbindungen sein könnte, die eine unterschiedliche Anzahl von Trifluoroessigsäureamiden enthalten, die mit den primären Aminogruppen in der polaren Kopfgruppe konjugiert sind, und dass die Addition dieser TFA-Einheiten für das verbesserte Transfektionsvermögen verantwortlich sein könnte.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Teile der neuen Charge absichtlich in das TFA-konjugierte Produkt umgewandelt, indem Reaktionen der reinen XG40-Verbindung mit steigenden Verhältnissen von Trifluoressigsäure herbeigeführt wurden und Massespektralanalysen an den Produkten entsprechend Beispiel 3 durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in 5A, 5B und 5C gezeigt. Diese Studien zeigten, dass die absichtliche Trifluoracetylierung der zweiten synthetischen Charge die Zusammensetzung der neuen Charge in die des Ausgangsproduktes umkehren konnte.
Der nächste Schritt war, zu bestimmen, ob die TFA-Konjugationschemie die Transfektionsaktivität aktivieren könnte und die Potenz der neuen Charge bis zum Stand der Original-Charge wiederherstellen könnte. Bis dahin wurde das in Beispiel 4 beschriebene Experiment durchgeführt. Absichtliche TFA-Konjugation der Neuen XG40-Charge stellte die Aktivität des Materials bis zum Niveau der Alten XG40-Charge in allen dreien der untersuchten Zelltypen wieder her, d.h., B16-F0 (siehe 6A, 6B und 6C), COS-7 (siehe 6D, 6E und 6F) und BHK-21 (siehe 6G, 6H und 6I). Die Transfektionsaktivitäten der TFA-konjugierten Produkte wurden mit der Alten XG40-Charge in 8 zusätzlichen Zelltypen verglichen (siehe alle Felder von 7). In HeLa-S3- (siehe 7A, 7B, 7C und 7D), Jurkat- (siehe 7E, 7F, 7G und 7H), PC 12- (siehe 7I, 7J, 7K und 7L) und COS.1-Zellen (siehe 7M, 7N, 7O und 7P), waren die neu konjugierten Produkte (entweder die T1- oder T2- Formen) ein wenig aktiver als die Alte XG40-Charge. In NIH-3T3- (siehe 7Q, 7R, 7S und 7T), CHO- (siehe 7U, 7V, 7W und 7X), 293- (siehe 7Y, 7Z, 7AA und 7BB) und CV1-Zellen (siehe 7CC, 7DD, 7EE und 7FF) gab es keinen offensichtlichen Unterschied in der Potenz zwischen Alter XG40-Charge und den T1- oder T2-Konjugaten. In 8 von den 11 untersuchten Zelltypen war die Aktivität des T3-Konjugats im Verhältnis zu den T1- oder T2- Konjugaten vermindert. Dieses Ergebnis zeigte, dass eine Über-Konjugation des XG40 nicht günstig ist für eine optimale Transfektionsaktivität. Alles in allem zeigten diese Resultate, dass die TFA-Konjugationschemie die Transfektionspotenz von reinem XG40 bis zur Potenz der Ausgangscharge und darüber hinaus wiederherstellen könnte. Die Schlussfolgerungen aus diesen Studien sind, dass die T1- und T2-TFA-Konjugate gleich oder besser als die Ausgangscharge sind und dass die T3-TFA-Konjugate allgemein weniger aktiv sind als sowohl T1- als auch T2-Derivate.
Die von dieser Konjugationschemie abgeleiteten Verbindungen haben eine viel größere in vitro-Transfektionsaktivität als LipofectAMINE^® (vgl. 8A und 8B), das eines der aktivsten auf dem Markt erhältlichen Transfektionsreagenzien ist.
Synthetische Methoden
Verbindungen der Formel (I) oder (II) können hergestellt werden, indem das im Synthese-Schema gezeigte Vorgehen angepasst wird, worin eine Verbindung, die ein 18:0- Fettsäurekettenpaar und 3 bis 5 Lysin-Gruppen enthält, zubereitet wird (siehe 9 and 10). Ein Dialkyl oder Dialkenylamin wird mit einem N-Alkylamin konjugiert, und diprotektionierte Lysin-Gruppen werden durch Amidbindungen daran gekoppelt und anschließend deprotektioniert. Eine spezifische Synthese der Verbindung XG40 wird in Beispiel 1 beschrieben. Acetat- oder Trifluoracetat-Gruppen werden mit den deprotektionierten primären Aminogruppen in der polaren Kopfgruppe konjugiert, indem das gereinigte Produkt von Beispiel 1 mit Essigsäure oder Trifluoressigsäure (Beispiel 2) zur Reaktion gebracht wird. Das Konjugationsausmaß wird vom molaren Verhältnis der Reagenzien bestimmt und mittels Massenspektralanalyse verifiziert.
Bestimmung der in vitro-Transfektionsaktivität

Das Transfektionsvermögen der Verbindungen der Erfindung wurde unter Anwendung des folgenden Protokolls und der folgenden Zellkultur-Systeme bestimmt.

Zell-Linien	Hoch-transfizierte adhärente Zell-Linie: COS 1 oder B16-FO Niedrig-transfizierte adhärente Zell-Linie: CV-1 oder HeLa Suspensionszelle: Jurkat
Kultur-Medium	OPTI-MEM^® I(Gibco, BRL) mit und ohne FBS
DNA	pCMV-int-LacZ
Lipide	Formulierte +/- DOPE^® und DMRIE^® (Vical Incorporated, San Diego, CA): DOPE^® wurde in jeder Transfektion als eine Referenz benutzt. Multilamellare Liposomen (MLV) wurden in Wasser zubereitet.
Puffer	1) Lyse-Puffer: 250mM Tris, 0,1% Triton (v/v), pH 8 2) 50% Glycerol/50% Wasser, um β-gal-Standard-Stammlösung (0,8 mg/ml) zu resuspendieren 3) β-Galactosidase-Puffer (1000 ml): – 60 mM Na₂HPO₄, pH 8 (8,52 g) – 1 mM MgSO₄ (120 mg) – 10 mM KCl (745 mg) – 50 mM β2-Mercaptoethanol (3,5 ml 14,3 M Vorratslösung, d =1,114 g/ml) 4) PBS mit 0,5% BSA (PBS 1x ohne Calcium und Magnesium-Salze, Irvine Scientific Cat. #9240)
Substrat	CPRG (Boehringer, Cat. #884308, 250 mg/Flasche) β-Galactosidase-Standard gereinigt, aus E. coli (Sigma, Cat. #G5635, 2 mg/Glasfläschchen).

1. Lipid-Reagens-Zubereitung und -Verdünnung:

A. Rekonstituiere jede Lipid-Probe und Referenzglasfläschchen mit ausreichend sterilem Wasser, um eine Lösung herzustellen, die 0,672 mM für jedes Lipid in der Verbindung beträgt. Verwirble jedes Glasfläschchen 1 Minute lang.
B. Führe zweifache Reihenverdünnungen von Lipid-Reagens säulenweise auf einer 96-Well-Platte mit abgerundeten Boden mit 12 Säulen (bezeichnet mit 1 bis 12) und 8 Reihen (bezeichnet mit A bis H) durch. (1) Verteile 120 μl OPTI-MEM^® I je Vertiefung in den Säulen 11 und 12. Füge 60 μl OPTI-MEM^® je Verteifung in den Säulen 1 bis 10 hinzu. (2) Verteile 60 μl 0,672 mM kationisches Lipid-Reagens in die Vertiefungen von Säule 1 und die Vertiefung 10A. (3) Führe zweifache Reihenverdünnungen von Säule 1 bis Säule 8 säulenweise mittels Überführen von 60 μl mit einer Mehrkanal-Pipette durch. (4) Führe zweifache Reihenverdünnungen in Säule 10 reihenweise mit seriellem Überführen von 60 μl von Reihe A bis H durch.

2. DNA-Herstellung und -Verdünnung:

A. Stelle eine genügende Menge von 0,08 mg/ml Lösung des pCMV-int-lacZ in OPTI-MEM^© I her (675 μl werden je Platte benötigt).
B. Führe zweifache Reihenverdünnungen von DNA auf einer 96-Well Platte mit rundem Boden reihenweise durch. (1) Verteile 75 μl des OPTI-MEM^® I je Vertiefung in den Säulen 1 bis 10. (2) Verteile in die Vertiefungen der Reihen A, 1 bis 9, 75 μl 0,08 mg/ml DNA-Lösung. (3) Führe zweifache Reihenverdünnungen reihenweise in den Säulen 1 bis 9 von Reihe A bis Reihe N durch Überführen von 75 μl mit einer Mehrkanal-Pipette durch.

3. Lipid- und DNA-Komplexbildung:

A. Übertrage für jede Vertiefung 60 μl der Lösung von der DNA-Verdünnungsplatte zu der Lipid- Verdünnungsplatte auf der entsprechenden Vertiefungsposition ein. Beginne bei Säule 10 bis Säule 1.
B. Vermische vorsichtig durch Antippen der Platte. Verwende die Lipid/DNA-Mischung zur Zelltransfektion zwischen 15 und 60 Minuten nach der Komplexierung.

4. Transfektion:

– Entferne das Zellkulturmedium von den 96-Well-Platten, die Zellen enthalten.
– Übertrage 100 μl der Verbindungen auf die Zellen.
– Inkubiere 4 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator.
– Vier Stunden nach der Transfektion: füge 50 μl des OPTI-MEM^® I (in 30% FBS) je Vertiefung hinzu.

Experimentelles Vorgehen
Die Zubereitung der Mischungen der vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung der folgenden Beispiele detailliert beschrieben, jedoch werden die Reaktionen und Verfahren in Begriffen ihrer allgemeinen Anwendbarkeit für die Herstellung und Beurteilungen der Verbindungen der Erfindung offenbart. Gelegentlich kann das Verfahren nicht wie beschrieben für jede Verbindung, die im offenbarten Umfang der Erfindung enthalten ist, anwendbar sein. Die Verbindungen, bei denen dies eintritt, werden von Sachkundigen schnell erkannt werden. In allen solchen Fällen kann entweder die Reaktion erfolgreich mit üblichen Änderungen, die Sachkundigen bekannt sind, durchgeführt werden, das heißt, durch angemessenen Schutz vor störenden Gruppen, durch den Wechsel zu alternativen herkömmlichen Reagenzien, oder durch routinemäßige Abwandlungen der Reaktionsbedingungen. Alternativ werden andere hier offenbarte oder anderweitig herkömmliche Reaktionen für die Zubereitung der entsprechenden Verbindungen der Erfindung anwendbar sein. In allen Zubereitungsmethoden sind alle Ausgangsmaterialen bekannt oder bereits in bekannten Ausgangsmaterialien zubereitet; alle Temperaturen sind in Celsius-Graden angegeben; und, wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile und Potenzsätze solche in Gewicht.
Strukturdefinition
BEISPIEL
Synthese von 18-1-Lys-S Tε (XG40)
XG40 wird entsprechend dem Synthese-Schema synthetisiert, das in 10 gezeigt ist. Dieses Schema führt zur Synthese von 5 Gramm des Produkts. Diese Synthese kann zweimal ausgeführt werden, um die 10 Gramm des Produkts herzustellen, die für die gesamte Analyse benötigt werden.
Schritt 1: Zu einer Lösung, die 10,4 Gramm (20 mmol) Dioctadecylamin in 100 ml CH₂Cl₂: Methanol (1:1) enthält, werden 50 ml Acrylnitril hinzugefügt. Die Verbindung wird kurz auf 60°C erhitzt und 12 Stunden lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Lösungsmittel und der Überschuss an Acrylnitril werden mittels eines Rotationsverdampfers entfernt, gefolgt von Hochvakuum folgt. Der Feststoff wird in Hexan aufgelöst und einer Normalphasen-Silicagel-Chromatographiereinigung unterzogen. Das resultierende N-Propyinitril-N-dioctadecyiamin wird in 100 ml Dioxan aufgelöst und auf 4°C abgekühlt und anschließend unter Verwendung von LiAlH₄ auf N-Propylamin-dioctadecylamin (18-1) reduziert. Der Überschuss wird mit verdünnter NaOH neutralisiert. Die organische Phase wird gefiltert, mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit Wasser gewaschen. Eine hohe Ausbeute von 18-1 als weißer Feststoff wird zurückgewonnen und mit Na₂SO₄-Verdampfungen luftgetrocknet, die Löaungsmittel werden verdampft und es wird im Hochvakuum getrocknet. Das resultierende 18-1 wird im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
Schritt 2: Zu einer Lösung von 18-1, die Triethylamin (TEA) im Verhältnis 1:1 enthält, wird di-Boc-Lysin-NHS Ester dem Amin im Verhältnis 1:2:1 hinzugefügt. Nach einer Reaktion von 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das resultierende di-Boc-Lysinamid von 18-1 unter Verwendung von Silicagel gereinigt werden. Die Freisetzung des di-Boc-Lysinamids mit TFA/CH₂Cl₂ wird 18-1-lys-1 ergeben. Nach der Routine-Aufarbeitung und Entfernen des Lösungsmittles wird das 18-1-Lysinamin in Hochausbeute entstehen und mit einer hohen Ausbeute erzeugt und in der nächsten Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
Schritt 3: Zu einer Lösung von 18-1-Lysin-1 in CH₂Cl₂ mit TEA, wird α-CBZ-ε-Boc-Lysin, das vorher mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxylsuccinamid (NHS) aktiviert wurde, zu dem Lysinamid in einem Verhältnis von 2:4:1 hinzugefügt. Die Reaktion wird mit Ninhydrin-Reaktion⁴⁰ bis zu ihrer Vollendung überwacht. Das resultiernde Bis-(Z-Boc-lysyl)-lysinamid wird nach der Aufarbeitung mit Silicagel gereinigt. Die Boc-Gruppe wird entfernt und das Bis-Zlys3-18-1 wird für die nächste Reaktion verwendet.
Schritt 4: B ist Z-Boc-lysyl (Bis(Z)Lys-3-18-1) und wird ähnlich wie Schritt 3 gewonnen und mit Silica-Gel ähnlich wie Z-Boc-lysyl-lysinamid gereinigt. Die Deprotektionierung des Zwischenproduktes mit TFA/CH₂Cl₂ entfernt die Boc-Gruppen. Die weitere Deprotektionierung mit Pd/H2 in EtOH führt zu dem Endprodukt 18-1-lys5Tε. Das Endprodukt wird mittels einer Ionenaustausch-Methode in das Chlorid-Salz oder Methansulfat-Salz umgewandelt.
BEISPIEL 2
Synthese von trifluoracetylierten Derivaten von 18-1-Lys-5Tε
Trifluoracetylierte Derivate von XG40 wurden zufällig wie folgt synthetisiert:
Der N-Hydroxysuccinamid-Ester von Trifluoressigsäure wurde aus TFA, N-Hydroxysuccinamid und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Dimethylformamid (DMF) in einem molaren Verhältnis von 1:1,1:1,1 zubereitet, für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und danach gefiltert, um Dicyclohexyl-Harnstoff zu entfernen. Ein Gramm XG40 wird in 10 ml trockenem Methanol aufgelöst und ein 10 molarer Überschuss an Triethylamin (TEA) wird hinzugefügt. Das aktivierte TFA wird dem XG40 in einem angemessenen molaren Verhältnis hinzugefügt, um den gewünschten Grad an Trifluoracetylierung zu erzielen, und die Verbindung wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum verdampft, wieder gelöst in 5 ml Methanol und bei -70° C mit 200 ml Ether ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, und der Vorgang wird einmal wiederholt. Das Produkt wird in 5 ml trockenem Methanol aufgelöst und in die Methansulfosäure (Mes)-Salzform durch Reaktion mit 2 molarem Überschuss von Mes zu den Aminogruppen umgewandelt. Der Überschuss an Mes wird durch wiederholte Ether-Fällung entfernt. Das Endprodukt wird unter Vakuum als weißes Pulver getrocknet.
BEISPIEL 3
Massenspektralanalyse von TFA-konjugierten Amphiphilen
Die Elektrospraymassenspektrometrie-Experimente wurden auf einem Hewlett-Packard 1100 MSD Elektrospray-Massenspektrometer durchgeführt. Elektrosprayproben wurden mit einer Rate von 12,0 ml/Minute in das Analysegerät gegeben. Die positiven und negativen Ionen, die durch den Ionen-Verdampfungsvorgang erzeugt wurden, traten durch eine Grenzflächenplatte mit einer 100 Mikron-Öffnung in das Analysegerät ein, während das Entclusterungspotential zwischen 50 und 200V gehalten wurde, um die Kollisionsenergie der eintretenden Ionen zu steuern.
Teile einer Charge von synthetisierten Amphiphilen wurden gezielt durch Reaktion der reinen XG40-Verbindung mit ansteigenden Konzentrationen von TFA in das TFA-konjugierte Produkt umgewandelt. Die in den 5A, 5B and 5C dargestellten Massenspektralanalysen ergaben, dass die Produkte dieser Synthesen ähnlich dem Material waren, das in der Ausgangscharge (4B) vorhanden war. Da die Menge von TFA in der Reaktion erhöht wurde, wurde das Ion mit dem Molekulargewicht 1220 schrittweise vermindert, und Familien von Verbindungen mit Molekulargewichten von 1220 + 96n wurden erzeugt. Das molekulare Ionen-Verteilungsmuster das erhalten wurde, wenn entweder 1 oder 2 Mol TFA je Mol XG40 (5A, 5B) zur Reaktion gebracht wurden, ähnelte dem Muster, das in der Ausgangscharge erlangt wurde. Wenn 3 Mol TFA je Mol XG40 (5C) zur Reaktion gebracht wurden, wurde die Verteilung der TFA-Konjugate zu einem signifikant höheren Molekulargewichtsmuster verschoben, als in der Ausgangscharge erhalten wurde. Das in 5C gezeigte Produkt war eine Verbindung von fünf Arten mit Molekulargewichten von 1220, 1316, 1412, 1508 und 1604, entsprechend 0, 1, 2, 3 oder 4 TFA-Amiden, die mit den 6 zugänglichen primären Aminogruppen in der polaren Kopfgruppe konjugiert wurden.
BEISPIEL 4
In vitro-Transfektionsaktivität von TFA-konjugierten Lysin-3- und Lysin-5-Amphiphil-Derivaten
Ein Satz an 13 kationischen Amphiphilen wurde synthetisiert und für in vitro-Transfektionsaktivitäten durchsucht, unter Verwendung des oben beschriebenen sensitiven, quantitativen in vitro-Tests, der in unserem Labor entwickelt wurde. In B16 Mäuse-Melanom- Zellen, wurden die Lysin-3-(XG39) und Lysin-5-(XG40) Derivate als am aktivsten befunden. XG39 und XG40 wurden weiter in zwei unterschiedlichen Zelltypen verglichen. XG40 war aktiver in COS 7-Zellen, und erheblich aktiver in BHK-21-Zellen.
Die Transfektionsaktivität alter XG40 in BHK-21-Zellen wurde verglichen mit LipofectAMINE^®. LipofectAMINE^® wurde für diesen Vergleich ausgewählt, weil es eines der potentesten im Handel erhältlichen Transfektions-Reagenzien ist. Die Daten in 8A und 8B zeigen, dass altes XG40 erheblich aktiver war als LipofectAMINE^®. Dieses Ergebnis zeigt, dass altes XG40 möglicherweise das aktivste bisher beschriebene Transfektions-Reagens seiner Art ist.
BEISPIEL 5
Synthese von N-Arg(Tos)-18-1•HCl
Zu einem 100 ml-Glaskolben mit abgerundetem Boden, der eine Lösung von 18-1 (579 mg, 1 mmol, zubereitet, wie in Beispiel 1, Schritt 1, beschrieben) in 10 ml CH₂Cl₂ enthielt, wurden hinzugefügt: Boc-Arg(Tos)-OH (428,5 mg, 1 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (HOBt, 135,1 mg, 1 mmol), bzw. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC, 191,7 mg, 1 mmol). Die sich ergebende Verbindung wurde bei Raumtemperatur einige Stunden lang gerührt. Wenn kein 18-1 mehr durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) nachgewiesen wurde, wurde die Reaktion angehalten. Nach einer Schnell-Chromatographie über Silicagel wurde Boc-Arg(Tos)-18-1 als farbloser Feststoff gewonnen. Das so gewonnene Boc-Arg(Tos)-18-1 wurde dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur der Behandlung mit HCl/Ether unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde unter Rotationsverdampfung bis zur Trockenheit konzentriert, um die Titel-Verbindung als HCl-Salz einzubringen.
BEISPIEL 6
Testergebnisse von H-Arg(Tos)-18-1•HCl
Testsergebnisse der Beurteilung von H-Arg(Tos)-18-1-HCl (in NIH-3T3- und HeLa-S3-Zellen) sind in 11A-11D dargestellt.
BEISPIEL 7
Synthese eines di-trifluoracetylierten Derivates von XG40 [Lys-5-18-1-Tfa(2)]
Ähnlich der Herstellung von Bis-Z-Lys-3-18-1, wie in Beispiel 1, Schritt 3 beschrieben, wurde Bis-Boc-Lys-3-18-1 aus der Reaktion von 18-1-Lysin-1 mit 2 Äquivalenten von Boc-Lys(Z)-OH in Anwesenheit von DCC und NHS als aktivierende Mittel hergestellt, und die Z-Gruppe des Kopplungsreaktionsprodukts wurde unter Hydrierungsbedingung und unter Verwendung eines Pd/C-Katalysators entfernt. Das so produzierte Bis-Boc-Lys-3-8-1 reagierte mit 2 Äquivalenten des Boc-Lys(Tfa)-NHS bei Raumtemperatur in CH₂Cl₂, um tetrakis-Boc-Lys-5-18-1-Tfa(2) zu ergeben, das durch Schnell-Chromatographie über Silicagel gereinigt wurde. Die Boc-Gruppen des Tetrakis-Boc-Lys-5-18-1-Tfa(2) wurden durch Methansulfosäure/CH₂Cl₂ entfernt. Das entstandene Lys-5-18-1-Tfa(2)•Mes-Salz wurde dreimal bei Raumtemperatur mit Ether gewaschen, unter Vakuum getrocknet und als weißer Feststoff gewonnen.
BEISPIEL 8
Testergebnisse von [Lys-5-18-1-Tfa(2)]
Testergebnisse zur Beurteilung von [Lys-5-18-1-Tfa(2)) (in NIH-3T3- und HeLa-53-Zellen) sind in 12A-12D dargestellt.
BEISPIEL 9
Synthese einer Verbindung eines mono- und di-trifluoracetylierten Derivates von XG40 [Lys-5-18-1-Tfa(1)]+[Lys-5-18-1-Tfa(2)]
Tetrakis-Boc-Lys-5-18-1-Tfa(2) (zubereitet wie in BEISPIEL 7 beschrieben) wurde 14 Stunden lang mit Methansulfonsäure in Methanol bei Raumtemperatur behandelt, und die Massenspektren zeigten, dass das Reaktionsprodukt eine Verbindung von Lys-5-18-1-Tfa(1)+Lys-5-18-1-Tfa(2) war. Die Verbindung wurde bei Raumtemperatur dreimal mit Ether gewaschen, unter Vakuum getrocknet und als weißer Feststoff in Form von Mes-Salzen gewonnen.
BEISPIEL 10
Testergebnisse von [Lys-5-18-1-Tfa(1)]+[Lys-5-18-1-Tfa(2)]
Testergebnisse zur Beurteilung einer Verbindung von [Lys-5-18-1-Tfa(1)] und [Lys-5-18-1-Tfa(2)] (in NIH-3T3- und HeLa-S3-Zellen) sind in 13A-13D dargestellt.
BEISPIEL 11
Synthese eines di-tosylierten Derivates von XG40 [Lys-5-18-1-Tos(2)]
Ein Äquivalent von 18-1-Lysin-1 reagierte mit 2 Äquivalenten von Boc-Lys(Z)-OH in Anwesenheit von DCC und NHS als aktivierende Mittel, um ein Kopplungsreaktionsprodukt zu bilden. Die Z-Gruppe des Kopplungsreaktionsproduktes wurde unter Hydrierungsbedingung und unter Verwendung eines Pd/C-Katalysators entfernt. Das so hergestellte Bis-Boc-Lys-3-18-1 reagierte mit 2 Äquivalenten von Boc-Lys(Tos)-NHS bei Raumtemperatur in CH₂Cl₂, um Tetrakis-Boc-Lys-5-18-1-Tos(2) zu ergeben, das mittels Schnell-Chromatographie über Silicagel gereinigt wurde. Die Boc-Gruppen des Tetrakis-Boc-Lys-5-18-1-TOS(2) wurden mittels Methansulfonsäure/CH₂Cl₂ entfernt. Das resultierende Lys-5-18-1-Tos(2)•Mes-Salz wurde dreimal mit Ether bei Raumtemperatur gewaschen, unter Vakuum getrocknet und als weißer Feststoff gewonnen.
BEISPIEL 12
Testergebnisse von [Lys-5-18-1-Tos(2)]
Testergebnisse zur Beurteilung von [Lys-5-18-1-Tos(2)] (in NIH-3T3- und HeLa-S3-Zellen) sind in 14A-14D dargestellt.
BEISPIEL 13
Synthese von acetylierten Derivaten von XG40 [XG40-A1]+[XG40-A2]
Die Synthese der acetylierten Derivate von XG40 ist identisch mit jener der trifluoracetylierten Derivate von XG40, wie in BEISPIEL 2 beschrieben, mit Ausnahme, dass Essigsäure durch Trifluoessigsäure ersetzt wird. XG40-A1 und XG40-A2 beziehen sich jeweils auf die Produkte, wenn ein und zwei Äquivalente aktivierte Essigsäure verwendet werden.
BEISPIEL 14
Testergebnisse von [XG40-A1]+[XG40-A2]
Testergebnisse zur Beurteilung einer Mischung aus [XG40-A1] und [XG40-A2] (in Jurkat- und NIH-3T3-Zellen) sind in 15A-15F dargestellt.
Literaturverzeichnis:

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Claims

Amphiphile Polyamin-Verbindung mit der Formel
wobei X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und Aminschutzgruppen, beinhaltend eine Carboxyl- oder Sulfonylgruppe und geeignet, eine Amidbindung zu bilden; r eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; n eine ganze Zahl von 7 bis 21 ist; und t₁, t₂, t₃ und t₄ jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, Tosylat (Tos); Benzyloxycarbonyl (Cbz); t-Butyloxycarbonyl (Boc); H₃C-HC(=O); und F₃C-HC(=O); r eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; n eine ganze Zahl von 7 bis 21 ist; und t₁, t₂, t₃ und t₄ jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
Amphiphile Polyamidin-Verbindung nach Anspruch 1, mit der Formel
wobei X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ unabhängig jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H; Tosylat (Tos), Benzyloxycarbonyl (Cbz), t-Butyloxycarbonyl (Boc); H₃C-HC(=O); und F₃C-HC(=O); r eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; n eine ganze Zahl von 7 bis 21 ist; und t₁, t₂, t₃, t₄, t₅ und t₆ unabhängig jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
Verbindung nach Anspruch 2, mit einer Lysin-Polyamidinkette, wobei r gleich 3 ist, n gleich 17 ist; und t₁, t₂, t₃, t₄, t₅ und t₆ jeweils 4 ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Dialkylgruppe mit der Formel --N-((CH₂)_n-CH₃)₂ Alkenylketten mit 1 bis 6 Doppelbindungen enthält.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Struktur
Transfektionsformulierung mit einer amphiphilen Polyamidin-Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 zusammen mit einem Colipid.
Formulierung nach Anspruch 7, wobei das Colipid ein Phospholipid mit einer neutralen Hauptgruppe ist.
Formulierung nach Anspruch 7, beinhaltend einen Rosenthal-Inhibitor-Ester oder -Etherderivativ als ein Colipid.