CN117861627A - 钾离子微球、质粒提取试剂和应用 - Google Patents

钾离子微球、质粒提取试剂和应用 Download PDF

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CN117861627A CN202410010952.5A CN202410010952A CN117861627A CN 117861627 A CN117861627 A CN 117861627A CN 202410010952 A CN202410010952 A CN 202410010952A CN 117861627 A CN117861627 A CN 117861627A
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肖晓文
喻春函
曹文刚
宋辉
周俊豪
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Hubei Qingke Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请涉及一种钾离子微球，包括微球核，微球核表面修饰有不溶于水的钾离子层，微球核的密度为2.2～2.66g/cm3。本申请创造性地选择密度在2.2～2.66g/cm3微球表面修饰不溶于水的钾离子层，能够使钾离子微球和菌体裂解液在离心作用下快速分离，同时，微球表面的不溶于水的钾离子层可实现吸附大量的细胞裂解杂质，从而在缩短质粒提取时间的同时提高质粒纯化效果。

Description

钾离子微球、质粒提取试剂和应用
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种钾离子微球、质粒提取试剂和应用。
背景技术
质粒是存在于细菌等生物中的可独立复制的DNA分子，可与细菌共生，并可随宿主的分裂而传给子代细胞，其在基因工程中具有广泛的应用，如用于构建表达载体，可实现目的基因转移、蛋白表达和疫苗制备等。
为了获得大量高纯度的质粒，传统方法采用以下方式，例如碱裂解法、煮沸法、CsCl-EB密度梯度平衡离心法等进行质粒提取。目前采用较多的方法是碱裂解法，碱裂解法操作简单，质粒提取效率高，而且涉及到的试剂成本较低。但碱裂解法涉及多次离心，其中分离裂解杂质的离心时间较长，延长了整个方法的处理周期。
如何缩短碱裂解法的处理周期是优化质粒提取流程的难点。
发明内容
为了解决上述问题，本申请的第一目的在于提供一种钾离子微球，包括微球核，微球核表面修饰有不溶于水的钾离子层，微球核的密度为2.2～2.66g/cm3。
本申请创造性地选择在密度为2.2～2.66g/cm3微球表面修饰不溶于水的钾离子层，能够使钾离子微球和菌体裂解液在离心作用下快速分离，同时，微球表面的不溶于水的钾离子层可实现吸附大量的细胞裂解杂质，从而在缩短质粒提取时间的同时提高质粒纯化效果。
在其中一个实施方式中，钾离子微球满足以下特征(1)～(3)中的至少一个：
(1)微球核的粒径为0.5μm～2μm；
(2)微球核表面修饰有聚合物层，聚合物层表面结合有不溶于水的钾离子；可选地，聚合物层包括磺酸基聚合物，磺酸基聚合物结合有钾离子；
(3)微球核的组成成分为二氧化硅，钾离子微球的制备方法包括：
通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰聚合物层，制备聚合物层修饰的二氧化硅微球；
将聚合物层修饰的二氧化硅微球和可溶性钾盐混合在二氧化硅微球表面形成不溶于水的钾离子层，以制备钾离子微球。
本申请的第二目的在于提供一种钾离子微球的制备方法，制备方法包括：
在微球表面修饰不溶于水的钾离子层以制备钾离子微球，微球的密度为2.2～2.66g/cm3。
在其中一个实施方式中，在微球表面修饰不溶于水的钾离子层以制备钾离子微球具体包括：
通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰聚合物层修饰聚合物层，制备聚合物层修饰的二氧化硅微球；
将聚合物层修饰的二氧化硅微球和可溶性钾盐混合在二氧化硅微球表面形成不溶于水的钾离子层，以制备钾离子微球；
可选地，通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面制备聚合物层修饰的二氧化硅微球具体包括：
将硅烷偶联剂修饰的二氧化硅微球和钾离子结合单体、聚合物单体、交联剂和引发剂混合，通过聚合反应制备聚合物层修饰的微球；
可选地，二氧化硅微球的粒径为0.5μm～2μm；
可选地，钾离子结合单体包括烷基磺酸盐；
可选地，钾离子结合单体包括2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵和2-丙烯酰胺基十六烷磺酸中的至少一种；
可选地，聚合物单体包括苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯中的至少一种；
可选地，交联剂包括二乙烯苯和二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种；
可选地，引发剂包括过硫酸钾和过硫酸铵中的至少一种；
可选地，可溶性钾盐包括乙酸钾、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的至少一种，且不包括硝酸钾、碳酸钾或碳酸氢钾。
本申请的第三目的在于提供上述钾离子微球在制备质粒提取试剂中的用途。
在其中一个实施方式中，质粒提取试剂包括杂质助沉剂，杂质助沉剂包括钾离子微球；
可选地，杂质助沉剂还包括不含有游离钾离子的缓冲试剂；
可选地，缓冲试剂的pH为5～6；
可选地，缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子；
可选地，乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括钾盐；
可选地，钾离子微球保存于缓冲试剂中；
可选地，杂质助沉剂中钾离子微球的浓度不低于5％；
可选地，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的裂解试剂；
可选地，裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离的钾离子；
可选地，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂；
可选地，分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子。
本申请的第四目的在于提供一种质粒提取试剂，包括上述钾离子微球。
在其中一个实施方式中，质粒提取试剂包括杂质助沉剂，杂质助沉剂包括钾离子微球；
可选地，杂质助沉剂还包括不含有游离钾离子的缓冲试剂；
可选地，缓冲试剂的pH为5～6；
可选地，缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子；
可选地，乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括乙酸钾；
可选地，钾离子微球保存于缓冲试剂中；
可选地，杂质助沉剂中钾离子微球的浓度不低于5％；
可选地，裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子；
可选地，可溶性烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠中的至少一种且不包括可溶性烷基硫酸钾盐；
可选地，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂；
可选地，分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子。
本申请的第五目的在于提供一种质粒提取方法，提取方法包括：
将细胞裂解产物和上述钾离子微球混合，细胞裂解产物包括质粒和细胞裂解杂质；
对细胞裂解产物进行离心处理，使钾离子微球吸附并沉淀细胞裂解杂质，得到离心上清液中的质粒。
在其中一个实施方式中，对细胞裂解产物进行离心处理之前，提取方法还包括：
将悬浮于分散试剂中含有质粒的细胞与裂解试剂混合，以释放细胞裂解产物，分散试剂和裂解试剂不含有游离钾离子；及/或
将细胞裂解产物和缓冲试剂混合以调节细胞裂解产物的pH，缓冲试剂不含有游离钾离子；
可选地，细胞包括细菌；
可选地，裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子；
可选地，可溶性烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠中的至少一种且不包括可溶性烷基硫酸钾盐；
可选地，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂；
可选地，分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子；
可选地，细胞裂解产物的pH为5～6；
可选地，缓冲试剂的pH为5～6；
可选地，缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子；
可选地，乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括乙酸钾；
可选地，离心速度为5000～12000rpm，离心处理的时间为30s～3min。
附图说明
图1为本申请实施例1提供的钾离子微球扫描电镜图；
图2为本申请实施例2提供的不加助沉剂和加助沉剂菌体杂质离心的上清图；
图3为本申请实施例2提供的钾离子微球不加助沉剂和加助沉剂离心后进行提质粒提取的电泳检测结果；
图4为本申请实施例3提供的N3溶液中加入不同浓度的钾离子微球后进行质粒提取的电泳检测结果；
图5为本申请实施例4提供的钾离子微球扫描电镜图；
图6为本申请实施例5提供的钾离子微球扫描电镜图；
图7为本申请实施例6提供的钾离子微球扫描电镜图；
图8为本申请实施例7提供的钾离子微球扫描电镜图；
图9为本申请实施例8提供的钾离子微球扫描电镜图；
图10为本申请实施例11提供的不同粒径的钾离子微球加助沉剂离心后进行提质粒提取的电泳检测结果；
图11为本申请实施例12提供的不同修饰基团的钾离子微球加助沉剂离心后进行提质粒提取的电泳检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
本申请中，术语“微球”是指具有表面修饰功能的球形微粒。
本申请中，术语“质粒”是指独立于基因组DNA的小环状DNA，由抗性基因、复制起点、启动子、终止子/ployA、多克隆位点组成。质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。从分子组成看，有DNA质粒，也有RNA质粒；从分子构型看，有线型质粒、也有环状质粒：其表型也多种多样。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。
碱裂解法获取细菌质粒主要分为三个环节，培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。具体步骤为，在对数生长后期收集菌体，将收集的菌体分散后，加入NaOH-SDS溶液裂解，加入醋酸-醋酸钾缓冲液复性。在恢复中性后染色体DNA与细胞碎片及蛋白质在SDS作用下形成沉淀，通过离心去除，离心的上清液用于下一步提取。
在杂质分离的过程中，裂解细菌后的杂质需要长时间高速离心进行分离，传统离心方法一般需要高速离心10min左右才能将上清液和杂质分离；针对高通量深孔板处理杂质的离心时间则需要20min，甚至更长，离心时间过短会导致裂解杂质残留，影响后续的质粒DNA纯化效果。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种钾离子微球，微球核表面修饰有不溶于水的钾离子层，微球核的密度为2.2～2.66g/cm3。
为了在质粒提取中实现裂解杂质快速离心，本申请创造性地选择在密度为2.2～2.66g/cm3微球表面修饰不溶于水的钾离子层，使得钾离子微球能够和菌体裂解液(裂解液密度为1.03g/cm3)在离心作用下快速分离；同时，微球表面修饰的不溶于水的钾离子层能实现吸附大量的细胞裂解杂质，从而在缩短质粒提取时间的同时提高质粒纯化效果。
一些实施方案中，为了实现更好的离心效果，微球核的粒径为0.5μm～2μm，以使钾离子微球悬浮于细胞裂解产物中。
一些实施方案中，微球核表面修饰有聚合物层，聚合物层表面结合有不溶于水的钾离子。
一些具体实施方案中，聚合物层包括磺酸基聚合物，磺酸基聚合物结合有钾离子以形成不溶于水的钾离子层。
一些实施方案中，微球核的组成成分为二氧化硅，钾离子微球的制备方法包括：
通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰聚合物层，制备聚合物层修饰的二氧化硅微球；
将聚合物层修饰的二氧化硅微球和可溶性钾盐混合，在二氧化硅微球表面形成不溶于水的钾离子层，以制备钾离子微球。
一些具体实施方案中，可溶性钾盐包括乙酸钾，烷基磺酸修饰的微球将溶液中电离的钾离子转变成不溶性有机钾盐，以用于在质粒提取中离心时吸附细菌裂解杂质。
相应地，本申请的第二方面提供了一种钾离子微球的制备方法，制备方法包括：
在微球表面修饰不溶于水的钾离子层以制备钾离子微球，微球的密度为2.2～2.66g/cm3。
一些实施方案中，在微球表面修饰不溶于水的钾离子层以制备钾离子微球具体包括：
通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰聚合物层修饰聚合物层，制备聚合物层修饰的二氧化硅微球；
将聚合物层修饰的二氧化硅微球和可溶性钾盐混合，在二氧化硅微球表面形成不溶于水的钾离子层，以制备钾离子微球。
具体地，将硅烷偶联剂修饰的二氧化硅微球和钾离子结合单体、聚合物单体、交联剂和引发剂混合，通过聚合反应制备聚合物层修饰的二氧化硅微球。硅烷偶联剂将双键修饰到二氧化硅微球上后，引发剂引发聚合物单体、交联剂、钾离子结合单体在二氧化硅微球双键上进行聚合。聚合物单体和交联剂在微球表面形成聚合物层，并提供更多的聚合位点聚合钾离子结合单体，从而使磺酸基均匀分布在微球表面，有利于下一步结合钾离子。
一些具体实施方案中，钾离子结合单体可以是烷基磺酸盐，通过上述聚合接枝反应可以在二氧化硅微球表面修饰一层磺酸基聚合物，形成聚合物层修饰的微球，将聚合物层修饰的微球和钾离子盐溶液混合反应，磺酸基聚合物可结合钾离子形成不溶的钾离子复合盐，使不溶于水的钾离子层结合在二氧化硅微球上，从而得到钾离子微球。
一些具体实施方案中，烷基磺酸盐包括2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵和2-丙烯酰胺基十六烷磺酸中的至少一种。
一些具体实施方案中，聚合物单体包括苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯中的至少一种。
一些具体实施方案中，交联剂包括二乙烯苯和二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种。
一些具体实施方案中，引发剂包括过硫酸钾和过硫酸铵中的至少一种。
一些具体实施方案中，可溶性钾盐包括乙酸钾、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的至少一种，且不包括硝酸钾、碳酸钾或碳酸氢钾。
本申请利用将上述反应物通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰磺酸基聚合物。
一些实施方案中，硅烷偶联剂修饰的二氧化硅微球的制备步骤包括：
将醇和纯水的混合物，与氨水混合均匀形成氨水混合物；
向氨水混合物逐步滴加正硅酸四乙酯反应后，继续加入硅烷偶联剂反应，得到硅烷偶联剂修饰的二氧化硅微球。
具体地，本申请采用Stober法制备二氧化硅微球。Stober法是一种合成单分散硅氧球或硅氧壳的方法，通过氨水催化正硅酸乙酯(TEOS)的水解和缩合反应，可以控制颗粒的形貌、粒径和分布。
具体地，通过控制氨水混合物中醇的种类和盐可以控制二氧化硅微球的粒径。本申请发现粒径为0.5μm～2μm的二氧化硅微球可以获得更好的质粒提取效果。
本申请的第三方面提供了上述钾离子微球在制备质粒提取试剂中的用途，具体地，提供了钾离子微球作为杂质助沉剂在制备质粒提取试剂中的用途。
其中，杂质助沉剂是指用于沉淀细胞裂解产物中细胞裂解杂质的试剂。在质粒提取过程中，对细胞裂解后，细胞裂解产物中细胞裂解杂质主要包括细胞基因组DNA和蛋白，钾离子微球能够吸附并沉淀上述细胞裂解杂质，从而在细胞裂解产物的离心步骤中缩短离心时间同时提升质粒纯化效果。
一些实施方案中，对于裂解法获得细胞裂解产物，为了调节细胞裂解产物的pH，杂质助沉剂还包括缓冲试剂，缓冲试剂不含有游离钾离子。
一些具体实施方案中，杂质助沉剂包括钾离子微球和缓冲试剂，钾离子微球保存于缓冲试剂中。
一些具体实施方案中，缓冲试剂的pH为5～6。
一些具体实施方案中，缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子。具体地，乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括乙酸钾，其中，乙酸钠或乙酸铵可以中和强碱，使基因组DNA发生复性，但是无法恢复原来天然的双链结构，而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让蛋白-基因组DNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心，蛋白-基因组DNA复合物等细胞裂解物全部沉淀管底，只有质粒DNA溶解在上清中。
相应地，为了得到更好的杂质沉淀效果，杂质助沉剂中钾离子微球的浓度不低于5％。具体地，杂质助沉剂中钾离子微球的浓度是指杂质助沉剂中钾离子微球的质量百分浓度，即质量分数。
一些实施方案中，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的裂解试剂，裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子，强碱用于使基因组DNA变性，可溶性烷基硫酸盐用于吸附蛋白和变性的基因组DNA形成蛋白-基因组DNA复合物沉淀，并可在离心过程中与钾离子微球结合，从而实现钾离子微球的杂质沉淀效果。
一些具体实施方案中，可溶性烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠中的至少一种且不包括可溶性烷基硫酸钾盐。
一些具体实施方案中，裂解试剂含有NaOH和十二烷基硫酸钠且不含有游离钾离子。其中，十二烷基硫酸钠能够破坏细胞壁，让细胞内容物释放出来，还可以使蛋白变性，结合到蛋白质表面。在这个过程中，基因组DNA会被降解成线性片段，一旦遇到强碱，基因组DNA会发生变性分离变成单链，而质粒DNA不受影响。
一些实施方案中，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂。
一些具体实施方案中，分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子，以使细胞悬浮，便于细胞裂解释放裂解产物。
其中，EDTA是金属离子螯合剂，能够螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。Ca2+、Mg2+是细胞膜的重要成分，同时，对于细胞内很多酶的活性至关重要。EDTA可以破坏细胞膜，抑制细胞内许多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解掉。
葡萄糖可以给细胞以渗透压，导致细胞壁和细胞膜裂解，还可以增加溶液的黏稠度，使细胞不至于快速沉降。
相应地，本申请的第四方面提供了一种质粒提取试剂，包括上述钾离子微球，以在质粒提取中实现裂解杂质快速离心，从而缩短质粒提取的处理周期。
一些实施方案中，质粒提取试剂包括杂质助沉剂，杂质助沉剂包括钾离子微球。本申请的质粒提取试剂中的杂质助沉剂，能够吸附并沉淀菌体裂解后形成的杂质形成高密度杂质复合体，在离心作用下使裂解菌体杂质和质粒快速分离。
一些实施方案中，杂质助沉剂还包括不含有游离钾离子的缓冲试剂。
一些实施方案中，缓冲试剂的pH为5～6。
一些实施方案中，缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子。
一些具体实施方案中，乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括乙酸钾。
一些实施方案中，钾离子微球保存于缓冲试剂中。
一些实施方案中，杂质助沉剂中钾离子微球的浓度不低于5％。
一些实施方案中，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的裂解试剂。
一些具体实施方案中，裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子。
一些实施方案中，质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂。
一些具体实施方案中，分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子。
本申请质粒提取试剂的特别之处在于，杂质助沉试剂成分包括钾离子微球和3M乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5～6，钾离子微球可分散于乙酸钠溶液中。杂质助沉试剂加入了钾离子微球后，和杂质助沉试剂配套使用的裂解试剂、分散试剂中不能含有游离的钾离子，即不含乙酸钾、氯化钾、硝酸钾、硫酸钾等钾盐。
可与理解的是，本申请的质粒提取试剂中，缓冲试剂、裂解试剂和分散试剂特别地不包括游离钾离子，以避免和结合细胞裂解杂质的可溶性烷基硫酸盐反应，从而降低离心过程中钾离子微球吸附杂质的效果。
本申请的第五方面提供了一种质粒提取方法，提取方法包括：
将细胞裂解产物和上述钾离子微球混合，细胞裂解产物包括质粒和细胞裂解杂质；
对细胞裂解产物进行离心处理，使钾离子微球吸附并沉淀细胞裂解杂质，得到离心上清液中的质粒。
传统离心方法一般需要高速12000rpm离心10min左右才能将上清液和杂质分离；针对高通量深孔板处理杂质的离心时间则需要20min，甚至更长。本申请创造性地将上述钾离子微球应用于质粒提取过程的离心步骤，在12000rpm条件下离心30s，能够完全将杂质离心到底部。
一些实施方案中，离心的速度为5000～12000rpm，离心处理的时间为30s～3min。
具体地，细胞裂解产物中细胞裂解杂质往往结合有可溶性烷基硫酸盐，钾离子微球表面悬挂的钾离子可以和细胞裂解杂质表面的可溶性烷基硫酸根形成不溶于水的沉淀，使得细胞裂解杂质被吸附在微球上，通过离心就能快速使细胞裂解杂质和质粒溶液分开。
一些具体实施方案中，细胞包括细菌、真菌等，例如大肠杆菌。
一些实施方案中，为了实现细胞裂解，对细胞裂解产物进行离心处理包括：
将悬浮于分散试剂中含有质粒的细胞与裂解试剂混合，以释放细胞裂解产物，分散试剂和裂解试剂不含有游离钾离子。
一些具体实施方案中，裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子。
一些具体实施方案中，分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子。
一些实施方案中，为了提高质粒的稳定性，方法还包括：
对细胞裂解产物进行离心处理之前，将细胞裂解产物和不含有钾盐的缓冲试剂混合以调节细胞裂解产物的pH。
一些实施方案中，缓冲试剂的pH为5～6。
一些具体实施方案中，缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子，其中，乙酸盐包括乙酸钠和乙酸钠中的至少一种且不包括乙酸钾。
一些实施方案中，钾离子微球保存于缓冲试剂中，将细胞裂解产物和上述钾离子微球混合时同时混合缓冲试剂。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。
实施例1 1μm钾离子微球的制备
S1.准备400mL无水乙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水和0.4g氯化钾搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应2h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g 2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基磺酸修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。钾离子微球扫描电镜图如图1所示，同时可确定钾离子微球的平均粒径为1μm。
实施例2助沉剂溶液的制备和质粒提取流程
S1.根据已确定的配方配制P1溶液、P2溶液和P3溶液。P1溶液为25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM葡萄糖；P2溶液为200mM NaOH，1％(W/V)十二烷基硫酸钠；P3溶液为3M乙酸钾，乙酸调节pH为5.5；N3溶液的试剂组成为3M的乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.5，然后加入5％钾离子微球振荡混匀，即得到N3溶液。
S2.准备6组菌液，每组菌液2mL，分别编号①、②、③、④、⑤、⑥；
S3.离心去掉上清，加入200μL P1溶液振荡分散；
S4.加入250μL P2溶液裂解菌体，混合2min；
S5.在①、②、③号样品中加入200μL P3溶液，在④、⑤、⑥号样品中加入200μL N3溶液，混合1min；
S6.在12000rpm/min条件下离心，①、④、样品离心30s，②、⑤样品离心5min，③、⑥样品离心10min；离心后上清液图如图2所示。
S7.离心结束后，将上清转移到深孔板中，用自动化核酸提取仪和配套纯化试剂盒完成质粒提取；
S8.将提取的质粒进行电泳和浓度检测后，保存在-80℃冰箱备用。电泳检测结果如图3所示。
根据图2可知，离心上清澄清度③＝④＝⑤＝⑥>②>①。不加杂质助沉剂，离心时间越短，上清越浑浊；加杂质助沉剂后，离心30s、5min、10min，上清没有明显差异。该结果表明，杂质助沉剂能够使菌体裂解后的杂质快速离心沉淀，得到澄清的上清液。
根据图3的检测结果可知，不加助沉剂，离心时间越短，质粒提取量越低；加助沉剂，不同离心时间，质粒提取量没有差异。在离心30s的条件下，④号样品加助沉剂的质粒提取量明显高于①号样品不加助沉剂离心30s，且与略高于①号样品不加助沉剂离心10min的质粒提取量。
实施例3钾离子微球含量对质粒提取效果的影响
S1.根据实施例1中配好P1溶液和P2溶液。N3溶液的实际组成为3M的乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.5，然后加入不同量钾离子微球振荡混匀，即得到N3溶液。配制4组N3溶液，分别标记为①、②、③、④，4组N3溶液中钾离子微球浓度分别为3％、4％、5％、6％。
S2.准备4组菌液，每组菌液2mL，分别对应4组N3溶液的编号；
S3.离心去掉上清，加入200μL P1溶液振荡分散；
S4.加入250μL P2溶液裂解菌体，混合2min；
S5.在4组样品中加入200μL N3溶液，对应①、②、③、④，混合1min；
S6.在12000rpm/min条件下离心30s；
S7.离心结束后，将上清转移到深孔板中，用自动化核酸提取仪和配套纯化试剂盒完成质粒提取；
S8.将提取的质粒进行电泳和浓度检测后，保存在-80℃冰箱备用。检测结果如图4所示。
通过图4中电泳图质粒条带亮度可知，③、④号N3溶液的质粒提取量相同，优于①和②号，①号最低。要得到更好的提取效果，N3溶液中钾离子微球的含量不低于5％。
实施例4 0.3μm钾离子微球的制备
S1.准备300mL无水乙醇、100mL无水甲醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应2h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g 2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基磺酸修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。钾离子微球扫描电镜图如图5所示，同时可确定钾离子微球的平均粒径为0.3μm。
实施例5 0.5μm钾离子微球的制备
S1.准备400mL无水乙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应2h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g 2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基磺酸修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。钾离子微球扫描电镜图如图6所示，同时可确定钾离子微球的平均粒径为0.5μm。
实施例6 2μm钾离子微球的制备
S1.准备400mL无水乙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水和0.6g氯化钾搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应3h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g 2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基磺酸修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。钾离子微球扫描电镜图如图7所示，同时可确定钾离子微球的平均粒径为2μm。
实施例7 2.5μm钾离子微球的制备
S1.准备200mL无水乙醇、200mL正丙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水和0.4g氯化钾搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应3h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g 2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基磺酸修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。钾离子微球扫描电镜图如图8所示，同时可确定钾离子微球的平均粒径为2.5μm。
实施例8 3μm钾离子微球的制备
S1.准备400mL正丙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水和0.4g氯化钾搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应3h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g 2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基磺酸修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。钾离子微球扫描电镜图如图9所示，同时可确定钾离子微球的平均粒径为3μm。
实施例9羧基修饰的钾离子微球的制备
S1.准备400mL无水乙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水和0.4g氯化钾搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应2h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5mL甲基丙烯酸，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g烷基羧基修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。
实施例10丙基磺酸基修饰的钾离子微球的制备
S1.准备400mL无水乙醇和100mL纯水混合后加入到烧瓶中，室温搅拌，转速为300rpm/min；
S2.在烧瓶中加入5mL氨水和0.4g氯化钾搅拌溶解；
S3.滴加100mL正硅酸四乙酯，1h滴加完毕；
S4.继续反应2h后，加入10mL硅烷偶联剂KH-570，继续反应1h；
S5.反应结束收集溶液，用切向流过滤系统洗涤KH-570修饰的二氧化硅微球；
S6.取2g KH-570修饰的微球，分散在100mL 0.1％的十二烷基硫酸钠和0.05％的聚乙二醇8000溶液中；
S7.加入1.5g丙烯磺酸钠，0.5mL苯乙烯，0.1mL二乙烯苯，0.1g过硫酸钾，在300rpm./min条件下搅拌分散，75℃反应8h；
S8.反应结束，收集溶液用切向流过滤系统洗涤微球，保存在水溶液中；
S9.取2g丙基磺酸基修饰的微球和2g乙酸钾分散于100mL水中，加入到烧瓶中高速搅拌1h；
S10.反应结束，通过切向流系统过滤即得到钾离子微球。
实施例11不同粒径的钾离子微球对质粒提取效果的影响
S1.根据实施例2中的助沉剂使用方法及质粒提取步骤，将实施例1、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8制备的6种不同粒径的钾离子微球配制成5％浓度的N3溶液，并分别编号为①、②、③、④、⑤、⑥；
S2.准备6组菌液，每组菌液2mL；
S3.离心去掉上清，加入200μL P1溶液振荡分散；
S4.加入250μL P2溶液裂解菌体，混合2min；
S5.在裂解样品中分别加入S1中的6种200μL N3溶液，分别对应①、②、③、④、⑤、⑥的N3溶液，混合1min；
S6.在12000rpm/min条件下离心30s；
S7.离心结束后，将上清转移到深孔板中，用自动化核酸提取仪和配套纯化试剂盒完成质粒提取；
S8.将提取的质粒进行电泳和浓度检测后，保存在-80℃冰箱备用。电泳检测结果如图10所示。
根据图10的检测结果可知，粒径为0.5～2.5μm的微球助沉效果较佳。
实施例12不同基团修饰的微球对质粒提取效果的影响
S1.根据实施例2中的助沉剂使用方法及质粒提取步骤，将实施例1、实施例9、实施例10制备的3种基团修饰的钾离子微球配制成5％浓度的N3溶液，并分别编号为①、②、③；
S2.准备3组菌液，每组菌液2mL；
S3.离心去掉上清，加入200μL P1溶液振荡分散；
S4.加入250μL P2溶液裂解菌体，混合2min；
S5.在裂解样品中分别加入S1中的3种200μL N3溶液，分别对应①、②、③的N3溶液，混合1min；
S6.在12000rpm/min条件下离心30s；
S7.离心结束后，将上清转移到深孔板中，用自动化核酸提取仪和配套纯化试剂盒完成质粒提取；
S8.将提取的质粒进行电泳和浓度检测后，保存在-80℃冰箱备用。电泳检测结果如图11所示。
根据图11的检测结果可知，实施例1中磺酸基修饰的钾离子微球助沉效果最佳，而实施例9中羧基修饰钾离子的钾离子微球或实施例10中丙基磺酸基修饰的钾离子微球容易难以达到助沉效果。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种钾离子微球，其特征在于，包括微球核，所述微球核表面修饰有不溶于水的钾离子层，所述微球核的密度为2.2～2.66g/cm3。
2.根据权利要求1所述的钾离子微球，其特征在于，所述钾离子微球满足以下特征(1)～(3)中的至少一个：
(1)所述微球核的粒径为0.5μm～2μm；
(2)所述微球核表面修饰有聚合物层，所述聚合物层表面结合有不溶于水的钾离子；可选地，聚合物层包括磺酸基聚合物，所述磺酸基聚合物结合有钾离子；
(3)所述微球核的组成成分为二氧化硅，所述钾离子微球的制备方法包括：
通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰聚合物层，制备聚合物层修饰的二氧化硅微球；
将聚合物层修饰的二氧化硅微球和可溶性钾盐混合在二氧化硅微球表面形成不溶于水的钾离子层，以制备钾离子微球。
3.一种钾离子微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
在微球表面修饰不溶于水的钾离子层以制备钾离子微球，所述微球的密度为2.2～2.66g/cm3。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在微球表面修饰不溶于水的钾离子层以制备钾离子微球具体包括：
通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面修饰聚合物层修饰聚合物层，制备聚合物层修饰的二氧化硅微球；
将聚合物层修饰的二氧化硅微球和可溶性钾盐混合在二氧化硅微球表面形成不溶于水的钾离子层，以制备钾离子微球；
可选地，通过聚合接枝法在二氧化硅微球表面制备聚合物层修饰的二氧化硅微球具体包括：
将硅烷偶联剂修饰的二氧化硅微球和钾离子结合单体、聚合物单体、交联剂和引发剂混合，通过聚合反应制备聚合物层修饰的微球；
可选地，所述二氧化硅微球的粒径为0.5μm～2μm；
可选地，所述钾离子结合单体包括烷基磺酸盐；
可选地，所述钾离子结合单体包括2-丙烯酰胺基十六烷磺酸铵和2-丙烯酰胺基十六烷磺酸中的至少一种；
可选地，所述聚合物单体包括苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯中的至少一种；
可选地，所述交联剂包括二乙烯苯和二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种；
可选地，所述引发剂包括过硫酸钾和过硫酸铵中的至少一种；
可选地，所述可溶性钾盐包括乙酸钾、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的至少一种，且不包括硝酸钾、碳酸钾或碳酸氢钾。
5.根据权利要求1或2所述的钾离子微球在制备质粒提取试剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述质粒提取试剂包括杂质助沉剂，所述杂质助沉剂包括所述钾离子微球；
可选地，所述杂质助沉剂还包括不含有游离钾离子的缓冲试剂；
可选地，所述缓冲试剂的pH为5～6；
可选地，所述缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子；
可选地，所述乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括钾盐；
可选地，所述钾离子微球保存于所述缓冲试剂中；
可选地，所述杂质助沉剂中钾离子微球的浓度不低于5％；
可选地，所述质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的裂解试剂；
可选地，所述裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离的钾离子；
可选地，所述质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂；
可选地，所述分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子。
7.一种质粒提取试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的钾离子微球。
8.根据权利要求7所述的质粒提取试剂，其特征在于，所述质粒提取试剂包括杂质助沉剂，所述杂质助沉剂包括所述钾离子微球；
可选地，所述杂质助沉剂还包括不含有游离钾离子的缓冲试剂；
可选地，所述缓冲试剂的pH为5～6；
可选地，所述缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子；
可选地，所述乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括乙酸钾；
可选地，所述钾离子微球保存于所述缓冲试剂中；
可选地，所述杂质助沉剂中钾离子微球的浓度不低于5％；
可选地，所述质粒提取试剂还包括不含有钾盐的裂解试剂；
可选地，所述裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子；
可选地，所述可溶性烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠中的至少一种且不包括可溶性烷基硫酸钾盐；
可选地，所述质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂；
可选地，所述分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子。
9.一种质粒提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：
将细胞裂解产物和权利要求1或2所述的钾离子微球混合，所述细胞裂解产物包括质粒和细胞裂解杂质；
对细胞裂解产物进行离心处理，使所述钾离子微球吸附并沉淀细胞裂解杂质，得到离心上清液中的质粒。
10.根据权利要求9所述的质粒提取方法，其特征在于，对细胞裂解产物进行离心处理之前，所述提取方法还包括：
将悬浮于分散试剂中含有质粒的细胞与裂解试剂混合，以释放细胞裂解产物，所述分散试剂和裂解试剂不含有游离钾离子；及/或
将细胞裂解产物和缓冲试剂混合以调节所述细胞裂解产物的pH，所述缓冲试剂不含有游离钾离子；
可选地，所述细胞包括细菌；
可选地，所述裂解试剂含有强碱、可溶性烷基硫酸盐和水且不含有游离钾离子；
可选地，所述可溶性烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠中的至少一种且不包括可溶性烷基硫酸钾盐；
可选地，所述质粒提取试剂还包括不含有游离钾离子的分散试剂；
可选地，所述分散试剂含有Tris-HCl、EDTA、葡萄糖和水且不含有游离钾离子；
可选地，所述细胞裂解产物的pH为5～6；
可选地，所述缓冲试剂的pH为5～6；
可选地，所述缓冲试剂含有乙酸盐、乙酸和水且不含有游离钾离子；
可选地，所述乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的至少一种且不包括乙酸钾；
可选地，所述离心速度为5000～12000rpm，所述离心处理的时间为30s～3min。
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