CN117165660A - 一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂及其应用，属于分子生物学技术领域，包括裂解液、结合液、改性吸附微球、PCR抑制物去除剂、漂洗液、洗脱液；改性吸附微球的制备原理如下：首先用油酸对合成的Fe3O4进行包覆，以甲烯丙烯酸甲酯、二乙烯基苯作为单体，使用小分子环己烷作为致孔剂，采用悬浮聚合法制备得到多孔Fe3O4，对多孔Fe3O4进一步进行二氧化硅包覆，制得改性吸附微球，增加了DNA的吸附量，提高了DNA提取效率，减少了试剂用量。本发明用于鼠尾基因型鉴定的试剂无需苯酚或氯仿抽提，可得到高产量的DNA，得到的DNA可以直接用于PCR从而完成对鼠尾基因型鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂及其应用。
背景技术
随着基因编辑技术发展成熟，转基因小鼠应运而生，目前国内外许多学者已经利用转基因小鼠开展研究工作。随着转基因技术的迅猛发展，转基因小鼠价格不再昂贵。因此，国内许多实验室转基因小鼠的品系和数量逐渐增加。纯合子转基因小鼠的获得需要通过杂合子亲代杂交，转基因小鼠的基因型鉴定工作—包括DNA的分离提取和PCR扩增。
小鼠基因组DNA的分离提取是决定小鼠的基因型鉴定结果好坏的关键，一般选择在小鼠出生3-4周剪尾，鼠尾尾尖(＜5mm)可获得的DNA量足够用于基因型鉴定。鼠尾DNA的分离提取的质量直接受基因组DNA的提取和纯化方法的影响，所以首先要保证DNA结构的完整，传统的DNA的分离提取方法包括酚/氯仿提取法和磁珠吸附法等，可获得较高纯度的组织DNA，但是需使用试剂量大，并且使用的试剂可能存在挥发性大、对人体有毒害作用的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂及其应用，以解决以下技术问题：现有用于鼠尾基因组DNA分离提取的试剂需大量使用，并且可能存在挥发性大、对人体有毒害作用的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，包括裂解液、结合液、改性吸附微球、PCR抑制物去除剂、漂洗液、洗脱液；
所述改性吸附微球包括如下步骤制备：
步骤一：将FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O加入去离子水中，搅拌5-10min，加热至80℃，通入氩气30min后加入质量分数为25％的氨水，反应30-50min后，滴加油酸，升温至85℃反应3-5h，过滤，去离子水洗涤，加入正辛烷，超声分散5-10min，得Fe3O4分散液；
步骤二：将甲烯丙烯酸甲酯、二乙烯基苯、环己烷、Fe3O4分散液、聚乙烯醇、质量分数为3％的NaCl溶液分别置于冰浴中超声30min后，混合，通入氩气，70℃下以300rpm的速度进行搅拌30min，加入过氧苯甲酰反应5-6h，去离子水和甲醇溶液洗涤3次，真空干燥，得多孔Fe3O4；
步骤三：将多孔Fe3O4加入质量分数为30％的盐酸溶液中，水浴加热至50-60℃，以300rpm的速度搅拌，滴加正硅酸乙酯，反应2h后，以5000rpm的速度离心5-10min后，去离子水洗涤三次，60-105℃干燥12-24h，得改性吸附微球。
作为本发明的进一步方案，所述裂解液包括如下步骤制备：将5-20gSDS(十二烷基硫酸钠)、0.1-1molNaCl(氯化钠)、0.01-0.5molTris(三羟甲基氨基甲烷)、0.05-0.1molEDTA(乙二胺四乙酸)、0.05-0.1g蛋白酶K、10gRNaseA加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至7.5-8.0，得裂解液。
作为本发明的进一步方案，所述结合液包括如下步骤制备：将1-1.5molNaCl、700-800mL异丙醇、50-80gPEG-8000(聚乙二醇-8000)加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至5.0，得结合液。PEG-8000提高了改性吸附微球的分散性，异丙醇促进了DNA结合作用。
作为本发明的进一步方案，所述PCR抑制物去除剂包括如下步骤制备：将300mmolBSA(牛血清白蛋白)、6.5mmol亚精胺、20gPEG-6000(聚乙二醇-6000)、500mL甘油加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀，得PCR抑制物去除剂。PCR抑制物去除剂可消除因剪鼠尾不可避免残留的血液中血红素对后续PCR的抑制作用。
作为本发明的进一步方案，所述漂洗液包括如下步骤制备：将10-15mmolTris、700-750mL无水乙醇加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，调节pH至8.0，得漂洗液。
作为本发明的进一步方案，所述洗脱液为pH值为8.0的去离子水。
作为本发明的进一步方案，所述FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、去离子水、氨水、油酸、正辛烷的用量比为24-30g:9-12g:100mL:50-60mL:5-6mL:100mL。
作为本发明的进一步方案，所述甲烯丙烯酸甲酯、二乙烯基苯、环己烷、Fe3O4分散液、聚乙烯醇、NaCl溶液、过氧苯甲酰的用量比为10-15mL:0.75-1mL:2.5-4mL:2-3mL:2-3g:2-4.5g:0.2-0.4g。
作为本发明的进一步方案，所述多孔Fe3O4、盐酸溶液、正硅酸乙酯的用量比为10-20g:50-80mL:0.3-0.6g。
作为本发明的进一步方案，所述一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂的应用，应用于鼠尾基因型鉴定，具体包括如下步骤：
步骤1：剪切0.3-0.5cm的鼠尾组织置于离心管中，加入100-150ul裂解液，于50-60℃水浴中裂解16-20h，得混合液A；
步骤2：向步骤1得到的混合液A中加入100-150μL结合液、10-15μL改性吸附微球、900ulPCR抑制物去除剂，旋涡震荡2-3min后，25±5℃下静置50-60min，得混合液B；
步骤3：向步骤2得到的混合液B中加入500-550μL漂洗液，旋涡震荡2-3min后，以5000rpm的速度离心1min，弃上清，90℃金属浴加热3-5min以除去乙醇，得到沉淀物C；
步骤4：向步骤2得到的沉淀物C中加入洗脱液80-100μL，旋涡震荡，25±5℃下静置10min，以13000rpm的速度离心5min，取上清即得基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖电泳检测，即完成鼠尾基因型鉴定。
本发明的有益效果：
本发明用于鼠尾基因型鉴定的试剂无需苯酚或氯仿抽提，通过裂解液有效裂解鼠尾样本同时去除蛋白和RNA干扰，再通过结合液使裂解鼠尾后产生的DNA高效结合到改性吸附微球中，同时添加PCR抑制物去除剂消除因剪鼠尾不可避免残留的血液中血红素对后续PCR的抑制作用，再通过漂洗液、洗脱液进行洗脱，即可得到高产量的DNA，得到的DNA可以直接用于PCR从而完成对鼠尾基因型鉴定，其中改性吸附微球的制备原理如下：
首先用油酸对合成的Fe3O4进行包覆，以甲烯丙烯酸甲酯、二乙烯基苯作为单体，使用小分子环己烷作为致孔剂，采用悬浮聚合法制备得到多孔Fe3O4，对多孔Fe3O4进一步进行二氧化硅包覆，制得改性吸附微球，包覆二氧化硅后Fe3O4纳米粒子的形态未发生变化，外观仍然呈现球形，并在其外表面形成了一层膜包裹住了纳米颗粒，其粒径约为310-320nm，二氧化硅可以吸附水分子的极性羟基形成水膜，在高浓度、低pH的结合液中，带正电的钠离子打破了负电性的二氧化硅周围的水分子结构，在二氧化硅和负电性的DNA磷酸骨架之间形成一个盐桥而结合从而对DNA进行吸附，且改性吸附微球的多孔结构大大增加了DNA的吸附量，提高了DNA提取效率，减少了试剂用量，节约了成本。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明实施例5-6的中T-bet flox小鼠基因鉴定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所用转基因小鼠背景均为C57BL/6J，PCR引物及方法采用美国Jackson实验室推荐的方法，DNA Marker为DL2000，其自上而下带型分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。本发明实施例所采用的设备及试剂原料均为实验室常用仪器。
实施例1
改性吸附微球包括如下步骤制备：
步骤一：将24gFeCl3·6H2O、9gFeCl2·4H2O加入100mL去离子水中，搅拌5min，加热至80℃，通入氩气30min后加入50mL质量分数为25％的氨水，反应30min后，滴加5mL油酸，升温至85℃反应3h，过滤，去离子水洗涤，加入100mL正辛烷，超声分散5min，得Fe3O4分散液；
步骤二：将10mL甲烯丙烯酸甲酯、0.75mL二乙烯基苯、2.5mL环己烷、2mLFe3O4分散液、2g聚乙烯醇、2g质量分数为3％的NaCl溶液分别置于冰浴中超声30min后，混合，通入氩气，70℃下以300rpm的速度进行搅拌30min，加入0.2g过氧苯甲酰反应5h，去离子水和甲醇溶液洗涤3次，真空干燥，得多孔Fe3O4；
步骤三：将10g多孔Fe3O4加入50mL质量分数为30％的盐酸溶液中，水浴加热至50℃，以300rpm的速度搅拌，滴加0.3g正硅酸乙酯，反应2h后，以5000rpm的速度离心5min后，去离子水洗涤三次，60℃干燥12h，得改性吸附微球。
实施例2
改性吸附微球包括如下步骤制备：
步骤一：将30gFeCl3·6H2O、12gFeCl2·4H2O加入100mL去离子水中，搅拌10min，加热至80℃，通入氩气30min后加入60mL质量分数为25％的氨水，反应50min后，滴加6mL油酸，升温至85℃反应5h，过滤，去离子水洗涤，加入100mL正辛烷，超声分散10min，得Fe3O4分散液；
步骤二：将15mL甲烯丙烯酸甲酯、1mL二乙烯基苯、4mL环己烷、3mLFe3O4分散液、3g聚乙烯醇、4.5g质量分数为3％的NaCl溶液分别置于冰浴中超声30min后，混合，通入氩气，70℃下以300rpm的速度进行搅拌30min，加入0.4g过氧苯甲酰反应6h，去离子水和甲醇溶液洗涤3次，真空干燥，得多孔Fe3O4；
步骤三：将20g多孔Fe3O4加入80mL质量分数为30％的盐酸溶液中，水浴加热至60℃，以300rpm的速度搅拌，滴加0.6g正硅酸乙酯，反应2h后，以5000rpm的速度离心10min后，去离子水洗涤三次，105℃干燥24h，得改性吸附微球。
实施例3
一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，包括裂解液、结合液、实施例1制得的改性吸附微球、PCR抑制物去除剂、漂洗液、洗脱液；
裂解液包括如下步骤制备：将5gSDS、0.1molNaCl、0.01molTris、0.05-0.1molEDTA、0.05g蛋白酶K、10gRNaseA加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至7.5，得裂解液；
结合液包括如下步骤制备：将1molNaCl、700mL异丙醇、5gPEG-8000加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至5.0，得结合液；
PCR抑制物去除剂包括如下步骤制备：将300mmolBSA、6.5mmol亚精胺、20gPEG-6000、500mL甘油加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀，得PCR抑制物去除剂。
漂洗液包括如下步骤制备：将10mmolTris、700mL无水乙醇加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，调节pH至8.0，得漂洗液。
洗脱液为pH值为8.0的去离子水。
实施例4
一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，包括裂解液、结合液、实施例2制得的改性吸附微球、PCR抑制物去除剂、漂洗液、洗脱液；
裂解液包括如下步骤制备：将20gSDS、1molNaCl、0.5molTris、0.1mol EDTA、0.1g蛋白酶K、10gRNaseA加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至8.0，得裂解液；
结合液包括如下步骤制备：将1.5molNaCl、800mL异丙醇、80gPEG-8000加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至5.0，得结合液；
PCR抑制物去除剂包括如下步骤制备：将300mmolBSA、6.5mmol亚精胺、20gPEG-6000、500mL甘油加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀，得PCR抑制物去除剂。
漂洗液包括如下步骤制备：将15mmolTris、750mL无水乙醇加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，调节pH至8.0，得漂洗液。
洗脱液为pH值为8.0的去离子水。
实施例5
采用实施例1制得的试剂用于鼠尾基因型鉴定，具体包括如下步骤：
步骤1：剪切0.3cm的鼠尾组织置于离心管中，加入100ul裂解液，于50℃水浴中裂解16h，得混合液A；
步骤2：向步骤1得到的混合液A中加入100μL结合液、10μL改性吸附微球、900ulPCR抑制物去除剂，旋涡震荡2min后，25±5℃下静置50min，得混合液B；
步骤3：向步骤2得到的混合液B中加入500μL漂洗液，旋涡震荡2min后，以5000rpm的速度离心1min，弃上清，90℃金属浴加热3min以除去乙醇，得到沉淀物C；
步骤4：向步骤2得到的沉淀物C中加入洗脱液80μL，旋涡震荡，25±5℃下静置10min，以13000rpm的速度离心5min，取上清即得基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖电泳检测，即完成鼠尾基因型鉴定；
其中PCR采用20μL体系，包括10μL2×TaqMasterMix、0.5μL上游引物F、0.5μL下游引物R、8μLddH2O、1μL步骤4提取的基因组DNA模板，
上游引物F、下游引物R由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列如下：F：AGTCCCCCTGGAAGAACACT；R：TGAAGGACAGGAATGGGAAC。
PCR程序如下：95℃加热3min，95℃加热30s，60℃加热30s，72℃加热45s顺序进行38个循环，接着72℃加热5min，4℃暂存。
实施例6
采用实施例2制得的试剂用于鼠尾基因型鉴定，具体包括如下步骤：
步骤1：剪切0.5cm的鼠尾组织置于离心管中，加入150ul裂解液，于60℃水浴中裂解20h，得混合液A；
步骤2：向步骤1得到的混合液A中加入150μL结合液、15μL改性吸附微球、900ulPCR抑制物去除剂，旋涡震荡3min后，25±5℃下静置60min，得混合液B；
步骤3：向步骤2得到的混合液B中加入550μL漂洗液，旋涡震荡3min后，以5000rpm的速度离心1min，弃上清，90℃金属浴加热5min以除去乙醇，得到沉淀物C；
步骤4：向步骤2得到的沉淀物C中加入洗脱液100μL，旋涡震荡，25±5℃下静置10min，以13000rpm的速度离心5min，取上清即得基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖电泳检测，即完成鼠尾基因型鉴定；
其中PCR体系、引物、程序与实施例5相同。
对比例1
采用实施例1制得的试剂用于鼠尾基因型鉴定，具体包括如下步骤：
本对比例与实施例5相比，仅将“10μL改性吸附微球”替换为“10μL二氧化硅”，其余步骤与参数均相同。
性能测试
(1)分别对实施例5-6及对比例1步骤4提取的基因组DNA用分光光度计测定DNA浓度，测试结果如表1所示；
(2)对实施例5-6的PCR产物进行琼脂糖电泳结果参见图1所示，泳道1-2分别为实施例5、6的电泳结果。
表1
| 项目 | 实施例5 | 实施例6 | 对比例1 |
| DNA浓度/(ng/μL) | 200.81 | 204.78 | 131.67 |
由表1可知，实施例5-6制得的试剂提取的DNA浓度明显高于对比例1制得的试剂提取的DNA浓度；
由图1可知，650bp单条带为T-betfl/fl小鼠，650bp和470bp双条带为T-betfl/+小鼠，470bp单条带为T-bet+/+小鼠。泳道M为DNA Marker(DL2000)，泳道1为T-betfl/+，泳道2为T-betfl/+，实施例5-6适用于提取转基因小鼠尾尖DNA，提取的DNA质量满足后续PCR鉴定。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，包括裂解液、结合液、改性吸附微球、PCR抑制物去除剂、漂洗液、洗脱液；
所述改性吸附微球包括如下步骤制备：
步骤一：将FeCl 3·6H2O、FeCl 2·4H2O加入去离子水中，搅拌5-10min，加热至80℃，通入氩气30min后加入质量分数为25％的氨水，反应30-50min后，滴加油酸，升温至85℃反应3-5h，过滤，去离子水洗涤，加入正辛烷，超声分散5-10min，得Fe3O4分散液；
步骤二：将甲烯丙烯酸甲酯、二乙烯基苯、环己烷、Fe3O4分散液、聚乙烯醇、质量分数为3％的NaCl溶液分别置于冰浴中超声30min后，混合，通入氩气，70℃下以300rpm的速度进行搅拌30min，加入过氧苯甲酰反应5-6h，去离子水和甲醇溶液洗涤3次，真空干燥，得多孔Fe3O4；
步骤三：将多孔Fe3O4加入质量分数为30％的盐酸溶液中，水浴加热至50-60℃，以300rpm的速度搅拌，滴加正硅酸乙酯，反应2h后，以5000rpm的速度离心5-10min后，去离子水洗涤三次，60-105℃干燥12-24h，得改性吸附微球。
2.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述裂解液包括如下步骤制备：将5-20gSDS、0.1-1molNaCl、0.01-0.5molTris、0.05-0.1molEDTA、0.05-0.1g蛋白酶K、10gRNaseA加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至7.5-8.0，得裂解液。
3.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述结合液包括如下步骤制备：将1-1.5molNaCl、700-800mL异丙醇、50-80gPEG-8000加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，用盐酸调节pH至5.0，得结合液。
4.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述PCR抑制物去除剂包括如下步骤制备：将300mmolBSA、6.5mmol亚精胺、20gPEG-6000、500mL甘油加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀，得PCR抑制物去除剂。
5.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述漂洗液包括如下步骤制备：将10-15mmolTris、700-750mL无水乙醇加去离子水溶解定容至1L，混合摇匀后，调节pH至8.0，得漂洗液。
6.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述洗脱液为pH值为8.0的去离子水。
7.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述FeCl 3·6H2O、FeCl 2·4H2O、去离子水、氨水、油酸、正辛烷的用量比为24-30g:9-12g:100mL:50-60mL:5-6mL:100mL。
8.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述甲烯丙烯酸甲酯、二乙烯基苯、环己烷、Fe3O4分散液、聚乙烯醇、NaCl溶液、过氧苯甲酰的用量比为10-15mL:0.75-1mL:2.5-4mL:2-3mL:2-3g:2-4.5g:0.2-0.4g。
9.根据权利要求1所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂，其特征在于，所述多孔Fe3O4、盐酸溶液、正硅酸乙酯的用量比为10-20g:50-80mL:0.3-0.6g。
10.根据权利要求1-9任一所述的一种用于鼠尾基因型鉴定的试剂的应用，其特征在于，应用于鼠尾基因型鉴定，具体包括如下步骤：
步骤1：剪切0.3-0.5cm的鼠尾组织置于离心管中，加入100-150ul裂解液，于50-60℃水浴中裂解16-20h，得混合液A；
步骤2：向步骤1得到的混合液A中加入100-150μL结合液、10-15μL改性吸附微球、900ulPCR抑制物去除剂，旋涡震荡2-3min后，25±5℃下静置50-60min，得混合液B；
步骤3：向步骤2得到的混合液B中加入500-550μL漂洗液，旋涡震荡2-3min后，以5000rpm的速度离心1min，弃上清，90℃金属浴加热3-5min以除去乙醇，得到沉淀物C；
步骤4：向步骤2得到的沉淀物C中加入洗脱液80-100μL，旋涡震荡，25±5℃下静置10min，以13000rpm的速度离心5min，取上清即得基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖电泳检测，即完成鼠尾基因型鉴定。
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