KR20060093779A - 라이코펜 생산능이 향상된 대장균 및 그를 이용한 라이코펜의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균에 대장균 appY 유전자, crl 유전자, dgo 오페론 또는 ycgZ, ymgA 및 ymgB의 오페론 폴리뉴클레오티드; 또는 appY 유전자, crl 유전자, dxs 유전자, rpoS 유전자, dgo 오페론 및 ycgZ, ymgA 및 ymgB의 오페론으로 구성되는 군으로부터 선택된 2 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입된, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균 및 그를 이용한 라이코펜의 생산방법을 제공한다.

라이코펜, appY, crl, 대장균

Description

라이코펜 생산능이 향상된 대장균 및 그를 이용한 라이코펜의 생산방법 {Escherichia coli capable of producing lycopene with enhanced productivity and method for producing lycopene using the same}

도 1은 대장균(E. coli) 내에서 해당 과정(glycolysis pathway), IPP 및 DMAPP가 생합성 되는 비메발론산 경로, FPP가 생합성 되는 이소프레닐 디포스페이트 경로(isoprenyl diphosphate pathway) 및 외래 유전자로 이루어진 라이코펜 생합성 경로를 나타내는 흐름도이다.

도 2는 재조합 대장균에서 라이코펜의 생성량을 증가시키는 유전자를 확인하기 위해 대장균 게놈 DNA 라이브러리를 탐색하는 과정을 나타낸 흐름도 (A) 및 그 결과 라이코펜 생산능이 높은 재조합 균주를 나타내는 도면이다.

도 3은 pBAD24-L4, pBAD24-H70, pBAD24-H72 및 pBAD24-H90의 유전자 배치를 모식적으로 나타낸 도면이다.

본 발명은 라이코펜 생산능이 향상된 대장균 및 그를 이용한 라이코펜의 생산 방법에 관한 것이다.

카로티노이드(Carotenoids)는 C₄₀ 이소프레노이드 화합물로서, 식물, 조류(algae), 박테리아 및 진균류 등에서 공통의 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)로부터 생합성 된다. 카로티노이드는 생성된 세포 또는 조직 내에서 생리학적 및 영양학적으로 중요한 역할을 수행하고, 그의 종류는 약 600여 종이 알려져 있으며, 예컨대 라이코펜, 베타-카로틴, 아스타잔틴, 루테인, 피토엔, 제아잔틴, 칸타잔틴, 아도니잔틴, 크립토잔틴, 에키네논 및 아도니루빈 등을 포함한다. 카로티노이드는 식용 착색제 및 동물 사료용 안료와 같은 색소(pigment)로서 사용되고 있으며, 최근 그의 약리학적 효과가 알려지면서 그의 의약 용도가 주목 받고 있다.

특히, 라이코펜(lycopene)은 효과적인 항산화제로 알려져 있고(Sies, H. and W. Stahl, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218(2):121-4, 1998), 암 및 퇴행성 질환의 치료에도 효과가 있을 뿐만 아니라(Giovannucci, E. Exp. Biol. Med. (Maywood) 227(10):852-9, 2002; Giovannucci, E. J. Natl. Cnacer Inst. 91(4):317-31, 1999), 협심증, 심근경색증 및 뇌졸증 등의 심혈관계 질환의 예방 효과, 면역 기능 증진 효과, 당뇨병 발병 위험의 감소 효과 및 남성의 생식불능 개선 효과도 보고 되고 있다.

상기와 같이 카로티노이드의 우수한 효과들이 확인됨에 따라, 이를 대량으로 생산하려는 연구가 진행되고 있다. 현재 상업적으로 중요한 카로티노이드는 주로 천연 공급원으로부터의 추출 방법(매리골드로부터 루테인 및 파프리카로부터 캡산틴) 및 화학 합성 방법(베타-카로틴, 칸타잔틴 및 아스타잔틴)에 의해 생산되고 있 으며, 최근 미생물을 이용하여 카로티노이드를 생합성하는 방법에 대한 연구가 활발하다.

카로티노이드의 공통 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)의 생합성 경로로서 메발론산 경로(Mevalonate pathway) 및 비메발론산 경로(Non-mevalonate pathway)가 알려져 있다. 메발론산 경로는 대부분의 진핵생물(예, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 식물 세포의 세포질, 일부 박테리아(예, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 파라코커스 제악산티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)) 및 말라리아 세포에 존재하는 것으로 알려져 있다. 비메발론산 경로는 대부분의 박테리아(예, 대장균), 식물 세포의 색소체 (plastid)에 존재한다.

메발론산 경로에 관련된 여러 단계들이 알려져 있다. 즉, 메발론산 경로는 아세토아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 신타제, HMG-CoA 리덕타제, MVA 키나제, MVAP 키나제, MVAPP 데카르복실라제 및 IPP 이소머라제에 의한 반응 단계로 구성된다. 또한, 비메발론산 경로(MEP 경로 또는 DXP 경로라고도 함)에 관련된 여러 단계들도 알려져 있다. 즉, 비메발론산 경로는 DXP 신타제, DXP 리덕토이소머라제, CDP-ME 신타제, CDP-ME 키나제, MECP 신타제, HMBPP 신타제 및 HMBPP 리덕타제에 의한 반응 단계로 구성된다.

상기에서 언급한 바와 같이, 그람 음성 박테리아인 대장균(E. coli)의 경우 비메발론산 경로만을 이용하여 IPP를 생합성한다. 도 1을 참조하면, 상기 비메발론산 경로에 관련된 대장균(E. coli) 효소들은 각각 dxs(Genbank accession No. AF035440), ispC(Genbank accession No. AB013300), ispD(Genbank accession No. AF230736), ispE(Genbank accession No. AF216300), ispF(Genbank accession No. AE000219), ispG(Genbank accession No. AE000338) 및 ispH(Genbank accession No. AE000113) 유전자에 의하여 코딩되는 것으로 알려져 있다. 생합성된 IPP는 ipi에 의해 코딩되는 IPP 이소머라제에 의해 DMAPP와 상호전환된다. 또한, 대장균에 있어서, 합성된 IPP 및 DMAPP는 ispA에 의해 코딩되는 FPP 신타제에 의해 차례로 GPP 및 FPP로 전환된다. FPP는 대장균 내에서 전자 전달체로 전자 전달계를 구성하는 유비퀴논 및 세포벽 구성에 필요한 당 운반체인 돌리콜 합성에 이용된다. 그러나, 야생형의 대장균은 라이코펜을 포함한 카로티노이드 생합성에 관련되는 유전자를 가지고 있지 않기 때문에, 카로티노이를 생합성할 수 없다.

최근 세균인 아그로박테리움 오란티아컴 (Agrobacterium aurantiacum), 에르위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) 또는 에르위니아 우레도보라 (Erwinia uredovora)로부터 클로닝된 카로티노이드 유전자 crtE (GGPP 신타제 코딩), crtB (피토엔 신타제 코딩) 및 crtI (피토엔 디새츄라제 코딩)을 대장균에 도입하여 얻어지는 재조합 대장균이 라이코펜의 생합성능을 가진다는 것이 개시된 바 있다 (미국 특허 제6,706,516호; Misawa and Shimada, J. Biotechnol., 59 :169-181, 1998). 이와 관련하여, 라이코펜을 포함한 카로티노이드의 생산 속도를 결정하는 유전자는 비메발론산 경로의 첫 번째 효소인 DXP 신타제를 암호화하는 dxs임이 알려져 있다 (Harker and Bramley, FEBS Lett., 448:115-119, 1999; Matthews and Wurtzel, J. Biotechnol., 59:169-181, 1998).

상기한 바와 같이 대장균에 라이코펜의 생합성에 관련된 외래 유전자를 도입하여 라이코펜을 생산하는 방법의 문제점은 재조합 대장균 균주들에 의해 생산되는 라이코펜의 양이 비재조합 미생물에 의해 생산되는 양에 비해 적어 대량 생산에 적합하지 않다는 것이다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 라이코펜 생합성에 관련되는 유전자가 도입된 대장균에서 라이코펜의 생산성을 증가시킬 수 있는 대장균 유전자를 탐색하던 중 라이코펜 생산성을 증가시키는 데 관여하는 대장균 유래의 DNA 단편을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 라이코펜 생산능이 향상된 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 대장균을 이용하여 라이코펜을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균에 대장균 appY 유전자, crl 유전자, dgo 오페론 또는 ycgZ, ymgA 및 ymgB의 오페론 폴리뉴클레오티드; 또는 appY 유전자, crl 유전자, dxs 유전자, rpoS 유전자, dgo 오페론 및 ycgZ, ymgA 및 ymgB의 오페론으로 구성되는 군으로부터 선택된 2 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입된, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균을 제공한다.

본 발명의 대장균에 있어서, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이들 활성을 코딩하는 것이면, 어느 것이나 포함되며, 특정한 개체 유래의 폴리뉴클레오티드에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 어위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) 유래의 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에 있어서, 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균은 폴리 뉴클레오티드 자체 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 통하여 상기 대장균에 도입되어 있는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 4 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균은 어위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) 유래의 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 15의 pAC-LYCO4 벡터로 형질전환된 대장균이다. 상기 IPP 이소머라제는 대장균에서 FPP 합성에 있어서 율속단계로 작용하는 효소로 알려져 있다. 또한, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성은 야생형 대장균에는 발현되지 않는 활성으로서, FPP로부터 라이코펜을 합성하는 과정에 필요한 활성이다. 이들 4 가지의 활성을 코딩하는 대장균은 예를 들면, 원용에 의하여 그 전체 내용이 본 명세서에 포함되어지는 미국특허 제6,706,516호에 개시되어 있으며, 본 발명의 대장균은 상기 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 더하여, 라이코펜 생산 활성을 증가시키는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 대장균은 바람직하게는, 서열번호 15의 pAC-LYCO4 벡터가 도입되어 있는 대장균에 서열번호 13의 L4 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 L4R 폴리뉴 클레오티드, 서열번호 8의 H36 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 H72 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 H90 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 dxs-crl 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 dxs-rpoS 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 dxs-appY 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 crl 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 1의 appY 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입된 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 대장균은 서열번호 15의 pAC-LYCO4 벡터가 도입되어 있는 대장균에 pBluescript SKII(+) (NCBI Genbank accession No. X52328)의 BamHI 부위에 서열번호 13의 L4 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 L4R 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 H36 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 H72 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 12의 H90 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는, pBluescript-L4, pBluescript-L4R, pBluescript-H36, pBluescript-H72 또는 pBluescript-H90 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균일 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 본 발명의 대장균은 서열번호 15의 pAC-LYCO4 벡터가 도입되어 있는 대장균에 pBAD24 (NCBI Genbank accession No. X81837)의 KpnI/XbaI 부위에 서열번호 13의 L4 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 L4R 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 H36 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 H72 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 H90 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 dxs-crl 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 dxs-rpoS 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 dxs-appY 폴리뉴클레 오티드, 서열번호 2의 crl 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 appY 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는, pBAD-L4, pBAD-L4R, pBAD-H36, pBAD-H72, pBAD-H90, pBAD-dxs-crl, pBAD-dxs-rpos, pBAD-dxs-appY, pBAD-crl 또는 pBAD-appY 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균일 수 있다.

라이코펜은 많은 카르티노이드, 예를 들면 베타-카로틴, 아스타잔틴, 루테인, 피토엔, 제아잔틴, 칸타잔틴, 아도니잔틴, 크립토잔틴, 에키네논 및 아도니루빈와 같은 물질의 합성에 있어서 중간체로서 작용한다. 따라서, 본 발명의 대장균은 상기 카르티노이드 합성에 관여하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 도입함으로써 이들 카르티노이드의 생산에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 라이코펜의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 사용되는 본 발명의 대장균은 상기한 바와 같다. 본 발명의 대장균의 배양은 종래 알려진 임의의 배양방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 대장균은 29 ℃에서 0.2% (v/v)의 아라비노스를 함유하는 2YT 배지에서 배양될 수 있다.

본 발명의 방법은 배양된 배양물로부터 라이코펜을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 라이코펜의 회수는 종래 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 예컨대, 아세톤을 이용한 추출에 의해 달성될 수 있다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에서는 라이코펜 생합성 능력을 갖도록 재조합된 대장균 의 라이코펜 생산 효율을 향상시킬 수 있는 대장균 유전자를 확인하기 위하여, 먼저 대장균의 게놈 라이브러리 (genomic library)를 제작한 후 라이코펜 생산 능력을 갖는 콜로니를 탐색하였다. 라이코펜을 생산한 콜로니는 붉은 색을 띈다는 사실을 이용하여 3단계의 비색 탐색 (colorimetric screening) 과정을 통해 대조군보다 짙은 붉은 색을 갖는 6개의 콜로니를 확인하였다 (표 1 참조; 각각 L4, H36, H39, H70, H72 및 H90으로 명명). 상기 각 콜로니의 삽입 DNA 서열을 분석하고, 서열 검색 시스템을 이용하여 공지된 서열인지를 동정하였다. 그 결과, L4는 곱슬표면섬유 (curli surface fibers)를 코딩하는 csgA의 전사조절인자를 코딩하는 crl 및 외부 멤브레인 포어 단백질 E를 코딩하는 phoE로 이루어져 있고, H36은 appA 및 기타 유전자에 영향을 미치는 조절 단백질을 코딩하는 appY로 이루어져 있고, H39는 RNA 폴리머라제, 시그마 S (시그마38) 인자를 코딩하는 rpoS로 이루어져 있고, H70은 비메발론산 경로에서의 DXP 신타제를 코딩하는 dxs로 이루어져 있고, H72는 각각 기능이 미확인된 단백질을 코딩하는 ycgZ, ymgA 및 ymgB으로 이루어져 있으며, H90은 2-옥소-3-데옥시갈락토 키나제를 코딩하는 dgoK, 갈라토네이트 이용에 대한 전사 억제제(repressor)를 코딩하는 dgoR, 추정의 레플리카제(replicase)를 코딩하는 yidX, 기능이 미확인된 단백질을 코딩하는 yidA 및 yidB로 이루어져 있음을 확인하였다 (표 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 상기에서 확인된 13개의 유전자에 대해 라이코펜 생산 능력 개선 효과를 확인하기 위하여, 라이코펜 생산 능력을 갖도록 재조합된 대장균에 13개 각각의 유전자가 삽입된 벡터를 도입한 후 배양하여 라이코펜 생 산량을 비교하였다. 그 결과, appY 및 dxs가 도입된 경우 대장균의 라이코펜 생성량은 벡터만 도입된 대조군에 비해 각각 약 4.7배 높았고, rpoS 및 crl이 도입된 대장균의 라이코펜 생산량은 대조군에 비해 각각 약 3.2배 및 2.5배 높았으며, phoE의 경우 대조군에 비해 유의적인 향상 효과가 없었다 (표 3 참조). 또한, 그 외 8개의 유전자도 대조군에 비해 유의적인 향상 효과를 확인할 수 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 상기 유전자들은 dxs를 제외하고는 카로티노이드 생성 경로 자체의 유전자가 아니라 포괄적 조절 인자를 코딩하는 유전자임을 확인하였고 (표 1 참조), 따라서, 상기 포괄적 조절 유전자들 appY, rpoS 및 crl은 라이코펜 생산에 적합한 대사적 조건을 생성하는 것으로 추정된다.

상기 향상된 라이코펜 생산 효율을 갖는 4개의 유전자 appY, dxs, rpoS 및 crl 중 dxs 및 rpoS는 이미 라이코펜 생산 효율에 영향을 미칠 수 있다는 사실이 공지되어 있음을 확인하였다 (Kim, S.W. and J.D. Keasling, Biotechnol. Bioeng. 72(4):408-15; Sandman, G. et al., FEMS Microbiol. Lett. 59(1-2):77-82). 따라서, 본 발명은 appY 및 crl 유전자의 카로티노이드, 특히 라이코펜의 생산 효율 개선 효과를 최초로 개시한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기에서 라이코펜 생산 효율 개선 효과가 확인된 유전자들의 조합에 따른 라이코펜 생산 능력을 확인하기 위해, 상기 4개의 유전자 appY, dxs, rpoS 및 crl로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 복합 유전자가 삽입된 벡터를 대장균에 도입한 후 배양하여 라이코펜 생산량을 비교하였다. 그 결과, dxs 유전자 및 나머지 3개의 유전자 중 하나로 구성된 복합 유전자의 경우 라이코펜 생산율이 높았다. 구체적으로 dxs-appY의 라이코펜 생성량이 가장 높아 대조군에 비해서는 약 7.8배 및 dxs에 비해서는 약 1.7배 높았고, dxs-rpoS 및 dxs-crl의 경우도 대조군에 비해서는 각각 약 5.8배 및 약 5.2배 및 dxs에 비해서는 각각 약 1.3배 및 약 1.1배 높았다 (표 6 참조). 따라서, 본 발명의 appY 유전자, crl 유전자, dxs 유전자 및 rpoS 유전자로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 복합 유전자를 포함하는 미생물 균주는 우수한 라이코펜 생산 능력을 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 일면은 appY 유전자 또는 crl 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드; appY 유전자, crl 유전자, dxs 유전자 및 rpoS 유전자로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 복수의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 라이코펜 생산능 향상된 대장균에 관한 것이다.

본 발명의 대장균을 제조하는데에 있어서, 핵산 서열, 유전자 또는 DNA를 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 형질전환, 형질감염, 형질도입, 전기천공 및 입자충돌법 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 도입되는 상기 DNA는 코딩 서열뿐만 아니라 상기 코딩 서열의 상류 (5′-비코딩 서열), 내부 및 하류 (3′-비코딩 서열)에 위치하는 조절서열을 포함한다. 상기 조절서열은 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 연관된 코딩 서열의 번역에 영향을 미친다. 상기 조절에는 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐레이션 인지 서열, RNA 가공 부위, 효과기 (effector) 결합 부위 및 스템-루프 구조가 포함될 수 있다. 도입되는 DNA는 DNA 그 자체 또는 운반체에 삽입된 상태로 숙주세포 에 도입될 수 있다. 상기 운반체에는 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"가 포함될 수 있으며, 이들은 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 종종 가지고 있으며, 보통 2중 가닥 원형 DNA 단편인 염색체외 요소를 말한다. 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환가능하게 사용된다. 상기 요소는 많은 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합되어진 독특한 구조체로서 프로모터 및 적합한 3′-비번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물을 코딩하는 DNA를 세포에 도입시킬 수 있는, 임의의 원천으로부터 유래된 독립적으로 복제하는 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형, 단일 또는 2중 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 pBluescript SKII(+) 또는 pBAD24이다.

본 발명의 또 다른 일면은 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 라이코펜의 제조 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서 본 발명의 재조합 균주를 제조하는데 사용되는 분자 생물학적 방법은 공지된 방법을 사용하였다(J. Sambrook & D.W. Russel, (Ed.) Molecular Cloning 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

실시예 1 : 대장균의 라이코펜 생합성 능력을 향상시키는 대장균 유전자의 탐색

대장균의 라이코펜 생합성 능력을 향상시키는 대장균 유전자를 검색하기 위하여, 먼저 라이코펜 생합성 능력을 갖지 않는 대장균 DH5α(F^-Φ80dlacZ△M15 △(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK^-, mK⁺) phoA supEλ^- thi-1 gyrA96 relA1)에 라이코펜 생산 능력을 부여하였다. 라이코펜 생합성에 관련된 유전자인 각각 에르위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) 유래의 crtE , crtB , crtI와 해마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 유래의 ipi HPI를 갖는 플라스미드 벡터 pAC-LYCO4 (서열번호 15 (ipiHP1, 2371-3288; crtE, 3758-4681; crtB, 7418-8347; crtI, 5943-7401), F. X. Cunningham, the University of Maryland)를 상기 대장균 DH5α에 도입하여 라이코펜 생합성 능력을 갖는 대장균 재조합 균주를 제작하였다. pAC-LYCO4를 갖는 재조합 균주의 선별을 위해서 항생제로 클로람페니콜 (50 ㎍/ml)을 함유하는 LB 고체배지에 상기 재조합 균주를 도말하고 37 ℃의 항온 배양기에서 밤새도록 정치배양하였다. 균주의 생장 여부는 콜로니 형성의 유무 및 크기를 측정함으로써 결정하였다. 상기에서 선별된 재조합 균주를 0.2% (w/v) 아라비노스를 함유하는 2YT 배지 (16g/L Tryptone, 10g/L Yeast extract, 5g/L NaCl)에서 29 ℃로 배양하여 라이코펜을 생산함을 확인하였다.

다음으로, 야생형 대장균 균주를 이용하여 게놈 라이브러리 (genomic library)를 제작하였다. 즉, 야생형 균주인 대장균 W3110의 게놈 DNA를 분리 및 정 제하고, Sau3AI으로 부분적 절단을 한 후 0.5% 아가로스 전기영동에 의해 분획하였다. 3~6 kb 및 6~9 kb의 젤 부위를 각각 절단한 다음 젤 내의 DNA를 퀴아젠 젤 추출 키트 (Qiagen gel extraction kit; Qiagen 사)를 이용하여 분리하였다. 상기 DNA 절편 (2.7 pg)을 BamHI으로 절단되고 CIP 처리되어 탈인산화된 1.4 pg의 pBluescript SKII(+) 클로닝 벡터 (Stratagene, 미국)에 삽입해서 다양한 대장균 게놈 DNA의 단편들로 구성된 게놈 라이브러리를 구축하였다. 상기 재조합 벡터를 상기 단계에서 제작된 재조합 균주 대장균 DH5α에 무작위로 형질전환시킨 다음, 상기 게놈 라이브러리 벡터와 pAC-LYCO4를 갖는 재조합 균주의 선별을 위해서 항생제로 앰피실린 (100 ㎍/ml)과 클로람페니콜 (50 ㎍/ml)을 함유하는 LB 고체배지에 상기 재조합 균주를 도말하였다. 하룻밤 동안 37 ℃의 항온 배양기에서 배양하고, 5일 동안 실온에서 배양하였다.

다음으로, 라이코펜 생합성 능력이 향상된 콜로니를 탐색하였다 (도 2A 참조). 먼저, 붉은 색을 나타내는 약 100,000개의 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니들을 LB 아가 플레이트 상에서 스트리킹을 한 후 여전히 대조군 (pAC-LYCO4와 pBluescript SKII(+)만을 포함하는 재조합 대장균)보다 짙은 붉은색 강도를 나타내는 콜로니를 선별하였다. 1차 선별을 통해 약 1,000개의 콜로니가 선별되었고, 2차 선별을 통해 53개 및 3차 선별을 통해 6개의 콜로니가 선별되었으며, 각각 L4, H36, H39, H70, H72 및 H90으로 명명하였다. 상기 6개의 콜로니는 대조군 클로니에 비해 훨씬 붉은 색 강도가 높았다 (도 2B 참조).

상기 6개의 콜로니로부터 대장균 DNA 단편을 함유하는 pBluescript SKII(+) 플라스미드를 분리하고, 상기 대장균 DNA 단편의 서열을 분석하고 어떤 유전자인지 동정하였다. 서열 분석은 자동화된 DNA 서열분석 설비 (Solgent Co., Korea)를 사용하여 프라이머 워킹법 (primer walking)에 의해 수행하였고, DNA 단편의 동정은 상기에서 밝혀진 서열에 대해 Vector NTI Suite, ver 9.0 (InforMax, North Bethesda, MD) 및 BLAST 2.1을 사용하여 분석하였다. 그 결과가 밝혀진 L4, H36, H39, H70, H72 및 H90의 염기서열은 서열번호 13, 8, 9, 10, 11 및 12에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 얻어진 폴리뉴클레오티드 서열을 근거로 하여 상동성 검색을 수행한 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

표 1 .

콜로니	포함된 유전자 및 그에 의해 코딩되는 단백질
L4	crl: 곱슬표면섬유(curli surface fibers)를 코딩하는 csgA의 전사조절인자 phoE: 외부 멤브레인 포어 단백질 E
H36	appY: appA 및 기타 유전자에 영향을 미치는 조절 단백질
H39	rpoS: RNA 폴리머라제, 시그마 S (시그마38) 인자
H70	dxs: 비메발론산 경로에서의 DXP 신타제
H72	ycgZ: 기능 미확인 ymgA: 기능 미확인 ymgB: 기능 미확인
H90	dgoK: 2-옥소-3-데옥시갈락토 키나제 dgoR: 갈라토네이트 이용에 대한 전사 억제제(repressor) yidX: 추정의 레플리카제(replicase) yidA: 기능 미확인 yidB: 기능 미확인

상기 6개의 양성 클론에서의 라이코펜 생산의 증가를 확인하기 위하여, 클로닝 벡터인 pBluescript에 삽입된 대장균 DNA 단편을 증폭하여 pBAD24 발현 벡터 (Genbank accession No. X81837)에 클로닝하였다. pBAD24는 아라비노즈 유도성인 P_BAD 프로모터를 가지고 있어, 라이코펜 생산에 사용되는 2YT와 같은 복합 배지 중에서 발현을 정밀하게 제어할 수 있다. 먼저, 각 클론으로부터 얻어진 대장균 게놈 DNA 단편을 포함하는 pBluescript를 주형으로 하고, 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고 양말단에 Kpn1/XbaI 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여, L4, H36, H39, H70, H72 및 H90 폴리뉴클레오티드를 증폭하였다. 상기 폴리뉴클레오티드를 Kpn1/XbaI 부위에서 절단하고, 동일한 효소로 절단된 pBAD24에 연결하여 각각 pBAD24-L4, pBAD24-L4R, pBAD24-H70, pBAD24-H72 및 pBAD24-H90를 제작하였다. pBAD24-L4R는 pBAD24-L4와는 방향을 달리하여 삽인된 L4를 갖는 벡터이다. 도 3은 pBAD24-L4, pBAD24-H70, pBAD24-H72 및 pBAD24-H90의 유전자 배치를 모식적으로 나타낸 도면이다. H36 및 H39은 rpoS 및 dxs가 라이코펜 생산을 증가시킨다는 것이 알려져 있어 더 이상 확인하지 않았다.

표 2.

DNA	프라이머(서열번호)
L4	16 및 17
L4R	18 및 19
H70	20 및 21
H72	22 및 23
H90	24 및 25

상기 pAC-LYCO4가 도입된 대장균 DH5α에 위에서 제작된 각 플라스미드를 도입시켰다. 상기 pAC-LYCO4 및 재조합된 각각의 pBAD24 플라스미드를 포함하는 대장균 DH5α를 0.2% (w/v)의 아라비노스를 함유하는 2YT 배지에서 29 ℃에서 48시간 동안 배양하였다.

상기 배양액을 13,000 rpm에서 3분간 원심 분리한 후, 회수된 균체를 물로 1회 세척하고 105 ℃에서 밤새도록 건조한 후, 건조균체중량 (DCW)을 측정하였다. 상기 건조균체 내의 라이코펜 함량을 측정하기 위하여, 상기 건조균체에 아세톤 1ml를 첨가하고 55℃에서 15분간 암흑에서 추출하였다. 이를 13,000rpm에서 10분간 원심분리해서 균체를 침전시킨 후에 상등액만을 취해 시험관으로 옮겼다. 스펙트로포토미터 (Beckman DU Series 640 spectrophotometer)를 이용해서 470nm에서 상기 상등액의 흡광도를 측정하고, 이를 라이코펜 표준물(Sigma)과 비교하였다. 대조군으로서 pAC-LYCO4 및 표 2의 유전자가 삽입되지 않은 pBAD24 플라스미드 자체가 도입된 대장균 DH5α를 사용하였다. 그에 따른 라이코펜 함량을 표 3에 나타내었다. 표 3의 각 데이터는 3회의 실험을 수행하여, 그의 평균값 및 표준 오차로 나타내었다.

표 3.

벡터	라이코펜 함량 (mg/g 건조중량)
pBAD24	0.5±0.03
pBAD24-L4	1.5±0.05
pBAD24-L4R	1.4±0.06
pBAD24-H36	1.7±0.05
pBAD24-H72	1.1±0.08
pBAD24-H90	1.0±0.09

appY 유전자를 포함하고 있는 pBAD-H36를 포함하는 클론에서 라이코펜 생산량이 가장 높았다. 그외의 클론도 모두 대조군에 비하여 2 내지 3 배의 생산량 증가를 보였다. crl 및 phoE를 포함하는 삽입체의 방향이 다름에도 불구하고, pBAD24-L4과 pBAD24-L4R 사이에서 라이코펜 생산량은 유의한 차이는 없었다.

실시예 2 : 각 단독 유전자가 도입된 재조합 균주의 제조 및 그의 라이코펜 생산 능력 측정

상기 실시예 1에서 대장균의 라이코펜 생산 능력을 개선시키는 것으로 추정 되는 유전자들 각각에 대하여 라이코펜 생산 능력을 측정하였다.

먼저, 실시예 1에서 얻어진 대장균 콜로니로부터 분리된 각 대장균 게놈 단편을 포함하는 pBluescript SKII(+) 벡터를 주형으로 하고, 하기 표 4에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 수행하여, 정크서열 (junk sequences)은 제외하고 ORF 부위 및 리보솜 결합 서열만으로 이루어진 각 유전자의 핵산 서열을 증폭하였다. PCR은 각 프라이머 3-5 pmol, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 2mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.25 mM dNTP 및 1.25U의 Taq 폴리머라제 (Gibco)를 포함하는 반응 용액에서 94℃에서 5분간 최초 변성화 반응을 수행하고, 94 ℃에서30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 반응을 35회 반복하여 수행한 다음, 72℃에서 10분간 최종 연장 반응을 수행함으로써 종결되었다. 이후, PCR 산물은 2% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었다. 상기 프라이머들은 PCR 산물을 재조합의 편의를 위하여 말단에 KpnI/XbaI 제한효소 부위를 포함하는 것을 사용하였다.

표 4.

유전자	프라이머 (서열번호)
crl	26 및 27
phoE	28 및 29
appY	30 및 31
rpoS	32 및 33
dxs	34 및 35
ycgZ	36 및 37
ymgA	38 및 39
ymgB	40 및 41
dgoK	42 및 43
dgoR	44 및 45
yidX	46 및 47
yidA	48 및 49
yidB	50 및 51

상기에서 증폭된 DNA 산물들을 각각 KpnI/XbaI 제한효소로 절단하고, KpnI/XbaI으로 절단된 pBAD24 발현 벡터 (Genbank accession No. X81837)에 삽입하여 벡터를 제조하였다. 제조된 재조합 벡터는 삽입된 유전자에 따라 각각 pBAD-crl, pBAD-phoE, pBAD-appY, pBAD-rpoS, pBAD-dxs, pBAD-ycgZ, pBAD-ymgA, pBAD-ymgB, pBAD-dgoK, pBAD-dgoR, pBAD-yidX, pBAD-yidA 및 pBAD-yidB로 명명하였다.

상기 실시예 1에서 제작된 pAC-LYCO4가 도입된 대장균 DH5α에 상기 벡터를 도입시켰다. 그 결과 얻어진 pAC-LYCO4 및 재조합된 각각의 pBAD24 벡터를 포함하는 대장균 DH5α를 0.2% (w/v)의 아라비노스를 함유하는 2YT 배지에서 29 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양액을 13,000 rpm에서 3분간 원심 분리한 후, 회수된 균체를 물로 1회 세척하고 105 ℃에서 밤새도록 건조한 후, 건조균체중량 (DCW)을 측정하였다. 상기 건조균체 내의 라이코펜 함량을 측정하기 위하여, 상기 건조균체에 아세톤 1mL를 첨가하고 55℃에서 15분간 암흑에서 추출하였다. 이를 13,000rpm에서 10분간 원심분리해서 균체를 침전시킨 후에 상등액만을 취해 시험관으로 옮겼다. 스펙트로포토미터 (Beckman DU Series 640 spectrophotometer)를 이용해서 470nm에서 상기 상등액의 흡광도를 측정하고, 이를 라이코펜 표준물(Sigma)과 비교하였다. 대조군으로서 pAC-LYCO4 및 표 4의 유전자가 삽입되지 않은 pBAD24 플라스미드 자체가 도입된 대장균 DH5α를 사용하였다. 그 결과 측정된 라이코펜 함량을 표 5에 나타내었다. 표 5의 각 데이터는 3회의 실험을 수행하여, 그의 평균값 및 표준 오차로 나타내었다.

표 5에 나타낸 바와 같이, pBAD-appY 및 pBAD-dxs의 경우 라이코펜 생성량이 대조군에 비해 각각 약 4.7배 높았고, pBAD-rpoS, pBAD-crl 및 pBAD-phoE의 경우 각각 약 3.2배, 2.5배 및 약 1.2배 높았다. 상기 결과로부터, appY, dxs, rpoS, crl 유전자가 도입된 재조합 대장균 균주의 라이코펜 생산 능력은 현저히 향상되었지만, phoE 유전자가 도입된 재조합 대장균 균주의 경우 유의적으로 향상되지 않음을 확인하였다.

표 5.

유전자	플라스미드	라이코펜 함량(mg/g 건조 중량)
대조군	pBAD24	0.6±0.03
crl	pBAD-crl	1.5±0.05
phoE	pBAD-phoE	0.7±0.04
rpoS	pBAD-rpoS	1.7±0.08
appY	pBAD-appY	2.8±0.09
dxs	pBAD-dxs	2.8±0.07

실시예 3 : 2개 이상의 복수 유전자가 도입된 재조합 균주의 제조 및 그의 라이코펜 생산 능력 측정

상기 실시예 2에서 대장균의 라이코펜 생산 능력을 개선시키는 것으로 확인된 유전자들의 조합에 따른 라이코펜 생산 능력을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 사용된 방법들을 응용하여 crl, rpoS 및 appY로 구성된 군에서 선택되는 1종의 유전자 및 dxs 유전자가 함께 삽입된 플라스미드 벡터 pBADdxs-crl, pBADdxs-rpoS 및 pBADdxs-appY를 각각 제조하였다.

상기 재조합 벡터를 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 형질전환 및 배양하여 그의 라이코펜 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다. 표 6의 데이터는 3회의 실험을 수행하여, 그의 평균값 및 표준 오차로 나타낸 것이다.

표 6에 나타낸 바와 같이, pBADdxs-appY의 라이코펜 생성량이 가장 높아 대조군에 비해서는 약 7.8배 및 pBAD-dxs에 비해서는 약 1.7배 높았다. 또한, pBADdxs-rpoS 및 pBADdxs-crl의 경우도 대조군에 비해서는 각각 약 5.8배 및 약 5.2배 및 pBAD-dxs에 비해서는 각각 약 1.3배 및 약 1.1배 높았다. 상기 결과로부터, 각각 dxs와 crl, dxs와 rpoS 및 dxs와 appY 유전자가 도입된 재조합 대장균 균주의 라이코펜 생산 능력은 단일 유전자 중 가장 높은 라이코펜 생산 능력을 갖는 dxs가 도입된 재조합 균주보다 우수함을 확인할 수 있었다.

표 6.

유전자	플라스미드	라이코펜 함량(mg/g 건조 중량)
대조군	pBAD24	0.6±0.03
dxs	pBAD-dxs	2.8±0.07
dxs 및 crl	pBADdxs-crl	3.1±0.11
dxs 및 rpoS	pBADdxs-rpoS	3.5±0.10
dxs 및 appY	pBADdxs-appY	4.7±0.12

본 발명에 따른 대장균에 의하면, 현저하게 향상된 라이코펜 생산능을 갖는다.

본 발명의 라이코펜 생산 방법에 의하면, 높은 생산성으로 라이코펜을 생산할 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Gyeongsang National University <120> Escherichia coli capable of producing lycopene with enhanced productivity and method for producing lycopene using the same <130> PN060442 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 732 <212> DNA <213> E.coli <220> <221> gene <222> (1)..(732) <223> E.coli appY gene <400> 1 atggattatg tttgctccgt agttttcatc tgtcaatcat ttgatttaat tataaacagg 60 agagttatct cgtttattgt aagcgacaaa attagaaggg agttaccagt atgcccctct 120 aaactaagaa ttgttgatat agataagaaa acatgtttat ccttttttat cgacgtgaat 180 aatgagctgc ctggcaaatt tactcttgat aagaatggct atattgctga agaggaacct 240 ccattatcgc ttgttttttc tctgtttgaa gggattaaaa tagcagactc acactccctt 300 tggttaaaag aaagactatg tatatcctta cttgccatgt tcaaaaaacg cgaaagtgta 360 aattcattta tactaacaaa tataaataca tttacctgta aaattactgg aataatcagt 420 tttaatattg agcggcaatg gcatttaaaa gatattgcgg aattgattta tacgagtgaa 480 agtttaataa aaaaaagatt aagggatgaa ggaacgtcat ttactgaaat attgagagat 540 actaggatga 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ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat 720 gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc 780 aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840 ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900 cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960 gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993 <210> 5 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.coli dxs-appY fusion protein gene <400> 5 atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac 60 ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaacagg aacccagtga taacgatttg 120 gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt 180 taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg 240 cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt 300 ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc 360 gaagagggca acctggggct gatccgcgcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc 420 cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac 480 caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga 540 accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag 600 caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtcttaacga gcgcattacc 660 tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat 720 gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc 780 aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840 ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900 cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960 gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993 <210> 6 <211> 2298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.coli dxs-crl fusion protein gene <400> 6 caggaggccc ctgatgagtt ttgatattgc caaatacccg accctggcac tggtcgactc 60 cacccaggag ttacgactgt tgccgaaaga gagtttaccg aaactctgcg acgaactgcg 120 ccgctattta ctcgacagcg tgagccgttc cagcgggcac ttcgcctccg ggctgggcac 180 ggtcgaactg accgtggcgc tgcactatgt ctacaacacc ccgtttgacc aattgatttg 240 ggatgtgggg catcaggctt atccgcataa aattttgacc ggacgccgcg acaaaatcgg 300 caccatccgt cagaaaggcg gtctgcaccc gttcccgtgg cgcggcgaaa gcgaatatga 360 cgtattaagc gtcgggcatt catcaacctc catcagtgcc ggaattggta ttgcggttgc 420 tgccgaaaaa gaaggcaaaa atcgccgcac cgtctgtgtc attggcgatg gcgcgattac 480 cgcaggcatg gcgtttgaag cgatgaatca cgcgggcgat atccgtcctg atatgctggt 540 gattctcaac gacaatgaaa tgtcgatttc cgaaaatgtc ggcgcgctca acaaccatct 600 ggcacagctg ctttccggta agctttactc ttcactgcgc gaaggcggga aaaaagtttt 660 ctctggcgtg ccgccaatta aagagctgct caaacgcacc gaagaacata ttaaaggcat 720 ggtagtgcct ggcacgttgt ttgaagagct gggctttaac tacatcggcc cggtggacgg 780 tcacgatgtg ctggggctta tcaccacgct aaagaacatg cgcgacctga aaggcccgca 840 gttcctgcat atcatgacca aaaaaggtcg tggttatgaa ccggcagaaa aagacccgat 900 cactttccac gccgtgccta aatttgatcc ctccagcggt tgtttgccga aaagtagcgg 960 cggtttgccg agctattcaa aaatctttgg cgactggttg tgcgaaacgg cagcgaaaga 1020 caacaagctg atggcgatta ctccggcgat gcgtgaaggt tccggcatgg tcgagttttc 1080 acgtaaattc ccggatcgct acttcgacgt ggcaattgcc gagcaacacg cggtgacctt 1140 tgctgcgggt ctggcgattg gtgggtacaa acccattgtc gcgatttact ccactttcct 1200 gcaacgcgcc tatgatcagg tgctgcatga cgtggcgatt caaaagcttc cggtcctgtt 1260 cgccatcgac cgcgcgggca ttgttggtgc tgacggtcaa acccatcagg gtgcttttga 1320 tctctcttac ctgcgctgca taccggaaat ggtcattatg accccgagcg atgaaaacga 1380 atgtcgccag atgctctata ccggctatca ctataacgat ggcccgtcag cggtgcgcta 1440 cccgcgtggc aacgcggtcg gcgtggaact gacgccgctg gaaaaactac caattggcaa 1500 aggcattgtg aagcgtcgtg gcgagaaact ggcgatcctt aactttggta cgctgatgcc 1560 agaagcggcg aaagtcgccg aatcgctgaa cgccacgctg gtcgatatgc gttttgtgaa 1620 accgcttgat gaagcgttaa ttctggaaat ggccgccagc catgaagcgc tggtcaccgt 1680 agaagaaaac gccattatgg gcggcgcagg cagcggcgtg aacgaagtgc tgatggccca 1740 tcgtaaacca gtacccgtgc tgaacattgg cctgccggac ttctttattc cgcaaggaac 1800 tcaggaagaa atgcgcgccg aactcggcct cgatgccgct ggtatggaag ccaaaatcaa 1860 ggcctggctg gcataacccg ggaggagata gcaatgacgt taccgagtgg acacccgaag 1920 agcagattga tcaaaaaatt taccgcacta ggcccgtata ttcgtgaagg taagtgcgaa 1980 gataatcgat tctttttcga ttgtctggct gtatgcgtca acgtgaaacc ggcaccggaa 2040 gtgcgtgagt tctggggctg gtggatggag cttgaagcgc aggaatcccg ttttacctac 2100 agttaccagt ttggtctgtt cgataaagca ggcgactgga agagtgttcc ggtaaaagac 2160 actgaagtgg ttgaacgact ggagcacacc ctacgtgagt ttcacgagaa gctgcgtgaa 2220 ctgctgacga cgctgaatct gaagctggaa ccggcggatg attttcgtga tgaaccggtg 2280 aagttaacgg cgtgagtt 2298 <210> 7 <211> 2888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.coli dxs-rpoS fusion protein gene <400> 7 caggaggccc ctgatgagtt ttgatattgc caaatacccg accctggcac tggtcgactc 60 cacccaggag ttacgactgt tgccgaaaga gagtttaccg aaactctgcg acgaactgcg 120 ccgctattta ctcgacagcg tgagccgttc cagcgggcac ttcgcctccg ggctgggcac 180 ggtcgaactg accgtggcgc tgcactatgt ctacaacacc ccgtttgacc aattgatttg 240 ggatgtgggg catcaggctt atccgcataa aattttgacc ggacgccgcg acaaaatcgg 300 caccatccgt cagaaaggcg gtctgcaccc gttcccgtgg cgcggcgaaa gcgaatatga 360 cgtattaagc gtcgggcatt catcaacctc catcagtgcc ggaattggta ttgcggttgc 420 tgccgaaaaa gaaggcaaaa atcgccgcac cgtctgtgtc attggcgatg gcgcgattac 480 cgcaggcatg gcgtttgaag cgatgaatca cgcgggcgat atccgtcctg atatgctggt 540 gattctcaac gacaatgaaa tgtcgatttc cgaaaatgtc ggcgcgctca acaaccatct 600 ggcacagctg ctttccggta agctttactc ttcactgcgc gaaggcggga aaaaagtttt 660 ctctggcgtg ccgccaatta aagagctgct caaacgcacc gaagaacata ttaaaggcat 720 ggtagtgcct ggcacgttgt ttgaagagct gggctttaac tacatcggcc cggtggacgg 780 tcacgatgtg ctggggctta tcaccacgct aaagaacatg cgcgacctga aaggcccgca 840 gttcctgcat atcatgacca aaaaaggtcg tggttatgaa ccggcagaaa aagacccgat 900 cactttccac gccgtgccta aatttgatcc ctccagcggt tgtttgccga aaagtagcgg 960 cggtttgccg agctattcaa aaatctttgg cgactggttg tgcgaaacgg cagcgaaaga 1020 caacaagctg atggcgatta ctccggcgat gcgtgaaggt tccggcatgg tcgagttttc 1080 acgtaaattc ccggatcgct acttcgacgt ggcaattgcc gagcaacacg cggtgacctt 1140 tgctgcgggt ctggcgattg gtgggtacaa acccattgtc gcgatttact ccactttcct 1200 gcaacgcgcc tatgatcagg tgctgcatga cgtggcgatt caaaagcttc cggtcctgtt 1260 cgccatcgac cgcgcgggca ttgttggtgc tgacggtcaa acccatcagg gtgcttttga 1320 tctctcttac ctgcgctgca taccggaaat ggtcattatg accccgagcg atgaaaacga 1380 atgtcgccag atgctctata ccggctatca ctataacgat ggcccgtcag cggtgcgcta 1440 cccgcgtggc aacgcggtcg gcgtggaact gacgccgctg gaaaaactac caattggcaa 1500 aggcattgtg aagcgtcgtg gcgagaaact ggcgatcctt aactttggta cgctgatgcc 1560 agaagcggcg aaagtcgccg aatcgctgaa cgccacgctg gtcgatatgc gttttgtgaa 1620 accgcttgat gaagcgttaa ttctggaaat ggccgccagc catgaagcgc tggtcaccgt 1680 agaagaaaac gccattatgg gcggcgcagg cagcggcgtg aacgaagtgc tgatggccca 1740 tcgtaaacca gtacccgtgc tgaacattgg cctgccggac ttctttattc cgcaaggaac 1800 tcaggaagaa atgcgcgccg aactcggcct cgatgccgct ggtatggaag ccaaaatcaa 1860 ggcctggctg gcataacccg ggaggagcca ccttatgagt cagaatacgc tgaaagttca 1920 tgatttaaat gaagatgcgg aatttgatga gaacggagtt gaggtttttg acgaaaaggc 1980 cttagtagaa caggaaccca gtgataacga tttggccgaa gaggaactgt tatcgcaggg 2040 agccacacag cgtgtgttgg acgcgactca gctttacctt ggtgagattg gttattcacc 2100 actgttaacg gccgaagaag aagtttattt tgcgcgtcgc gcactgcgtg gagatgtcgc 2160 ctctcgccgc cggatgatcg agagtaactt gcgtctggtg gtaaaaattg cccgccgtta 2220 tggcaatcgt ggtctggcgt tgctggacct tatcgaagag ggcaacctgg ggctgatccg 2280 cgcggtagag aagtttgacc cggaacgtgg tttccgcttc tcaacatacg caacctggtg 2340 gattcgccag acgattgaac gggcgattat gaaccaaacc cgtactattc gtttgccgat 2400 tcacatcgta aaggagctga acgtttacct gcgaaccgca cgtgagttgt cccataagct 2460 ggaccatgaa ccaagtgcgg aagagatcgc agagcaactg gataagccag ttgatgacgt 2520 cagccgtatg cttcgtctta acgagcgcat tacctcggta gacaccccgc tgggtggtga 2580 ttccgaaaaa gcgttgctgg acatcctggc cgatgaaaaa gagaacggtc cggaagatac 2640 cacgcaagat gacgatatga agcagagcat cgtcaaatgg ctgttcgagc tgaacgccaa 2700 acagcgtgaa gtgctggcac gtcgattcgg tttgctgggg tacgaagcgg caacactgga 2760 agatgtaggt cgtgaaattg gcctcacccg tgaacgtgtt cgccagattc aggttgaagg 2820 cctgcgccgt ttgcgcgaaa tcctgcaaac gcaggggctg aatatcgaag cgctgttccg 2880 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cactcccttt ggttaaaaga aagactatgt atatccttac 840 ttgccatgtt caaaaaacgc gaaagtgtaa attcatttat actaacaaat ataaatacat 900 ttacctgtaa aattactgga ataatcagtt ttaatattga gcggcaatgg catttaaaag 960 atattgcgga attgatttat acgagtgaaa gtttaataaa aaaaagatta agggatgaag 1020 gaacgtcatt tactgaaata ttgagagata ctaggatgag gtatgcaaaa aaactcataa 1080 cttcaaactc ttattctatc aatgtcgtag cccagaaatg tggctataac agtacttcat 1140 atttcatatg tgcatttaaa gattattatg gtgtcacgcc atctcattat tttgagaaaa 1200 taatcggcgt cacagatgga ataaacaaaa caattgactg ataatgttta ttacaagttg 1260 tctacatgtt aattataata ttatacagcg ttttttttga tgtgatattc tggaaccatt 1320 aatttgtaat tgggttgctg tcgcctattt tatacatact ataattgatg gttttctatg 1380 tgatttagtt aataaccttc tgggtttatt ttaagggtta attgttacat tgaaatggct 1440 agttattccc cggg 1454 <210> 9 <211> 1260 <212> DNA <213> E.coli <400> 9 cggaaccagt tcaacacgct tgcattttga aattcgttac aaggggaaat ccgtaaaccc 60 gctgcgttat ttgccgcagc gataaatcgg cggaaccagg cttttgcttg aatgttccgt 120 caagggatca cgggtaggag ccaccttatg agtcagaata cgctgaaagt tcatgattta 180 aatgaagatg cggaatttga tgagaacgga gttgaggttt ttgacgaaaa ggccttagta 240 gaacaggaac ccagtgataa cgatttggcc gaagaggaac tgttatcgca gggagccaca 300 cagcgtgtgt tggacgcgac tcagctttac cttggtgaga ttggttattc accactgtta 360 acggccgaag aagaagttta ttttgcgcgt cgcgcactgc gtggagatgt cgcctctcgc 420 cgccggatga tcgagagtaa cttgcgtctg gtggtaaaaa ttgcccgccg ttatggcaat 480 cgtggtctgg cgttgctgga ccttatcgaa gagggcaacc tggggctgat ccgcgcggta 540 gagaagtttg acccggaacg tggtttccgc ttctcaacat acgcaacctg gtggattcgc 600 cagacgattg aacgggcgat tatgaaccaa acccgtacta ttcgtttgcc gattcacatc 660 gtaaaggagc tgaacgttta cctgcgaacc gcacgtgagt tgtcccataa gctggaccat 720 gaaccaagtg cggaagagat cgcagagcaa ctggataagc cagttgatga cgtcagccgt 780 atgcttcgtc ttaacgagcg cattacctcg gtagacaccc cgctgggtgg tgattccgaa 840 aaagcgttgc tggacatcct ggccgatgaa aaagagaacg gtccggaaga taccacgcaa 900 gatgacgata tgaagcagag catcgtcaaa tggctgttcg agctgaacgc caaacagcgt 960 gaagtgctgg cacgtcgatt cggtttgctg gggtacgaag cggcaacact ggaagatgta 1020 ggtcgtgaaa ttggcctcac ccgtgaacgt gttcgccaga ttcaggttga aggcctgcgc 1080 cgtttgcgcg aaatcctgca aacgcagggg ctgaatatcg aagcgctgtt ccgcgagtaa 1140 gtaagcatct gtcagaaagg ccagtctcaa gcgaggctgg ccttttctgt gcacaataaa 1200 aggtccgatg cccatcggac ctttttatta aggtcaaatt accgcccata cgcaccaggt 1260 1260 <210> 10 <211> 2944 <212> DNA <213> E.coli <400> 10 caactggctg aacagtcact cgatacctcg gcactggaag cgctagcgga ctacatcatc 60 cagcgtaata aataaacaat aagtattaat aggcccctga tgagttttga tattgccaaa 120 tacccgaccc tggcactggt cgactccacc caggagttac gactgttgcc gaaagagagt 180 ttaccgaaac tctgcgacga actgcgccgc tatttactcg acagcgtgag ccgttccagc 240 gggcacttcg cctccgggct gggcacggtc gaactgaccg tggcgctgca ctatgtctac 300 aacaccccgt ttgaccaatt gatttgggat gtggggcatc aggcttatcc gcataaaatt 360 ttgaccggac gccgcgacaa aatcggcacc atccgtcaga aaggcggtct gcacccgttc 420 ccgtggcgcg gcgaaagcga atatgacgta ttaagcgtcg ggcattcatc aacctccatc 480 agtgccggaa ttggtattgc ggttgctgcc gaaaaagaag gcaaaaatcg ccgcaccgtc 540 tgtgtcattg gcgatggcgc gattaccgca ggcatggcgt ttgaagcgat gaatcacgcg 600 ggcgatatcc gtcctgatat gctggtgatt ctcaacgaca atgaaatgtc gatttccgaa 660 aatgtcggcg cgctcaacaa ccatctggca cagctgcttt ccggtaagct ttactcttca 720 ctgcgcgaag gcgggaaaaa agttttctct ggcgtgccgc caattaaaga gctgctcaaa 780 cgcaccgaag aacatattaa aggcatggta gtgcctggca cgttgtttga agagctgggc 840 tttaactaca tcggcccggt ggacggtcac gatgtgctgg ggcttatcac cacgctaaag 900 aacatgcgcg acctgaaagg cccgcagttc ctgcatatca tgaccaaaaa aggtcgtggt 960 tatgaaccgg cagaaaaaga cccgatcact ttccacgccg tgcctaaatt tgatccctcc 1020 agcggttgtt tgccgaaaag tagcggcggt ttgccgagct attcaaaaat ctttggcgac 1080 tggttgtgcg aaacggcagc gaaagacaac aagctgatgg cgattactcc ggcgatgcgt 1140 gaaggttccg gcatggtcga gttttcacgt aaattcccgg atcgctactt cgacgtggca 1200 attgccgagc aacacgcggt gacctttgct gcgggtctgg cgattggtgg gtacaaaccc 1260 attgtcgcga tttactccac tttcctgcaa cgcgcctatg atcaggtgct gcatgacgtg 1320 gcgattcaaa agcttccggt cctgttcgcc atcgaccgcg cgggcattgt tggtgctgac 1380 ggtcaaaccc 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gacaaacacg aggattgggg aacggtgcat cacatcaacg aagcgtgaga gctttaatgc 3300 ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat 3360 gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg 3420 ccggtactgc cgggcctctt gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat 3480 ggcgtgctgc tagcgctata tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca 3540 ctgtccgacc gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc 3600 gactacgcga tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatct aaaggcacag cgtctcatgc 3660 ttcgcacaat gtaaaactgc ttcagaacct ggcgagagct atccgcgcgg tctacggtta 3720 actgatacta aaagacaatt cagcgggtaa ccttgcaatg gtgagtggca gtaaagcggg 3780 cgtttcgcct catcgcgaaa tagaagtaat gagacaatcc attgacgatc acctggctgg 3840 cctgttacct gaaaccgaca gccaggatat cgtcagcctt gcgatgcgtg aaggcgtcat 3900 ggcacccggt aaacggatcc gtccgctgct gatgctgctg gccgcccgcg acctccgcta 3960 ccagggcagt atgcctacgc tgctcgatct cgcctgcgcc gttgaactga cccataccgc 4020 gtcgctgatg ctcgacgaca tgccctgcat ggacaacgcc gagctgcgcc gcggtcagcc 4080 cactacccac aaaaaatttg gtgagagcgt ggcgatcctt gcctccgttg ggctgctctc 4140 taaagccttt ggtctgatcg ccgccaccgg cgatctgccg ggggagaggc gtgcccaggc 4200 ggtcaacgag ctctctaccg ccgtgggcgt gcagggcctg gtactggggc agtttcgcga 4260 tcttaacgat gccgccctcg accgtacccc tgacgctatc ctcagcacca accacctcaa 4320 gaccggcatt ctgttcagcg cgatgctgca gatcgtcgcc attgcttccg cctcgtcgcc 4380 gagcacgcga gagacgctgc acgccttcgc cctcgacttc ggccaggcgt ttcaactgct 4440 ggacgatctg cgtgacgatc acccggaaac cggtaaagat cgcaataagg acgcgggaaa 4500 atcgacgctg gtcaaccggc tgggcgcaga cgcggcccgg caaaagctgc gcgagcatat 4560 tgattccgcc gacaaacacc tcacttttgc ctgtccgcag ggcggcgcca tccgacagtt 4620 tatgcatctg tggtttggcc atcaccttgc cgactggtca ccggtcatga aaatcgcctg 4680 ataccgccct tttgggttca agcagtacat aacgatggaa ccacattaca ggagtagtga 4740 tgaatgaagg acgagcgcct tgttcagcgt aagaacgatc atctggatat cgttctcgac 4800 ccccgtcgcg ccgtaactca ggctagcgca ggttttgagc gctggcgctt tacccactgc 4860 gccctgccag agctgaattt tagcgacatc acgctggaaa ccaccttcct gaatcggcag 4920 ctacaggctc cgctgctgat cagctccatg accggcggcg ttgagcgctc gcgccatatc 4980 aaccgccacc tcgccgaggc ggcgcaggtg ctaaaaattg cgatgggggt gggctcccag 5040 cgcgtcgcca ttgagagcga cgcgggctta gggctggata aaaccctgcg gcagctggct 5100 ccggacgtgc cgctgctggc gaacctcggc gcggcgcagc tgaccggcag aaaaggtatt 5160 gattacgccc gacgggccgt ggagatgatc gaggcggatg cgctgattgt gcacctaaac 5220 ccgctgcagg aggcgctaca gcccggcggc gatcgcgact ggcgcggacg gctggcggct 5280 attgaaactc tggtccgcga gctgcccgtt ccgctggtgg tgaaagaggt gggagccggt 5340 atctcccgaa ccgtggccgg gcagctgatc gatgccggcg ttaccgtgat tgacgtcgcg 5400 ggcgcgggcg gcaccagctg ggccgccgtt gaaggcgagc gggcggccac cgagcagcag 5460 cgcagcgtgg ccaacgtctt tgccgactgg gggatcccca ccgctgaggc gctggttgac 5520 attgccgagg cctggccgca gatgcccctt attgcctcgg gaatgcgggc tgggctattt 5580 caccctacca ctggctattc gctgccgctg gcggtggccc ttgccgacgc gattgccgac 5640 agcccgcggc tgggcagcgt tccgctctat cagctcaccc ggcagtttgc cgaacgccac 5700 tggcgcaggc agggattctt ccgcctgctg aaccggatgc ttttcctggc cgggcgcgag 5760 gagaaccgct ggcgggtgat gcagcgcttt tatgggctgc cggagcccac cgtagagcgc 5820 ttttacgccg gtcggctctc tctctttgat aaggcccgca ttttgacggg caagccaccg 5880 gttccgctgg gcgaagcctg gcgggcggcg ctgaaccatt ttcctgacag acgagataaa 5940 ggatgaaaaa aaccgttgtg attggcgcag gctttggtgg cctggcgctg gcgattcgcc 6000 tgcaggcggc agggatccca accgtactgc tggagcagcg ggacaagccc ggcggtcggg 6060 cctacgtctg gcatgaccag ggctttacct ttgacgccgg gccgacggtg atcaccgatc 6120 ctaccgcgct tgaggcgctg ttcaccctgg ccggcaggcg catggaggat tacgtcaggc 6180 tgctgccggt aaaacccttc taccgactct gctgggagtc cgggaagacc ctcgactatg 6240 ctaacgacag cgccgagctt gaggcgcaga ttacccagtt caacccccgc gacgtcgagg 6300 gctaccggcg ctttctggct tactcccagg cggtattcca ggagggatat ttgcgcctcg 6360 gcagcgtgcc gttcctctct tttcgcgaca tgctgcgcgc cgggccgcag ctgcttaagc 6420 tccaggcgtg gcagagcgtc taccagtcgg tttcgcgctt tattgaggat gagcatctgc 6480 ggcaggcctt ctcgttccac tccctgctgg taggcggcaa ccccttcacc acctcgtcca 6540 tctacaccct gatccacgcc cttgagcggg agtggggggt ctggttccct gagggcggca 6600 ccggggcgct ggtgaacggc atggtgaagc tgtttaccga tctgggcggg gagatcgaac 6660 tcaacgcccg ggtcgaagag ctggtggtgg ccgataaccg cgtaagccag gtccggctgg 6720 cggatggtcg gatctttgac accgacgccg tagcctcgaa cgctgacgtg gtgaacacct 6780 ataaaaagct gctcggccac catccggtgg ggcagaagcg ggcggcagcg ctggagcgca 6840 agagcatgag caactcgctg tttgtgctct acttcggcct gaaccagcct cattcccagc 6900 tggcgcacca taccatctgt tttggtcccc gctaccggga gctgatcgac gagatcttta 6960 ccggcagcgc gctggcggat gacttctcgc tctacctgca ctcgccctgc gtgaccgatc 7020 cctcgctcgc gcctcccggc tgcgccagct tctacgtgct ggccccggtg ccgcatcttg 7080 gcaacgcgcc gctggactgg gcgcaggagg ggccgaagct gcgcgaccgc atctttgact 7140 accttgaaga gcgctatatg cccggcctgc gtagccagct ggtgacccag cggatcttta 7200 ccccggcaga cttccacgac acgctggatg cgcatctggg atcggccttc tccatcgagc 7260 cgctgctgac ccaaagcgcc tggttccgcc cgcacaaccg cgacagcgac attgccaacc 7320 tctacctggt gggcgcaggt actcaccctg gggcgggcat tcctggcgta gtggcctcgg 7380 cgaaagccac cgccagcctg atgattgagg atctgcaatg agccaaccgc cgctgcttga 7440 ccacgccacg cagaccatgg ccaacggctc gaaaagtttt gccaccgctg cgaagctgtt 7500 cgacccggcc acccgccgta gcgtgctgat gctctacacc tggtgccgcc actgcgatga 7560 cgtcattgac gaccagaccc acggcttcgc cagcgaggcc gcggcggagg aggaggccac 7620 ccagcgcctg gcccggctgc gcacgctgac cctggcggcg tttgaagggg ccgagatgca 7680 ggatccggcc ttcgctgcct ttcaggaggt ggcgctgacc cacggtatta cgccccgcat 7740 ggcgctcgat cacctcgacg gctttgcgat ggacgtggct cagacccgct atgtcacctt 7800 tgaggatacg ctgcgctact gctatcacgt ggcgggcgtg gtgggtctga tgatggccag 7860 ggtgatgggc gtgcgggatg agcgggtgct ggatcgcgcc tgcgatctgg ggctggcctt 7920 ccagctgacg aatatcgccc gggatattat tgacgatgcg gctattgacc gctgctatct 7980 gcccgccgag tggctgcagg atgccgggct gaccccggag aactatgccg cgcgggagaa 8040 tcgggccgcg ctggcgcggg tggcggagcg gcttattgat gccgcagagc cgtactacat 8100 ctcctcccag gccgggctac acgatctgcc gccgcgctgc gcctgggcga tcgccaccgc 8160 ccgcagcgtc taccgggaga tcggtattaa ggtaaaagcg gcgggaggca gcgcctggga 8220 tcgccgccag cacaccagca aaggtgaaaa aattgccatg ctgatggcgg caccggggca 8280 ggttattcgg gcgaagacga cgagggtgac gccgcgtccg gccggtcttt ggcagcgtcc 8340 cgtttaggcg ggcggccatg acgttcacgc aggatcgcct gtaggtcggc aggcttgcgg 8400 gcgtaaataa aaccgaagga gacgcagccc tcccggccgc gcaccgcgtg gtgcaggcgg 8460 tgggcgacgt agagccgctt caggtagccc cggcgcggga tcccgcctcg ccgtgctgtc 8520 cggtctcaac ctgatccgcc agaatcgagc caacgggatc ggccagcacg aattcggtat 8580 gcggagagtg tttggcaaac catgcctgca agccacccag cgtgccgccg gagccaacgc 8640 ctactaccac ggcatcaacc ctgcctgcca gctggtcgaa cagctccggt gcggtggtgg 8700 tggcgtgcgc cagcgggttg gccgggttag agaactgatc aatatagtaa gcacccggcg 8760 tctcctctgc caggcggcgg gcgtagtcct gatagtactc cgggtggccc tttgtcacgt 8820 cggagcgggt caggcgcaca tcaacaccca gcgcacgcag gtggtagatc ctctacgccg 8880 gacgcatcgt ggccggcatc accggcgcca caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg 8940 acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg 9000 tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac 9060 cattccttgc ggcggcggtg ctcaacggcc tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc 9120 aggagtcgca taagggagag cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct 9180 ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca 9240 tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc 9300 gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg 9360 ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg 9420 ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga 9480 tggccttccc cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg 9540 ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg 9600 ctcttaccag cctaacttcg atcactggac cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct 9660 cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc 9720 tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg 9780 gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc aatcaattct tgcggagaac 9840 tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc gcgtccgcca tctccagcag 9900 ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca cgggtgcgca tgatcgtgct 9960 cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc 10020 accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac 10080 aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcccctac 10140 gtgctgctga agttgcccgc aacagagagt ggaaccaacc ggtgatacca cgatactatg 10200 actgagagtc aacgccatga gcggcctcat ttcttattct gagttacaac agtccgcacc 10260 gctgtccggt agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 10320 tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgcccaaca gtcccccggc 10380 cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgccc tgcaccatta tgttccggat 10440 ctgcatcgca ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg 10500 ctaaccgttt ttatcaggct ctgggaggca gaataaatga tcatatcgtc aattattacc 10560 tccacgggga gagcctgagc aaactggcct caggcatttg agaagcacac ggtcacactg 10620 cttccggtag tcaataaacc ggtaaaccag caatagacat aagcggctat ttaacgaccc 10680 tgccctgaac cgacgaccgg gtcgaatttg ctttcgaatt tctgccattc atccgcttat 10740 tatcacttat tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa 10800 ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 10860 atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 10920 gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 10980 cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 11040 ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 11100 atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 11160 ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 11220 accgtctttc attgccatac g 11241 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cggtacctat cttgacgttc tggccag 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtctagaaat taccacattt taagaat 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cggtaccaat taccacattt taagaat 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtctagatat cttgacgttc tggccag 27 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cggtacccaa ctggctgaac agtcactc 28 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtctagaact tgtgctcgtg tcgcccc 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cggtaccata acacattgtt ttatatg 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gtctagatga tcaataatat gactatc 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cggtaccagg ccggataagg cgttcac 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gtctagacca ttgtggggaa ttcagcg 27 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cggtaccagg agatagcaat gacgttac 28 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gtctagaact cacgccgtta acttcac 27 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cggtaccagg aatgaaaatg aaaaagag 28 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtctagatta aaactgatac gtcatgcc 28 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cggtaccgat aggtgcaaga tggattatg 29 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gtctagaatc agtcaattgt tttgtttatt cc 32 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 cggtaccagg agccacctta tgagtcag 28 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gtctagactt actcgcggaa cagcgcttc 29 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cggtaccagg aggcccctga tgagttttg 29 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gtctagagat tatgccagcc aggccttg 28 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 cggtaccaca gaggcgtagc atgcatc 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gtctagacat tattcaaaaa gcaaccc 27 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cggtaccatg aagtcgttat gaagacatc 29 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gtctagatta atgtattctg tttattttc 29 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cggtaccgag aggttaccat gcttgaag 28 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gtctagagtt acatatcatc agctgtg 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cggtaccacg ctttacaggt gattatc 27 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gtctagatta gcggaagagt ttccctttc 29 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 cggtacccta cctggggaac tcatggc 27 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gtctagatta attcagcaca tacttctc 28 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cggtaccaag gattaatcat gaagttg 27 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gtctagatta ttggtttact gcatatac 28 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 cggtaccaag gactctccat gactctc 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gtctagagtc atgtgatttc ctttaac 27 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cggtaccagg aaatcacatg acagctc 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gtctagatta gtttgccact gcatgag 27

Claims (7)

1. 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티 드, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균에 대장균 appY 유전자, crl 유전자, dgo 오페론 또는 ycgZ, ymgA 및 ymgB의 오페론 폴리뉴클레오티드; 또는 appY 유전자, crl 유전자, dxs 유전자, rpoS 유전자, dgo 오페론 및 ycgZ, ymgA 및 ymgB의 오페론으로 구성되는 군으로부터 선택된 2 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입된, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균.
2. 제1항에 있어서, 상기 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균은 어위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) 유래의 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균인, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균.
3. 제2항에 있어서, 상기 어위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) 유래의 파네실 디포스페이트 (FPP)를 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제라닐제라닐디포스페이트 (GGPP)를 피토엔으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균은 서열번호 15의 pAC-LYCO4 벡터로 형질전환된 대장균인 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균.
4. 제3항에 있어서, 서열번호 13의 L4 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 L4R 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 H36 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 H72 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 H90 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 dxs-crl 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 dxs-rpoS 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 dxs-appY 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 crl 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 1의 appY 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입된 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균.
5. 제4항에 있어서, pBluescript SKII(+) (Genbank accession No. X52328)의 BamHI 부위에 서열번호 13의 L4 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 L4R 폴리뉴클레 오티드, 서열번호 8의 H36 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 H72 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 12의 H90 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는, pBluescript-L4, pBluescript-L4R, pBluescript-H36, pBluescript-H72 또는 pBluescript-H90 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균.
6. 제4항에 있어서, pBAD24 (Genbank accession No. X81837)의 KpnI/XbaI 부위 에 서열번호 13의 L4 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 L4R 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 H36 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 H72 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 H90 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 dxs-crl 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 dxs-rpoS 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 dxs-appY 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 crl 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 appY 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는, pBAD-L4, pBAD-L4R, pBAD-H36, pBAD-H72, pBAD-H90, pBAD-dxs-crl, pBAD-dxs-rpos, pBAD-dxs-appY, pBAD-crl, 또는 pBAD-appY 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는, 라이코펜 생산능이 향상된 대장균.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 라이코펜의 생산 방법.

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