CN111394369A - 抗草甘膦epsps突变基因、含有该基因的植物遗传转化筛选载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及抗草甘膦EPSPS突变基因、含有该基因的植物遗传转化筛选载体及其应用。本发明提供的牛筋草5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合成酶突变基因及能够赋予植物草甘膦高抗性。本发明提供的以该表达盒作为筛选标记的植物遗传转化筛选载体及其筛选方法使得愈伤组织在组培阶段可以草甘膦作为筛选剂，所获得的转基因植株具备草甘膦除草剂的高抗性。该载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用，在转基因过程中利用植物源基因替代菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。

Description

抗草甘膦EPSPS突变基因、含有该基因的植物遗传转化筛选载 体及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及抗草甘膦EPSPS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选表达盒、植物遗传转化筛选载体及其应用。

背景技术

随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展，转基因技术的应用范围越来越广泛。转基因技术具有诸多的优点，如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等。转基因作物于1996年被批准商业化种植，截至2017年，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统计，2017年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物，面积达1.9亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。

目前，随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基因产品需要严格的控制和监管。对于转基因作物的争议关键之一是筛选标记可能带来的潜在风险，其转入植物后对靶标生物的抗性、所表达蛋白质的致敏性以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar筛选系统等。这些筛选标记绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物则可去除外源基因引起的风险和担忧。

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-Enolpyruvyl Shikimate-3-PhosphateSynthase，EPSPS)是草甘膦的唯一靶标酶，草甘膦可竞争性地占据PEP与EPSPS的结合位点，进而与EPSPS、三磷酸莽草酸(Shikimate-3-Phosphate，S3P)结合成结构稳定的三元配合物，导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸及其他代谢物的生物合成，扰乱生物体正常的氮代谢而使植物死亡(Jaworski E G.Mode of action of N-phosphonomethylglycine.Inhibition of aromatic amino acid biosynthsis[J].Journal of Agricultural&FoodChemistry,1972,20(6):1195-1198.；Kishore G M,Shah D M.Amino acid biosynthesisinhibitors as herbicides[J].Annual Review of Biochemistry,1988,57(4):627-663.；Herrmann K M,Weaver L M.The Shikimate Pathway[J].Annual Review of PlantBiology,1999,50(4):473-503.)。动物中不存在莽草酸途径，故草甘膦对动物和人类表现为低毒。

EPSPS基因分为两种类型：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型主要来源于植物和微生物，天然对草甘膦敏感，经人工改造后具有一定的耐草甘膦特性；Ⅱ型通常来源于对草甘膦有抗性的微生物，如根癌农杆菌CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)和假单胞菌(Pseudomonas sp.PG2982)等，天然对草甘膦不敏感，有一定的抗性(Funke T,Han H,Healyfried M L,et al..Molecular basis for the herbicideresistance of Roundup Ready crops.[J].Proceedings of the National Academy ofSciences,2006,103(35):13010-13015.)。目前已发现的抗性EPSPS中，微生物来源的抗性EPSPS占绝大部分，植物源的抗性EPSPS比较稀少且一般是草甘膦长期胁迫下的杂草变种，能够在水稻、玉米等农作物中有效发挥抗草甘膦作用的植物源抗性EPSPS更是极其有限。

发明内容

本发明的目的之一是提供抗草甘膦EPSPS突变基因，以丰富抗除草剂基因资源、增加植物遗传转化的可选择性。本发明的另一个目的是解决目前植物遗传转化中因使用菌源筛选标记而导致的潜在安全风险的问题，提供一种利用植物源基因作为筛选标记的植物遗传转化筛选载体。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明意外地发现牛筋草来源的抗草甘膦EPSPS突变基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)可在水稻、玉米等农作物中发挥功能，赋予这些农作物草甘膦抗性。在此基础上，在不改变蛋白功能的情况下，本发明通过对牛筋草来源的抗草甘膦EPSPS突变基因进行特异的优化，实现了该基因在水稻、玉米等农作物中的高效表达和草甘膦抗性功能的发挥。

本发明的第一方面提供一种DNA分子，其编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白，其核苷酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列；

(2)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(3)来源于植物，且与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有至少85％的同源性、编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白的核苷酸序列；

(4)来源于牛筋草，且为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个替换、缺失或插入得到的编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白的核苷酸序列。

本发明中所使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和l mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1×SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

本发明中，所述同源性可为85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。其中，序列同源性的百分比可以通过公知的生物信息学算法获得。

如SEQ ID NO.1所示的序列包含经特异序列优化的牛筋草来源的抗草甘膦I型EPSPS突变基因的编码框以及经筛选得到的与上述优化的抗草甘膦I型EPSPS突变基因组合表达效果最佳的翻译稳定序列和叶绿体导肽序列。

如SEQ ID NO.1所示的核苷酸所编码的抗草甘膦EPSPS突变蛋白的序列如SEQ IDNO.7所示。

本发明还提供包含所述DNA分子的生物材料，其为表达盒、载体、宿主细胞、转基因植物细胞系或转基因植物。

本发明的第二方面提供所述DNA分子或包含所述DNA分子的生物材料的如下任一种应用：

(1)在调控植物对除草剂的抗性中的应用；

(2)在选育抗除草剂植物中的应用；

(3)在植物种质资源改良中的应用；

(4)在作为植物遗传转化的筛选标记或筛选载体中的应用。

本发明所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地，所述植物为农作物，优选为水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。

本发明的第三方面提供一种植物转基因筛选表达盒，其以植物源基因作为筛选标记，所述植物源基因为抗草甘膦EPSPS突变基因。

所述抗草甘膦EPSPS突变基因优选为牛筋草来源的EPSPS突变基因(EiEPSPSm)。

所述抗草甘膦EPSPS突变基因优选为如下任一种DNA分子：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列；

(2)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(3)来源于植物，且与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有至少85％的同源性、编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白的核苷酸序列；

(4)来源于牛筋草，且为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个替换、缺失或插入得到的编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白的核苷酸序列。

作为本发明的优选方案，所述植物转基因筛选表达盒以序列如SEQ ID NO.1所示的EPSPS突变基因作为筛选标记。本发明发现序列如SEQ ID NO.1所示的EPSPS突变基因可在水稻、玉米等作物中高效表达并在植物遗传转化过程中高效、稳定地发挥筛选标记的功能。

本发明所述植物转基因筛选表达盒还包含用于启动和终止所述抗草甘膦EPSPS突变基因转录的启动子和终止子。

所述启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子。

所述启动子优选为玉米Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子，或者为水稻ALS基因启动子或Ubi启动子。

所述终止子优选为牛筋草EPSPS基因终止子或水稻Ubi终止子。

本发明优选采用如下的启动子和终止子与如SEQ ID NO.1所示的抗草甘膦EPSPS突变基因组合使用，这些组合能够更好地控制EPSPS突变基因的高效、稳定、适度表达，使得EPSPS基因突变体更好地发挥筛选标记的功能：

(1)启动子为玉米Ubi启动子，终止子为水稻Ubi终止子；

(2)启动子为水稻Ubi启动子，终止子为水稻Ubi终止子；

(3)启动子为水稻ALS基因启动子；终止子为水稻Ubi终止子。

所述植物转基因筛选表达盒中，启动子、抗草甘膦EPSPS突变基因和终止子以转录方向彼此功能性连接。

作为本发明的优选方案，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示(ZmUbip-oEiEPSPSm-OsUbiT)、或如SEQ ID NO.3所示(OsUbip-oEiEPSPSm-OsUbiT)，或如SEQ ID NO.4所示(OsALSp-oEiEPSPSm-OsUbiT)。

基于上述植物转基因筛选表达盒，本发明的第四方面提供一种植物遗传转化筛选载体，该载体含有上述其中之一的植物转基因筛选表达盒。

优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化；所述其他表达盒是指除上述的植物转基因筛选表达盒外的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒等。

更优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体还包括一系列多克隆位点如AfeI、AvrII、PmlI、SnaBI、AloI、HindIII等，以便后续克隆目的基因进入。

作为本发明的优选方案，本发明提供的植物遗传转化筛选载体为pCEiEPSPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。pCEiEPSPS载体含有本发明所述的植物转基因筛选表达盒，可通过克隆除本发明所述的植物转基因筛选表达盒以外的其他表达盒进入该载体进行遗传转化。

上述植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到：

(1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如SEQ ID NO.1所示的EiEPSPS突变基因置于玉米Ubi启动子驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，得到序列如SEQ IDNO.2所示的植物转基因筛选表达盒；

(2)将植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0310，获得植物遗传转化筛选载体。

本发明的第五方面提供所述植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体在植物遗传转化或制备转基因植物中的应用。

所述的应用具体为：将植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段将愈伤组织接种到含有除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。

所述除草剂为草甘膦。

所述筛选培养基中优选含有1.2-5mM草甘膦。更优选含有2-5mM草甘膦。最优选地，含有2.5-5mM草甘膦可获得良好的筛选效率。

进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的分化阶段，将从筛选培养基中得到的阳性愈伤采用含有除草剂的分化培养基进行分化培养。

所述分化培养基中，优选含有0.025-3mM草甘膦。更优选含有0.05-1mM草甘膦。最优选地，含有0.05-0.25mM草甘膦可获得良好的分化效率，同时有效抑制非转基因愈伤分化成苗。

进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的生根阶段，将分化培养得到的阳性苗采用含除草剂的生根培养基进行生根培养。

所述生根培养基中优选含有0.025-4mM草甘膦。更优选含有0.05-2mM草甘膦，最优选地，含有0.05-0.25mM草甘膦可获得良好的生根效率，同时有效抑制非转基因分化苗生根。

以下以水稻为例，提供植物遗传转化及筛选方法，其他植物转基因方法可参考水稻：

1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，27℃暗培养30-50天；

2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用；

3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面出现菌体；

4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加草甘膦的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

5)分化：将筛选获得的抗性愈伤组织接种到添加草甘膦的分化培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗；

6)生根：将分化获得的幼苗接种到添加草甘膦的生根培养基上生根，30℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植；

以上所涉培养基的具体配方如下：

诱导培养基为N6D培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基；

悬浮培养基为N6-AA培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM，pH值为5.4的培养基；

共培养基为N6-AS培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM、琼脂粉(Agar)浓度为7g/L，pH值为5.6的培养基；

筛选培养基为N6S培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.6-1g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.5-1.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L、头孢(Cn)浓度为500mg/L。筛选培养基中筛选剂草甘膦浓度为1.2-5mM，pH值为5.8的培养基；

分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素(KT)浓度为1-2mg/L、α-萘乙酸(NAA)浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。分化培养基中筛选剂草甘膦浓度为0.025-3mM，pH值为5.9的培养基；

生根培养基为1/2MSR培养基，其为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20g/L、多效唑浓度为0.5-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。生根培养基中筛选剂草甘膦浓度为0.025-4mM，pH值为5.8的培养基；

本发明的有益效果至少包括：本发明提供的经特异组合优化的牛筋草EPSPS突变基因(oEiEPSPSm)可在水稻、玉米等作物中发挥草甘膦抗性功能，oEiEPSPSm在作物中的功能发现丰富了植物源草甘膦抗性基因资源。本发明提供的经特异优化的oEiEPSPSm能够在作物中实现高效表达，赋予作物较高的草甘膦抗性。同时本发明还提供了以该oEiEPSPSm突变基因作为筛选标记的植物转基因筛选表达盒、植物遗传转化筛选载体以及相应的遗传转化筛选方法。本发明的植物遗传转化筛选载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用进行植物的遗传转化。本发明的筛选标记为植物源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可有效降低菌源等外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。

附图说明

图1为本发明实施例2中pC0310载体图谱。

图2为本发明实施例2中pCEiEPSPS载体经EcoRI和PstI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为未酶切的pCEiEPSPS重组质粒，1-5为酶切的pCEiEPSPS重组质粒，可切出大小约为2.5kb片段。

图3为本发明实施例2中pCEiEPSPS载体图谱。

图4为本发明实施例3中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为pCEiEPSPS重组质粒阳性对照，2-6为转pCEiEPSPS重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图5为本发明实施例4中普通水稻苗期草甘膦临界浓度测试比较图；其中，对照苗盆左侧为ZH11，中间为9311，右侧为MH63，样品苗盆为GH297；其中，1×代表1125mg/L，0.2×，0.5×，2×，5×分别为相应的倍数。

图6为本发明实施例5中水稻愈伤对草甘膦抗性临界浓度测试结果；其中，N6为愈伤在不添加筛选压的培养上筛选40d结果，N6+分别为添加1.2、2、2.5、3及5mM草甘膦筛选压。

图7为本发明实施例10中草甘膦筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。

图8为本发明实施例16中分化培养基中添加草甘膦分化愈伤组织30d的结果；其中，1为非转基因愈伤进行分化，2为转基因阳性愈伤进行分化。

图9为本发明实施例26中生根培养基中添加草甘膦生根15d的结果；其中，1为非转基因分化苗进行生根，2为转基因阳性分化苗进行生根。

图10为本发明实施例38中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为H₂O，2为9311非转基因植株基因组DNA，3为ZH11非转基因植株基因组DNA，4为质粒阳性对照，5-24为筛选获得的转基因植株基因组DNA。

图11为本发明实施例39中T0转基因株系除草剂抗性测试结果；其中，a-d：草甘膦筛选株系移栽后喷施1125mg/L草甘膦结果；a-d分别为喷施前，喷施后7天、14天、21天，图中箭头表示野生型对照ZH11，在喷施21天时已完全死亡，存活的均为草甘膦抗性株系。

图12为本发明实施例39中T0转基因株系除草剂抗性测试结果；其中，a-d：草甘膦筛选株系移栽后喷施11250mg/L草甘膦结果；a-d分别为喷施前，喷施后3天、7天、14天，图中箭头所指一列为野生型对照ZH11，在喷施14天时已完全死亡，存活的均为草甘膦抗性株系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1EiEPSPSm序列分析及优化

牛筋草来源的EPSPS突变基因(EiEPSPSm)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明在如SEQ ID NO.6所示序列的基础上进行密码子优化和表达元件的筛选，筛选适合于作物表达并适于作为筛选标记的经优化的EiEPSPSm序列和表达元件的组合。本发明在优化和筛选过程中发现，采用常规的密码子优化原则和优化系统并不能较好地实现牛筋草来源的EPSPS突变基因在作物中的高效表达，而且有些密码子优化后的序列虽然能够在作物中较好地表达，但是作为筛选标记的筛选效率却不高，限制了其作为筛选标记的应用。在EiEPSPSm的基础上，经过大量探索、筛选和对比，本发明最终选择如SEQ ID NO.1所示的含有特异优化的EiEPSPSm编码框序列以及翻译稳定序列和叶绿体导肽序列的组合优化序列，并通过直接基因合成获得了该序列的DNA片段，命名为oEiEPSPSm。

实施例2植物遗传转化筛选载体的构建

1、植物转基因筛选表达盒的制备

本发明的植物转基因筛选表达盒ZmUbiP-oEiEPSPSm-OsUbiT(序列如SEQ ID NO.2所示)的构建方法如下：

设计引物0310-UEU-F/0310-UEU-Rv1从玉米基因组中扩增启动子ZmUbiP片段；利用引物0310-UEU-F2/0310-UEU-Rv2从实施例1合成的经序列优化的牛筋草EPSPS突变基因片段中扩增获得目的基因oEiEPSPSm片段；利用引物0310-UEU-F3/0310-UEU-Rv从水稻基因组中扩增获得终止子OsUbiT片段。其中，引物0310-UEU-F和0310-UEU-Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310-UEU-Rv1与0310-UEU-F2，0310-UEU-Rv2与0310-UEU-F3)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

0310-UEU-F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggGAGCTCGTGCAGCGTGACCC(SEQ IDNO.8)；

0310-UEU-Rv1：TGTAAAAATACAAGTAACACCAAACAACAGGGTGAGCATC(SEQ ID NO.9)；

0310-UEU-F2：TGGTGTTACTTGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAAC(SEQ IDNO.10)；

0310-UEU-Rv2：GCTGAGGACTCAATTCTTCACGAATGTAGAGAGGAC(SEQ ID NO.11)；

0310-UEU-F3：TGAAGAATTGAGTCCTCAGCCATAGAGCTGC(SEQ ID NO.12)；

0310-UEU-Rv:TGCCCGGGCCTGCAgGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQ IDNO.13)。

PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物0310-UEU-F和0310-UEU-Rv1扩增的PCR产物为ZmUbiP片段，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1988bp产物；引物0310-UEU-F2和0310-UEU-Rv2扩增的PCR产物为oEiEPSPSm片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1637bp；引物0310-UEU-F3和0310-UEU-Rv扩增的PCR产物为OsUbiT片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为310bp。

2、植物遗传转化筛选载体的构建

使用Gibson Assembly方法，将上述1中的扩增产物插入到pC0310载体(pC0310为申请人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相邻区域不必要区域，以使得T-Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列。因此，在T-Border中后续连入植物源序列，转入植物时可降低公众对转基因植物安全性的担忧，载体图谱见图1)的BstXI和PstI双酶切位点间，具体方法如下：

(1)用BstXI+PstI对载体质粒pC0310进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.

Extraction kit(Omega，下同)回收7kb左右大小条带，得到pC0310线性片段。

BstXI+PstI双酶切反应体系如下：

(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒

连接ZmUbiP-oEiEPSPSm-OsUbiT表达盒到pC0310载体上，连接体系如下：

连接程序：50℃，30min。

(3)转化：取上述连接产物2μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入LB培养基1ml，37℃、220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(UEU-F1和UEU-R1)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(如图2)，保菌并送测序。将测序正确的植物遗传转化筛选载体命名为pCEiEPSPS，载体图谱见图3，测序得到其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

引物序列：

UEU-F1:GGATGGCAATGGCGTTCAG(SEQ ID NO.14)；

UEU-R1:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.15)。

实施例3农杆菌转化及鉴定

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μl实施例1中得到的测序正确pCEiEPSPS质粒，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(UEU-F1和UEU-R1)进行菌液PCR验证(如图4)，可扩增得到约900bp目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

实施例4普通水稻苗期草甘膦的临界浓度测试

草甘膦是一种非选择性灭生性除草剂，普通水稻对其不具抗性，多数推荐喷施浓度为1.125g/L。本实施例分析水稻对草甘膦抗性的临界浓度，通过实验测试，结果如图5所示。对于草甘膦，无论是粳稻中花11(ZH11)还是籼稻9311、MH63，在苗期喷施1×(1125mg/L)浓度以上均枯萎死亡，所以可选1125mg/L作为临界浓度。

实施例5愈伤时期ZH11草甘膦的筛选压力测试

本实施例分析愈伤时期ZH11对草甘膦抗性的临界浓度，将愈伤置于含不同浓度的草甘膦培养基中培养，测试结果如图6所示。在培养基中添加1.2mM草甘膦会使愈伤生长受到一定抑制，但仍会有增殖；添加2mM以上草甘膦就使愈伤增殖受到抑制，几乎不增殖。

实施例6草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(1)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦1.2mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例7草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(2)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.8g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦1.5mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例8草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(3)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦2mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例9草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(4)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦2.5mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例10草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(5)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.8g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦3mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤(如图7)。

实施例11草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(6)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦3.5mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例12草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(7)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦4mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例13草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(8)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦4.5mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例14草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选(9)

以水稻为例，将实施例3得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含草甘膦的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+草甘膦5mM)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例15 pCEiEPSPS遗传转化体系——筛选统计

通过实施例6-14中利用不同浓度的草甘膦进行筛选的阳性率比较发现(见表1)，筛选培养基中添加2.5-5mM草甘膦，均可得到抗性愈伤，添加低浓度的筛选压都会使阳性愈伤率降低甚至阳性率为零。因此在筛选培养基中优选添加2.5-5mM草甘膦可获得良好的筛选效率。

表1不同浓度草甘膦的筛选结果统计

实施例16草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(1)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.025mM)上，分化25-30d获得阳性苗(如图8)。

实施例17草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(2)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.05mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例18草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(3)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.1mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例19草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(4)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.15mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例20草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(5)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.3mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例21草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(6)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.5mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例22草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(7)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.75mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例23草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(8)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦1mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例24草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——分化(9)

将获得的抗性愈伤转移至含草甘膦抗性的分化培养基(MS+KT2 mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+草甘膦3mM)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例25 pCEiEPSPS遗传转化体系——分化统计

通过实施例16-24中添加不同浓度的草甘膦进行分化培养的出苗率比较发现(见表2)，分化培养基中添加草甘膦均可抑制ZH11的愈伤分化，而转基因阳性愈伤具有较高的分化率，但随着浓度的升高，转基因阳性愈伤的分化率下降。因此在分化培养基中优选添加0.05-1mM，更优选添加0.05-0.25mM草甘膦在抑制非转基因时可获得良好的分化效率。

表2不同浓度草甘膦分化结果统计

实施例26草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(1)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.025mM/L)上，最后获得阳性转基因植株(如图9)

实施例27草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(2)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.05mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例28草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(3)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.1mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例29草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(4)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.15mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例30草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(5)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.3mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例31草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(6)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.5mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例32草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(7)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦0.75mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例33草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(8)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦1mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例34草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(9)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦1.5mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例35草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(10)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦2mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例36草甘膦-pCEiEPSPS遗传转化体系——生根(11)

经分化获得的阳性苗转移至含草甘膦抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+草甘膦4mM/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例37 pCEiEPSPS遗传转化体系——生根统计

通过实施例26-36中添加不同浓度的草甘膦进行生根培养的生根存活率比较发现(见表3)，生根培养基中添加0.025-4mM/L草甘膦，均可抑制ZH11的分化苗存活，而大部分转基因阳性分化苗存活率还可分别达到80％以上。根据分析结果，在生根培养基中优选添加0.05-2mM/L草甘膦，更优选添加0.05-0.25mM/L草甘膦可获得良好的生根存活效率。

表3不同浓度草甘膦生根结果统计

实施例38转基因株系鉴定

为了鉴定获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH2O溶解DNA。

为了区分水稻内源基因，设计一对引物(UEU-F2/UEU-R2)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因表达盒为模板扩增获得片段大小为682bp。

引物序列如下：

UEU-F2:ACCGTGACAGGACCACAGAG(SEQ ID NO.16)；

UEU-R2:CAAAAGGGTATAGCAGAAGCAA(SEQ ID NO.17)。

以转化用质粒DNA作为阳性对照，ZH11基因组DNA作为阴性对照。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如下：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示。电泳结果表明，大部分转基因样品中含有682bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而阴性对照ZH11无法扩出条带。

实施例39抗性表型鉴定

选取部分生根材料在移栽1-2周后(5叶期左右)，喷施1125mg/L草甘膦(图11的a)。喷施后7天，野生型出现叶片枯黄至萎蔫(图11的b)。14天后，野生型对照ZH11已枯黄致死，转基因株系多数植株生长正常，部分出现黄化(图11的c)。21天后，野生型对照ZH11及转基因敏感株系已完全死亡，存活株系为草甘膦抗性株系(图11的d)。

在前述结果基础上，进一步对新获得的生根材料在移栽1-2周后(5叶期左右)进行更高浓度草甘膦抗性鉴定，喷施11250mg/L草甘膦(图12的a)，喷施后3天，野生型出现叶片枯黄至萎蔫(图12的b)，7天后，野生型对照ZH11(白色箭头所指中间一列)已濒临死亡，转基因株系多数植株生长正常，部分出现黄化(图12的c)，14天后，野生型对照ZH11及转基因敏感株系已完全死亡，存活株系为草甘膦抗性株系(图12的d)。

上述结果表明，本发明提供的经序列优化的oEiEPSPSm抗性基因可使植物具备对草甘膦的高抗性。

上述结果表明，本发明已成功建立基于草甘膦-EiEPSPS筛选标记的遗传转化全时期筛选系统，可用于水稻遗传转化。

本发明获得的pCEiEPSPS作为植物双元表达载体，可以通过克隆其他表达盒进入该载体，进行遗传转化，获得相应的性状。如：将荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒、其他功能基因等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 抗草甘膦EPSPS突变基因、含有该基因的植物遗传转化筛选载体及其应用

<130> KHP201111233.4

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1637

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtatttttac aacaattacc aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa ttactattta 60

caattacaac catggcacag atcagtagca tgggccaagg cattcggact cccaacctca 120

attcctacct ccctaagacc cagaaagttc ctctgttctc acattctatc ttcatcggaa 180

gcaagaagat cacccagaac tccgccaagt ctttgtgggt gtccaaggaa gattccgtcc 240

tgagggtcgc taagtcacca ttccggattt ctgccagcgt ggtcactgca cagatgcagg 300

caggagcaga ggaggtggtc ctccagccaa tcaaggagat cagcggcgtg gtcaagctgc 360

ctggctcgaa gtccctcagc aaccgcatcc tcctgctctc agcactcgca gagggcacca 420

cagtggtgga caacctgctc aattcggagg atgtccacta catgctggga gcactcaaga 480

ccctgggact ctcagtggag gcagacaagg cagcaaagag ggcagtggtc gtgggatgcg 540

gcggcaagtt cccggtcgag aaggatgcca aggaggaggt gcagctgttc ctcggaaacg 600

caggaatcgc aatgcggtcc ctgaccgccg cggtgacagc cgcgggcggc aatgcaacat 660

acgtcctgga cggcgtgccg aggatgaggg agaggccaat cggcgatctc gtcgtgggac 720

tgaagcagct cggagcagac gtcgattgct tcctcggcac ggactgccca ccagtccgcg 780

tgaagggaat cggaggactg ccaggaggca aggtgaagct ctctggctca atctccagcc 840

agtacctgtc tgcgctgctc atggcagcac ctctggcact cggcgacgtg gagatcgaga 900

tcatcgacaa gctcatctca atcccatacg tggagatgac cctgcgcctc atggagaggt 960

tcggcgtgaa ggccgagcat tcggactcct gggataggtt ctacatcaag ggcggccaga 1020

agtacaagag ccctaagaat gcctacgtgg agggcgacgc ctcttcagcg tcttacttcc 1080

tcgcaggagc agcaatcaca ggaggcacag tcacggtgga gggatgcggc acgacctccc 1140

tccagggcga tgtcaagttc gcggaggtgc tggagatgat gggcgccaag gtgacctgga 1200

cagagacctc cgtcaccgtg acaggaccac agagggagcc tttcggaagg aagcacctca 1260

aggcgatcga cgtcaacatg aataagatgc cggatgtggc catgacactg gcagtcgtgg 1320

cactcttcgc agacggacca acggcaatcc gcgatgtcgc atcctggagg gtgaaggaga 1380

ccgagaggat ggtcgcgatc cggacggagc tgaccaagct cggagcaagc gtggaggagg 1440

gcctggacta ctgcatcatc acccctccgg agaagctcaa cgtgacggcg atcgacacct 1500

acgacgatca taggatggca atggcgttca gcctggcagc atgcgcagac gtccctgtga 1560

ccatccgcga cccgggatgc acacgcaaga cgttcccaga ctacttcgat gtcctctcta 1620

cattcgtgaa gaattga 1637

<210> 2

<211> 3935

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagctcgtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct 60

aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct 120

atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag tactacaata 180

atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg 240

agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt 300

tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag 360

ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt 420

tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat 480

ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa 540

aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg 600

acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag 660

acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg 720

gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca 780

cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac 840

cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc 900

tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc 960

acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 1020

cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 1080

tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140

cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 1200

ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 1260

tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 1320

catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 1380

ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 1440

atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 1500

taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 1560

tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620

agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680

tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 1740

tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800

ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 1860

ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920

tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980

tgttacttgt atttttacaa caattaccaa caacaacaaa caacaaacaa cattacaatt 2040

actatttaca attacaacca tggcacagat cagtagcatg ggccaaggca ttcggactcc 2100

caacctcaat tcctacctcc ctaagaccca gaaagttcct ctgttctcac attctatctt 2160

catcggaagc aagaagatca cccagaactc cgccaagtct ttgtgggtgt ccaaggaaga 2220

ttccgtcctg agggtcgcta agtcaccatt ccggatttct gccagcgtgg tcactgcaca 2280

gatgcaggca ggagcagagg aggtggtcct ccagccaatc aaggagatca gcggcgtggt 2340

caagctgcct ggctcgaagt ccctcagcaa ccgcatcctc ctgctctcag cactcgcaga 2400

gggcaccaca gtggtggaca acctgctcaa ttcggaggat gtccactaca tgctgggagc 2460

actcaagacc ctgggactct cagtggaggc agacaaggca gcaaagaggg cagtggtcgt 2520

gggatgcggc ggcaagttcc cggtcgagaa ggatgccaag gaggaggtgc agctgttcct 2580

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gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg 4740

gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc 4800

cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc 4860

accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa 4920

gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc 4980

gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc 5040

gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc 5100

accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg 5160

cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc 5220

tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa 5280

ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg 5340

tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt 5400

tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc 5460

ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag 5520

tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg 5580

cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg 5640

agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat 5700

tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa 5760

gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat 5820

caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat 5880

tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac 5940

cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga 6000

aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac 6060

acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg 6120

gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag 6180

ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc 6240

gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa 6300

aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg 6360

tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg 6420

cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac 6480

aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc 6540

agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc 6600

gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc 6660

ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg 6720

atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg 6780

gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg 6840

gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat 6900

ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg 6960

ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg 7020

tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca 7080

agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg 7140

taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc 7200

gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga 7260

tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag 7320

aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga 7380

agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga 7440

aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg 7500

gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag 7560

gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc 7620

cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt 7680

cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt 7740

taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca 7800

cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg 7860

cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca 7920

atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag 7980

gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 8040

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 8100

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 8160

gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 8220

ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 8280

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 8340

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 8400

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 8460

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 8520

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 8580

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 8640

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 8700

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 8760

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 8820

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 8880

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 8940

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 9000

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 9060

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatt 9120

ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc caatcaggct 9180

tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata tcctccctga 9240

tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt ctcccaagat 9300

caataaagcc acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt 9360

gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg 9420

gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat 9480

tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg 9540

atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata atcttttcag 9600

ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca 9660

gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt 9720

ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata ggtggtccct ttataccggc 9780

tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat accttagcag 9840

gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg 9900

gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat 9960

accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa 10020

ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt 10080

atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta 10140

caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc 10200

gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg 10260

ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc 10320

cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg 10380

cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt atgctccacc atgttgg 10437

<210> 6

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcaggcgg gcgcggagga ggtggtgctg cagcccatca aggagatctc cggcgtcgtg 60

aagctgccgg ggtccaagtc gctctccaac cggatcctcc tgctctccgc cctcgccgag 120

ggaacaactg tggtggataa ccttttaaac agtgaggacg tccactacat gctcggggcc 180

ctgaaaaccc tcggactctc tgtggaagcg gacaaagctg ccaaaagagc ggtagttgtt 240

ggctgtggtg gcaagttccc agttgagaag gatgcgaaag aggaggtgca gctcttcttg 300

gggaatgctg gaattgcaat gcgatcattg acagcagccg taactgctgc tggaggaaat 360

gcaacttatg tgcttgatgg agtgccaaga atgcgggaga gacccattgg cgacttggtt 420

gtcggattga aacagcttgg tgcggatgtt gattgtttcc ttggcactga ctgcccacct 480

gttcgtgtca agggaatcgg agggctacct ggtggcaagg ttaagttatc tggttccatc 540

agcagtcagt acttgagtgc cttgctgatg gctgctcctt tagctcttgg ggatgtggag 600

attgaaatca ttgataaact gatctccatc ccttatgttg aaatgacatt gagattgatg 660

gagcgttttg gcgtgaaagc agagcattct gatagctggg acagattcta catcaaggga 720

ggtcaaaaat acaagtcccc taaaaatgcc tacgtggaag gtgatgcctc aagtgcgagc 780

tatttcttgg ctggtgctgc aatcactgga gggactgtga ctgttgaagg ttgtggcacc 840

accagtctgc agggtgatgt gaaatttgcc gaggtactcg agatgatggg agcgaaggtt 900

acatggactg aaactagcgt aactgttacc ggtccacaac gtgagccatt tgggaggaaa 960

cacctaaaag ctattgatgt taacatgaac aaaatgcccg atgtcgccat gactcttgcc 1020

gtggttgccc tatttgctga tggcccaact gctatcagag atgtggcttc ctggagagta 1080

aaggagaccg agaggatggt tgcaatccgg actgagctaa caaagctggg agcgtcggtc 1140

gaggaaggac tggactactg cattatcaca ccgcccgaga agctgaacgt aacggccatc 1200

gacacctacg atgaccacag gatggccatg gccttctccc tcgccgcctg cgccgacgtg 1260

cctgtgacca tccgggaccc cggctgcacc cgcaagacct tcccagacta cttcgacgtg 1320

ctgagcactt tcgtcaagaa ctaa 1344

<210> 7

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gln Ala Gly Ala Glu Glu Val Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile

1 5 10 15

Ser Gly Val Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile

20 25 30

Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ala Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu

35 40 45

Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Lys Thr Leu

50 55 60

Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val

65 70 75 80

Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val

85 90 95

Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala

100 105 110

Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val

115 120 125

Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys

130 135 140

Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro

145 150 155 160

Val Arg Val Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu

165 170 175

Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala

180 185 190

Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile

195 200 205

Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly

210 215 220

Val Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly

225 230 235 240

Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala

245 250 255

Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr

260 265 270

Val Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys

275 280 285

Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu

290 295 300

Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Gln Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys

305 310 315 320

His Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala

325 330 335

Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile

340 345 350

Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala

355 360 365

Ile Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Leu

370 375 380

Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile

385 390 395 400

Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala

405 410 415

Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys

420 425 430

Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn

435 440 445

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgtttttaat gtatgctcca ccatgttggg agctcgtgca gcgtgaccc 49

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtaaaaata caagtaacac caaacaacag ggtgagcatc 40

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggtgttact tgtattttta caacaattac caacaacaac aaac 44

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctgaggact caattcttca cgaatgtaga gaggac 36

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgaagaattg agtcctcagc catagagctg c 31

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcccgggcc tgcaggacaa atttgtttgt cagatcaaat ttttaagc 48

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggatggcaat ggcgttcag 19

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttgttcatgg cgtaatgtct cc 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accgtgacag gaccacagag 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caaaagggta tagcagaagc aa 22

Claims (10)

1.一种DNA分子，其特征在于，其编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白，其核苷酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列；

(2)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(3)来源于植物，且与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有至少85％的同源性、编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白的核苷酸序列；

(4)来源于牛筋草，且为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个替换、缺失或插入得到的编码抗草甘膦I型EPSPS蛋白的核苷酸序列。

2.包含权利要求1所述的DNA分子的生物材料，其特征在于，其为表达盒、载体、宿主细胞、转基因植物细胞系或转基因植物。

3.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的生物材料的如下任一种应用：

(1)在调控植物对除草剂的抗性中的应用；

(2)在选育抗除草剂植物中的应用；

(3)在植物种质资源改良中的应用；

(4)在作为植物遗传转化的筛选标记或筛选载体中的应用。

4.一种植物转基因筛选表达盒，其特征在于，以植物源基因作为筛选标记，所述植物源基因为抗草甘膦EPSPS突变基因；

优选地，所述抗草甘膦EPSPS突变基因为牛筋草来源的EPSPS突变基因；

更优选地，所述抗草甘膦EPSPS突变基因为权利要求1所述的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒还包含用于启动和终止所述抗草甘膦EPSPS突变基因转录的启动子和终止子；

优选地，所述启动子为玉米Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子，或者为水稻ALS基因启动子或Ubi启动子；和/或，所述终止子为牛筋草EPSPS基因终止子或水稻Ubi终止子；

更优选地，所述启动子和终止子为如下任一种组合：

(1)启动子为玉米Ubi启动子，终止子为水稻Ubi终止子；

(2)启动子为水稻Ubi启动子，终止子为水稻Ubi终止子；

(3)启动子为水稻ALS基因启动子；终止子为水稻Ubi终止子。

6.根据权利要求4或5所述的植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

7.一种植物遗传转化筛选载体，其特征在于，含有权利要求4～6任一项所述的植物转基因筛选表达盒；

优选地，所述载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化；

所述其他表达盒为除权利要求4～6任一项所述的植物转基因筛选表达盒之外的表达盒。

8.根据权利要求7所述的植物遗传转化筛选载体，其特征在于，所述植物遗传转化筛选载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.权利要求4～6任一项所述的植物转基因筛选表达盒或权利要求7或8所述的植物遗传转化筛选载体在植物遗传转化、制备转基因植物或使得植物具备除草剂高抗性中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述植物转基因筛选表达盒或所述植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段采用含有除草剂的筛选培养基进行抗性筛选；

优选地，所述筛选培养基中，含有1.2-5mM草甘膦；

和/或，

所述应用包括：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的分化阶段，采用含有除草剂的分化培养基进行分化培养；

优选地，所述分化培养基中，含有0.025-3mM草甘膦；

和/或，

所述应用包括：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的生根阶段，采用含有除草剂的生根培养基进行生根培养；

优选地，所述生根培养基中，含有0.025-4mM草甘膦。

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