CN115491385A

CN115491385A - 一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用

Info

Publication number: CN115491385A
Application number: CN202110669621.9A
Authority: CN
Inventors: 王东芳; 张意红
Original assignee: Hangzhou Fangyun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Fangyun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2021-06-17
Publication date: 2022-12-20

Abstract

本发明公开了一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用，所述载体包含5‑烯醇丙酮酸莽草酸3‑磷酸合酶EPSPS突变基因和乙酰乳酸合成酶ALS突变基因；所述EPSPS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3所示；所述ALS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示。本发明通过利用优化的启动子、终止子、Mar等调控元件已经连接的方式，确保目的基因高效稳定表达，使得获得的转基因植物达到抗四倍以上的中剂量的目标除草剂，确保转基因植株达到产业化种植要求和标准，有效拓展杀草谱，达到更好的杂草防治效果，而且还能够减缓杂草抗性产生。

Description

一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用

(一)技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及在植物中同时高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的表达载体、构建方法及其在培育耐除草剂植物细胞和植物方面的应用。

(二)背景技术

近年来由于水资源的迅速枯竭和劳动力的短缺，许多亚洲地区的农民正在从水田移栽水稻的方式转向旱作水稻。然而，杂草危害是旱作水稻系统中的一个严重问题，因为旱作和好氧土壤条件有利于杂草的萌发和生长。杂草可以带来39-41％的产量损失(ChauhanB S et al.Field Crops Research,2013,141(1):9-15.)。而玉米、大豆、棉花等旱作作物一直以来饱受杂草侵害。

杂草防治的方法主要包括人工除草、机械除草、物理除草、化学除草、生物除草和生态除草。而化学除草是最主要的一种除草方法。利用除草剂防治杂草，在现代农业生产中起到了巨大的作用。但是，因为要防止对农作物造成危害，目前使用的除草剂大都是选择性除草剂，而这些除草剂普遍存在杀草谱窄，除草成本高等问题。

从1996年开始，转基因大豆和玉米等作物已经在美国和巴西等国家商业化种植，通过在植物中转入抗除草剂基因，可以赋予植物源耐除草剂的性状。目前推广应用的转基因植物中使用耐除草剂基因及其性状情况如表1所示。

表1：转基因植物中使用耐除草剂基因及其性状情况

上述已经应用于商品化种植的转基因植物材料中的耐除草剂基因大多是来源于细菌等微生物。而目前，在植物中也发现了许多天然或者突变的具有耐除草剂性能的基因。其中包括突变EPSPS(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，5-烯醇丙酮酸莽草酸3-磷酸合酶)基因和突变ALS(Acetolactate Synthase，乙酰乳酸合成酶)基因。EPSPS是植物合成分支酸盐的莽草酸途径中的一种关键酶，而分支酸酶是植物合成芳香族氨基酸(L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸)所必须的(Funke T et al.2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,13010–13015.)。根据其固有的草甘膦敏感性和催化效率，EPSPS酶可分为两大类。第1类EPSPS(草甘膦敏感形)存在于所有植物和一些细菌中；第二类EPSPS目前只在一些细菌中发现，例如金黄色葡萄球菌、农杆菌CP4株和假单胞菌PG2982株对草甘膦既有固有的耐受性，又对PEP(phosphoenolpyruvate，磷酸烯醇式丙酮酸)有较高的亲和力(Achary,Vmm,et al.Plant Biotechnology Journal.2020,18:2504–2519)。第一类EPEPS突变基因突变可以使得其具有耐草甘膦性能，例如突变的牛筋草(Eleusineindica)EPSPS基因(Yu Q et al.2015.Plant Physiol.167,1440–1447.)，突变的玉米(Zeamays)EPSPS基因(Feng P C C et al.2010，pp.45–66.Hoboken,NJ:John Wiley&Sons,Inc.)。ALS是支链氨基酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸生物合成途径中最常见的酶。已知ALS中特定氨基酸的突变使得突变后的ALS基因具有抗除草剂性能，这些除草剂包括磺酰脲(SUs)包括CS和BM，咪唑啉酮(IMs)包括IQ和IP，嘧啶基羧基除草剂(PCs)包括BS、PS和PM(Okuzaki A et al.Plant Mol Biol.2007,64:219–224)。

基因功能除了由其自生的特性决定，同时也很大程度上受到表达量的影响。比如目前唯一应用于商品化种植的转玉米突变EPSPS基因转化体GA21，其外源T-DNA中包含3个完整的表达框(Feng P C C et al.2010，pp.45-66.Hoboken,NJ:John Wiley&Sons,Inc.)。因此，通过改进和优化获得一种稳定高效表达植物源耐除草剂突变基因的表达载体，对利用植物源耐除草剂基因来获得抗除草剂作物非常迫切。

通常，由于长期大量单一不合理使用除草剂，导致除草剂的防除效果显著下降，同时也造成抗性杂草的发生。除草剂的抗性问题已成为全球面临的挑战。杂草的抗药性产生，是一些耐药性的杂草或具有抗药性的遗传类型被保留，并能繁殖形成一个较大的种群。目前，有效应对杂草抗性发生的方法主要包括高剂量策略和不同杀草机理的除草剂复配策略。上述策略，一方面是要求转基因耐除草剂植物中目的基因具有较高的表达量，可以耐受较高水平的除草剂；另一方面是要求转入不同除草剂抗性的基因，赋予植物多种除草剂抗性。因此，研发一种同时高效表达两种耐除草剂基因的载体及其转基因植物对研发新一代转基因耐除草剂作物及其杂草抗性治理非常迫切。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种同时稳定高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体，及其在制备抗除草剂植物细胞、抗除草剂植物方面的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种同时稳定高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T-DNA，所述载体包含5-烯醇丙酮酸莽草酸3-磷酸合酶(EPSPS)突变基因和乙酰乳酸合成酶(ALS)突变基因；所述EPSPS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3所示；所述ALS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示。

进一步，本发明所述的EPSPS突变基因为水稻EPSPS突变基因OsEPSPS-T，其核苷酸序列为SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。所述的EPSPS突变基因为玉米EPSPS突变基因ZmEPSPS-T，其核苷酸序列为SEQ ID No：3所示，氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明所述的ALS突变基因为水稻ALS突变基因OsALS-T1，其核苷酸序列为SEQ IDNo：5所示，氨基酸序列如SEQ ID No：6所示；所述的ALS突变基因为水稻ALS突变基因OsALS-T2，其核苷酸序列为SEQ ID No：7所示，氨基酸序列如SEQ ID No：8所示。

本发明所述的植物源耐除草剂突变基因是指来源于植物本身的基因，该基因在突变之前对草甘膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶基羧基类等除草剂比较敏感，但是通过基因突变，导致一个或者多个氨基酸残基发生了替换、缺失或者插入，从而导致该突变基因对上述一种或者多种除草剂的耐受性增强，这种突变后的基因即为本发明所述的植物源耐除草剂突变基因。

本发明提供的EPSPS突变基因还可以是通过对其它植物源EPSPS基因进行突变而获得的对草甘膦具有抗性的基因，这些植物源EPSPS基因编码的蛋白氨基酸序列如表2所示，本发明提供的植物源EPSPS基因包括但不限于上述基因及其同源基因。

表2：植物源EPSPS基因编码蛋白

本发明提供的植物ALS突变基因还可以是通过对其它植物ALS基因进行突变而获得的对磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶基羧基类等一种或多种除草剂具有抗性的基因，这些植物ALS基因编码的蛋白氨基酸序列如表3所示，本发明提供的植物ALS基因包括但不限于上述基因及其同源基因。

表3：植物ALS基因编码蛋白

编码	来源植物	序列简称	NCBI序列号
				1	水稻	Oryza sativa	XP_015626459
2	二穗短柄草	Brachypodium distachyon	<u>XP_003575020.1</u>
				3	玉米	Zea mays	<u>NP_001151761.2</u>
4	高粱	Sorghum bicolor	<u>XP_021315526.1</u>
				5	牛筋草	Eleusine indica	<u>AOF40433.1</u>
6	野生二粒小麦	Triticum dicoccoides	<u>XP_037452582.1</u>
				7	柳枝稷	Panicum virgatum	<u>XP_039789731.1</u>
8	黍	Panicum hallii	<u>XP_025801953.1</u>
				9	小米	Setaria italica	<u>XP_004952560.1</u>
10	拟南芥	Arabidopsis thaliana	<u>NP_190425.1</u>
				11	绿穗苋	Amaranthus hybridus	<u>AXN57277.1</u>

进一步，本发明载体还包括介导植物源耐除草剂突变基因表达的启动子，所述启动子是指一段能够介导基因转录的核苷酸序列，除了植物泛素启动子外，还包括肌动蛋白启动子(McElroy D et al.Plant Cell.1990，2(2)：163-71)、木薯的veinmosaicvirus(CsVMV)启动子、Austranlianb ananastreakvirus(BSV)启动子、mirabilismosaicvims(MMV)启动子等。优选植物泛素启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No：9或SEQ ID No：10所示。

进一步，本发明载体还包括终止植物源耐除草剂突变基因表达的终止子，所述终止子是指一段能终止基因转录的核苷酸序列，终止子可以是来源于植物自身的终止子，也可以是来源于病毒和其它生物，或者人工合成的终止子。优选为水稻HSP17.9基因终止子ter1或拟南芥HSP18.2终止子ter2，terl的核苷酸序列如SEQ ID No：11，ter2的核苷酸序列如SEQ ID No：12所示。

进一步，本发明所述载体还包括增强植物源耐除草剂突变基因表达量或者稳定性的调控元件，所述调控元件是指可以调控基因表达的一段核苷酸序列，包括增强子、基质附着区序列等，优选基质附着区序列(MAR)，核苷酸序列为SEQ ID No：13所示。所述调控元件设置在植物源耐除草剂突变基因表达框5’端或者终止子的3’端增加增加一种调控序列。

本发明中提供所述载体骨架的基础载体可以是pCambia系列载体(CAMBIA，Canberra，Australi a)或者其它载体，优选pCambia 1300载体。更优选将pCambia 1300载体中的CaMV35S终止子替换为水稻HSP17.9基因的终止子(terl)或者拟南芥HSP18.2基因的终止子(ter2)，具体为：以水稻基因组为模板，通过PCR克隆水稻HSP17.9基因的终止子序列Ter1(引物为Ter1-F:5’-TAACTCGAGGCATCGCCGGCGTGCCGCGT；Ter1-R:5’-GAATTAACGCCGAATCGGCTAGAGGGGTTAAATCC)，5’端设置一个XhoI酶切位点。以pCambia 1300载体为模板，通过PCR克隆一段载体骨架序列(引物为LBcl1-F:5’-AACCCCTCTAGCCGATTCGGCGTTAATTCAGTAC；LBcl1-R:5’-GCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATC)，命名为LBcl1，其核苷酸序列为pCambia1300载体(NCBI Accession Number：AF234296)中6319bp-6648bp所示。以上述通过PCR克隆获得的水稻HSP17.9基因的终止子序列Ter1和载体骨架序列LBcl1为模板，通过PCR克隆获得5’至3’分别为水稻HSP17.9基因的终止子和载体骨架序列LBcl1的DNA片段(引物为Ter1-F:5’-TAACTCGAGGCATCGCCGGCGTGCCGCGT；LBcl1-R:5’-GCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATC)，Ter1-LBcl1，片段5’端和3’端分别设置有XhoI和BclI酶切位点。用XhoI和BclI分别对pCambia1300载体和PCR克隆片段Ter1-LBcl1进行双酶切，并分别回收酶切后的pCambia1300载体和Ter1-LBcl1片段，然后对上述片段进行连接后克隆获得过渡载体pCambia1300-Ter1。

本发明所述载体T-DNA元件组成为EPSPS突变基因及其启动子和终止子、ALS突变基因及其启动子和终止子，还可以包含调控元件(MAR)。

本发明所述载体T-DNA组成为下列之一：(1)SEQ ID No：1所示的水稻EPSPS突变基因OsEPSPS-T、SEQ ID No：5所示的水稻ALS突变基因OsALS-T1、SEQ ID No：9所示的启动子pOsUbi、SEQ ID No：11所示的终止子ter1；(2)SEQ ID No：1所示的水稻EPSPS突变基因OsEPSPS-T、SEQ ID No：5所示的水稻ALS突变基因OsALS-T1、SEQ ID No：9所示的启动子pOsUbi、SEQ ID No：13所示的调控元件MAR、SEQ ID No：11所示的终止子ter1；(3)SEQ IDNo：3所示的玉米EPSPS突变基因ZmEPSPS-T、SEQ ID No：7所示的水稻ALS突变基因OsALS-T2、SEQ ID No：10所示的启动子pZmUbi、SEQ ID No：12所示的终止子ter2。

本发明还提供了一种同时高表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T-DNA在制备植物细胞中的应用，所述的应用是用含T-DNA的农杆菌侵染植物组织，获得含T-DNA的植物细胞。

本发明还提供了一种同时高表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T-DNA的植物细胞，在植物转基因细胞培养中将耐除草剂基因植物源EPSPS突变基因或者植物ASL突变基因作为筛选标记。

本发明同时还提供了一种同时高表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T-DNA的植物。

本发明进一步提供了利用所述载体获得同时稳定高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的植物细胞或者植物的方法，该方法可以是农杆菌介导转化法、基因枪法、原生质体侵染法或者其他植物遗传转化方法，优选农杆菌介导转化法。

本发明构建的载体适于单子叶植物的表达或者双子叶植物的表达，单子叶植物包括：玉米、水稻等；双子叶植物包括：大豆、油菜、棉花等。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明的高效表达植物源耐除草剂基因载体主要有两方面的突破和改进。第一，通过利用优化的启动子、终止子、Mar等调控元件已经连接的方式，确保目的基因高效稳定表达，使得获得的转基因植物达到抗四倍以上的中剂量的目标除草剂，确保转基因植株达到产业化种植要求和标准；第二，本载体使用的基因，启动子、终止子和调控元件全部来源于常规作物，相对于来源于细菌和动物等其它来源，安全性更容易受到公众理解和接受，有利于后期的安全评价和产业化；第三，本载体同时高效表达两种耐除草剂基因，赋予转基因植物源耐两种以上的除草剂的性状，可以采用复合除草剂进行杂草防治，有效拓展杀草谱，达到更好的杂草防治效果，而且还能够减缓杂草抗性产生。

(四)附图说明

图1：一种同时高表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T-DNA结构示意图。pUbi表示植物泛素启动子；EPSPS-T表示植物源EPSPS(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase)突变基因，ALS-T表示植物ALS(Acetolactate Synthase)突变基因；ter表示植物HSP(Heat Shock Protein)基因终止子。

图2：一种含有调控元件的同时高表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T-DNA结构示意图。pUbi表示植物泛素启动子；EPSPS-T表示植物源EPSPS(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase)突变基因，ALS-T表示植物ALS(Acetolactate Synthase)突变基因；ter表示植物HSP(Heat Shock Protein)基因终止子。M表示烟草基质附着区序列(MAR)等表达调控元件。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

在不背离本发明实质的情况下，对本发明的步骤、方法或者条件进行修改或者替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、载体构建：

1、基因合成

为了构建同时表达植物源EPSPS突变基因和ALS突变基因的载体，人工合成水稻EPSPS突变基因OsEPSPS-T，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示(氨基酸序列如SEQ ID No：2所示)；人工合成玉米EPSPS突变基因ZmEPSPS-T，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示(氨基酸序列如SEQ ID No：4所示)。人工合成水稻ALS突变基因OsALS-T1，其核苷酸序列分别如SEQID No：5(氨基酸序列如SEQ ID No：6所示)；人工合成水稻ALS突变基因OsALS-T2，其核苷酸序列分别如SEQ ID No：7(氨基酸序列如SEQ ID No：8所示)。

2、构建同时表达水稻OsEPSPS-T突变基因和ALS-T1突变基因的载体

(1)构建OsEPEPS-T突变基因的表达框

以人工合成的OsEPSPS-T为模板，通过PCR克隆OsEPSPS-T基因(引物为OE-F:5’-ATCGGATCCACCATGGCGGCGACCATGGCGTCCAACGCC；OE-R:5’-GCGATGCCTCGAGTTATCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAAC)，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，序列5’端设置一个BamHI位点，3’端设置一个XhoI酶切位点。以水稻(秀水134)基因组为模板，通过PCR克隆水稻UBI-2启动子pOsUbi(引物为Osubi-F1:5’-CCGGGTACCCTGCAGAAATGCAAATTTCATAAAACAAAC；Osubi-R1:5’-CATGGTGGATCCGATCTGCAAGAAATAATCACCAAAC)，核苷酸序列如SEQ ID No：9所示，序列5’端设置一个KpnI位点，3’端设置一个BamHI位点。

将pCambia 1300载体中的CaMV35S终止子替换为水稻HSP17.9基因的终止子：以水稻基因组(秀水134)为模板，通过PCR克隆水稻HSP17.9基因的终止子序列Ter1(引物为Ter1-F:5’-TAACTCGAGGCATCGCCGGCGTGCCGCGT；Ter1-R:5’-GAATTAACGCCGAATCGGCTAGAGGGGTTAAATCC)，核苷酸序列如SEQ ID No：11所示，5’端设置一个XhoI酶切位点。以pCambia1300载体为模板，通过PCR克隆一段载体骨架序列(引物为LBcl1-F:5’-AACCCCTCTAGCCGATTCGGCGTTAATTCAGTAC；LBcl1-R:5’-GCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATC)，命名为LBcl1，其核苷酸序列为pCambia1300载体(NCBI Accession Number：AF234296)中6319bp-6648bp所示。以上述通过PCR克隆获得的水稻HSP17.9基因的终止子序列Ter1和载体骨架序列LBcl1为模板，通过PCR克隆(引物为Ter1-F:5’-TAACTCGAGGCATCGCCGGCGTGCCGCGT；LBcl1-R:5’-GCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATC)获得5’至3’分别为水稻HSP17.9基因的终止子和载体骨架序列LBcl1的DNA片段，即片段Ter1-LBcl1，片段5’端和3’端分别设置有XhoI和BclI酶切位点。用XhoI和BclI分别对pCambia1300载体和PCR克隆片段Ter1-LBcl1进行双酶切，并分别回收酶切后的pCambia1300载体和Ter1-LBcl1片段，然后对上述片段进行连接后克隆获得过渡载体pCambia1300-Ter1。

构建完整的OsEPSPS-T基因表达载体：用KpnI和XhoI对过渡载体pCambia1300-Ter1进行双酶切，回收酶切后的载体；用KpnI和BamHI对PCR产物水稻UBI-2启动子pOsUbi进行双酶切，回收酶切后的pOsUbi；用BamHI和XhoI对PCR产物OsEPSPS-T基因进行双酶切，回收酶切后的OsEPSPS-T基因。然后对上述回收的载体和两个片段进行连接后克隆获得过渡载体pCambia1300-pOsUbi-OsEPSPS-T-Ter1。

(2)构建水稻ALS突变基因OsALS-T1表达框

以人工合成的水稻ALS突变基因OsALS-T1为模板，通过PCR克隆OsALS-T1基因(引物为ALS-F:5’-CAGATCGGATCCACCATGGCTACGACCGCCGC；ALS-R:5’-CATATCTCGAGTTATCAATACACAGTCCTGCCATCACC)，核苷酸序列如SEQ ID No：5所示，序列5’端设置一个BamHI位点，3’端设置一个XhoI酶切位点。

构建完整的OsALS-T1基因表达载体：用KpnI和XhoI分别对之前获得的过渡载体pCambia1300-Ter1，回收酶切后的载体；用KpnI和BamHI对PCR产物水稻UBI-2启动子pOsUbi进行双酶切，回收酶切后的pOsUbi；用BamHI和XhoI对PCR产物OsALS-T1基因进行双酶切，回收酶切后的OsALS-T1基因。然后对上述回收的载体和两个片段进行连接后克隆获得载体pCambia1300-pOsUbi-OsALS-T1-Ter1。

(3)构建表达载体

以步骤(2)pCambia1300-pOsUbi-OsALS-T1-Ter1载体为模板，通过PCR克隆OsALS-T1的PCR片段(引物为OsALS-T1-F2:5’-GCGGGCAAGCTTCTGCAGAAATGCAAATTTCAT和OsALS-T1-R2:5’-TTCTGCAGGGTACCCGGCTAGAGGGGTTAAATCC)，PCR产物5’端设置HindIII酶切位点，3’端设置KpnI酶切位点。然后用HindIII和KpnI分别对步骤(1)过渡载体pCambia1300-pOsEPSPS-T-Ter1和OsALS-T1的PCR片段进行双酶切，回收酶切后的载体和片段进行连接后克隆获得表达载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1。

3、构建增加MAR调控元件的同时表达水稻OsEPSPS突变基因和ALS突变基因的表达载体

以烟草基因组(本生烟(Nicotiana benthamiana))为模板，通过PCR克隆MAR片段(引物为MARF:5’-GCCGGGTACCTCGATTAAAAATCCCAATTATATTT；MARR:5’-TCTGCAGGGTACCACTATTTTCAGAAGAAGTTC)，核苷酸序列如SEQ ID No：13所示，序列5’端和3’端分别设置一个KpnI酶切位点。用限制性内切酶KpnI分别对载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1和MAR片段进行双酶切，同时用FastAP对pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1进行去磷酸化，防止自连。回收酶切后的pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1载体和MAR片段，连接后克隆获得终载体pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1。

4、构建同时表达玉米ZmEPSPS突变基因和ALS突变基因的载体

(1)构建玉米EPSPS突变基因ZmEPSPS-T表达框：

以人工合成的ZmEPSPS-T为模板，通过PCR克隆ZmEPSPS-T基因(引物为ZE-F:5’-ATCGGATCCACCATGGCGGCCATGGCGACC；ZE-R:5’-GGCGTCTCGAGTTATCAATTCTTGACGAAAGTGCTCAGC)，核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，序列5’端设置一个BamHI位点，3’端设置一个XhoI酶切位点。以玉米(B73)基因组为模板，通过PCR克隆玉米UBI-1启动子pZmUbi(引物为Zmubi-F1:5’-CCGGGTACCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTC；Zmubi-R1:5’-CATGGTGGATCCGATCTGCAGAAGTAACACCAAACAAC)，核苷酸序列如SEQ ID No：10所示，序列5’端设置一个KpnI位点，3’端设置一个BamHI位点。

将pCambia 1300载体中的CaMV35S终止子替换为拟南芥HSP18.2基因的终止子ter2：以拟南芥基因组(哥伦比亚型(Col，Columbia)生态型)为模板，通过PCR克隆拟南芥HSP18.2基因的终止子序列Ter2(引物为Ter2-F:5’-GCGGCTCGAGATATGAAGATGAAGATGAAATATTT；Ter2-R:5’-CTGAATTAACGCCGAATCTTATCTTTAATCATATTCC)，5’端设置一个XhoI酶切位点，ter2核苷酸序列如SEQ ID No：12所示。以pCambia 1300载体为模板，通过PCR克隆一段载体骨架序列(引物为LBcl1-F2:5’-GAATATGATTAAAGATAAGATTCGGCGTTAATTCAGTAC；LBcl1-R:5’-GCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATC)，命名为LBcl1，其核苷酸序列为pCambia1300载体(NCBI Accession Number：AF234296)中6319bp-6648bp所示。以上述通过PCR克隆获得的拟南芥HSP18.2基因的终止子序列Ter2和载体骨架序列LBcl1为模板，通过PCR克隆(引物为Ter2-F:5’-GCGGCTCGAGATATGAAGATGAAGATGAAATATTT；LBcl1-R:5’-GCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATC)获得5’至3’分别为拟南芥HSP18.2基因的终止子和载体骨架序列LBcl1的DNA片段，即Ter2-LBcl1，片段5’端和3’端分别设置有XhoI和BclI酶切位点。

构建完整的ZmEPSPS-T基因表达框：用XhoI和BclI分别对pCambia1300载体和PCR克隆片段Ter2-LBcl1进行双酶切，并分别回收酶切后的pCambia1300载体和Ter2-LBcl1片段，然后对上述片段进行连接后克隆获得过渡载体pCambia1300-Ter2。接下来，用KpnI和XhoI分别对过渡载体pCambia1300-Ter2，回收酶切后的载体；用BamHI和XhoI对PCR产物ZmEPSPS-T基因进行双酶切，回收酶切后的ZmEPSPS-T基因；用KpnI和BamHI对PCR产物玉米UBI-1启动子pZmUbi进行双酶切，回收酶切后的pZmUbi。然后对上述回收的载体和两个片段进行连接后克隆获得过渡载体pCambia1300-pZmUbi-ZmEPSPS-T-Ter2。

(2)构建水稻ALS突变基因OsALS-T2表达框

以人工合成的水稻ALS突变基因OsALS-T2为模板，通过PCR克隆OsALS-T2基因(引物为ALS-F:5’-CAGATCGGATCCACCATGGCTACGACCGCCGC；ALS-R:5’-CATATCTCGAGTTATCAATACACAGTCCTGCCATCACC)，核苷酸序列如SEQ ID No：7所示，序列5’端设置一个BamHI位点，3’端设置一个XhoI酶切位点。

构建完整的OsALS-T2基因表达框：用KpnI和XhoI分别对过渡载体pCambia1300-Ter2，回收酶切后的载体；用BamHI和XhoI对PCR产物OsALS-T2基因进行双酶切，回收酶切后的OsALS-T2基因；用KpnI和BamHI对PCR产物玉米UBI-1启动子pZmUbi进行双酶切，回收酶切后的pZmUbi。然后对上述回收的载体和两个片段进行连接后克隆获得过渡载体pCambia1300-pZmUbi-OsALS-T2-Ter2。

(3)构建终载体

以pCambia1300-pZmUbi-OsALS-T2-Ter2载体为模板，通过PCR克隆OsALS-T2基因表达框(引物为OsALS-T2-F2:5’-CCGGGTACCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTC和OsALS-T2-R2:5’-TGCAGGTACCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCC)。PCR产物5’端设置HindIII酶切位点，3’端设置KpnI酶切位点。然后用HindIII和KpnI分别对过渡载体pCambia1300-pZmUbi-ZmEPSPS-T-Ter2和OsALS-T2基因表达框PCR片段进行双酶切，回收酶切后的载体和片段进行连接后克隆获得载体pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2。

将获得的T-DNA载体(pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1、pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1和pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2)分别电击转化农杆菌EHA105，通过kan筛选，获得含有植物转化载体的菌株，加甘油后保存至-80度冰箱，用于转基因作物侵染。

实施例2、同时表达植物源EPSPS突变基因和ALS突变基因水稻的获得

转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙,1998,生命科学.10:125-131；刘凡等,2003,分子植物育种.1:108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取实施例1构建的含载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1、pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1和pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2的农杆菌单菌落接种至培养基(培养基组成：3g/L K₂HPO₄、1g/LNaH₂PO₄、1g/LNH₄Cl、0.3g/LMgSO₄·7H₂O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl₂、0.0025g/L FeSO₄·7H₂O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，28℃培养至OD600为0.6，获得农杆菌菌液。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6的农杆菌菌液中，28℃培养3天让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L脱落酸(ABA)+1mg/L萘乙酸(NAA)+5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L植物凝胶(gelrite))上，28℃培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室。将含载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1、pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1和pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2的转基因水稻植株分别命名为OEOA、OEMOA和ZEOB。

实施例3、同时表达植物源EPSPS突变基因和ALS突变基因大豆的获得

这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(Deng et al.,1998,PlantPhysiology Communications 34:381-387；Ma et al.,2008,Scientia AgriculturaSinica 41:661-668；Zhou et al.,2001,Journal of Northeast AgriculturalUniversity 32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的“天隆1号”大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50ml NaClO与2ml浓HCl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到B5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m²·s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。

准备好的外植体分别浸没在实施例2方法制备的农杆菌菌液(分别含载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1、pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1和pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2)中，28℃共培养30分钟左右。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10B5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。

共培养的植物组织用B5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到B5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有25mg/L草甘膦的B5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2B5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。

实施例4、同时表达植物源EPSPS突变基因和ALS突变基因玉米的获得

玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov and DavidDuncan(in MPaul Scott(ed.),Methods in Molecular Biology:Transgenic Maize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei and Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。

分别将实施例2分方法制备的含载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1、pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1和pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2的农杆菌菌液(OD660＝0.70)与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO₃+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L 6-糠基氨基嘌呤(kinetin)+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。获得含转化载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1、pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1和pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2中T-DNA的转基因玉米植株。

实施例5、除草剂抗性鉴定

1、转植物源EPSPS突变基因和ASL突变基因水稻OEOA、OEMOA和ZEOB的耐草甘膦性能的测定

大田耐草甘膦性能测定：T2代转基因水稻和常规水稻种子(秀水134)在发芽后15-20天，4-6叶时期，分别喷施用自来水以体积比1：200、1：100和1：50稀释的41％草甘膦异丙胺盐(孟山都公司)，喷施剂量为40L/亩，14天后记录水稻生长发育情况和死亡率。

通过在4-6叶期间大田喷施草甘膦，测定了转基因水稻的抗草甘膦性能，结果见表5。

表5转EPSPS突变基因水稻耐草甘膦性能试验^#

^#每亩喷施40L的1：200；1：100或者1:50稀释的农达(41％草甘膦，孟山都产品)。1:200为推荐稀释倍数。OEOA表示载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1转基因植株；OEMOA表示载体pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1转基因植株；ZEOB表示载体pCambia1300-Zm EPSPS-T-OsALS-T2转基因植株。转化体缩写后面的数字表示不同编号的转化体。秀水134为长江中下游的一个主栽品种。

结果表明，大多数转化体可以耐受较高浓度的草甘膦。OEOA-3、OEOA-10、OEOA-21、OE OA-39、OEMOA-17、OEMOA-22、OEMOA-29、OEMOA-45、OEMOA-47、ZEOB-8、ZEOB-25、和ZEOB-51的抗性水平比较高，其在每亩喷施40L的1：50稀释的农达(41％草甘膦异丙胺盐，孟山都)的条件下，即中剂量4倍的情况下，没有对转基因水稻产生明显影响。

2、转植物源EPSPS突变基因和ASL突变基因水稻OEOA、OEMOA和ZEOB的耐双草醚性能的测定

大田耐双草醚性能测定：T2代转基因水稻和常规水稻种子(秀水134)在发芽后15-20天，4-6叶时期，分别喷施重量为0.84g/亩、1.68g/亩和2.52g/亩的双草醚(江苏润泽农化有限公司)，剂量为30L/亩，14天后记录水稻生长发育情况和死亡率。

通过在4-6叶期间大田喷施双草醚，测定了转基因水稻的耐双草醚性能，结果见表6。

表6转ALS突变基因水稻耐双草醚性能试验^#

^#每亩喷施0.84g/亩、1.68g/亩和2.52g/亩的双草醚(江苏润泽农化有限公司)。0.84g/亩为推荐使用剂量。OEOA表示载体pCambia1300-OsEPSPS-T-OsALS-T1转基因植株；OEMOA表示载体pCambia1300-OsEPSPS-T-MAR-OsALS-T1转基因植株；ZEOB表示载体pCambia1300-ZmEPSPS-T-OsALS-T2转基因植株。转化体缩写后面的数字表示不同编号的转化体。秀水134为长江中下游的一个主栽品种。

结果表明，大多数转化体可以耐受较高浓度的双草醚。OEOA-3、OEOA-21、OEOA-39、OEMOA-17、OEMOA-22、OEMOA-29、OEMOA-45、OEMOA-47、ZEOB-8、ZEOB-24、ZEOB-25、和ZEOB-51的抗性水平比较高，其在每亩喷施2.52g双草醚(江苏润泽农化有限公司)的条件下，即中剂量4倍的情况下，没有对转基因水稻产生明显影响。

还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州芳韵生物科技有限公司

<120> 一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1548

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atggcggcga ccatggcgtc caacgccgcg gctgcggcgg cggtgtccct ggaccaggcc 60

gtggcggcgt cggcggcgtt ctcgtcgcgg aagcagctgc ggctgcccgc cgcggcgcgc 120

ggggggatgc gggtgcgggt gcgggcgcgg gggcggcggg aggcggtggt ggtggcgtcc 180

gcgtcgtcgt cgtcggtggc agcgccggcg gcgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc 240

atcagggaga tctccggggc ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caaccgcatc 300

ctcctcctct ccgccctctc cgagggcaca acagtggtgg acaacttgct gaacagtgag 360

gatgttcact acatgcttga ggccctgaaa gccctcgggc tctctgtgga agcagataaa 420

gttgcaaaaa gagctgtagt cgttggctgt ggtggcaagt ttcctgttga gaaggatgcg 480

aaagaggaag tgcaactctt cttggggaac gctggaattg caatgcgatc attgacagca 540

gccgtgactg ctgctggtgg aaatgcaact tatgtgcttg atggagtgcc acgaatgagg 600

gagagaccga ttggtgactt ggttgtcggg ttgaaacaac ttggtgcgga tgtcgactgt 660

ttccttggca ctgaatgccc acctgttcgt gtcaagggaa ttggaggact tcctggtggc 720

aaggttaagc tctctggttc catcagcagt cagtacttga gtgccttgct gatggctgct 780

cctttggccc ttggggatgt ggagatcgaa atcattgaca aactaatctc cattccttac 840

gttgaaatga cattgagatt gatggagcgt tttggtgtga aggcagagca ttctgatagt 900

tgggacagat tctatattaa gggagggcag aagtacaaat ctcctggaaa tgcctatgtt 960

gaaggtgatg cctcaagcgc gagctatttc ttggctggtg ctgcaatcac tggaggcact 1020

gtgacagttc aaggttgtgg tacgaccagt ttgcagggtg atgtcaaatt tgctgaggta 1080

cttgagatga tgggagcaaa ggttacatgg actgacacca gtgtaaccgt aactggtcca 1140

ccacgtgagc cttatgggaa gaaacacctg aaagctgttg atgtcaacat gaacaaaatg 1200

cctgatgttg ccatgaccct tgccgttgtt gcactcttcg ctgatggtcc aactgctatc 1260

agagatgtgg cttcctggag agtaaaggaa accgaaagga tggttgcaat tcggaccgag 1320

ctaacaaagc tgggagcatc ggttgaagaa ggtcctgact actgcatcat caccccaccg 1380

gagaagctga acatcacggc aatcgacacc tacgatgatc acaggatggc catggccttc 1440

tccctcgctg cctgcgccga cgtgcccgtg acgatcaggg accctggttg cacccgcaag 1500

accttcccca actacttcga cgttctaagc actttcgtca ggaactga 1548

<210> 2

<211> 515

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly Met Arg Val Arg Val Arg

35 40 45

Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val Ala Ser Ala Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Val Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro

65 70 75 80

Ile Arg Glu Ile Ser Gly Ala Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu

85 90 95

Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val

100 105 110

Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg

130 135 140

Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala

145 150 155 160

Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg

165 170 175

Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val

180 185 190

Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val

195 200 205

Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr

210 215 220

Glu Cys Pro Pro Val Arg Val Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly

225 230 235 240

Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu

245 250 255

Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile

260 265 270

Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met

275 280 285

Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe

290 295 300

Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val

305 310 315 320

Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile

325 330 335

Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln

340 345 350

Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val

355 360 365

Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro

370 375 380

Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met

385 390 395 400

Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly

405 410 415

Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu

420 425 430

Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val

435 440 445

Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn

450 455 460

Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe

465 470 475 480

Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly

485 490 495

Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe

500 505 510

Val Arg Asn

515

<210> 3

<211> 1518

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atggcggcca tggcgaccaa ggccgccgcg ggcaccgtgt cgctggacct cgccgcgccg 60

tcgcgccgcc accaccgccc gagctcggcg cgcccgcccg cccgccccgc cgtccgcggg 120

ctgcgggcgc ctgggcgccg cgtgatcgcc gcgccgccgg cggcggcagc ggcggcggcg 180

gtgcaggcgg gtgccgagga gatcgtgctg cagcccatca aggagatctc cggcaccgtc 240

aagctgccgg ggtccaagtc gctttccaac cgcatcctcc tgctcgccgc cctgtccgag 300

gggacaacag tggttgataa cctgttgaac agtgaggatg tccactacat gctcggggcc 360

ttgaggactc ttggtctctc tgtcgaagcg gacaaagctg ccaaaagagc tgtagttgtt 420

ggctgtggtg gaaagttccc agttgaggat tctaaagagg aagtgcagct cttcttgggg 480

aatgctggaa ttgcaatgcg gtcattgaca gcagctgtta ctgctgctgg tggaaatgca 540

acttacgtgc ttgatggagt accaagaatg agggagagac ccattggcga cttggttgtc 600

ggattgaagc agcttggtgc agatgttgat tgtttccttg gcactgactg cccacctgtt 660

cgtgtcaatg gaatcggagg gctacctggt ggcaaggtca agctgtctgg ctccatcagc 720

agtcagtact tgagtgcctt gctgatggct gctcctttgg ctcttgggga tgtggagatt 780

gaaatcattg ataaattaat ctccattccc tacgtcgaaa tgacattgag attgatggag 840

cgttttggtg tgaaagcaga gcattctgat agctgggaca gattctacat taagggaggt 900

caaaaataca agtcccctaa aaatgcctat gttgaaggtg atgcctcaag cgcaagctat 960

ttcttggctg gtgctgcaat tactggaggg actgtgactg tggaaggttg tggcaccacc 1020

agtttgcagg gtgatgtgaa gtttgctgag gtactggaga tgatgggagc gaaggttaca 1080

tggaccgaga ctagcgtaac tgttactggc ccaccgcggg agccatttgg gaggaaacac 1140

ctcaaggcga ttgatgtcaa catgaacaag atgcctgatg tcgccatgac tcttgctgtg 1200

gttgccctct ttgccgatgg cccgacagcc atcagagacg tggcttcctg gagagtaaag 1260

gagaccgaga ggatggttgc gatccggacg gagctaacca agctgggagc atctgttgag 1320

gaagggccgg actactgcat catcacgccg ccggagaagc tgaacgtgac ggcgatcgac 1380

acgtacgacg accacaggat ggccatggcc ttctcccttg ccgcctgtgc cgaggtcccc 1440

gtgaccatcc gggaccctgg gtgcacccgg aagaccttcc ccgactactt cgatgtgctg 1500

agcactttcg tcaagaat 1518

<210> 4

<211> 506

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ala Ala Met Ala Thr Lys Ala Ala Ala Gly Thr Val Ser Leu Asp

1 5 10 15

Leu Ala Ala Pro Ser Arg Arg His His Arg Pro Ser Ser Ala Arg Pro

20 25 30

Pro Ala Arg Pro Ala Val Arg Gly Leu Arg Ala Pro Gly Arg Arg Val

35 40 45

Ile Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gln Ala Gly

50 55 60

Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val

65 70 75 80

Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala

85 90 95

Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu

100 105 110

Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ser Val

115 120 125

Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly

130 135 140

Lys Phe Pro Val Glu Asp Ser Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu Gly

145 150 155 160

Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala

165 170 175

Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu

180 185 190

Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Asn Gly

210 215 220

Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser

225 230 235 240

Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly

245 250 255

Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val

260 265 270

Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala Glu His

275 280 285

Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys

290 295 300

Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr

305 310 315 320

Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu Gly

325 330 335

Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu

340 345 350

Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val Thr Val

355 360 365

Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys Ala Ile

370 375 380

Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val

385 390 395 400

Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser

405 410 415

Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu

420 425 430

Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile

435 440 445

Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp

450 455 460

His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro

465 470 475 480

Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp Tyr

485 490 495

Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn

500 505

<210> 5

<211> 1935

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60

ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgccc gaggccgggt gggggcggcg 120

gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180

ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240

ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg gcggcgcgtc catggagatc 300

caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360

gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420

acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480

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aattaatttt tactaacaca tatatttact tatcaaaaat ttgacaaagt aagattaaaa 600

taatattcat ctaacaaaaa aaaaaccaga aaatgctgaa aacccggcaa aaccgaacca 660

atccaaaccg atatagttgg tttggtttga ttttgatata aaccgaacca actcggtcca 720

tttgcacccc taatcataat agctttaata tttcaagata ttattaagtt aacgttgtca 780

atatcctgga aattttgcaa aatgaatcaa gcctatatgg ctgtaatatg aatttaaaag 840

cagctcgatg tggtggtaat atgtaattta cttgattcta aaaaaatatc ccaagtatta 900

ataatttctg ctaggaagaa ggttagctac gatttacagc aaagccagaa tacaaagaac 960

cataaagtga ttgaagctcg aaatatacga aggaacaaat atttttaaaa aaatacgcaa 1020

tgacttggaa caaaagaaag tgatatattt tttgttctta aacaagcatc ccctctaaag 1080

aatggcagtt ttcctttgca tgtaactatt atgctccctt cgttacaaaa attttggact 1140

actattggga acttcttctg aaaatagt 1168

Claims

1.一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体，其特征在于所述载体包含5-烯醇丙酮酸莽草酸3-磷酸合酶EPSPS突变基因和乙酰乳酸合成酶ALS突变基因；所述EPSPS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3所示；所述ALS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体还包括介导植物源耐除草剂突变基因表达的启动子，所述启动子包括植物泛素启动子。

3.如权利要求2所述的载体，其特征在于所述植物泛素启动子核苷酸序列如SEQ IDNo：9或SEQ ID No：10所示。

4.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体包括终止植物源耐除草剂突变基因表达的终止子，所述终止子包括水稻HSP17.9基因终止子ter1或拟南芥HSP18.2终止子ter2。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于所述终止子ter1的核苷酸序列如SEQ ID No：11，终止子ter2的核苷酸序列如SEQ ID No：12所示。

6.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体包括增强植物源耐除草剂突变基因表达量或者稳定性的调控元件，所述调控元件为基质附着区序列MAR，所述基质附着区序列MAR核苷酸序列为SEQ ID No：13所示。

7.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体的基础载体是将pCambia1300载体中的CaMV35S终止子替换为水稻HSP17.9基因的终止子ter1或者拟南芥HSP18.2基因的终止子ter2。

8.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体组成为下列之一：(1)SEQ ID No：1所示的水稻EPSPS突变基因OsEPSPS-T、SEQ ID No：5所示的水稻ALS突变基因OsALS-T1、SEQID No：9所示的启动子pOsUbi、SEQ ID No：11所示的终止子ter1；(2)SEQ ID No：1所示的水稻EPSPS突变基因OsEPSPS-T、SEQ ID No：5所示的水稻ALS突变基因OsALS-T1、SEQ ID No：9所示的启动子pOsUbi、SEQ ID No：13所示的调控元件MAR、SEQ ID No：11所示的终止子ter1；(3)SEQ ID No：3所示的玉米EPSPS突变基因ZmEPSPS-T、SEQ ID No：7所示的水稻ALS突变基因OsALS-T2、SEQ ID No：10所示的启动子pZmUbi、SEQ ID No：12所示的终止子ter2。

9.一种权利要求1所述同时表达两种植物源耐除草剂突变基因载体在制备植物细胞中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述植物包括玉米、水稻、大豆、油菜或棉花。