CN108753809B - 一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法，涉及脂肪酸生产领域。通过构建提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒并转化获得重组蓝藻，该重组蓝藻过表达前脂蛋白二脂酰转移酶Lgt和硫酯酶AcTesA。前脂蛋白二脂酰转移酶Lgt是一种支架蛋白，在蓝藻膜导向序列的作用下定位于细胞膜。硫酯酶AcTesA通过柔性肽FL3与支架蛋白Lgt相连，硫酯酶蛋白AcTesA具有低底物特异性，可以水解C8－C16的酰基ACP，能获得种类丰富的脂肪酸产物。本发明通过支架蛋白Lgt将硫酯酶蛋白AcTesA的固定在细胞膜上，加快了蓝藻细胞中脂肪酸合成速度，降低了细胞中的ROS含量，最终提高了转基因突变株分泌至细胞外的脂肪酸产量。

Description

一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种重组蓝藻，尤其涉及其在提高蓝藻脂肪酸合成效率方面的作用及其制备方法。
背景技术
能源，是整个人类社会发展的推动力，随着石油资源的紧缺以及环境的日亦恶化，对环保且可再生能源的需求变得越来越迫切，而生物燃料能很好地解决此问题。脂肪酸是合成生物燃料的重要前体，可以通过化学或生物合成将其进一步加工成脂肪醇、脂肪烃、脂肪酸甲酯等不同用途的化工材料和能源。目前为止，被用于生产脂肪酸的微生物主要是大肠杆菌和酵母，但天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂产量有限，且天然脂肪酸多为胞内分泌，必须从组织和细胞中分离才能得到，增加了生物燃料的制造成本。
作为一种原始的单细胞原核生物，蓝藻广泛分布在不同的生境中，能利用太阳能进行产氧性光合作用。与植物和异养微生物相比，蓝藻具有光合转化效率高、生长速度快、不占用土地、遗传操作简便等优势，而且经过遗传改造的蓝藻能够将合成的燃料物质直接分泌出胞外，有助于降低工艺成本，因此在生物燃料开发领域具有广阔的应用前景。利用代谢工程和合成生物学手段对蓝藻脂肪酸代谢途径进行改造和调控以提高目的产物产量的工作有很多。研究人员用蓝藻模式菌株Synechocystis sp.PCC 6803作为宿主细胞，通过敲除内源酰基-ACP合成酶(AAS)，过表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，引入经密码子优化的大肠杆菌硫酯酶(TesA)，同时削弱细胞壁肽聚糖层的强度，将游离脂肪酸产量提高到了197mg/L。在另一种脂肪酸耐受的蓝藻模式菌株Synechococcus sp.PCC 7002中，研究人员也通过敲除酰基-ACP合成酶(AAS)和长链脂肪酸辅酶A连接酶(FadD)，以及过表达大肠杆菌硫酯酶TesA和来源于Synechococcus elongatus PCC 7942的RuBisCO基因，最终合成了130mg/L的游离脂肪酸。在发明专利“一种脂肪酸产量提高的重组蓝藻、其制备方法及其应用”中，发明人通过在Synechocystis sp.PCC 6803中过表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)，将重组蓝藻的总脂肪酸含量相较于野生型藻株提高了47.93％。
但是，要想达到工业生产的需求，目前用蓝藻来生产脂肪酸的效率还远远不够，需要更有效的方法对脂肪酸代谢途径进行改造，以获得理想的产物合成效率。在构建脂肪酸合成工程菌的过程中，研究人员不仅要解决在不影响宿主细胞体内代谢流平衡的前提下最大限度地提高脂肪酸生物合成途径的效率的问题，同时还要面对工程菌对于其自身代谢终产物耐受性不足的挑战。研究表明，蓝藻对脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸具有较高的敏感性，不饱和酸可能通过与活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)反应产生一些毒性物质，如过氧化氢物或自由基，这些物质会通过插入细胞或细胞器膜对细胞生理活动产生影响。有研究显示，ROS的产生和胞内游离脂肪酸的含量密切相关，因此对脂肪酸的耐受性不足是限制工程化蓝藻的经济稳定性的重要因素之一。另外，由于很多工程菌都会被敲除酰基－ACP合成酶(AAS)来阻断脂肪酸的再循环途径，因此进一步加剧了脂肪酸在胞内的堆积，给细胞生长造成巨大的压力。不少研究工作通过削弱细胞外膜强度和过表达脂肪酸外排泵系统来促进积聚在胞内的游离脂肪酸外排，进而提升胞外游离脂肪酸的产量，但是类似的改造会对细胞产生生长抑制效应，造成细胞的提早凋亡，因此现有技术并不利于构建稳定的脂肪酸合成工厂。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的重组蓝藻，该重组蓝藻具有促进胞内合成的脂肪酸的外排，增加胞外脂肪酸产量，也进一步提高工程化蓝藻对自身合成脂肪酸产物的耐受性。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现阶段蓝藻生产脂肪酸的效率偏低，同时工程化蓝藻对自身合成脂肪酸的耐受性交叉，无法达到工业化生产的需求。
本发明的一个方面提供了一种提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，所述质粒包括蓝藻膜导向序列、编码前脂蛋白二脂酰转移酶的Lgt基因和编码硫酯酶的基因，所述Lgt基因来源于集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803，所述蓝藻膜导向序列用于将前脂蛋白二脂酰转移酶定位于细胞膜上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因顺序串联在一个表达盒上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因的表达位于同一启动子的控制之下。
进一步地，所述编码硫酯酶的基因为AcTesA基因，来源于不动杆菌Acinetobacterbaylyi的硫酯酶AcTesA。在微生物合成脂肪酸的过程中，有一类叫做硫酯酶的蛋白发挥着重要作用。硫酯酶可以催化水解脂酰基ACP生成游离脂肪酸和ACP，解除由脂酰ACP导致的脂肪酸生物合成调节机制中的反馈抑制作用，释放游离脂肪酸。而且不同来源的硫酯酶具有不同的底物特异性，因此可以产生不同碳链长度的脂肪酸产物，从而提高产物的多样性。分离自不动杆菌Acinetobacter baylyi的硫酯酶AcTesA具有低底物特异性，可以水解C8－C16的酰基ACP，获得种类丰富的脂肪酸产物，避免了在底盘细胞中同时表达多个硫脂酶的复杂性。
进一步地，所述Lgt基因的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示；AcTesA基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述Lgt基因的基因序列为SEQ ID NO:3；AcTesA基因的基因序列如SEQID NO:4。
进一步地，所述Lgt基因和AcTesA基因之间通过柔性肽FL3的编码序列相连，柔性肽FL3的编码序列如SEQ NO:5所示。
进一步的，所述蓝藻膜导向序列优选为蓝藻蛋白转运系统Sec途径相关基因的信号序列ssSec，其基因序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步地，所述启动子优选为为光敏启动子PcpcB，其基因序列为SEQ ID NO:7。
进一步地，所述提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒以pBluescript II KS(+)(Stratagene，货号：212207)为原始载体，最终质粒命名为PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII。原始载体中的U0168序列和D0168序列作为同源臂将需要表达的基因定向整合到蓝藻基因组中，U0168序列为SEQ ID NO:8，D0168序列为SEQ ID NO:9。
本发明的另一个方面还提供了一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻，所述重组蓝藻由前述提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒转化得到，其中Lgt蛋白和硫酯酶在蓝藻中同时过表达。
优选的，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。
进一步地，所述重组蓝藻为mAcT。
本发明的再一个方面提供一种制备上述重组蓝藻的方法，所述方法包括：将额外拷贝的编码所述前脂蛋白二酯酰转移酶(Lgt)的基因和编码所述硫酯酶(AcTesA)的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。
更具体地，本发明提供一种提高蓝藻胞外脂肪酸产量和提高蓝藻对脂肪酸耐受性的方法，其步骤如下：
1)PCR克隆相关基因PcpcB，ssSec，Lgt和AcTesA，Lgt和AcTesA之间用柔性肽FL3连接，AcTesA的3’端带有His-tag。将各基因片段按顺序依次连接到载体pBluescript II KS(+)中，形成载体PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII。卡那霉素抗性基因nptII作为重组蓝藻抗性筛选标记,序列为SEQ ID NO:10。U0168序列和D0168序列作为同源臂将需要表达的基因定向整合到蓝藻基因组中。
2)将载体转化野生型蓝藻细胞，利用卡那霉素抗性平板筛选转化克隆；
3)转化藻株均质化，基因水平和蛋白水平鉴定；
4)转基因突变株分泌型胞外脂肪酸含量分析。
5)转基因突变株ROS含量分析。
本发明的又一方面提供了一种利用重组蓝藻高效生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
第一步：制备前述高效表达脂肪酸的重组蓝藻；
第二步：重组蓝藻的培养，并回收发酵液；
第三步：从发酵液中提取脂肪酸。
在一个优选的实施方式中，在第一步和第二步之间还包括对蓝藻基因水平和蛋白水平的鉴定，以及对胞外脂肪酸含量分析和重组蓝藻的ROS分析。
集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803(ATCC，27184)(以下简称为Synechocystissp.)的Lgt蛋白的TM4具有对于脂蛋白结合非常重要的基元[LVI](-3)[ASTVI](-2)[GAS](-1)C(+1)。因此本发明选择用Synechocystis sp.内源的Lgt蛋白作为蓝藻膜支架的核心元件，并利用蓝藻蛋白转运系统Sec途径相关基因的信号序列ssSec，将Lgt蛋白定位在细胞膜上。
本发明通过将前脂蛋白二酯酰转移酶Lgt基因和硫酯酶AcTesA基因顺序串联在一个表达盒，由光敏启动子PcpcB调控，将AcTesA融合在Lgt膜蛋白上，并在蓝藻的质体膜上表达了AcTesA，进而构建了重组蓝藻菌株mAcT。
通过利用本专利中前脂蛋白二酯酰转移酶Lgt基因和硫酯酶AcTesA基因，加快了蓝藻细胞中脂肪酸合成速度，降低了细胞中的ROS含量，最终提高了转基因突变株分泌至细胞外的脂肪酸产量。该基因组合方式亦可用于真核藻类脂代谢基因工程改造。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
1、相比于改造蓝藻细胞膜来帮助脂肪酸分泌出细胞，利用本发明中的系统对蓝藻脂肪酸合成途径进行改造能够在高效加速脂肪酸代谢反应的同时大幅提升胞外的脂肪酸含量，胞外脂肪酸含量的提升可极大的帮助脂肪酸提取工艺的简化。
2、相比于用定向进化等传统手段提高工程菌对具有生物毒性的终产物的耐受性，本发明能够有效地降低重组蓝藻体内的ROS含量，提高基因改造菌株对于脂肪酸的耐受性，提供了一种便利的提高工程化蓝藻经济稳定性的方案。
3、相比于大肠杆菌，开发蓝藻来源的膜蛋白的生物学功能为以光合微生物为生物底盘生产清洁生物能源和高附加值产物的研究提供了新的设计思路和技术支持。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明较佳实施例中转化子mAcT总基因组DNA PCR鉴定结果；
图2是本发明较佳实施例中转化子mAcT目标蛋白表达鉴定结果；
图3是本发明较佳实施例中野生型蓝藻和转化子mAcT发酵7天所得上清液的GC-MS图谱；
图4是本发明较佳实施例中转化子mAcT发酵7天所得上清液与同条件野生型蓝藻生产脂肪酸的比较；
图5是本发明较佳实施例中转化子mAcT发酵7天所得胞外脂肪酸种类与同条件野生型蓝藻的比较；
图6是本发明较佳实施例中转化子mAcT的胞内ROS相对含量与同条件野生型蓝藻的比较；
图7是本发明较佳实施例中转化子mAcT的细胞凋亡率与同条件野生型蓝藻的比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1构建基因组整合质粒平台
提取Synechocytis sp.PCC 6803基因组DNA，以其为模板，通过PCR，克隆Synechocytis sp.相关基因，包括重组同源臂U0168、D0168、PcpcB、ssSec、Lgt(GenbankAccession No.CP003265.1)。AcTesA基因序列由金唯智公司合成。DNA抗药性筛选标记nptII片段来自已有的载体质粒pRSFDuet-1Vector(购自Novagen)的PCR产物。通过酶切，获得带有相关粘性末端的所需各基因DNA片段。以上使用的引物序列如下：
Figure BDA0001686417920000051
Figure BDA0001686417920000061
通过载体构建将U0168、PcpcB、ssSec、Lgt、AcTesA序列通过酶切连接的方法依次克隆到质粒pBluescript II KS(+)的多克隆位点KpnI和NotI之间，形成带有PcpcBssSecLgtAcTesA的质粒，将nptII和D0168序列通过重叠PCR的方法连接，再通过酶切连接的方法克隆到质粒PcpcBssSecLgtAcTesA的多克隆位点NotI和SacI之间，形成PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII质粒，转化大肠杆菌，利用卡那霉素和青霉素进行双抗性筛选，获得转化菌株。将质粒提取纯化后，DNA测序验证，证明所构建质粒DNA序列正确。
实施例2转化子mAcT的获得
通过同源重组，将PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII序列整合到Synechocytis sp.PCC6803基因组DNA上，并使之表达(每条染色体含至少一个PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII拷贝)。具体步骤如下：
1)转化：收集处于对数生长期的Synechocytis sp.PCC 6803蓝藻细胞，用BG11液体培养基调整藻液浓度至OD730＝2.5，取5-20μg质粒PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII加入到500μl藻液中混匀，25μmol/m2/s的光照强度下静置培养2小时，摇床震荡培养过夜。
2)筛选：在含有卡那霉素的BG11固体培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓度为50ug/ml。经多次传代选择均质化转化子，将筛选到的重组子命名为mAcT。
3)基因水平鉴定：用引物KpnI-U0168F、SalI-U0168R对重组子进行PCR扩增，使扩增片段包含PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII基因；提取蓝藻mAcT总基因组DNA；分别以KpnI-U0168F、SalI-U0168R为引物，进行PCR扩增。结果如图1所示，在mAcT中用引物扩增到特异性条带，与目标产物大小(～3000bp)相符，经DNA测序为正确序列，表明mACT含有目的基因片段Lgt和AcTesA。
4)蛋白表达水平鉴定：将新接种的mAcT菌株光照摇床震荡培养至OD730＝0.4，再置于绿光下继续培养24小时直到OD730＝0.45。收集细胞进行超声处理，通过梯度超速离心法分别得到类囊体膜、质体膜两个部分。用抗His-tag的一抗与两个部分的蛋白提取物进行反应，通过Western Blot方法检测融合蛋白Lgt-AcTesA的表达情况。结果如图2显示，在质体膜蛋白(PM)中有特异性条带，与目标蛋白大小(～50KD)相符，在类囊体膜蛋白(TM)中没有发现条带，证明融合蛋白Lgt-AcTesA正确表达在蓝藻细胞的质体膜上。
实施例3总膜蛋白提取及内、外膜蛋白的分离：
1.蓝藻培养24h后收集细胞，4℃，6700g离心力离心10分钟；
2.用相当于细胞体积50倍的100mM Tris-HCl(pH7.5)冲洗细胞两次；
3.用0.5－1ml的10mM Tris(pH7.5)重悬细胞，将细胞重悬液在-80℃下冷冻2小时；
4.超声破碎细胞(周期为15s超声，45s冷却)，直到细胞悬液从浑浊状变成半透明状，4℃，10000g离心力离心10分钟，收集上清液；
5.4℃，100000g离心力离心10分钟，上清液为胞质蛋白，下层沉淀为总膜蛋白；
6.用500μl的10mM Tris(pH7.5)冲洗总膜蛋白两次，用100mM Tris-HCl(pH7.5)重悬，再次以4℃，100000g离心力离心10分钟；
7.用100－200μl含有2％Triton X-100的Tris-HCl(pH7.5)重悬沉淀，室温放置30分钟，使内膜蛋白溶解；
8.混合物用4℃，100000g离心力离心10分钟，上清液包含内膜蛋白，不溶于水的部分包含外膜蛋白；
总膜蛋白提取：
1.蓝藻培养3-5天后收集细胞，4℃，6700g离心力离心10分钟，用无菌水冲洗细胞；
2.将细胞重悬于20mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)，终体积为5ml；
3.加入酸洗玻璃珠(直径0.425-0.6μm)，涡旋振荡器最高速震荡2分钟，冰浴1分钟，4℃，4000g离心力离心1分钟；
4.收集上层细胞悬液，4℃，4000g离心力离心10分钟，收集上清液，4℃，103000g离心力离心30分钟；
5.弃上清，总膜蛋白沉淀用含0.25M蔗糖的5mM磷酸钾(pH7.8)缓冲液冲洗，并用同样的缓冲液重悬至3ml。
双水相分配系统分离类囊体膜和质体膜：
1.按照配方表(见表1)准备好双水相分配系统；
2.在4℃温和地翻转管子35次以完成分配；
3.4℃，1000g离心力离心4分钟以完成固定；
4.分别收集重分配管中的上层相和下层相；
5.样品管的深绿色下层相包含了绝大多数的类囊体膜(B1)，上层相包含了绝大多数的质体膜(T1)。收集T1，转移至新的离心管；
6.在收集的T1中加入新的重分配管的下层相；
7.按照步骤2、3进行重分配。弃下层相，加入重分配管中的下层相，重复3次，得到上层相(T3)。将T3加入含有20％葡聚糖和40％聚乙二醇的5.8％的下层相，使得每种聚合物的比例为6.2％。重分配之后，上层相(T4)用下层相重分配两次得到上层相T6；
8.T6含有纯的黄色质体膜，用至少5倍体积的0.25M蔗糖和5mM磷酸钾(pH7.8)的缓冲液稀释，4℃，125000g离心力离心1小时；
9.质体膜用含有1mM PMSF的0.25M蔗糖和5mM磷酸钾(pH7.8)的缓冲液均质化；
10.在第5步中得到的B1中加入来自重分配系统的新的上层相；
11.按照步骤2、3进行重分配。绝大多数类囊体膜被分配到下层相中(B2)，弃上层相并加入新的上层相；
12.为了分离类囊体膜，B2用5.8％的上层相重分配3次，得到下层相(B5)；
13.收集B5，用至少5倍体积的0.25M蔗糖和5mM磷酸钾(pH7.8)的缓冲液稀释，4℃，125000g离心力离心1小时；
14.类囊体膜用含有1mM PMSF的0.25M蔗糖和5mM磷酸钾(pH7.8)的缓冲液均质化；
15.用10％聚丙烯酰胺胶分离T6和B5中的蛋白，转印到PVDF膜上用特异性标签检测目标蛋白的表达。
表1双水相分配系统配方表
母液 样品管(6.25g) 重分配管(40g) 重分配瓶(20g)
20％葡聚糖 1.812g 11.6g 6.2g
40％聚乙二醇 0.906g 5.8g 3.1g
双相缓冲液(4*) 0.906g 8.4g 4.2g
无菌水 0.328g 14.04g 7.02g
0.2M苯甲基磺酰氟 0.031g 0.16g 0.08
膜 2.267g - -
实施例4转化子mAcT的发酵培养和脂肪酸含量测定
将处在对数生长期的蓝藻藻株mAcT接种在配制好的BG11液体培养基(配方见表2)中，使细胞密度达到109个细胞/ml。培养过程光照强度控制在50μmol/m2/s，在培养期间，向培养液中通入1％的二氧化碳和空气的混合气体，温度控制在30℃。培养所使用的容器为250ml三角瓶。培养进行到第7天，取20ml藻液，通过离心将藻泥和培养液分离。
表2 BG11培养基配方
Figure BDA0001686417920000081
Figure BDA0001686417920000091
配制时每1L培养基加入每种母液1ml，Na2CO3和NaNO3后加，最后定容至1L。
测定Synechocystis sp.野生型藻株胞外脂肪酸组分含量如下表3，测定mAcT胞外脂肪酸组分含量如下表4，分析方法如下：
1.脂肪酸提取：
取20ml与藻泥分离后的培养液，加入0.4ml含0.4g NaCl的1M磷酸进行酸化；加入10ml正己烷，充分震荡萃取游离脂肪酸；室温下以8000rpm的转速离心5分钟，将上层有机相转移至干净的玻璃管中；重复萃取两次；合并有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml离心管中，用氮气吹干至恒重。
2.脂肪酸甲酯化：
按上述方法提取出粗提物后，用2-3ml甲醇充分溶解，加入相同体积的三氟化硼-甲醇进行甲酯化反应，得到脂肪酸甲酯混合物。具体方法为：将混合物于60℃加热30分钟，室温冷却后转移至塑料管；加入4-6ml正己烷，涡旋震荡混匀至少2分钟；室温静置至彻底分层，取1ml上层正己烷相转移至1.5ml色谱进样瓶。
3.脂肪酸分析：
使用LECO Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪进行气相色谱-质谱分析(色谱条件为载气，氦气流量30ml/min、氢气流量40ml/min、空气流量400ml/min，进样器温度：250℃，检测器温度：250℃，分流比：1:20，程序升温：起始150℃，持续2min，10℃/min升温至220℃，保持10分钟)。分析方法为内标法。图3是野生型蓝藻和转化子mAcT发酵7天所得上清液的GC-MS图谱；图4是转化子mAcT发酵7天所得上清液与同条件野生型蓝藻生产脂肪酸的比较，图5是转化子mAcT发酵7天所得胞外脂肪酸种类与同条件野生型蓝藻的比较，具体结果详见表3和表4。
表3气相色谱测定的Synechocystis sp.野生型藻株胞外脂肪酸组分表
样品 脂肪酸含量(％)
C10:0 /
C12:0 /
C14:0 /
C16:0 58.59
C16:1 /
C18:0 41.40
C18:1 /
C18:2 /
C18:3 /
C18:4 /
C20:0 /
C20:1 /
C22:0 /
C22:1 /
C24:0 /
合计 100
表4气相色谱测定的mAcT藻株胞外脂肪酸组分表
Figure BDA0001686417920000101
Figure BDA0001686417920000111
实施例5转化子mAcT的细胞内ROS含量测定
按照标准培养方法光照振荡培养mAcT至第7天，收集藻液进行总ROS含量检测，具体方法如下：
1.取1ml藻液，加入活性氧簇的细胞渗透性指示剂CM-H2DCFDA(Invitrogen,货号C6827)至终浓度为25mM。另取1ml不加CM-H2DCFDA的藻液作为对照以去除细胞自身荧光；
2.在32℃的黑暗条件下孵育90分钟，用BG11液体培养基冲洗两次，将细胞重悬于0.5ml BG11液体培养基中；
3.取200ul细胞悬液加至酶标仪专用透明96孔板中，每个样品设立4个重复；
4.用BioTeK Synergy 2Multi-Mode Reader进行荧光检测(程序参数设置为激发光波长：485/20nm，吸收光波长：535/20nm，灵敏度：50，光学元件位置：底部，读取速度：正常。)分析方法：Gene5软件，图6为转化子mAcT的胞内ROS相对含量与同条件野生型蓝藻的比较的结果示意图，前脂蛋白二酯酰转移酶Lgt基因的转入通过将脂肪酸转入细胞膜外，大大降低了蓝藻细胞内ROS的相对含量，提高了蓝藻对脂肪酸的耐受性。
实施例5转化子mAcT的细胞凋亡率测定
用绿色核酸染料
Figure BDA0001686417920000112
Green(Invitrogen，货号S7020)检测死细胞百分比。1ml含有1×105个细胞的藻液中加入30nM
Figure BDA0001686417920000113
Green，室温放置20分钟，用BDFACSAriaII流式细胞仪检测荧光，激发光波长为488nm，带通滤光片530/30处收集荧光信号。绿色荧光细胞被收集并计数为死细胞，图7为细胞凋亡率的统计结果，重组蓝藻的凋亡率显著低于野生型，从侧面证明了重组蓝藻细胞内的ROS相对含量明显低于野生型ROS的相对含量。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 283
<212> PRT
<213> 集胞藻(Synechocystis PCC 6803)
<400> 1
Met Ile Glu Gln Ile Phe Phe Gly Gln Phe Gln Ser Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
Met Phe Gln Ile Gly Gly Phe Ala Leu Arg Trp Tyr Gly Phe Leu Ile
20 25 30
Ala Ser Ala Val Ile Ile Gly Leu Asn Leu Cys Gln Trp Leu Gly Gln
35 40 45
Lys Arg Gly Ile Asn Pro Asp Leu Phe Asn Asp Leu Val Ile Trp Leu
50 55 60
Val Val Ala Ala Ile Pro Ser Ala Arg Leu Tyr Tyr Val Ala Phe Glu
65 70 75 80
Trp Pro Arg Tyr Ala Gln His Trp Leu Asn Ile Phe Ala Ile Trp Gln
85 90 95
Gly Gly Ile Ala Ile His Gly Ala Leu Ile Gly Gly Thr Ile Ala Ile
100 105 110
Leu Val Phe Ser Arg Tyr His Gln Leu Ser Phe Trp Asn Leu Leu Asp
115 120 125
Val Leu Thr Pro Ala Val Ile Leu Gly Gln Ala Ile Gly Arg Trp Gly
130 135 140
Asn Phe Phe Asn Ser Glu Ala Phe Gly Ala Pro Thr Asn Leu Pro Trp
145 150 155 160
Lys Leu Tyr Ile Pro Phe Ala Asn Arg Pro Leu Asn Leu Thr Ser Tyr
165 170 175
Ala Tyr Phe His Pro Thr Phe Leu Tyr Glu Ser Val Trp Asn Leu Gly
180 185 190
Ile Phe Ala Ile Leu Ile Ala Leu Phe Phe Tyr Gly Leu Arg Asn Pro
195 200 205
Glu Lys Ile Lys Thr Gly Thr Ile Thr Cys Val Tyr Leu Ile Gly Tyr
210 215 220
Ser Leu Gly Arg Val Trp Ile Glu Gly Leu Arg Leu Asp Ser Leu Met
225 230 235 240
Leu Gly Pro Leu Arg Ile Ala Gln Val Val Ser Ile Thr Leu Val Leu
245 250 255
Leu Gly Thr Ala Gly Ile Val Trp Leu Tyr Leu Leu Gln Lys Asn Leu
260 265 270
Pro Asp Trp Ser Glu Arg Lys Leu Val Lys Asn
275 280
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 不动杆菌(Acinetobacter baylyi)
<400> 2
Met Lys Thr Ile Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Ser Ala Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Ile Asn Pro Glu Gln Gly Trp Val Ala Leu Leu Gln Lys Arg Leu Asp
20 25 30
Gln Gln Phe Pro Lys Gln His Lys Val Ile Asn Ala Ser Val Ser Gly
35 40 45
Glu Thr Thr Ser Gly Ala Leu Ala Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Thr
50 55 60
Tyr Arg Pro Asn Val Val Val Ile Glu Leu Gly Gly Asn Asp Ala Leu
65 70 75 80
Arg Gly Gln Pro Pro Gln Met Ile Gln Ser Asn Leu Glu Lys Leu Ile
85 90 95
Gln His Ser Gln Lys Ala Lys Ser Lys Val Val Val Phe Gly Met Lys
100 105 110
Ile Pro Pro Asn Tyr Gly Thr Ala Tyr Ser Gln Ala Phe Glu Asn Asn
115 120 125
Tyr Lys Val Val Ser Gln Thr Tyr Gln Val Lys Leu Leu Pro Phe Phe
130 135 140
Leu Asp Gly Val Ala Gly His Lys Ser Leu Met Gln Asn Asp Gln Ile
145 150 155 160
His Pro Asn Ala Lys Ala Gln Ser Ile Leu Leu Asn Asn Ala Tyr Pro
165 170 175
Tyr Ile Lys Gly Ala Leu
180
<210> 3
<211> 852
<212> DNA
<213> 集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)
<400> 3
atgattgagc aaatattttt cggacaattt cagtcccccg ggccggtgat gttccagata 60
gggggttttg ccctgcgttg gtacggattt ttgattgcca gtgctgtcat tattggtttg 120
aatctctgtc aatggttggg gcaaaaacgg ggcattaacc cggatttatt caacgattta 180
gtcatttggt tagtggtggc ggccatccct tctgctcgcc tatattacgt cgcctttgag 240
tggccccgct atgcccagca ttggttaaat atttttgcca tttggcaagg gggcattgct 300
atccatgggg ccttgattgg gggaacgatc gccattcttg ttttcagtcg ctaccatcag 360
ttatctttct ggaatttgct ggatgtactc accccggcgg ttattctcgg ccaggcgatc 420
ggtcggtggg gcaacttttt taactccgaa gcttttggtg cccccactaa tttgccttgg 480
aagctctata ttccctttgc taatcgtccg ctaaatctga ccagctatgc ctatttccat 540
cctacttttt tatacgaatc agtctggaac ctaggaattt ttgcaatctt gatagcccta 600
tttttttatg gactaagaaa tccagaaaaa atcaaaactg ggaccataac ctgtgtttat 660
ttgattggtt atagcctcgg tcgagtgtgg attgaaggtt taagattaga tagtttgatg 720
cttggtcctc tgagaatagc tcaggttgtt agcatcaccc tagttttatt gggaacagcg 780
ggaattgtct ggttatatct tctgcagaaa aatttaccgg actggtcgga gcgaaaattg 840
gtaaaaaatt aa 852
<210> 4
<211> 549
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter baylyi)
<400> 4
atgaaaacca ttcttatctt aggcgacagt ctgagtgcgg gttatggcat taaccccgaa 60
cagggctggg tcgctttatt acaaaaacgt ctggatcaac aatttcccaa gcagcataaa 120
gtcattaatg ccagtgtaag tggggaaacc accagtggtg ctttagctcg tttacccaaa 180
ctacttacta cttatcgacc taatgtggtg gtcattgagc ttggtggtaa tgatgcatta 240
agaggacaac cgcctcaaat gattcaaagt aatctggaaa aattaatcca gcacagccaa 300
aaggcaaaat ctaaagtcgt ggtgtttgga atgaaaatac caccaaatta tggcactgcc 360
tatagtcagg catttgaaaa taattataag gtagtgagtc aaacatatca ggttaagttg 420
ttgccatttt ttcttgatgg tgtggctgga cacaaaagtc taatgcaaaa tgaccagatc 480
catccaaatg ccaaagccca gtcaatcttg ctaaataacg catacccata tattaaaggc 540
gctttataa 549
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actagagctg aggccgccgc aaaagaagca gcagctaagg aagctgcggc gaag 54
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> 集胞藻(synechocystis sp.)
<400> 6
tttaaaggag gttaagtgtt aaacaaatct gttcagatcc tctctggagt tgtgcttgct 60
gctgcggcct taggttttac aacccccgcc caggct 96
<210> 7
<211> 589
<212> DNA
<213> 集胞藻(synechocystis sp.)
<400> 7
gttataaaat aaacttaaca aatctatacc cacctgtaga gaagagtccc tgaatatcaa 60
aatggtggga taaaaagctc aaaaaggaaa gtaggctgtg gttccctagg caacagtctt 120
ccctacccca ctggaaacta aaaaaacgag aaaagttcgc accgaacatc aattgcataa 180
ttttagccct aaaacataag ctgaacgaaa ctggttgtct tcccttccca atccaggaca 240
atctgagaat cccctgcaac attacttaac aaaaaagcag gaataaaatt aacaagatgt 300
aacagacata agtcccatca ccgttgtata aagttaactg tgggattgca aaagcattca 360
agcctaggcg ctgagctgtt tgagcatccc ggtggccctt gtcgctgcct ccgtgtttct 420
ccctggattt atttaggtaa tatctctcat aaatccccgg gtagttaacg aaagttaatg 480
gagatcagta acaataactc tagggtcatt actttggact ccctcagttt atccggggga 540
attgtgttta agaaaatccc aactcataaa gtcaagtagg agattaatt 589
<210> 8
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactatggct ttgatggtta tatgggaatt cccggtatgg atggcaccga tgcggaatcc 60
caacagattg cctttgacaa caatgtggcc tggaataacc tgggggattt gtccaccacc 120
acccaacggg cctacacttc ggctattagc acagacacag tgcagagtgt ttatggcgtt 180
aatctggaaa aaaacgataa cattcccatt gtttttgcgt ggcccatttt tcccaccacc 240
cttaatccca cagattttca ggtaatgctt aacacggggg aaattgtcac cccggtgatc 300
gcctctttga ttcccaacag tgaatacaac gaacggcaaa cggtagtaat tacgggcaat 360
tttggtaatc gtttaacccc aggcacggag ggagcgattt atcccgtttc cgtaggcaca 420
gtgttggaca gtactccttt ggaaatggtg ggacccaacg gcccggtcag tgcggtgggt 480
attaccattg atagtctcaa cccctacgtg gccggcaatg gtcccaaaat tgtcgccgct 540
aagttagacc gcttcagtga cctgggggaa ggggctcccc tctggttagc caccaatcaa 600
aataacagtg gcggggattt atatggagac caagcccaat ttcgtttgcg aatttacacc 660
agcgccggtt tttcccccga tggcattgcc agtttactac ccacagaatt tgaacggtat 720
tttcaactcc aagcggaaga tattacggga cggacagtta tcctaaccca aactggtgtt 780
gattatgaaa ttcccggctt tggtctggtg caggtgttgg ggctggcgga tttggccggg 840
gttcaggaca gctatgacct gacttacatc gaagatcatg acaactatta cgacattatc 900
ctcaaagggg ac 912
<210> 9
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagccgcagt tcgccaaatt aagagggttg ctttgccctc cgaaggggat tattcggcgg 60
tttataatcc cggtggcccc ggcaatgatc cagagaatgg tcccccaggg ccctttactg 120
tgtccagtag tccccaggta attaaggtaa cggataccat cggccagccc accaaagtct 180
cctatgtgga agtggatggc cccgtattgc gtaatccctt cagtggtact cccattgggc 240
aagaggtggg tttagcggtt aaagatctgg ccacaggtca tgaaatttat cagtacactg 300
acccagatgg gaaggtattt tatgcttcct ttgctgccgc tgatgaccaa gccacggatt 360
taaccacggc gatcgccaat cccacggcca tcgatttaat taacgccagg ggatttacgg 420
cgggtagttc cgtcaccgta tcgggttcct acagtcggga agcctttttt gatggatcca 480
tgggttttta tcgacttctg gacgataacg gtgcagtgct agatccctta acaggtggtg 540
taatcaaccc aggacaggta ggttatcaag aagcagcttt ggcagatagc aatcgtttgc 600
aagccactgg ctccacccta acggcagaag acctagaaac cagagcattt tccttcaata 660
ttttgggtgg cgagttgtat gcgccatttt taacggttaa tgacagtctt tccggtatta 720
atcagactta ttttgccttt gggtcggcca acccagatgg catcagccac agcacaaact 780
tgggacccaa cgtgattggt tttgaagatt ttctcggcgg aggag 825
<210> 10
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgaacaat aaaactgtct 60
gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc 120
tctaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 180
gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 240
gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 300
agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 360
cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 420
gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 480
ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 540
caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 600
aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg 660
gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 720
ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 780
atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 840
tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 900
ttc 903
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggggtaccc aactatggct ttgatgg 27
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgcgtcgac gtcccctttg aggataat 28
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgcgtcgac gttataaaat aaacttaaca aatctat 37
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccggaattca attaatctcc tacttgactt tatg 34
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccggaattct ttaaaggagg ttaagtgtta aacaaatctg ttcagatcc 49
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcggatcca gcctgggcgg gggttgta 28
<210> 17
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcggatcca ctagagctga ggccgccgca aaagaagcag cagctaagga agctgcggcg 60
aaggccgaag gaagattaat gattgagc 88
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctagtctaga attttttacc aattttcgct ccg 33
<210> 19
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctctagaac tagagctgag gccgccgcaa aagaagcagc agctaaggaa gctgcggcga 60
agatgaaaac cattcttatc ttaggcg 87
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ataagaatgc ggccgcatga tgatgatgat gatgttataa agcgccttta atatatggg 59
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaggaaaaaa gcggccgcgt tataaaataa acttaacaaa tctat 45
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggcgaactgc ggcttttaga aaaactcatc gagcatc 37
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctcgatgag tttttctaaa agccgcagtt cgccaaat 38
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgagctcctc ctccgccgag aaaatc 26

Claims (4)

1.一种提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，所述质粒包括蓝藻膜导向序列、编码前脂蛋白二脂酰转移酶的Lgt基因和编码硫酯酶的基因，所述Lgt基因来源于集胞藻Synechocystissp.PCC 6803，其特征在于，所述蓝藻膜导向序列用于将前脂蛋白二脂酰转移酶定位于细胞膜上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因顺序串联在一个表达盒上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因的表达位于同一启动子的控制之下；所述编码硫酯酶的基因为AcTesA基因，来源于不动杆菌Acinetobacter baylyi的硫酯酶AcTesA；所述Lgt基因编码的蛋白序列如SEQID NO:1所示；所述AcTesA基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示；所述Lgt基因和AcTesA基因之间通过柔性肽FL3的编码序列相连，所述柔性肽FL3的编码序列如SEQ NO:5所示；所述蓝藻膜导向序列为蓝藻蛋白转运系统Sec途径相关基因的信号序列ssSec，其基因序列如SEQ ID NO:6所示；所述启动子为光敏启动子PcpcB，其基因序列如SEQ ID NO:7所示；所述提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒以pBluescript II KS(+)为原始载体，最终质粒命名为PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII。
2.一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻，其特征在于，所述重组蓝藻由如权利要求1所述的提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒转化得到，其中前脂蛋白二脂酰转移酶和硫酯酶在蓝藻中同时过表达。
3.如权利要求2所述的高效表达脂肪酸的重组蓝藻，其特征在于，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。
4.一种利用如权利要求2或3任一项所述的重组蓝藻高效生产脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：制备如权利要求2或3所述的高效表达脂肪酸的重组蓝藻；
第二步：重组蓝藻的培养，并回收发酵液；
第三步：从发酵液中提取脂肪酸。
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