DE1069330B

DE1069330B - Verfahren zur Gewinnung von Vitamin Biä durch anaerobe Gärung

Info

Publication number: DE1069330B
Application number: DENDAT1069330D
Authority: DE
Inventors: Dr. BeIa Molnar und Geza Wack Budapest Dr. Eva Cserei-Pechany
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyär R. T" Budapest
Publication date: 1959-11-19

Description

Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 durch anaerobe Gärung In der deutschen Patentschrift Nr. 922 126 und in der britischen Nr. 705 346 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 Konzentraten beschrieben, in welchem als Ausgangsstoffe Faulschlamm oder andere, durch Methangärung erzeugte Produkte verwendet werden. Es konnte auch nachgewiesen werden, daß das Vitamin Blz im Laufe der Methangärung von Bakterien gebildet wird. Es war jedoch bisher ungeklärt, ob in der Produktion der Substanz sämtliche Bakterien der Methangärung eine Rolle spielen oder aber nur einzelne Stämme B12 produzieren und daneben auch indifferente, ja sogar vitaminverbrauchende Bakterien zugegen sind. Die Erfinder haben versucht, durch Isolierung der einzelnen Bakterienstämme der gemischten Bakterienflora des Faulschlammes festzustellen, welche vitaminproduzierend sind, zu dem Zwecke, durch Sicherstellung der optimalen Lebensbedingungen dieser Stämme die Vitaminausbeute im Faulschlamm zu erhöhen. Im Laufe dieser Versuche ist es auch gelungen, etwa 20 verschiedene Bakterienstämme aus dem Faulschlamm zu isolieren. Bei der Untersuchung dieser Stämme hinsichtlich ihrer Bi. -Erzeugung wurde aber festgestellt, daß der überwiegende Teil derselben überhaupt kein Vitamin B12 produziert, während man auch von der restlichen geringeren Anzahl der Stämme nur unbedeutende Mengen dieses Vitamins erhalten kann. Hierdurch wurde die Annahme bestätigt, daß in der reichen Flora des Faulschlammes eine große Anzahl der Bakterienstämme hinsichtlich der Vitamin B"-Produktion nicht ausschlaggebend ist. Die Frage jedoch, welches Bakterium bzw. welche Bakteriengruppe die aktive Substanz erzeugt, blieb unbeantwortet. Zur Lösung dieser Frage mußte daher eine andere Methode herangezogen werden, und zwar die Ermittlung derjenigen Phase der Faulschlammgärung, in welcher man im Laufe der bakteriellen Zersetzung des außerordentlich komplexen Nährbodens Vitamin B12 erhalten kann.
Es wurde derart vorgegangen, daß Versuchsfermentoren mit Faulschlamm beschickt wurden, und dieser wurde mit einer anorganische Salze enthaltenden Nährflüssigkeit versetzt; dann wurde dieser Nährboden bei den einzelnen Versuchen noch jeweils mit variablen Komponenten - Proteinen, Kohlehydraten, Alkoholen, Fettsäuren usw. - ergänzt. Der Verlauf der B12 Produktion während der Fermentation wurde beobachtet und auch das Verhältnis von Vitamin B12 zu den B12artigen Faktoren jeweils ermittelt, ferner wurde der Verlauf der Gasentwicklung beobachtet. Es konnte festgestellt werden, daß eine bedeutende Vitamin B" Ausbeute lediglich bei jenen Versuchen erreicht werden konnte, bei welchen niedrige Alkohole, vorzugsweise Äthylalkohol, dem synthetischen Nährboden zugesetzt worden sind, und zwar bei jenen Versuchen, bei welchen auch Karbonate bzw. C 02 in der Gärflüssigkeit anwesend waren.
In jenen Versuchen, die mit Zusatz von hochmolekularen Kohlehydraten (Stärke, Zellulose) durchgeführt wurden, konnte ebenfalls eine erhöhte B12-Produktion beobachtet werden, die aber in einer späteren Phase der Fermentation eingetreten ist; dies ist vermutlich auf die Bildung von Alkoholen im Laufe der Vergärung zurückzuführen.
Diese Versuche führten somit zum Ergebnis, daß die Produktion von Vitamin B" im Laufe der Methangärung durch die Gegenwart von Alkoholen mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gefördert wird; als Alkohole können sowohl primäre als auch sekundäre Alkohole, ferner auch andere Stoffe verwendet werden, die im Laufe der Methangärung derartige Alkohole bilden. Auch die Gegenwart von Karbonaten bzw. CO, oder von Stoffen, die im Laufe der Methangärung C 02 bilden können, ist erforderlich.
Die Erfindung besteht darin, daß man zur Gewinnung von Vitamin B12 durch anaerobe Gärung unter Methanentwicklung derart verfährt, daß man der Gärflüssigkeit vor und/oder während der Gärung einen primären oder sekundären Alkohol mit 2 bis 5 C-Atomen und Kohlendioxyd zuführt.
Es ist selbstverständlich, daß durch die verschieden zusammengesetzten Nährflüssigkeiten jeweils die Entwicklung bzw. das 1=lberhandnehmen verschiedener Bakterienarten gefördert worden ist. Insofern diese Umwandlung der Flora von einer Veränderung der Vitamin B12 Ausbeute begleitet wird, kann man daraus folgern, daß diese Veränderung von der gesteigerten oder erhöhten B12-Erzeugung des fraglichen Bakteriums hervorgerufen wird. Die Tatsache, daß das maximale Niveau durch Zusatz von Alkoholen und CO, erreicht wird, ferner, daß sich im Laufe der Gärung Methangas bildet, ist für eine einzige Bakterienart, nämlich für das Methanobakterium Omelianskii, aus der Gruppe der Kuyver van Niel'schen Methanobakterien, kennzeichnend (s. Bergey's Manual of Det. Bact., 6. Auflage, 1948; H. Henkelekian, H. Heinemann, SewageWorks J.,11-426,1939, und H. A. Barker, J. Biol. Chem. 137, 153, 1941). Dies ist um so überraschender, als Methanobakterium Omelianskii bisher nicht als Vitamin B12-erzeugender Mikroorganismus gegolten hat, obwohl seine Gegenwart im Faulschlamm nachgewiesen wurde.
Gemäß der v organgs zitierten Literatur gewinnt das genannte Bakterium die zum Wachstum erforderliche Energie vorzugsweise aus der Umwandlung von Alkoholen und C02 in Fettsäuren und Methan z. B. nach der folgenden Gleichung: 2 C2 Hb O H -f- CO, -f- 2 H,0 -+- 2 CH,COOH -f- CH, -f- 2 H20. Die entstandene Fettsäure wird dann im weiteren Verlauf der Methangärung von den übrigen, im Faulschlamm enthaltenen Bakterien zu C02 und CH, zersetzt. So wird durch den Zusatz von Alkoholen auch das Wachstum der mit dem Methanobakterium Omelianskii symbiontisch lebenden fettsäurezersetzenden Bakterien des Faulschlammes aufrechterhalten. Diese Symbiose kann und soll auch nicht vermieden werden, da die säurezersetzenden Mikroorganismen durch Zersetzung der metabolischen Produkte des Vitamin B12 erzeugenden Methanobakterium Omelianskii und durch Erzeugung eines Teiles der erforderlichen Kohlensäure für die Vermehrung desselben förderlich sind.
Aus den mit Alkoholzusatz erhaltenen B12 Konzentrationen und aus den mit anderen Nährbodenzusätzen erhaltenen negativen Ergebnissen sowie aus den oben beschriebenenphysiologischen Eigenschaften des Methanobakterium Omelianskii kann mit Sicherheit gefolgert werden, daß im Laufe der sogenannten Methangärung das Vitamin B12-unter den zahlreichen im Faulschlamm vorhandenen Bakterienarten - obwohl nicht ausschließlich, jedoch hauptsächlich von Methanobakterien und in erster Linie vom Methanobakterium Omellanskii erzeugt wird.
Die Bedeutung der Erfindung liegt darin, daß man einerseits in der Lage ist, den B12-Gehalt des Faulschlammes durch Zusatz geeigneter Nährbodenbestandteile zu erhöhen, andererseits darin, daß man einen neuen Stamm für die industrielle Fermentation heranziehen kann, welcher als Vitamin B12-erzeugend unerkannt gewesen ist.
Die Nährflüssigkeit der Fermentation enthält gemäß der Erfindung neben den zur Züchtung der Bakterien bekannten, üblichen anorganischen Salzen auch die zur selektiven Vermehrung des Methanobakterium Omelianskii erforderlichen Alkohole und CO,.
Diese beiden Stoffe können jedoch teilweise oder ganz durch Kohlehydrate ersetzt werden, die durch alkoholische Gärung Alkohol und CO, liefern können, wie z. B. Melasse. In diesem Falle müssen in der Fermentationslösung auch Mikroorganismen anwesend sein, die als Erreger der alkoholischen Gärung wirken, was man z. B. durch Zusatz von Hefe erreichen kann.
Man kann auch derart verfahren, daß man ein synthetisches Nährsubstrat, das auch Naturstoffe, wie Hefe, enthält, mit Methanobakterium Omelianskii beimpft.
Die Fermentation kann in einem einfachen, mit Rührwerk versehenen geschlossenen Behälter unter septischen Bedingungen durchgeführt werden. Als Impfmaterial kann Faulschlamm verwendet werden, worauf man zunächst täglich eine gewisse Menge Nährflüssigkeit zusetzt, bis der Fermentor aufgefüllt ist. Danach wird der normale kontinuierliche Betrieb des Fermentors derart fortgesetzt, daß gleichzeitig mit den täglichen Nährbodenzusätzen eine gleiche Menge Fermentationsflüssigkeit abgezogen wird.

Beispiel 1 Ein 1000m1-Gefäß wird mit 480m1 gut gärendem Faulschlamm-Bodensatz (Vitamin B"-Gehalt etwa 0,3 gamma/ml) versetzt. Hierzu werden 120m1 der folgenden Nährlösung zugesetzt:

Äthylalkohol........................ 1,0 g

H,NC1 .... ...... . .. . ... .. ... . ...... 0,1 g

K2 H P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,04 g

MgS04 7 H20 .. . ... .... . .. ... ...... 0,01 g

CoCL2 6 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0004 g

Bierhefe ............................ 0,002 g

ergänzt mit Wasser auf 100 ml.

Es werden pro Stunde etwa 200 ml CO, gleichmäßig eingeleitet und das Reaktionsgemisch während 150 Tagen bei 28° C und bei einem p$ = 7,0 bis 7,4 gehalten. Nach j e 3 Tagen werden jeweils 120 ml Gärmischung abgezogen und gleichzeitig eine identische Menge der Nährlösung eingetragen. Vitamin Bit Gehalt der abgezogenen Proben: 0,5bis0,6 gamma/ml,Trockensubstanzgehalt: 1,1g/100m1. Tägliche Ausbeute: 37 gamma[liter Fermentorvolumen. Beispiel 2 In einem 20-Liter-Gärbottich wird mittels 51 eines gut gärenden Faulschlammes eine Fermentation bei 37° C in Gang gesetzt. Der Schlamm enthält 0,44 gamma/ ml Vitamin B12, bei einem Trockensubstanzgehalt von 2,7 g/100 ml. Zu Beginn der Fermentation wird zweitägig eine Nährlösung folgender Zusammensetzung zugesetzt

Äthylalkohol........................ 5,6 ml

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g

H4NCL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g

K,HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... 0,2 g

M9S04 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g

Co (N 0,) , 6 HZ 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,003 g

gemahlene Rübenschnitzel (ausgelaugt) 2,8 g

mit Wasser auf 560 ml ergänzt.

Nach der Auffüllung des Fermentors entnimmt man (stets nach Verrühren des Bodensatzes) täglich 560 ml Fermentsaft und ergänzt den Inhalt des Fermentors mit der gleichen Menge der obigen Nährlösung. Der Vitamingehalt der abgezogenen Proben wird nach Ablauf von 2 Wochen konstant, 0,6 gamma/inl, bei einem Trockensubstanzgehalt von 1,2 g(100 ml. Gebildete Gasmenge: täglich etwa 7 bis 9000 ml. Ausbeute: täglich 22 gamma Vitamin B12 pro Liter Fermentorvolumen.
Beispiel 3 Man beschickt einen 800m3 Fermentor mit 680m3 Faulschlamm mit einem B12 Gehalt von 0,18 gamma/ml, und setzt 120 m3 Nährlösung folgender Zusammensetzung zu:

Alkohol ............................ 1,0%

Nag C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,401,

und die üblichen Nährsalze gemäß den vorangehenden Beispielen. Vom dritten Tage an werden nach Durchrühren des Fermentorinhalts täglich 40 m3 Fermentationsflüssigkeit abgezogen und gleichzeitig das gleiche Volumen der obigen Nährlösung eingetragen. Die abgezogene Flüssigkeit wird immer klarer und ihr Vitamin-Gehalt entsprechend höher. Nach 20 bis 25 Tagen wird der Saft gleichmäßig klar und enthält im Durchschnitt 4,35 gamma/ml Vitamin B12 bei einem Trockensubstanzgehalt von 0,54 g(100 ml. Ausbeute: täglich 17 gamma, berechnet auf 1 Liter Fermentor-Volumen.

Die täglich abgezogene Fermentationsflüssigkeit kann zur Gewinnung des Vitamin B12 in üblicher Weise aufgearbeitet werden. Da der gebildete Wirkstoff in Bakterienkörper eingelagert ist, bringt man vorzugsweise lediglich ,die durch Filtrieren oder Sedimentation getrennten Bakterienkörper zur Weiterverarbeitung. Beispiel 4 In einem 200-Liter-Fermentor wird als Methanobakterium-Impfmaterial 100 Liter nach dem Beispiel 2 hergestellte Fermentationsflüssigkeit eingesetzt. Die Fermentationsflüssigkeit wurde mit 500 ml einer auf einem Melasse-Nährboden in üblicher Weise hergestellten Saccharomyces-Kultur beimpft, und danach setzt man zwei- bis viertägig 201 Nährlösung folgender Zusammensetzung zu:

0

Nag C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40[,)

Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0()/,

Co C12 6H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,00010/0

Sobald das Volumen 2001 erreicht hat, werden täglich 121 Fermentationsflüssigkeit abgezogen und die gleiche Menge Nährlösung eingetragen. Die entnommenen Anteile enthalten 0,80 gamma/ml Vitamin B12, die tägliche Ausbeute beträgt pro Liter Fermentor 48 gamma. Aus den nach den Beispielen erhaltenen Rohprodukten kann die aktive Substanz mittels bekannter Methoden gewonnen werden.

Die Fermentation mittels Methanobakterium Omelianskii kann auch mit anderen alkoholbildenden Bakterien, wie z. B. mit butylogenen Clostridien, auf einem stärkehaltigen Nährboden verbunden werden oder mit zellulosezersetzenden Bakterien auf einem zellulosehaltigen industriellen Abfallmaterial. Die symbiontische Funktion dieser Stämme ermöglicht die Verwendung billiger Nährbodenquellen; andererseits können, wie bekannt, einzelne dieser Stämme, wie z. B. die butylogenen Clostridien, das B12 Niveau erhöhen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 durch anaerobe Gärung unter Methanentwicklung und Isolierung des Vitamins B12 aus dem Fermentationsprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß man der Gärflüssigkeit vor und/oder während der Gärung einen primären oder sekundären Alkohol mit 2 bis 5 C-Atomen und Kohlendioxyd zuführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gärflüssigkeit ein mit Methanobakterium Omelianskii beimpftes synthetisches Nährsubstrat, das auch Naturstoffe, wie Hefe, enthalten kann, verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gärflüssigkeit eine mit Faulschlamm beimpfte Nährflüssigkeit verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man der Gärflüssigkeit die Substrate und die Erreger der alkoholischen Gärung beigibt.