Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 durch anaerobe Fermentation In der britischen Patentschrift Nr. 748043 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin-B12 Konzentraten beschrieben, in welchem als Ausgangs stoffe Faulschlamm oder andere durch Methan gärung erzeugte Produkte verwendet werden. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass das Vitamin B12 im Laufe der Methangärung von Bakterien ge bildet wird.
Es war jedoch bisher ungeklärt, ob in der Produktion der Substanz sämtliche Bakterien der Methangärung eine Rolle spielen oder aber nur ein zelne Stämme Vitamin 1312 produzieren und daneben auch indifferente, ja sogar vitaminverbrauchende Bakterien zugegen sind.
Es wurde versucht, durch Isolierung der einzelnen Bakterienstämme der gemischten Bakterienflora des Faulschlammes festzustellen, welche vitaminproduzie rend sind, zu dem Zwecke, durch Sicherstellung der optimalen Lebensbedingungen dieser Stämme die Vitaminausbeute im Faulschlamm zu erhöhen. Im Laufe dieser Versuche ist es auch gelungen, etwa 20 verschiedene Bakterienstämme aus dem Faulschlamm zu isolieren.
Bei der Untersuchung dieser Stämme hinsichtlich ihrer B12 Erzeugung wurde aber fest gestellt, dass der überwiegende Teil derselben über haupt kein Vitamin B12 produziert, während man auch von der restlichen geringeren Anzahl der Stämme nur unbedeutende Mengen dieses Vitamins erhalten kann.. Hierdurch wurde die Annahme be stätigt, dass in der reichen Flora des Faulschlammes eine grosse Anzahl der Bakterienstämme hinsichtlich der Vitamin-B12 Produktion nicht ausschlaggebend ist. Die Frage jedoch, welches Bakterium bzw. welche Bakteriengruppe die aktive Substanz erzeugt, blieb unbeantwortet.
Zur Lösung dieser Frage musste daher eine andere Methode herangezogen werden, und zwar die Ermittlung derjenigen Phase der Faulschlamm gärung, in welcher man im Laufe der bakteriellen Zersetzung des ausserordentlich komplexen Nähr bodens Vitamin B12 erhalten kann.
Es wurde derart vorgegangen, dass Versuchs- fermentoren mit Faulschlamm beschickt wurden, und dieser wurde mit einer anorganische Salze enthalten den Nährflüssigkeit versetzt;
dann wurde dieser Nährboden bei den einzelnen Versuchen noch jeweils mit variablen Komponenten - Proteinen, Kohlehydra ten, Alkoholen, Fettsäuren usw. - ergänzt. Der Ver lauf der Vitamin-B"-Produktion während der Fer mentation wurde beobachtet und auch das Verhältnis von Vitamin B12 zu den B12 artigen Faktoren jeweils ermittelt, ferner wurde der Verlauf der Gasentwick lung beobachtet.
Es konnte festgestellt werden, dass eine bedeutende Vitamin-B12 Ausbeute lediglich bei jenen Versuchen erreicht werden konnte, bei welchen niedrige Alkohole, vorzugsweise Äthylalkohol, dem synthetischen Nährboden zugesetzt worden sind, und zwar bei jenen Versuchen, bei welchen auch Car- bonate bzw. C02 in der Gärflüssigkeit anwesend waren.
In jenen Versuchen, die mit Zusatz von hoch molekularen Kohlehydraten (Stärke, Zellulose) durch geführt wurden, konnte ebenfalls eine erhöhte Vitamin-B12 Produktion beobachtet werden, die aber in einer späteren Phase der Fermentation eingetragen ist; dies ist vermutlich auf die Bildung von Alkoholen im Laufe der Vergärung zurückzuführen.
Diese Versuche führten somit zum Ergebnis, dass die Produktion von Vitamin B12 <B>Im</B> Laufe der Methangärung durch die Gegenwart von Alkoholen mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gefördert wird; es können sowohl primäre als auch sekundäre Alkohole, ferner auch andere Stoffe, die im Laufe der Methan gärung derartige Alkohole bilden, die Erzeugung von Vitamin B12 günstig beeinflussen. Auch die Gegen wart von C02 oder von Stoffen, z.
B. Carbonaten, die im Laufe der Methangärung C02 bilden können, ist erforderlich.
Die Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 durch anaerobe Kultivierung von Vitamin B12 erzeugenden Mikro organismen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man dem Nährmedium oder der Kultur einen primären oder sekundären Alkohol mit 2 bis 5 C-Atomen und Kohlendioxyd zusetzt.
Es ist selbstverständlich, dass durch die verschie den zusammengesetzten Nährflüssigkeiten jeweils die Entwicklung bzw. das überhandnehmen verschie dener Bakterienarten gefördert worden ist. Insofern diese Umwandlung der Flora von einer Veränderung der Vitamin-B.2Ausbeute begleitet wird, kann man daraus folgern, dass diese Veränderung von der ge steigerten oder erhöhten Vitamin-B12-Erzeugung des fraglichen Bakteriums hervorgerufen wird.
Ausser der Tatsache, dass eine optimale Ausbeute durch Zu- Satz von Alkoholen der genannten Art und CO, er reicht wird, wurde ferner in einigen Fällen festge stellt, dass sich im Laufe der Gärung Methangas bildet, was auf eine bestimmte Bakterienart schlie ssen lässt, nämlich auf das Methanobakterium Ome- lianskii aus der Gruppe der Kyver van Nielschen Methanobakterien (s. Bergeys Manual of Det. Bact., 6. Auflage, 1948;
H. Henkelekian, H. Heinemann, Sewage Works J., 11-426, 1939, und H. A. Barker, J. Biol. Chem. 137,<B>153,</B> 1941). Dies ist um so über raschender, als Methanobakterium Omelianskii bisher nicht als Vitamin B12 erzeugender Mikroorganismus gegolten hat, obwohl seine Gegenwart im Faul schlamm nachgewiesen wurde.
Gemäss der vorgangs zitierten Literatur gewinnt das genannte Bakterium die zum Wachstum erfor derliche Energie vorzugsweise aus der Umwandlung von Alkoholen und C02 in Fettsäuren und Methan z. B. nach der folgenden Gleichung:
-2C2H50H + C02 + 2H20 --> 2CH3COOH + CH4 + 2H,0 Die entstandene Fettsäure wird dann, falls Faul schlamm im Nährmedium enthalten ist, im weiteren Verlauf der Methangärung von den übrigen im Faul schlamm enthaltenen Bakterien zu C02 und CH4 zersetzt.
So wird durch den Zusatz von Alkoholen auch das Wachstum der mit dem Methanobakterium Omelianskii symbiotisch lebenden fettsäurezersetzen- den Bakterien des Faulschlammes aufrechterhalten. Diese Symbiose kann und soll auch nicht vermieden werden, da die säurezersetzenden Mikroorganismen durch Zersetzung der metabolischen Produkte des Vitamin Bi. erzeugenden Methanobakterium Ome- lianskii und durch Erzeugung eines Teils der erfor derlichen Kohlensäure für die Vermehrung desselben förderlich sind.
Aus den hohen Ausbeuten an Vitamin B1, beim erfindungsgemässen Verfahren und aus den mit an dern Nährbodenzusätzen erzielten negativen Ergeb nissen sowie aus den oben beschriebenen physiolo gischen Eigenschaften des Methanobakterium Ome- lianskii kann mit Sicherheit gefolgert werden, dass das Vitamin B12 nicht ausschliesslich, jedoch hauptsäch lich, von Methanobakterien und in erster Linie vom Methanobakterium Omelianskii erzeugt wird.
Vorzugsweise wird derart verfahren, dass man ein mit Methanobakterium Omelianskii beimpftes synthetisches Nährsubstrat verwendet.
Die Nährflüssigkeit der Fermentation enthält in der Regel die bei bekannten Verfahren verwendeten üblichen anorganischen Salze. Zusätzlich zu den Al koholen und dem CO, können auch Kohlehydrate zugesetzt werden, die durch alkoholische Gärung entsprechende Alkohole und C02 liefern, wie. z. B. Melasse, sofern in der Fermentationslösung auch Mikroorganismen anwesend sind, die als Erreger der alkoholischen Gärung wirken, was man z. B. durch Zusatz von Hefe erreichen kann.
Man kann derart verfahren, dass man ein synthe tisches Nährsubstrat, das z. B. Hefe enthält, mit Me- thanobakterium Omelianskii beimpft. Das Nähr medium kann aber auch mit Faulschlamm beimpft werden.
Die Fermentation kann in einem einfachen, mit Rührwerk versehenen geschlossenen Behälter unter septischen Bedingungen durchgeführt werden. Man kann z. B. so vorgehen, dass man die Gärflüssigkeit mit Faulschlamm beimpft und täglich eine gewisse Menge Nährflüssigkeit zusetzt, bis der Fermentor aufgefüllt ist. Danach wird der normale kontinuier liche Betrieb des Fermentors derart fortgesetzt, dass gleichzeitig mit den täglichen Nährbodenzusätzen eine gleiche Menge Fermentationsflüssigkeit abge zogen wird.
<I>Beispiel 1</I> Ein 1000-ml-Gefäss wird mit 480 ml gut gären dem Faulschlamm (Vitamin-Bi.-Gehalt etwa 0,3 ;"\ml) versetzt. Hierzu werden 120 ml der folgenden Nähr lösung zugesetzt:
EMI0002.0085
Äthylalkohol <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> NH4C1 <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 0,04 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> * <SEP> 7<B><U>11</U></B>1)0 <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> CoCh <SEP> - <SEP> 6H,0 <SEP> 0,0004 <SEP> g
<tb> Lufttrockenes <SEP> Bierhefepulver <SEP> 0,002 <SEP> g ergänzt mit Wasser auf<B>100</B> ml.
Es werden pro Stunde etwa 200 ml CO<B><U>.,</U></B> gleich mässig eingeleitet und das Reaktionsgemisch während <B>150</B> Tagen bei 28 C und bei einem pH - 7,0 bis 7,4 gehalten. Nach je 3 Tagen werden jeweils 120 ml Gärmischung abgezogen und gleichzeitig eine iden tische Menge der Nährlösung eingetragen. Vitamin- B12-Gehalt der abgezogenen Proben: 0,5 bis 0,6 ;,,\ml, Trockensubstanzgehalt: <B>1,1</B> gi100 ml. Tägliche Aus beute: 37 ;,JLiter Fermentorvolumen.
<I>Beispiel 2</I> In einem 20-Liter-Gärbottich wird mittels 5 1 eines gut gärenden Faulschlammes eine Fermentation bei 37 C in Gang gesetzt. Der Schlamm enthält 0,44 ;@(ml Vitamin Bi., bei einem Trockensubstanz- gehalt von 2,7 g(100 ml. Zu Beginn der Fermentation wird zweitägig eine Nährlösung folgender Zusammen setzung zugesetzt:
EMI0003.0004
Äthylalkohol <SEP> 5,6 <SEP> ml
<tb> CaCO3 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> NH4C1 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> Co(N03)3 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> 0,003 <SEP> g
<tb> gemahlene <SEP> Rübenschnitzel
<tb> (ausgelaugt) <SEP> 2,8 <SEP> g
<tb> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 560 <SEP> ml <SEP> ergänzt.
Nach der Auffüllung des Fermentors entnimmt man (stets nach Verrühren des Bodensatzes) täglich 560 ml Fermentsaft und ergänzt den Inhalt des Fermentors mit der gleichen Menge der obigen Nähr lösung. Der Vitamin-131.-Gehalt der abgezogenen Proben wird nach Ablauf von 2 Wochen konstant, 0,6 ;,(ml, bei einem Trockensubstanzgehalt von 1,2 g/100 ml.
Gebildete Gasmenge: täglich etwa 7 bis 9000 ml. Ausbeute: täglich 22 ;, Vitamin B12 pro Liter Fermentorvolumen.
<I>Beispiel 3</I> Man beschickt einen 800-m3-Fermentor mit 680 m- Faulschlamm mit einem Vitamin-B"-Gehalt von 0,18 y(ml, und setzt 120 m3 Nährlösung folgen der Zusammensetzung zu: Alkohol 1,0 Q/0- Na2C03 0,411/9 und die üblichen Nährsalze gemäss den vorangehen den Beispielen.
Vom dritten Tage an werden nach Durchrühren des Fermentorinhalts täglich 40 m3 Fermentationsflüssigkeit abgezogen und gleichzeitig das gleiche Volumen der obigen Nährlösung eingetra gen. Die abgezogene Flüssigkeit wird immer klarer und ihr Vitamin-Bi.-Gehalt entsprechend höher.
Nach 20 bis 25 Tagen wird der Saft gleichmässig klar und enthält im Durchschnitt 0,35 y/ml Vitamin B12 bei einem Trockensubstanzgehalt von 0,54 g/100 ml. Ausbeute: täglich 17 y , berechnet auf 1 Liter Fer- mentor-Volumen.
Die täglich abgezogene Fermentationsflüssigkeit kann zur Gewinnung des Vitamins B12 in üblicher Weise aufgearbeitet werden. Da der gebildete Wirk stoff in Bakterienkörper eingelagert ist, bringt man vorzugsweise lediglich die durch Filtrieren oder Sedi- mentation getrennten Bakterienkörper zur Weiter verarbeitung. <I>Beispiel 4</I> In einem 200-Liter-Fermentor wird als Methano- bakterium-Impfmaterial 100 Liter nach dem Beispiel 2 hergestellte Fermentationsflüssigkeit eingesetzt.
Die Fermentationsflüssigkeit wurde mit 500 ml einer auf einem Melasse-Nährboden in üblicher Weise herge stellten Saccharomyces-Kultur beimpft, und danach setzt man zwei- bis viertägig 20 1 Nährlösung folgen der Zusammensetzung zu:
EMI0003.0051
Alkohol <SEP> <B>1,0,1/0</B>
<tb> Na2C03 <SEP> 0,4,1/0
<tb> Melasse <SEP> 1,Ofl/o C0C12 <SEP> ' <SEP> 6H20 <SEP> <B>0,000111/0.</B> Sobald das Volumen 200 1 erreicht hat, werden täglich 12 1 Fermentationsflüssigkeit abgezogen und die gleiche Menge Nährlösung eingetragen. Die ent nommenen Anteile enthalten 0,80 yiml Vitamin B12, die tägliche Ausbeute beträgt pro Liter Fermentor <I>48 y.</I>
Aus den nach den Beispielen erhaltenen Roh produkten kann die aktive Substanz mittels bekann ter Methoden gewonnen werden.
Die Fermentation mittels Methanobakterium Omelianskii kann auch mit andern alkoholbildenden Bakterien, wie z. B. mit butylogenen Clostridien, auf einem stärkehaltigen Nährboden verbunden werden oder mit zellulosezersetzenden Bakterien auf einem zellulosehaltigen industriellen Abfallmaterial. Die symbiotische Funktion dieser Stämme ermöglicht die Verwendung billiger Nährbodenquellen; anderseits können, wie bekannt, einzelne dieser Stämme, wie z.
B. die butylogenen Clostridien, das Vitamin-B1.- Niveau erhöhen.