DE2450185A1

DE2450185A1 - Verfahren zur herstellung von fermentationsfluessigkeiten mit gesteigertem vitamin b tief 12 -gehalt durch synchronisierung der bakterienpopulation

Info

Publication number: DE2450185A1
Application number: DE19742450185
Authority: DE
Inventors: Geb Erdoes Judit Bekes; Geb Franyo Aniko Hargitai; Bela Dr Johan; Janos Kiss; Geb Komoroczy Erzsebet Kovacs; Laszlo Kuti; Geb Czink Emilia Simonovits; Denes Szekely; Laszlo Szemler; Tamas Szontagh
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1973-10-26
Filing date: 1974-10-22
Publication date: 1975-04-30
Also published as: FR2249167A1; HU168293B; IN139047B; SU573129A3; US3979259A; FR2249167B1; JPS5082281A; ATA824174A; AT336179B; DD114831A5; NL7413954A; BE821536A

Description

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Beschreibung zur Patentanmeldung der

RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYÄR R.T. Budapest / Ungarn

betreffend

YERPAHRM ZUR HERSTELLUNG VON ffERMENTATIONSFLÜSSIGKEITEN MIT GESTEIGERTEM YITAMIIT- B.₂-GEHALT DURCH SYNCHRONISIERUNG DER BAKDERIENPOPULATION

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₂ in erhöhter Kozentration enthaltenden Eermentationsflüssigkeiten durch anaerobe, unter septischen Bedingungen mit einer methanproduzierenden ge-· mischten Bakterienpopulation durchgeführte Fermentation.

Es ist bekannt, daß Vitamin B^₂ im allgemeinen entweder durch sterile Monokultur-Fermentation, oder mit Hilfe vom aus Abwasserschlamm stammenden, auf spezielle

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Nährböden adaptierten gemischten Bakterienpopulationen (vgl. z. B. österreichische Patentschrift Nr. 266 311) hergestellt werden kann.

Es ist ferner "bekannt, daß bei der Anwendung von gemischten Bakterienpopulationen die Produktion von Vitamin B^2 nicht durch die Steigerung der individuellen Produktionsfähigkeit der einzelnen Bakterienarten erhöht werden kann, wie dies im Fall von sterilen Monokultur-Fermentationen be kannt und üblich ist. In den gemischten Populationen ist der Metabolismus der einzelnen Mikroorganismenarten " nicht von jenem der anwesenden anderen Mikroorganismenarten unabhängig. Diese Wechselwirkung kann in gewissen Fällen derart positiv sein, daß dadurch die Produktion des gewünschten Stoffwechselprodukts - vielleicht sogar.in hohem Maß - gesteigert wird (vgl. Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung. Vl/4-, 1959)* kann aber auch negativ sein, wie das z. B. bei den septischen Fermentationen beobachtet werden kann, wo die gewöhnlichen infizierenden Bakterien sich in den Fermentationsflüssigkeiten nicht vermehren können.

Es sind schon verschiedene Verfahren zur Steigerung der Produktion von Vitamin B_-12 in den mit methan- · produzierenden gemischten Bakterienpopulationen durchgeführten Fermentationen bekannt, nach diesen Methoden können aber im allgemeinen nur etwa 10 000 bis 11 500 /UgAiter Vitamin B^₂ enthaltene Fermentationsflüssigkeiten hergestellt werden. · - ,

Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Ausarbeitung eines Verfahrens, durch welchem man bei der zur Zeit üblichen halbkontinuierlichen Fermentation mit aus Abwasserschlamm stammenden Bakterienpopulationen in wirtschaftlicher Weise noch" höhere Vitamin B ₂-Produktion erreichen kann. Bei der praktischen Lösung dieser Aufgabe wurden die folgenden Untersuchungsergebniaee bzw. latsaehen zur Hilfe gezogen:

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1. Es wurde "bei der Untersuchung von Fermentationen mit Vitamin B₂ produzierenden, aus Abwasserschlämmen stammenden ^Methanobakterien festgestellt, daß 93-^7% des produzierten Vitamins B^₂ sich in den Bakterienkörpern "befindet und nur nach dem Absterben der Bakterien in die supernatante Flüssigkeit gelangt (B. Johan: .Acta Micro- biol. Acad. Sei. Hung. 1£, 319-328, /1970/). Daraus folgt, daß wenn man die Produktion von Vitamin B.pin der Fermentation steigern will, dann muß die Zahl der produzierenden Bakterien erhöht werden.

2. Die Duplikationszeit der methanproduzierenden Bakterien in den von Abwasserschlamm stammenden Bakterienpopulationen (besonders der Coccen und Diplococcen) ist verhältnismäßig lang. Bei diesen Bakterien gibt es keine wirkliche "logarithmische Phase", die sonst ein charakteristisches Merkmal der Vermehrung der meisten Bakterienarten darstellt. Der Vermehrungstyp dieser Bakterien entspricht eher dem von Lamana und Mallette beschriebenen "arithmetic linear growth" (vgl. 0. Lamana, M. Mällette: Basic Bacteriology, 368 /1965/). Es ist auch bekannt,, daß die Bakterien sich unter günstigen Bedingungen durch Zweiteilung vermehren, d.h. aus einem Bakterium zwei Individuen entstehen. Unter günstigen äußeren Bedingungen wird diese Verdoppelung der sich schon geteilten Bakterien weiter fortgesetzt, unter ungünstigen Verhältnissen kommen aber die Bakterien in den Ruhe zustand. Die in diesem Zustand befindlichen Bakterien beginnen sich dann - unter entsprechenden ökologischen Bedingungen - nur nach einer mehr oder minder langen vorbereitenden Phase ("lag phase") wieder zu vermehren. Dieser Vorgang ist der normale Vermehrungszyklus der Bakterien. In einer gegebenen Kultur befinden sich die Bakterien in den verschiedensten Phasen von diesem Vermehrungszyklus.

3. Wenn man im laufe einer halbkontinuierlich geführten Fermentation (mit täglicher Entnahme von etwa 10%

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der Fermentationsflüssigkeit und Nachfüllen von gleicher ^Menge von frischem Nährboden) den-Bakteriengehalt und den Vitamin B₁₂~Gehalt der Fermentationsflüesigkeit täglich bestimmt, so findet man, daß die täglich bestimmten Werte beinahe gleich sind, also daß die Anzahl der Bakterien und die ^iVlenge des Vitamins B.p in 24 Stunden wieder das vor der Flüssigkeitsabnahme bestehende Niveau erreichen. Diese Tatsache kann schernatisch in der folgenden Weise veranschaulicht werden: wenn in einer gegebenen Menge einer Fermentationsfliissigkeit z. B. 100 Millionen Bakte-rien anwesend sind und man 10 % dieser (gleichmäßig verrührten) Fermentationsflüssigkeit abnimmt und durch ein gleiches Volumen von frischem Nährboden ersetzt, dann verbleiben in der auf diese Weise verdünnten Fermentationsflüssigkeit nur mehr 90 Millionen Bakterien. Diese Zahl erhöht sich aber erfahrungsgemäß bis zum nächsten Tag wieder auf 100 Millionen. Diese Tatsache kann am einfachsten so erklärt werden, daß von den zurückgebliebenen 90 Millionen Bakterien sich nur 10 Millionen gespaltet haben, d.h.« aus diesem 10 Millionen Bakterien 20 Millionen geworden sind, womit zusammen mit den nicht gespaltenen übrigen 80 Milionen Bakterien die ursprüngliche Bakterienzahl 100 Millionen wieder erreicht wurde.

Wenn man also eine höhere Bakterienzahl - und damit auch eine höhere Produktion von Vitamin B.ρ erreichen will, dann muß man erreichen, daß nicht nur z. B. 10 Millionen, sondern möglichst viel mehr Bakterien auf einmal sich teilen sollen und damit die Anzahl der in der Ferment at ionsflüssigke it anwesenden Bakterien das bisher bestehende Niveau erheblich überschreiten soll. Das kann aber nur dadurch erreicht werden, daß, man eine möglichst große Zahl der Bakterien in dieselbe Phase des Vermehrungszyklus bringt, also die Teilung der Bakterien möglichst weitgehend synchronisiert.

Die Zielsetzung der Erfindung war also den Ver-

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mehrungszyklus der gesamten Bakterienmasse in der Fermentationsflüssigkeit möglichst weitgehend zu synchronisieren und dadurch eine wesentlich, höhere Bakterienkonzentration in der Fermentationsflüssigkeit und eine entsprechend höhere Vitamin B^-Produktion _zu erreichen und im Laufe ' der üblichen halbkontinuierlichen Fermentation dauernd aufrecht zu erhalten.

Dieses Ziel kann z. B. dadurch erreicht werden, daß man von einer, durch die übliche anaerobe septische Fermentation mit einem gemischten methanproduzierenden Bakterienpopulation erhaltenen, etwa 9500 bis 10 000 /Ug/l Vitamin B- enthaltenden Fermentati'onsmedium ausgeht und diesem - zweckmäßig nach einer, einige Tage dauernden Hungerperiode, in welcher die Bakterien nur mit ein wenig ^ethanol gefüttert werden - die Nährstoffe in der folgenden periodisch wiederholten Dosierungsweise zusetzt:

1. am ersten Tag wird ein Teil, vorteilhaft 10 % der Fermentationsflüssigkeit abgenommen und es werden 0,4 bis 1,5 Vol.% ^ethanol und ein der abgenommenen Flüssigkeitsmenge entsprechendes Volumen eines konzentrierten Nährbodens zugesetzt, welcher mit Ausnahme von Methanol die üblichen, in der bisherigen Fermentation verwendeten Nährstoffe und Zusätze, aber in mehrfacher, vorteilhaft" zehnfacher Konzentration enthält;

2. am nächsten Tag wird keine Flüssigkeit entnommen und es wird nur 0,4 bis 1,5 Vol.% Methanol dem Fermentationsmedium zugesetzt;

3. an dem folgenden, etwa 4 bis 10 Tagen wird wieder täglich, ein Teil, zweckmäßig 10 % der Fermeriationsflüssigkeit abgenommen , und es werden 0,4 bis 1,5 VoI ·#

' Methanol und ein der abgenommenen Flüssigkeitsmenge entsprechendes Volumen eines normalen, also die üblichen Nährstoffe und Zusätze in der während der bisherigen Fermentation eingesetzten Konzentration enthaltenden Nährbodens zugesetzt.

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Die halbkontinuierliche Fermentation wird dann mit dieser periodisch abwechselnden Nährbodenzugabe weitergeführt, d.h. es werden jeweils nach 4 bis 10 Tagen normaler Plussigkeitsabnähme und Zusatz von normalem Nährboden, sowie von 0,4 bis 1,5 Vol.% Methanol zwei Tage mit abweichender Fütterung eingeschaltet: ein Tag, an welchem der übliche Teil der Fermentationsflüssigkeit abgenommen und ein Nährboden von mehrfacher, vorteilhaft zehnfacher Konzentration, sowie.0,4 bis 1,5 Vol.% Methanol zugesetzt werden, und der darauf folgende Tag, an welchem ohne Flüssigkeitsentnahme nur 0,4 bis 1,5 YoI.% ^ethanol zugegeben wird.

Durch diese zyklische Fütterungsweise wird der Vermehrungszyklus der gesamten Bakterienpopulation allmählich synchronisiert, wodurch auch die Konzentration der Bakterien und dementsprechend auch die Vitamin B-p-Konzentration im Fermentationsmedium allmählich anwächst. Die oben beschriebene Verfahrensweise und die dadurch erzielte allmähliche Steigerung der Vitamin B ^-Produktion ist im nachstehenden Beispiel 2 ausführlich geschildert. Wie es aus den dort angegebenen Zahlwerten ersichtlich ist, wird nach etwa 7 bis 8 Zyklen, also in etwa 50 bis 60 Tagen eine Vitamin B.p-Eonzentration von etwa 30000 bis 40000 /Ug/l erreicht. Setzt man dann die halbkontinuierliche Fermentation in der gleichen Weise fort, dann wird diese hohe Konzentration in den täglich zum Aufarbeiten entnommenen !Teilmengen (etwa täglich 10 %) der Fermentationsflüssigkeit auch weiterhin erhalten und so wurde die laufende Produktion von Vitamin B^₂ ^im Vergleich zu der usprünglichen Fermentation auf das drei- bis vierfache erhöht·

Es ist aber im Sinn der Erfindung auch möglich, die oben geschilderte allmähliche Steigerung der Vitamin B^p-Konzentration im Fermentationsmedium von etwa 10000^ug/l auf etwa 30-40000 /Ug/l wesentlich zu verkürzen, und zwar gibt es dafür zwei verschiedene Möglichkeiten.

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a) Man kann vor dem Übergang auf die erfindungsgeniäße zyklische Fütterungsweise (1 Tag konzentriert-es Nährboden, 1 Tag nur ^ethanol, 4-10 Tage normaler Nähr-· "boden) eine sogenannte beschleunigte -^nreiche'rungsperiode einschalten. Während die sei· Anreicherungsperiode wird am ersten Tag die übliche etwa 10 % der Fermentationsflüssigkeit abgenommen, das gleiche Volumen des etwa zehnfach .·'konzentrierten'Nährbodens und 0,4 bis 1,5 Vol.% Methanol zugesetzt, dann, wird 6 bis 10 Tage lang keine Flüssigkeit entnommen und täglich nur 0,4 bis 1,5 YoI.% Methanol zugesetzt, dann wird etwa 10 % drc Ifermentationsflüssigkeit entnommen, das gleiche Volumen des konzentrierten Nährbodens und 0,4 bis 1,5 YoI.% Methanol zugesetzt, usw. Bei dieser Verfahrensweise wird die gewünschte Synchronisierung und damit auch die gewünschte hohe Vitamin B>p-Konzentration von etwa 30-40000 /Ug/l in wesentlich kürzerer Zeit, in etwa "bis 25 Tagen erreicht. Die Länge der Zeitabschnitte, in welchen der konzentrierte Nährboden zugesetzt werden soll, hängt von dem Nährstoff verbrauch der Bakterien ab und kann an der allmähligen Abnahme des pH-Wertes im Fermentationsmedium erkannt werden. Es wurde gefunden, daß das Absinken des pH-Wertes auf 5»5-5»8 als ein Zeichen des beginnenden Nähr st off mangels betrachtet werden kann; bei dem Erreichen dieses pH-Wertes ist also die Zugabe der nächsten Dose des konzentrierten Nährbodens erforderlich.

"b) Die gewünschte hohe Bakterienkonzentration im Fermentatinnsmedium kann aber in einfacher-Weise auch dadurch erreicht werden, daß man von einer anderen, in der üblichen Weise durchgeführten Fermentation erhaltenen Fermentationsflüssigkeit die lebendigen Bakterieukörper z. B. durch Zentrifugieren abtrennt und so ein Bakterienzellen-Konzentrat mit etwa 80000 bis 90000 /ig/l Vitamin B^-Gehalt herstellt und dann

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dieses Konzentrat dem als Ausgangsmedium verwendeten Fermentationsflüssigkeit in einer solchen Menge zusetzt, daß damit die Yitamin B. ^Konzentration des ^ediums den gewünschten Wert von z, B. 30000 /ug/l erreichen soll. Dann kann man gleich auf die halbkontinuierliche Fermentation mit den erfindungsgemäß abwechselnden Fütterungszyklen übergehen, wobei die eingangs eingestellte hohe Vitamin B^-Konzentration in den täglich entnommenen Fermentationsflüssigkeitsmen-~ gen laufend erhalten bleibt.

Ein bisher nicht erörtertes, aber ebenfalls nicht belangloses Element des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Dosierung des sowohl in den vorbereitenden Phasen des Verfahrens, als auch während der erfindungsgemäß fortgeführten halbkontinuierlichen Fermentation zum Fermentationsmedium zuzusetzenden Methanols. Die durchgeführten Versuche haben erwiesen, daß ein eindeutiger und linearer Zusammenhang zwischen den Mengen des täglich zugesetzten Methanols und des entwickelten sogenannten Biogases besteht, so daß man aus dem Volumen des in einheitlichen Zeitabschnitten produzierten Biogases eindeutig auf die Menge des durch die Bakterien verbrauchten Methanols folgern kann. Es ist vorteilhaft, das Methanol in zum Ersetzen des Verbrauchs eben erforderlichen Mengen zuzusetzen, da eine Überdosierung zu einer Anhäufung des Methanols im Fermentationsmedium führen kann und das übermäßig angehäufte Methanol toxische Wirkungen auf die Bakterienpopulation ausüben kann. Die nachstellende, auf empirisch ermittelte Werte gegründete Tabelle II zeigt diesen Zusammenhang auf 1 Liter Fermentationsmedium bezogen j mit der Hilfe dieser Tabelle II kann man also auf Grund des Volumens (ml) des in 1 Liter Fermentations-' medium in einer Stunde produzierten Gases die dem Fermentationsmedium täglich zuzusetzenden Mengen von Methanol bestimmen.

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Tabelle II

In 1 Liter Fermentationsmedium _vErforderliche tägliche produziertes Gas, ml/Stunde ^1Vienge von ^ethanol,

114 0,5

140 0,6

164 0,7

186 0,8

210 0,9

2J2 1,0

256 1,1

280 1,2

304 1,3

326 1,4

348 . 1,5

Die in der Tabelle II angegebenen Gasmengen umfassen praktisch den gesamten Bereich der im erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren üblichen Gasentwicklungsgeschwindigkeitensso ist es aus dieser Tabelle ersichtlich, daß die während des Verfahrens täglich zuzusetzende Methanolmenge auf das Gesamtvolumen des Fermentationsmediums berechnet etwa 0,4 bis 1,5 Vol.% beträgt, wobei innerhalb dieses Bereichs vorteilhaft die sich aus der Tabelle II ergebenden Mengen eingesetzt werden.

Die Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von Fermentationsflüssigkeiten mit gesteigertem Vitamin B^₂-(3-ehalt durch anaerobe, unter septischen Bedingungen mit einer methanproduzierenden gemischten Bakterienpopulation, in Anwesenheit von an sich bekannten Fährbodenkomponenten. und Präkursoren durchgeführte Fermentation, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus einem nach der obenerwähnten Fermentationsmethode in bekannter Weise erhaltenen, die lebendige Bakterienpopulation enthaltenden Fermentationsmedium ausgeht, und die halbkontinuierliche, unter zeitweise? Entnahme eines Teils der Fermentationsflüssigkeit und Ersetzen

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des entnommenen Volumens durch frischen. Nährboden erfolgende Fermentation - gegebenenfalls nach einer Anreicherung des Bakteriengehalts des'ⁿediums - in solcher Weise weiterführt, daß man nach Entnahme von einem Teil, zweckmäßig 1O % der Fermentationsflüssigkeit das entnommene Volumen durch die Zugabe eines konzentrierten, die üblichen Nährstoffe mit Ausnahme von Methanol in mehrfacher, vorteilhaft zehnfacher Konzentration enthaltenden Nährbodens ersetzt und dabei 0,5 bis 1,5 Vol.% Methanol zusetzt, am nächsten Tag ohne Flüssigkeitsabnahme nur 0,5 bis 1,5 Vol.% Methanol zusetzt, an den folgenden 5 bis 10 Tagen täglich einen Teil, zweckmäßig 10 % der Fermentationsflüssigkeit abnimmt und des gleiche Volumen eines die Nährstoffe in der bisher üblichen Konzentration enthaltenden Nährbodens, ferner 0,5 bis 1,5 Vol.% Methanol zusetzt, und dann die beschriebene abwächselnde Zugabe von konzentriertem und einfachem Nährböden in der beschriebenen Reihenfolge während der gesamten weiteren Fermentation periodisch wiederholt.

Die oben erwähnte, gegebenenfalls bei dem Übergang von der üblichen bekannten Fermentationsmethode auf das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführende Anreicherung des Bakteriengehalts im Medium kann in der oben schon beschriebenen Weise, also entweder durch die einfache Zugabe von einen aus anderen Fermentationen stammenden und z. B. durch Zentrifugieren gewonnenen Bakterienkörper-Konzentrats, Öder durch die Einschaltung einer oben ebenfalls schon ausführlich beschriebenen Anreicherungsperiode erfolgen. Im letzteren Fall gibt man zweckmäßig einige, z. B. drei Tage lang mir etwa 0,5 Vol.# Methanol zu dem als Ausgangsmedium eingesetzten Fermentationsflüssigkeit, dann wird etwa 10 # der Fermentationsflüssigkeit entnommen und durch das gleiche Volumen des erwähnten, die Nährstoffe in mehrfacher, vorteilhaft zehnfacher Konzentration enthaltenden Nährbodens ersetzt, wobei auch 0,4 bis 1,5 VoI J6 Methanol zugesetzt

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wird, dann wird 6 bis 10 Tage lang ohne Flüssigke its ab nähme nur täglich. 0,4 bis 1,5 Vol.% Methanol zugesetzt und diese Reihenfolge wird bis zum Erreichen der gewünschten höheren Konzentration von Bakterienkörpern und somit auch von Vitamin . B^₂ periodisch wiederholt. Dann wird bei der nächsten Zugabe des konzentrierten Nährbodens auf die oben beschriebene, erfindungsgemäße Ausführung^weise der halbkontinuierlichen Fermentation übergegangen, wobei in den täglich
(mit Ausnahme des auf die Zugabe des konzentrierten Nährbodens folgenden Tages) agbenommenen Fermentationsflüssigkeiten schon die gewünschte hohe Konzentration von Vitamin B₂ erhalten wird.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind vor allem die folgenden:

1.. Es werden so hohe Konzentrationen von Vitamin B^j₂ in der Fermentationsflüssigkeit (30000 bis 40000 /Ug/l) erzielt, wie bisher durch stptische Fermentation überhaupt nicht, und auch durch künstlich aktivierte Monokultur-Fermentationen kaum erreicht worden konnton. Zur Herstellung von solchen, im Vergleich mit den durch, die bisher üblichen betrieblichen πepU wehen Fermentationen erhältlichen etwa 10000 /Ug/l Vitamin B.ρ rnthaibenden Fermentationsflüssigkeiten drei- biu vierfache ^engen -V_0n Vitamin B^₂ enthaltenden Fermentationsflüasigkeiten werden - im Vergleich, zu den bisher üblichen Verfahren - nur die 2- bis 2,5-fachen Mengen von Nährstoffen und höchstens dreifache Mengen von Methanol verbraucht. ■

2, Die herstellung von Ferment at ioiisflüssigkeiten von drei- bis vierfacher Vitamin B^ ^Konzentration ist vom Gesichtspunkt der Aufarbeitungstechnologie besonders vor-' teilhaft, da zur Gewinnung einer gegebenen Menge von
Vitamin B₂ wesentlich kleinere Flüssigkeitsmengen behandelt und aufgearbeitet werden müssen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete
Synchronisierungsteclinik wurde bisher nur zu wißsen-

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schaftlichen Zwecken, ζ. B. zur Bestimmung der Duplikationszeit von Bakterien, aber mir bei reinen Monokulturen angewendet. Im erfindungsgemäßen Verfahren wurde diese Technik zum ersten Mal bei gemischten Bakterienpopulationen und ebenfalls zum ersten Mal in betrieblichen Fermentationen angewendet. In gemischten Populationen kann zwar die Duplikationszeit der einzelnen anwesenden Arten mehr oder minder verschieden sein, aber einerseits können diese verschiedenen Arten durch das in der einleitenden Phase des Verfahrens vorteilhaft 1-3 Tage lang angewendete Hunger-Periode in einen annähernd einheitlichen Ruhezustand gebracht werden, wodurch die Synchronisierung der Vermehrung gefördert wird, andererseits wird durch das periodisch abwechselnde Verabreichung der Nährstoffe die Vermehrung der sich an diesen Zyklus besser anpassenden und zugleich die beste Vitamin B^-^roduktion zeigenden Coccus- und Diplococcus-Arten gefördert und die Vermehrung der weniger produktionsfähigen Bacillen eher unterdrückt, wodurch dann auch die spezifische -Produktionsfähigkeit der gemischten Bakterienpopulation gesteigert wird.

Die praktische Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht:

Beispiel 1

Zwei, je 10 Liter fassende, mit Gasableitungsrohr versehene Versuchs ferment oren werden mit je 10 Liter einer in bekannter Weise, durch halbkontinuierliche Fermentation mit einer gemischten mesophilen methanproduzierenden Bakterienpopulation erhaltenen, 99^0 /ug/l Vitamin B^₂ enthaltenden Fermentationsflüssigkeit beschickt. Bei dieser, das Ausgangsmedium des erfindungsgemäßen Verfahrens liefernden Fermentation wurde täglich (unter gleichzeitiger Abnahme von gleichen Mengen der Fermentationsflüssigkeit) ein Nährboden der folgenden Zusammensetzung zugesetzt:

Maisquellwasser-Konzentrat 5 g/l

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1	ml/1
2	g/i
1,6	g/l
1	ml/1
1,1	ml/1
2	g/l
3	g/i
1,5	g/i
0,02	g/i
0,1	g/i
0,01	g/i

Bierhefehydrolysat, 20%-ig Melasse

Sulfilablauge

Leberextrakt, 10%-rig Ammoniumhydroxyd, 24%-ig Diammoniumhydrogenphosphat Ammoniumhydrogencarbonat Ammoniumsulfat

Natriumhydrogensulfit Magnesiumchlorid Oobaltchlorid

Bernsteinsäureanhydrid 0,006 g/l

Glycin 0,006 g/l

5,6-Dimethylbenzimidazol 0,003 g/l

Neben diesem Nährboden, der auch im weiteren Verlauf des Versuchs verwendet wurde, und der im weiteren "Nährboden NB-, " genannt wird, wurde täglich auch 0,6 VoI,% Methanol dem Medium zugesetzt.

Die mit je 10 Liter der in der obigen Weise erhaltenen Fermentationsflüssigkeit beschickten Fermentoren "A" und "B" werden jetzt bei 32-34 ⁰O gehalten und drei Tage lang werden nur täglich 50 ml Methanol zugesetzt. Am vierten Tag wird 1 Liter Fermentationsflüssigkeit abgenommen und das gleiche Volumen eines, konzentrierten Nährbodens der folgenden Zusammensetzung (im weiteren als Nährboden NB>_n) bezeichnet zugegeben:

Maisquellwasser-Konzentrat Bierhefehydrolysat, 20 %-ig Melasse

Sulfitablauge

Leberextrakt, 10%-ig Ammoniumhydroxyd, 24%-ig Diammbniumhydrogenphosphat Ammoniumhydrοgenearbonat Ammonixuttsulfat

PO	g
10	ml
20	g
10	g
10	ml
11	ml
20	g
30	g
15	g

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Natriumhydrogensulfit 0,2 g

Magnesiumchlorid ' 10g

CobaltChlorid 0,1 g

Bernsteinsäureanhydrid 0 06 g

Glycin 0,06 g

5,6-Dimethylbenzimidazol 0,03 g Nasser bis 100 0 ml'

Vorher wird das Voliimen des durch den Ga sah leitungsrohr austretenden Gases gemessen, und da die ^Menge des in einer Stunde produzierten Gases auf 1 Liter Fermentationsflüssigkeit berechnet etwa 160 ml beträgt werden gleichzeitig mit dem obigen Nährboden NB^₀ auch 70 ml (0,7 Vol.%) Methanol zugesetzt.

An den folgenden 5 Tagen, also am 5., 6., 7., 8., und 9. Tag des Versuches wird ohne Fliissigkeitsabnahme nur Methanol zugesetzt, und zwar in der Geschwindigkeit der Gasentwicklung nach Tabelle II (siehe oben) entsprechenden täglichen Mengen. Am zehnten Tag wird wieder 1 Liter Fermentationsflüssigkeit abgenommen, 1 Liter Nährboden NB.q und die entsprechende ^uenge von Methanol zugesetzt, ebenso am 17. und am 25· Tag, während inzwischen, am 11., 12,, 13., 14., 15., 16., ferner am 18., 19-, 20., 21., 22., 23. und Tag wieder ohne Flüssigkeitsabnahme nur die entsprechenden ^Mengen von Methanol zugesetzt werden.

Von dem 25. Tag an wird die fortlaufende halbkontinuierliche Fermentation begonnen} am 26. Tag wird ohne Flüssigkeitsabnahme nur ^ethanol zugesetzt, dann am 27. bis 32. Tag täglich 1 Liter Fermentationsflüssigkeit abgenommen, 1 Liter Nährboden NB. und die erforderliche ^Menge von Methanol .zugesetzt, am 33. Tag, nach Abnahme von 1 Liter Fermentationsflüssigkeit wieder 1 Liter Nährboden NB₁₀ und so weiter in periodisch wiederholter Reihenfolge, Während dieser Zeit, vom 25. bis zum 75. Tag wurde in der abgenommenen Fermentatiqnsflüssigkeit der Vitamin B₁₂-Gehalt bestimmt. Die Konzentration von Vitamin B₁₂ in den Fermentations-

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flüssigkeiten zeigte im Laufe der ^zeit nur geringe Schwankungen} die Burchschnittswerte waren: Fermentor "A" 4-3268 /Ug/l,
Ferment or "B" 4354-3 /Ug/l.

Beispiel 2

Es wird nach Beispiel 1 gearbeitet, aber mit dem Unterschied, daß am 4-, Tag gleich die laufende halbkontimiierliche Fermentation begonnen wird, wie am 25. in Beispiel 1. In diesem Fall war die Vitamin B^ zentration in der als Ausgangsmedium eingesetzten, in bekannter Weise gewonnenen Fermentationsflüssigkeit 10600 /Ug/l.

Neben der periodisch abwechselnden Zugabe von Nährboden NB^₀ bzw. NB^ wurden täglich die folgenden Mengen von ^ethanol zugesetzt:

^ des Versuchs Methanol

3.-9. 80 ml

10. - 12. 100 ml

13.- 14-. 120 ml

15* · . 130 ml

16. 140 ml

17. . 150 ml

Die. im weiteren Lauf des Versuchs täglich zugegebenen ^Mengen in Methanol wurden auf Grund der Geschwindigkeit der Gasentwicklung, nach Tabelle II bemessen.

In diesem Versuch wurde der Vitamin B^-Gehalt der Fermentationsflüssigkeit laufend bestimmt. Die nachstehende Tabelle zeigt die allmähliche Steigerung dieser Konzentration bis zum 50» Tag:

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'Vitamin B.^ in der Ifermen-Tag des Versuchs tationsflüssigkeit, /Ug/l

2. 12 400

4. 11 700

8. . 16 800

10. 14 900

11. 16 200

14. . 14 900

15. 16 200

16. 19 872

17. 23 124

18. 25 400

21. 23 124

22. 23 200 28. 21 432 31. 26 400 52. 27 700

35. 25 944

36. 26 600

37. 32 800

38. 32 200

39. 33 270 -

43. 28 152

44. 30 400 45! 32 2 00 £6. 27 200 49 30 500 50. 31 600

Beispiel 3

Ein 10 Liter fassender, mit Gasableitungsrohr versehener Versuchst ermentor wird mit, 4500 ml einer in bekannter Weise, durch halbkontinuierliche Fermentation mit einer gemischten mesophilen methanproduzierenden Bakterienpopulation, unter Verwendung des im Beispiel 1

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beschriebenen Hahrbodens NB. erhaltenen, 9940 /Ug/l Vitamin B_x^ enthaltenden Fermentationsflüssigkeit beschickt. Dann werden bei 32 ⁰O 500 ml eines 88 000 /ug/l Vitamin B^₂ enthaltenden Bakterienkonzentrats augesetzt, welcher aus einer anderen, mit demselben Verfahren hergestellten Fermentati^nsflüssigkeit durch Zentrifugieren gewonnen wurde. Zu diesem, nunmehr 18 500 /Ug/l Vitamin B.p in den Bakterienkörpern enthaltenden 5000 ml Medium werden 500 ml Nährboden -EfB^₀ "und 75 ml Methanol zugesetzt. Am 2. und 3·. Tag der Fermentation wird keine Flüssigkeit abgenommen und es werden nur täglich 75 ml ^ethanol zugesetzt, dann werden vom 4. bis 10. Tag je 500 ml Fermentationsflüssigkeit abgenommen und durch das gleiche Volumen Nährboden NB. und 75 ml Methanol ersetzt. Am 11. Tag werden bei gleicher Flüssigkeitsabnahme wieder der konzentrierte Nährboden NB.q und die übliche ⁿenge Methanol zugesetzt und diese periodische Reihenfolge wird in der im ,Beispiel 2 beschriebene Weise auch weiter fortgeführt.

Die nachstehende Tabelle zeigt das allmähliche weite re Ansteigen der Vitamin B. ^Konzentration in der täglich abgenommenen Fermentationsflüssigkeiteni

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Vitamin B p-Gehalt in der

Tag des Versuchs üTermentationsflüssigkeit

5. 22 632

6. 19 320

7. 20 424 10. 21 016

• 11. 21 200

12. 27 000

13. . 53 400

14. 32 000 17. 36 310

20. 36 690

21. 35 548

22. 35 880

23. 30 968

26. 39 800

27. 33 450

28. 34 166

29. - 36 250

30. * * 36 200 ; 33. ²⁸ 900

34.' 35 780

35. 30 360

36. 30 800

3₇. 33 000

43. 30 500

44, 33 000

Werden die obigen Werte noch mit der Menge γοη dem anweeenden, biologisch gleichwertigen Faktor III, ergänzt, so werden z. B₄ die folgenden Werte erhalten:

^ ⁰⁰°

am 20, OJa₆ ^ ⁰⁰° /

am 28. Tag ** 500 »

*9 320

am 34. Tag ^ 3²°

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Beispiel 4-

Ein Betriebsfermentor von 50 & nützlichem Rauminhalt befinden sich als Ausgangsmedium 50 tj? einer, in der im Beispiel 1 gbeschriebenen Weise gewonnenen, 9936 /Ug/l Vitamin B^₂ enthaltenden Fermentationsflüssigkeit. An den ersten drei Tagen des Übergangs, auf das erfindungsgemäße Verfahren werden je 250 Liter Methanol zugesetzt. (Um das vermischen des Methanols zu erleichtern und lokale Überdosie'rungeh zu vermeiden, ist es vorteilhaft, das Methanol von der Zugabe mit einer 2- bis 3-fachen Menge von Wasser zu verdünnen; in diesem Fall muß aber ein entsprechendes Volumen der Fermentationsflüssigkeit abgenommen werden, um ein übermäßiges Anwachsen des Volumens zu vermeiden.) Am 4. Tag werden 5 & Fermentationsflüssigkeit abgenommen, das gleiche Volumen Nährboden NILq und 400 Liter Methanol zugesetzt. Dann wird an den 10., 14., 21. und 27· Tagen· der Fermentation wieder 5 nr Fermentationsflüssigkeit abgenommen und (unter Zugabe der üblichen Mengen von Methanol) durch das während auch den 5- bis 9-, 11. bis 13-» 15· bis 20. und 22 bis 26. Tagen nur Methanol in der oben angegebenen Weise zugesetzt wird. Von dem 27. Tag wird dann der übliche periodische Produktionszyklus begonnen, an den 27., 33-, 42., 46., 50., 59-, 65. und 71. Tagen werden nach Abnahme von 5 m* Fermentationsflüssigkeit das gleiche Volumen von NB^₀ und die entsprechende Menge von Methanol, an den 28., 34.> 43., 47-, 51., 61, 66. und 72. Tagen wird ohne Flüssigkeitsabnahme nur Methanol zugesetzt und an den ■ übrigen Tagen der bis zum 77- Tag weitergeführten fermentation werden je 5 nr Fermentationsflüssigkeit abgenommen und durch das gleiche Volumen von Nährboden UB^ ersetzt. Die Menge des täglich zugesetzten ^Methanol8 war maximal 75O Liter j die jeweils erforderlichen Mengen wurden auf Grund der obigen Tabelle II "bestimmt.

Der Vitamin B^-Gehalt der Fermentationsflüssigkeit hat nach allmählichem Ansteigen bis zum Übergang auf

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den normalen periodischen Produktionszyklus Werte um etwa 3OOOO /Ug/l erreicht} vom 46. Tag bis zum Ende des Versuchs war der Durchschnittswert (mit nur geringen Abweichungen) 3275O /Hg/1.

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Claims

«jY.'T ^ν&\ο _ 21 ^1A"⁴⁵

SGHWE- J^ii3Xa.»

PATENTANSPRÜCHE

Q) Verfahren zur Herstellung von Fermentationsfliissigkeiten mit gesteigertem Vitamin B ₂-Gehalt durch anaerobe, unter septischen Bedingungen mit einer methanproduzierenden gemischten Bakterienpopulation, in Anwesenheit von an sich bekannten Nährbodenkomponenten und Präkursoren durchgeführte Fermentation, dadurch gekennzeich-' η e t, daß man aus einem nach der oben erwähnten Fermentationsmethode in bekannter Weise erhaltenen, die lebendige Bakterienpopulation enthaltenden Fermentationsmedium ausgeht, und d?ie halbkontinuierliche, unter zeitweiser Entnahme eines Teils der Fermentationsflüssigkeit und ^rsetzen des entnommenen 'Volumens durch frischen Nährboden erfolgende Fermentation - gegebenenfalls nach einer Anreicherung des Bakteriengehalts des Mediums - in solcher Weise weiterführt, daß man nach Entnahme von einem Teil, zweckmäßig 10 % der Fermentationsflüssigkeit das entnommene Volumen durch. die Zugabe eines konzentrierten, die üblichen Nährstoffe mit Ausnahme von Methanol in mehrfacher, vorteilhaft zehnfacher Konzentration enthaltenden Nährbodens ersetzt und dabei 0,5 bis 1,5 Vol.% Methanol zusetzt, am nächsten Tag ohne Flüssigkeitsabnahme nur 0,5 bis 1,5 Vol<,% Methanol zusetzt, an den folgenden 5 bis 10 Tagen täglich einen Teil, zweck mäßig 10% der'Fermentationsflüssigkeit abnimmt und das glei che Volumen eines, die Nährstoffe in der bisher üblichen Konzentration enthaltenden Nährbodens, ferner 0,5 bis 1,5 Vol.% Methanol zusetzt, und dann die beschriebene abwächselnde Zugabe von konzentriertem und einfachem Nährboden in der beschriebenen Reihenfolge während der gesam-, ten weiteren Fermentation periodisch wiederholt.

2. Verfahren nach Anspruch, 1, dadurch. gekennzeichnet, den man die Anreicherung des Bakteriumgehalts des Mediums derart durchführt, daß man bis zum Erreichen der gewünschten Vitamin B₁₂-Konzentration nur in 6 bis 12 täglichen Zeitabständen einen Teil, zweckmäßig 10% der Fermentationsflüssigkeit abnimmt und

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durch den konzentrierten, die Nährstoffe mit Ausnahme von Methanol in mehrfacher, zweckmäßig zehnfacher Konzentration enthaltenden Nährboden ersetzt und täglich Q,5 bis 1,5 VoI.96 Methanol zusetzt.

5, Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e- kennze lehnet , daß man den konzentrierten Nähr boden dann zusetzt, wenn der pH-Wert des Mediums bis 5,5-5>8 herabsinkt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man die Anreicherung der Bakterienkon zentration durch die Zugabe von einer aus einer anderen Fermentation separierten Bakterienmasse durchführt.

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