DE1442197A1

DE1442197A1 - Verfahren zur fermentativen L-Glutaminsaeureherstellung

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Publication number: DE1442197A1
Application number: DE19631442197
Authority: DE
Inventors: Taketoshi Ando; Tsuyoshi Shiio; Toshinao Tsunado; Tetsuo Yoshida
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1962-12-18
Filing date: 1963-12-17
Publication date: 1968-11-07
Also published as: GB1009370A; NL301993A

Description

«000 FRANKFURT (MAIN)

ANNASTRASSE 19

FERNSPRECHER! (0611) 5550« ' TELEGRAMMEi LOMOSAPATENT LANDESZENTRALBANK 4/951 DRESDNER BANK FFM., Nr. 5S474S POSTSCHECK-KONTO FFM. 16<57

FRANKFURT

h 16»Dezember 1963

Ajinomoto Co₀, Ine«

No· 7* 1-chome, Takara-cho,

Chuo-ku, Tokio, Japan»

i /

Verfahren zur fermentativen L-Glutaminsäureherstellung·

Die Erfindung "betrifft -ein Verfahren zur Produktion von L-G-Iutaminsäure durch Fermentation und insbesondere durch halbkonti« nuierliche Fermentation*

Bei der fermentativen L-Glutaminsäureproduktion ist die Aufmerksamkeit auf Methoden zur Erhöhung der Ausbeute bei der fer~ mentativen Produktion unter Verwendung von billigen Materialien und Erhöhung der Operationsgeschwindigkeit dsr Fermentationsvorrichtung gerichtet rr~^r.l*n* Beträchtliche Versuche sind insbesondere im Hinblick auf eine Erhöhung der Leistungsfähigkeit der Vorrichtung gemacht worden, um die fermentative Glutaminsäureproduktion in kontinuierlicher Verfahrensweise zu erreichen» Diese Versuche haben aus verschiedenen Gründen nicht zu industriell durchführbaren Prozessen geführt*

EAD ORIGtNAL

8 0 9 8 0 7/0235

14421

3* Bo-si) Is ±nt ®&hx3i®z-±Q_d dio p

des Bak^Q3?ieas©llGa ai£fe©Gß.t ob ©Emails ©2,0 2) Bis Ij^IfstaBiagäiisQf ©2?mGataisi@a oess uüiE-oaä im ö

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OFtl_GlNAL

S? C 7/0 2 ? c.

14421S7

Aufgrund dieser Untersuchungen wurde ein Verfahren zur Herstellung tob L-Glutaminaäure durch halbkontinuierliche Ferment ation entwickelt, wonach man «in Kulturmedium, in dea die Wachstumsgeachwimdlgkeit der Bakterien zu fallen beginnt und die Zellenkena en trat ion kam« den höehsten stationären Wert erreichte, in Mehrere Teile teilt, jedem dieser Teilmedien - eines ausgenommen -durch ein Grundnährmedium ergänzt, die Medien zur Bildung der L-Glutaminsäure 4er Inkubation unterwirft und die angereicherte Glutaminsäure isoliert, während man das restliche Medium durch ein Grundmedium ergänzt, darauf das Medium kultlriert, es in mehrere Teile teilt, wenn seine Konzentration die Höhe der initialen Konsentration erreicht hat, alle Teilmedien - eines ausgenommen - dureh Grundmedien ergänzt, die L-Glutaminsäurefermentation wie weiter ölen beschrieben durchführt, die Bakterien in dem zurückgebliebenen Medium wachsen lässt undjeur weiteren Wiederholung der gesamten Stufe, wie sie weiter oben beschrieben ist, teilt, sohlieeslich im allen Teilen die L-Glutamineäureferment at lern stattfinden lässt und die gebildete L-Glutaminsäure isoliert.

Oemäss Xrflndmng wird die LwGlutaminsäurefermentation im zwei 7ermentationsstufem unterteilt, die primäre fermentation (Ale ergänzende primäre fermentation eingeschlossen) und die sekundäre fermentation. Die primäre fermentation rechnet toxü Beginn der Inkubatiem bis zu Aiii Stadium des Kulturmediums, in welchem die Wachs» tummgemehwimdlgkeit der Bakterien zu fallen beginnt und die Konsentratlern der Seilen kaum den hSoksten stationären Wert erreicht« d*Ju. die primäre fermentation 1st nicht länger (later) als die,

i • · ,

BAD ORIGINAL

809807/0235

dem das Bakterienwachstum von einem Endstadium der logarithmisch^ Phase bis zu einer negativen Wachstumsbeschleunigungsphase auf der Wachstumskurve entspricht· Die sekundäre Fermentation« besteht aus den Stufen:

Teilung des bei der ersten Fermentation erhaltenen Kulturmediums,

Uli es in den sekundären Fermenter zu giessen;

Grund Ergänzung des geteilten Mediums durch ein/medium und

Inkubation zur Bildung und Anreicherung der L-Glutaminsäure» Die sekundäre Fermentation erfordert etwa 24 Stunden»

Tabelle I veranschaulicht die experimentellen Ergebnisse, wobei eine Hälfte des Kulturmediums nach Beendigung der primären Fermentation zur Ergänzung mit einem .Grundmedium aufgefüllt worden ist und kultiviert wurde_o In Proben, die in gleichmässigen Abständen während der Inkubation entnommen wurden, wurde der Restsucker und die Trübung des Mediums bestimmt· Diese Messungen wurden in der folgenden Weise experimentell durchgeführt»

Aue 1o g/1oo com Glucose, ο«8 g/1oo ecm Harnstoff, o,1 g/1oo ecm EH₂PO^ ,
o,oo4 g/1oo ecm MgSO^,TH₂O, 2 p.p.*· Fe-Ionen_$

o,5 ccm/ioo ecm "Mieki" (Handelsname für Sojabohnenprotein

_ hydrolysat,Gesamtstickstoff 2,25 g/ 1oo cc») und

5 γ/1 Biotin .

wurdt ein Grundmediun hergestellt, das mit Brevibacterium lactoftrmtntuM Steam Uo· 2256 (ATCG 15869) beimpft und bei 31'C

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unter Schütteln kultiviert wurde. 18 Stunden nach Beginn (primäre Fermentation) wurde das Kulturmedium in zwei Hälften geteilt und die eine Hälfte durch Auffüllen mit dem oben angegebenen Grundmedium ergänzt und danach bei 31⁰C unter Schütteln die Inkubation durchgeführt* In der ersten Spalte der Tabelle ist die Inkubationsdauer angegeben, nach der Kulturmedien als Proben zur Messung des Restzuckers und der Trübung entnommen wurden» In der zweiten Spalte ist die restliche Glucosekonzentration und in der dritten die spezifische Trübung angegeben» die durch Messung des LichtabSorptionsvermögens des auf das 26fache des initialen Volumens verdünnten Kulturmediums bei einer Wellenlänge von 562 mu bestimmt wurde· In der vierten und der fünften Spalte ist die restliche Glucosekonzentration bzw. die spezifische Trübung des Kulturmediums enthalten, die wei der gewöhnlichen diskontinuierlichen (batch-type) Fermentation erhalten wurde»

Tabelle I

Inkuba tion (Std.)	Sekundäre Fermentation Restzucker Spez.Trü- (g/1oo ecm) bung	o,45	Gewöhnliche diskontinuier liche Fermentation Restzucker Spez,Trübung (g/1oo ecm)	o,74
19	8,22	o,53	6,24	o,76
22	7,49	o,71	5,2o	o,8o
25	6,51	o, Ij	4,25	o,8o
28	4,96	o,76	3,34	o,81
3o	4,22	ο ,79	2,66	o,81
33	3,o1	o,8^	1,94	o,8o
36	1,84	o,85	1_t2o	o,8o
42	o,63	o,67

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Tabθ11« I zeigt:

Wird die Hälfte eines Kulturmediums, in dem das Bakterienwachstum von einem Endstadium der logarithmischen Phase zu einer negativen Wachstumsbeschleunigungsphase auf der Zellenwachstumskurve (primäre Fermentation) liegt, durch Grundmedium ergänzt und kultiviert, dann ist die initiale Trübung in etwa 4-6 Stunden wieder hergestellt*

Gemäss Erfindung wird nach Beendigung der primären Fermentation das Kulturmedium in zwei Hälften geteilt (Weiter&eförde·» rung des Mediums;(broth shift)), beide Hälften durch Grundmedium ergänzt und in der einen Hälfte die Kultivierung sur Produktion von L-Glutaminsäure durchgeführt, die dann isoliert wird (sekundäre Fermentation)« Die andere Hälfte wird so lange kultiviert, bis die initiale Zellkonzentration des Mediums wieder hergestellt ist (hierfür braucht man etwa 4 Stunden: ergänzende primäre Fermentation), die Weiterbeförderung des Mediums durchgeführt und die sekundäre Fermentation zur Produktion von L-Glutaminsänre in einer Hälfte ausgeführt und danach die Säure ana dem Kulturmedium isoliert· Während der ergänzenden primären fermentatiön,die in einer anderen Hälfte 4—6 Stundwn durchgeführt wisttj werden der Eeihe nach, die Weiterbeförderung des Mediums _f die Is*gän2iing mit Grundmedium und die Fermentationen durchgeführt»

Wiederholt man diese Behandlungen aacheimaai.ss' « - kana man. tamiasä-ur® durch nahes-y, kontimLierlic^® Ferment at i®mea Me Als Beispiel soll ein© halfelEoatiimierlioh® l92?ffi®mtati©a gemäss

*) des Grundmedims

BAD ORIGINAL

80980 7/023 5 .

Erfindung mähend von ^ig»1 erklärt werden« Fig.1 stellt eine Zelttabelle dar mit einer halbkontlnulerllchen Fermentation unter Verwendung von 8 Fermentern· Als Fermenter werden die gleichen Behälter wie bei dem üblichen diskontinuierlichen (batbm—type) Fermentatlonsrerfahren benutzt·

In Fig_#1 stellen A und B die primären Fermenter und G,D,E,F_fG- und H die sekundären Fermenter dar· Das Intervall von α und β betragt 86 Stunden· Sie Funkte c,d,e,f··. sind In Intervallen νοφ 4 Stunden punktiert aufgetragen· Dann wird die primäre Feraentatlon In dem Fermenter A durchgeführt· Nachdem die Hälfte des Mediums in ferment er C übergeführt 1st (c), wird mit Grundmedium ergänzt* um die Fermenter A und O aufzufüllen« Die sekundäre Fermentation wird durchgeführt, um L-aiutaminsäure In Ferment er 0 im 2* Stunden su bilden und anzureichern, und die Säure wird isoliert· BIe ergänzende primäre Fermentation wird durchgeführt. lach 4 Stunden (d) wigd eine Hälfte de« Medium· la fesmenter D gegeben, sodann die Brgänzaag !*♦· Grundaediuap umd öle sekundäre Fermentation vorgeaomaea· lach der weiter, ebea beschriebenen Behandlung wir* das lulturmedium de* Ferment er A der Heia· naeh la fermeater 0*1,1,1,β umt I weiter befördert· 4 Stunden nachdem d#j ergämzemte primäre Ferment at ipnsmedium vea Feraeater A ju Fe^Uater 8 feitierbefordert ist, ist ti» sekuatäre Fermeatei la fifriienter α Meade%. Die L-aimtaminsäure aus Fermemter C wird gesammelt, 4er fermenter gewaschen und sterilisiert· «la· Hälfte des Meaiums ies Fermeaters A* im dem die ergänzende primäre Fermeatatiem 6 Staaten durchgeführt worden ist, wir» aaea

ORIGINAL

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Ferment er C weiterbefördert· Das Medium wird der Reihe nach in Ferment er D und E weit erb ef ordert· Ferment er A wird in die sekundäre Fermentation gleichzeitig mit der Beförderung des Mediums nach Fermenter E gebracht (Fermenter £ kann für weitere ergänzende primftre Fermentation benutzt werden, jedoch bei der Kulturflüssigkeit des Fermenters muss mit dem Risiko der Verunreinigung gerechnet werden) und die Bildung des Produktes findet statt«

Die Hälfte des Mediums von Fermenter B, in dem die primäre Fermentation zuvor durchgefiührt worden ist, wird der Reihe nach zu

aus den Fermentern F,G,H,C··* befördert, nachdem man/ihnen nach der vorhergehenden Durchführung das Verfahrens die !-Glutaminsäure isoliert und sie gewaschen und sterilisiert hat* In allen sekundären Fermentern wird die Produktion, Anreicherung und Isolierung der Glutaminsäure durchgeführt. Der Fermenter B wird zur gleichen Zeit, wenn ein Medium in den letzten Ferment er H weiter befördert wird, in die sekundäre Fermentation gebracht«

GemäsB Erfindung kann mit 8 Behältern bei 86 Stunden Fermentation die Produktion von 2o Behältern Medium erzielt werden, während mit der üblichen diskontinuierlichen Fermentation, bei welcher 48 Stunden für eine Fermentation benötigt wird, in 86 Stunden die Produktion 14,3 Behälter Medium erreicht wird (8 χ || - 14,3)· Gemäss Erfindung wird somit die Leistungsfähigkeit der Vorrich·· tung in Bezug auf die der gewöhnlichen diskontinuierlichen Fermentation um etwa 4o % gesteigert«

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Ausserdem kann das Verfahren gemäss Erfindung in der Weise durchgeführt werden, dass das Nährmedium der primären Fermentation in 3-5 Teile geteilt, alle Teile zur Ergänzung mit einem Fleischmedium aufgefüllt und die ergänzten Medien in die sekundäres Fermentation gebracht werden, wenn die Zusammensetzung für die als Ergänzung verwendeten Fleischmedien und, der Zeitpunkt, zu dem das Nährmedium weiter befördert wird, genau ausgewählt werden· In einem solchen Fall wird die Leistungsfähigkeit der Vorrichtung weiter gesteigert·

Die Dauer der primären und sekundären Fermentation kann durch Aenderung der Mengen an Nährstoffen, die .dem Grundmedium zugesetzt werden, abgekürzt werden, so dass die Ausbeut· der fermentativen Produktion nicht beeinträchtigt wird. Somit führt bei der halbkontinuierlichen Fermentation gemäss Erfindung die Kürzung der Fermentationsdauer zu einer Erhöhung der Leistungsfähigkeit der Vorrichtung und der Produktionsmenge«

Die Wirkung des Nährstoffes auf die Fermentationsdauer und das Bakterienwachstum ist in Tabelle II veranschaulicht· Es wurde experimentell wie folgt verfahren:

Mit'Brevibacterium lactofermentum Stamm No.2256 wurde ein Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie das der Tabelle Ι-φ jedoch mit der Ausnahme, dass 1o γ/l Biotin benutzt wurden-und daw Medium bei 31°C unter Schütteln kultiviert· In der dritten Spalte der Tabelle ist £b Biotinmenge angegeben, die in Form von Fleischgrandmedium dem Medium zugefügt wurde, dessen Weiter-

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■Ί442187

-1ο-

beförderung durchgeführt worden war· Die oberen Zahlen der fünften Spalte stellen die spezifische Trübung der ergänzenden " primären Fermentationsmed^ien vor der Weiterbeförderung des Mediums und die unteren Zahlen die Trübung nach der Ergänzung durch Fleischmedium dar· Die oberen Zahlen der sechsten Spalte stellen den Restzucker der ergänzenden primären Fermentationsmedien vor der Weiterbeförderung des ^Mediums und die unteren den Zucker des Mediums nach der Ergänzung durch Fleischmedium dar· In der achten Spalte sind die Verunreinigungen angegeben»

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Tabelle II

809807/

Fermenta- Zugesetzte

ctionsdauer Biotinmenge 5_{(Btde) (γ/1)}

Weiterbeförde- Spez· Rest- Gebildete rung des Mediums Trübung zucker L-Glutamin-

(g/1ooccm) säure (g/1oo ecm)

Verunreinigungen

Beginn

1· Weiterbeforderung des Mediums

2· "

3. ^M

ο 15

18 22 26

4. "	3o
5· "	34
6. ^η	38
7. ^w	46
8. »	5o
9. "	54
sekundäre Fermentation	66 78

1o

5 5

7,5 5 vorher
nachher

vorher
nachher

vorher
Xachher

vorher
nachher

o,o7

1o,24

o,68 ο ,44	7,15 8,49
o,65 0,42	7,o7 8,41
o,7o o,47	6,91 8,23
o,7o 0,48	6,4o 8,16
o,71 0,46	6,97 8,23
o,68 o,44	6,99 8,26
o,75 o,49	6,32 8,o1
o,7o o,45	6,48 8,2o
o,71 o,48	6,94 8,62
o,78 o,86	4,21 o,94

keine

1,5o 5,1o

R It

N ti

Il N

H N

Il N

η η

H W

Bei der gewöhnlichen kontinuierlichen Fermentation wirkt sich eine Verunreinigung der Fermentationsflüssigkeit auf das ganze .Fermentationssystem nachteilig aus, da sich die Verunreinigung über die ganze Fermentation ausbreitet« Da im Gegensatz dazu gemäss Erfindung die Arbeitsweisen des Fermenters*- fltfeff der übli« chen diskontinuierlichen Fermentation entsprechen, und die Behälter zu geeigneten Zeitpunkten sterilisiert werden können, ist das Riskiko der Verunreinigung gering« Tritt in dem Medium des primären Fermenters eine Verunreinigung auf, kann das Medium dee sekundären Fermenters, das kurz zuvor in die sekundäre Fermentation gebracht worden ist, zur Verwendung für eine primäre Fermentation ausgetauscht werden_e Iritt im sekundären Fermenter eine Verunreinigung auf, kann der dadurch verursachte Schaden lediglich auf diesen Fermenter beschränkt werden«

Durch die folgenden Beispiele soll das Verfahren der Erfindung näher erläutert, hieraus jedoch keine Beschränkung hergeeleitet werden«

Beispiel 1

Es wurde in Kulturmedium hergestellt, das o.8 g Harnstoff_t Io g Glucose, o,1 g ₂₄ o,o4 g MgSO₄-TH₂O, o, 1mg,. FeSO₄ o,5 g Sojabohnenproteinhydrolysat, o,5 Y Biotin und I00 ecm Wasser

enthielt_f sein pH«Wert auf 7$ο eingestellt und der Inkubation mit Brevibacterium lactofcrmentum Stamm iäo<»2256 (ATGC 13869) in

809807/023

einem 5ooccm-Schüttelkolben (A) unterworfen, wobei die Kultivierung des Mediums bei 31⁰C unter Schütteln durchgeführt wurde (primäre Fermentation)· 18 Stunden nach Beginn der Inkubation wurde eine Hälfte des Kulturmediums in einen anderen Ferment er (B) übergeführt, der dieselbe Kapazität wie Fermenter (A) hat, mit Fleischgrundmedium der oben angegebenen Zusammensetzung zur Epgääaxmg aufgefüllt und das Medium weitere 23 Ϋ2 Stunden kultiviert (sekundäre Fermentation). Aus dem kultivierten Medium wurde die gebildete !»-Glutaminsäure isoliert* Das in dem Kolben (A) zurückgebliebene Medium wurde zur Ergänzung mit Fleischmedium aufgefüllt und danach in die erganzaende primär· Fermentation gerührt« Nach 5 Stunden wurde eine Hälfte des Kulturmediums in Ferment er (C) gegossen und die gleiche Volumenmenge Fleischmedium dem Fermenter (C) zugefügt, wonach die sekundär· Fermentation 22 Stunden stattfinden konnte« Zur gleichen Zeit wurde Fermenter (A) zur Ergänzung die gleiche Volumenmenge Fleischmedium zugefügt und die sekundäre Fermentation durchgeführt.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums in schwach alkalischem Bereich durch Zusatz von Harnstofflösung gehalten*

Folgende Ausbeuten an gebildeter Glutaminsäure, auf die initiale Glucose bezogen, wurden erzielt»

Fermenter Fermentationsdauer (Stunden) Ausbeute an gebildeter Glutaminsäure!

A	18 + 5
B	23,5
C	22
gewöhnlich·	41
Fermentation

22 43,4

43,7 809807/0235

Beispiel 2 . Es wurde ein Grundmedium, das

1o g/1oo com Glucose, ■ . . · -o,1 g/1oo ecm KH₂PO^,

oko4 g/1oo oca MgSO₂^TH₂O, -

2 p.p.au Ee-Ionen,

o,5 com/loo ecm Sojabohnenproteinhydrolysat, 1o γ/l Biotin

enthielt, hergestellt und sein pH-Wert mit gesättigter Harnstoff*· lösung auf 7,o eingestellt« 2o 1 des Mediums wurden in ein 4o 1« Fermentergefäss gegeben, mit Brevibaoterium lactoiermentum, Stamm No.2256 beimpft und dann die Kultivierung bei 31 ·0.' unter Rühren und Belüften durchgeführt (primäre Fermentation)·

18 Stunden nach Beginn der Inkubation wurde die erste Weiterbeförderung des Mediums, Zuführung von Fleischmedium der gleichen Zusammensetzung des Grundmediuas, jedoch ohne Biotin ausgeführt« um die sekundäre Fermentation durchzuführen* Gleichzeitig wurde Fleischmediua der Zusammensetzung des Grundmediums, das jedoch 5 γ/l Biotin enthielt, dem ergänzenden primären Ferment er zugesetzt» Das Medium des primären Fermenters wurde in Intervallen <■ ._: von 4 Stunden weiter befördert· Nach neunmaliger Weit erb ef ör de« rung des Mediums wurde der primär» Fermenter in die sekundäre . ' Fermentation übergeführt· Als di« siebte Weiterbeförderung des. Mediums 8 Stunden nach der sechsten Weiterbeförderung des. Mediums gemässdtr Zeittabelle durchgeführt wurde, wurde ein Fleisohmediu* dem ergänzenden primären Ferment er zur Ergänzung zugeführt, das kein Biotin enthielt· Der Biotingehalt in dem sekundären Fermentationseediua wurde nach der siebten WeiCerbeiördtrung deo Mediums

_v : ORIGINAL

809807/0235 . V '---'T-. -:-.*Γ

auf 5 γ/1 eingestellt und 7,5 γ/l Biotin dem ergänzenden primären Fermentationemedium nach der siebten Weiterbeförderung des Mediums

.zugesetzt· Das Medium der ergänzenden primären Fermentation£nt~

' immer hielt zwar/Ιόγ/l Biotin, Jedoch 5 γ/l in dem Medium nach der

sechsten Weiterbeförderung des Nährmediums und die sekundäre Fermentation wurde in dem Medium durchgeführt, das·- immer 5 γ/1 Biotin enthielt»

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der analytischen Untersuchungen von Medien dtr primären und sekundären Fermentation enthalten«

Primärer Fermenter

Fermenter

Inkuba- Weiterbetions·· förderung dauer des Me~ (Sfd>) dlum«

Spes« Trübung

Rest*» Glutamin·· Yerun·*

sucker säure·· asLnigun

(g/ _w ausbeute

looccm) (%)

Beginn

15

.Weiterbef äArung des Mediums

§4. «
5· -

I⁸·¹:

22 26 jo

. 34-38 46 5o 54

vorher nachher

vkrher Xaohher

vorher nachher

o,o7 o,55

0.68 0,44

o,65 0,42

o,7o o,47

o,7o 0,48

o,71 o,46

o,68

o_f44

o,75

o,49

o,7o o,45

o,71 0,46

1o,24

18 ,So 7,15

8,49 7,o7

8,41

6,91 8,23

6,4o 8,16 6,97 8,23

6,99 8,26

6,32 8,o1

6,48 8,2o

6,94 8>62

keine

4,6

66 71 78

0,82 0,86

809807/0235

4,21 2,18 ό,94

43,3

copy- ί

1442187

Sekundärer Fermenter

Fermenter Inkubationsdauer Spez. Restzucker Glutaminsäure-(Stde) Trübung (g/iooccm) ausbeute (%)

1. Weiter beförderung des Mediums	O 17	o,42 0,72 o,8o	8,4o 4,58 3,14	4,1
	24	ο ,81	1,6o	4o,1
	26	o,83	o,98	42,6
2« Weiter» beförderung des Mediums	O 17	0,44 o,74 o,83	8,26 2,27	3,1
	24	o,84	o,85	43,8
£· Weiter beförderung dew Mediums	O 17	o,46 o,84	8,14 2,1o	4,8
	24	o,84	o,87	44,6
Beispiel 3		*

Es wurde ein Grundmedium hergestellt, das

1o g Glucose,

o,8 g Harnstoff, o,1 g
o,o4 g

1 mg ₄

0,5 S ßojabohiienproteinhydrolysat,

1o γ Vitamin B>j,

o,5t Biotin und 1oo ecm Wasser

enthielt, sein pH-Wert auf 7_to eingestellt, das Medium mit.Brevi-

Stamm bacterium flavim/lio.2247 beimpft und die Kultivierung bei 31 "C

. unter Schütteln durchgeführt (primäre Fermentation)· 18 Stunden

BAD ORIGfNAL 8 Ü 9 δ ü 7 / ü 2 3

nach Beginn der Inkubation wurden die Hälften des Mediums in die sekundären Fermenter A und B gegossen, mit einem Grundmedium der gleichen Zusammensetzung wie das, dessen Herstellung weiter oben beschrieben ist, zur Ergänzung der weiter beförderten Medien aufgefüllt und die Medien weitere 26 Stunden kultiviert· Die Ausbeute der gebildeten L»Glutaminsäure ist weiter unten angegeben*

Fermenter Inkubationsdauer (Std») Glutaminsäureausbeute

A 26 42,5

B 26 42,6

gewöhnliche die- 43 41,8

kontinuierliche

Fermentation

Bemerkung; Bei der Inkubationsdauer von 26 Stunden ist nicht die Dauer der primären Fermentation (18 Stunden) berücksichtigt»

Beispiel 4

Ein Grundmedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1, Jedoch ohne Vitamin B,., wurde mit Brevibacterium lactofermentum, Stamm No»2256 beimpft und die Kultivierung 18 Stunden bei 31*0 unter Schütteln durcb^'^ührt (primäre Fermentation)· Je Y3 des Mediums wurde in neu vorgesehene Fermenter A,B und C übergeführt und nach Zusatz von 2/3 Grundmedium zu den Fermentern die sekundäre Fermentation durchgeführt«

Bei der L-Glutaminsäureproduktion wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Fermenter Dauer der sek.Fermentat.i.on Ausbeute an gebildeter Glu«* (SBd») taminsäure (%)

A 26 43,6

B 26 43,4

C 26 42,8

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U42197

Beispiel 5 Die primäre und die sekundäre Fermentation wurden in Medien mit \

kultur verschiedenen Mengen Biotin durchgeführt· Das Grundinedium hatte

mit Ausnahme des Biotingehaltes die gleiche Zusammensetzung wie das des Beispiels 4« Die Menge an Nährmedium» die weiter befördert werden sollte, wurde in Uebereinstimmung mit der in dem primären Fermentationsmedium enthaltenen Biotinmenge variiert· Als Mikroorganismus wurde Brevibaoterium lactofermentum Stamm Nr·2256 verwendet* Sie JXJlutaminsäure wurde in folgender Ausbeute produziert»

litiale Biotin·· Volumen de» Initiale Biotin·· Inkubjt- Glutamin·· inge im primären , weit erb eföiv menge in dem sur tions- säure·» •rmentationsme- derten Kemg Ergäniung verwen- dauer ausbeute Lum (γ/l) diums deten Fleisohme- (ßtd.) {%) ^: dium (y/1) - ■ ; ,

5 iV2 des prim» 7 21,5 4o,o

Fermentatlonsmerli—

7 Γ η " 3 23

1· - V3 " ο 22

7 VJ " 5 22 42,7

JV* ^β ο 31

•wohnliche diekentinnitrliehe Fermentation Enitialer Biotimgehalt 7 Y/1) »wohnliche diskemtlnmierliche fermentatiom [nitialer liotUfehait 5 TA)

Besterkungt g)t»l dir Imkutatlemsaausr gemäss Irfindung ist nicht die Dauer ter primären Fermentation (1β Stunden) be»

• ^: . ■ ffttokeioatitt. ·'.;'· "·■·.'*■:.■ . - V ■·■' ; Y: ■■' -;^:-·^;

^f Ϊ

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Claims

Pat ent ansprüohe

1) Verfahren zur L-Glutaminsäureproduktion durch halbkontinuierlich« Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kulturmedium in dem die Wachstumageschwind^eit der Bakterien zu fallen beginnt und die Zellkonzentration kaum den höchsten stationären. Wert erreicht« in zwei oder mehrere Teile teilt, alle Teilmedien zur Ergänzung mit einem Grundmedium auffüllt und der Inkubation zur IwGlutaminsäureproduktion unterwirft, die man dann isoliert· .,. ■-.·-.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kulturmedium, in dem die Wachstumsgeschwindigkeit der Bakterien zu fallen beginnt und die Zellkonzentration kaum den höchsten stationären Wert erreicht _% in zwei oder mehrere Teile teilt, alle Teil« . medien, mit einer Ausnahme, durch ein Grundnährmedium ergänzt,' die * Medien zur Produktion von ![»«-Glutaminsäure -der Inkubation unterwirft, danach die gebildete Säure isoliert, während man das rest«· lieh· Medium durch das Grundmedium ergänzt, darauf das Medium kultiviert, es, wenn die Zellkonzentration in dem Medium die initiale Konzentration erreicht hat, in zwei oder mehrere Teile teilt, alle Ttilmedien, mit einer Ausnahme, durch ein GrimdnährmediuM ergänzt, ;· die L-Glutaminsäurefermentation wie oben durchführt,_{; ft}die-_; B.ait.erien;_;, in dem oben zurückgebliebenen Medium nach Ergänzung!mit einem Grund· nährmedium wachsen läset, um die Teilung des Mediums zu'wiederholen schliesslich in allen Teilmedien die L-Gluta»inwäurefermentation stattfinden lässt und die gebildete Säure isoliert*

COPY

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