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Gebiet der Erfindung
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Stilbenoiden,
umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen einer Zelle,
welche in der Lage ist, Stilbenoide zu bilden, mit einem Nährmedium
beinhaltend mindestens einen Polyether und II) Kultivieren der Zelle
unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, Stilbenoide
zu bilden.
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Stand der Technik
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Stilbenoide
sind Derivate des Stilbens. Zu den Stilbenoiden gehört
insbesondere das Resveratrol (3,4',5-Trihydroxystilben), welches
ebenfalls zur Stoffklasse der Polyphenole, genauer der polyphenolischen Phytoalexine,
zu zählen ist. In Pflanzen werden Stilbenoide, wie etwa
Resveratrol, insbesondere bei Pilzinfektionen oder starker UV-Belastung
gebildet.
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Resveratrol
ist ein pflanzlicher Sekundärmetabolit, der aufgrund seiner
antioxidativen Eigenschaften und biologischen Wirksamkeit als Inhaltsstoff
für kosmetische Formulierungen und Nahrungsergänzungsmittel von
erheblichem kommerziellem Interesse ist. Resveratrol wird aktuell
ausschließlich durch extraktive Verfahren aus Pflanzen
gewonnen, vor allem aus Polygonum cuspidatum und Vitis vinifera.
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Nachteil
der extraktiven Verfahren ist die geringe Ausbeute bei hohen Lösungsmittel-
und Pflanzenmengen.
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Alternative
Herstellverfahren für Resveratrol wurden sowohl in Form
von chemischen Synthesen (z. B.
US
6,552,213 ,
WO 2005023740 ,
US 7,235,324 ) als auch von
biotechnologischen Verfahren in Mikroorganismen entwickelt.
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Die
in biochemischen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen sind meist
rekombinante, da der Biosyntheseweg hin zum Resveratrol lediglich
in einigen Pflanzen realisiert ist und dieser Stoffwechselweg in
Mikroorganismen übertragen werden muss.
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Resveratrol
wird durch drei Enzyme aus den Metaboliten Tyrosin und Malonyl-CoA
(Intermediat der Fettsäurebiosynthese), die in allen Organismen
vorkommen, synthetisiert. Die drei Enzyme sind i) die Tyrosin-Ammonium-Lyase
(TAL), die Tyrosin durch Deaminierung in 4-Coumarsäure
umwandelt, ii) die 4-Coumaryl-CoA-Ligase, die die Aktivierung der
Coumarsäure zum 4-Coumaryl-CoA katalysiert, und schließlich,
iii) die Stilben-Synthase, die in drei Schritten drei Moleküle
Malonyl-CoA mit einem Molekül 4-Coumaryl-CoA zum Resveratrol
kondensiert. Wird Coumarsäure als Vorläufermolekül
gefüttert, kann man auch nur unter Verwendung der letzten
beiden Enzyme, 4-Coumaryl-CoA-Ligase und Stilben-Synthase, Resveratrol
auf biotechnologischem Wege herstellen.
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Eine
funktionelle Expression von zwei der genannten Enzyme (4-Coumaryl-CoA-Ligase
und Stilben-Synthase) bzw. des gesamten Stoffwechselweg wurde sowohl
in Bakterien (Beekwilder et al., 2006; Watts et al., 2006, Katsuyama
et al., 2007,
WO 05084305 )
als auch Hefen (Becker et al., 2003; Beekwilder et al., 2006,
WO 06089898 ) bereits gezeigt.
Es konnte Resveratrol entweder aus dem Vorläufermolekül
Coumarsäure und Glukose (als Kohlenstoff- und Energiequelle
für die Herstellung von Malonyl-CoA als zweitem Vorläufermolekül
oder auch ausschließlich aus Glukose hergestellt werden.
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Nachteil
aller oben beschriebenen biotechnologischen Verfahren ist, dass
trotz massiver Überproduktion der Resveratrol synthetisierenden
Enzyme das Produkt lediglich in einer Konzentration von 100 mg/l
bezogen auf die Kulturbrühe erreicht werden konnten. Dies
ist sehr weit von Konzentrationen entfernt, die eine biotechnologische
Herstellung sinnvoll machen.
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Aufgabe
der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, welches
die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwindet.
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Beschreibung der Erfindung
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die
beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwindet.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher ein biotechnologisches Verfahren
zur Herstellung von Stilbenoiden.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Stilbenoide selber so
wie chemische Produkte, die mit diesen Stilbenoiden hergestellt
werden.
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Ein
Vorteil der Erfindung ist es, dass keine großen Pflanzenmengen
für die Herstellung der Stilbenoide benötigt werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Reduzierung an benötigten,
organischen Extraktionsmitteln. Noch ein weiterer Vorteil der Erfindung
ist es, dass in dem biochemischen Verfahren weniger Kohlenstoffquelle
bezogen auf hergestelltes Stilbenoide als bisher eingesetzt werden
muss und somit dem ressourcenschonenden Umgang mit Rohstoffen Rechnung
getragen werden kann.
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Unter „Stilbenoide” werden
im Rahmen der Erfindung mit mindestens einer Hydroxygruppe hydroxylierte
strukturelle Derivate des Stilbens (1,2-Ethendiylbisbenzen) verstanden,
wobei „Stilben” das E- und Z-Isomer bzw. cis-
und trans-Isomer umfasst; Beispiele für Stilbenoide sind
daher Resveratrol, Piceatannol, Pinosylvin und Pterostilben.
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Alle
angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Stilbenoiden,
umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen einer Zelle,
welche in der Lage ist, Stilbenoide zu bilden, mit einem Nährmedium
beinhaltend mindestens einen Polyether und II) Kultivieren der Zelle
unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, Stilbenoide
zu bilden.
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Erfindungsgemäß können
in dem Verfahren sämtliche Zellen, bevorzugt rekombinante,
d. h. gentechnisch veränderte Zellen, eingesetzt werden,
die in der Lage sind, Stilbenoide zu bilden; dies können
Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen
(wie etwa Zellen aus dem Menschen), um pflanzliche Zellen oder um
Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen
besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt
sind. Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen
Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig,
Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt
sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören
zu den Gattungen, die am Anmeldetag dieser Anmeldung unter
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
aufgeführt
sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören
zu denjenigen Gattungen, die am Anmeldetag dieser Anmeldung unter
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
aufgeführt
sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind
diejenigen, die am Anmeldetag dieser Anmeldung unter
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
aufgeführt
sind.
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Erfindungsgemäß werden
in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugte
Zellen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus,
Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula,
Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium,
Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium eingesetzt,
wobei Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum,
Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae,
Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida rugosa, Corynebacterium
glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia
lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Ralstonia
eutropha H16, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris und Pichia
ciferrii ganz besonders bevorzugt eingesetzt werden.
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Bevorzugt
werden gegenüber ihrem Wildtyp gentechnisch veränderte
Zellen eingesetzt, die im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Stilbenoide
als ihr Wildtyp zu bilden vermögen. Die Formulierung „dass
sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Stilbenoide zu bilden vermögen” betrifft
auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten
Zelle überhaupt keine Stilbenoide, vorzugsweise kein Resveratrol,
zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen zu
bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung
nachweisbare Mengen dieser Komponenten gebildet werden können.
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Beispiele
solcher Zellen sind in der
WO
2006/089898 beschrieben und dieses Dokument wird hiermit als
Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung
der vorliegenden Erfindung.
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Erfindungsgemäß können
in dem Verfahren sämtliche Zellen eingesetzt werden, die
in der Lage sind, aus beliebiger Kohlenstoffquelle wie beispielsweise
Zuckern, Hexosen, Pentosen, Disacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden,
Fetten, Triglyceriden, Glycerin, Fettsäuren, Alkanen, Methan,
Methanol, Ethanol, Alkoholen, Kohlendioxid, Lactat, Pyruvat, Acetat,
Propionat, Butyrat oder organischen Säuren, Stilbenoide,
bevorzugt Resveratrol, zu bilden. Erfindungsgemäß bevorzugt
werden solche Zellen eingesetzt, die in der Lage sind aus Glucose,
Saccharose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle Stilbenoide, bevorzugt
Resveratrol, zu bilden.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ganz besonders
bevorzugt Zellen eingesetzt, die in der Lage sind, Stilbenoide,
bevorzugt Resveratrol, über Malonsäure, Tyrosin,
Phenylalanin, Zimtsäure, Coumarsäure, Ferulasäure,
Kaffeesäure oder andere Zimtsäureabkömmlinge
als Edukte oder als Zwischenprodukte zu bilden.
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Es
ist dem Fachmann bewusst, dass an Stelle der genannten Säuren
auch deren korrespondierenden Salze bzw. Mischungen der freien Säure
und Salze eingesetzt werden können. Beispiele für
solche Zellen sind der
WO
2006/124999 zu entnehmen, und dieses Dokument wird hiermit
als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung
der vorliegenden Erfindung.
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Das
im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Kulturmedium
muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen
Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien
verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual
of Methods for General Bacteriology" der American Society
for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
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Als
Kohlenstoffquelle in dem eingesetzten Nährmedium werden
Kohlehydrate, wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl
und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B.
Glycerin und Methanol, Aminosäuren wie L-Glutamat oder
L-Valin oder organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäure
eingesetzt.
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Diese
Stoffe können einzeln oder als Mischung eingesetzt werden.
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Neben
den Kohlenstoffquellen kann das Nährmedium insbesondere
Stickstoff und Phosphorquellen, Salze sowie Mittel zur pH-Kontrolle
enthalten.
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Als
Stickstoffquelle in dem eingesetzten Nährmedium können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und
Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat eingesetzt
werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
eingesetzt werden.
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Als
Phosphorquelle in dem bzw. in den im Verfahrensschritt a) eingesetzten
Nährmedium/Nährmedien können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze eingesetzt werden. Das im
Verfahren eingesetzte Nährmedium sollte weiterhin Salze
von Metallen enthalten, die für das Wachstum notwendig
sind, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat,
Mangansulfat oder Eisensulfat.
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Schließlich
können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen im
Nährmedium eingesetzt werden.
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Bei
dem im Verfahrensschritt I) eingesetzten, vorzugsweise wasserlöslichen
Polyether handelt es sich vorzugsweise um ein Polyalkylenglykol.
Als Polyether werden insbesondere Polyethylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol
(PPG) eingesetzt, wobei PEG besonders bevorzugt ist.
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Das
Molekulargewicht des in dem erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzten Polyethers liegt in einem Bereich von 100
g/mol bis 200000 g/mol, bevorzugt von 200 g/mol bis 200000 g/mol
und besonders bevorzugt von 300 g/mol bis 100000 g/mol. Es ist dem
Fachmann geläufig, dass die Polyether in Form eines Gemisches
mit einer im Wesentlichen durch statistische Gesetze geregelten
Verteilung des Molekulargewichtes vorliegen bzw. vorliegen können.
Die Werte für das Molekulargewicht stellen deshalb üblicherweise
einen Mittelwert dar.
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Bei
dem im Verfahrensschritt I) eingesetzten Polyether werden Konzentrationen
von 1 g/l bis 1000 g/l, bevorzugt von 2 g/l bis 800 g/l und besonders
bevorzugt von 10 g/l bis 600 g/l bezogen auf das Gesamtvolumen des
Nährmediums eingesetzt.
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Erfindungsgemäß können
auch Mischungen verschiedener Polyether eingesetzt werden.
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Die
Kultivierung der Mikroorganismen im Verfahrensschritt II) kann kontinuierlich
oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im
fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder im repeated-fed-batch-Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung von Biomasse
bis zum Erreichen einer relevanten Biotrockenmasse erfolgen. Denkbar
ist auch ein semikontinuierliches Verfahren, wie es in der
GB-A-1009370 beschrieben
wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind
im Lehrbuch von
Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von
Storhas („Bioreaktoren
und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994) beschrieben. Dem Kulturmedium können überdies
im Rahmen der Kultivierung geeignete Vorstufen wie beispielsweise
4-Hydroxyzimtsäure, Malonsäure, Tyrosin, Phenylalanin, Zimtsäure,
Coumarsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure
oder andere Zimtsäureabkömmlinge zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen
wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter
Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können
Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie
z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Sollen aerobe Bedingungen
aufrechterhalten werden, so werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige
Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur
der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C
und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C, bei einem
Einsatz thermophiler Bakterien können die Temperaturen
auch bis zu 80°C betragen.
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Gemäß einer
weiteren, besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens beinhaltet dieses Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt
III) Isolierung der gebildeten Stilbenoide.
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Im
Schritt III) des erfindungsgemäßen Verfahrens
können die durch die Zellen gebildeten Stilbenoide gegebenenfalls
aus den Zellen und/oder dem Nährmedium isoliert werden,
wobei zur Isolierung alle dem Fachmann bekannten Methoden zur Isolierung
von niedermolekularen Substanzen aus komplexen Zusammensetzungen
in Betracht kommen. Beispielhaft seien an dieser Stelle die Fällung
mittels geeigneter Lösungsmittel, die Extraktion mittels
geeigneter Lösungsmittel, die Komplexierung, beispielsweise
mittels Cyclodextrinen oder Cyclodextrin-Derivaten, die Kristallisation,
die Aufreinigung bzw. Isolierung mittels chromatographischer Methoden
oder die Überführung der Stilbenoide in leicht
abtrennbare Derivate genannt.
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Für
den Fall, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren
ein wasserunlöslicher Polyether eingesetzt wird, kann der
Polyether als Extraktionsmittel verwendet werden. Somit ist es dann
bevorzugt, den Polyether von der Kulturbrühe, beispielsweise
durch Zentrifugation oder Sedimentation zu trennen und aus diesem
heraus das Stilbenoid weiter aufzuarbeiten.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Stilbenoide und das Resveratrol
erhalten durch das erfindungsgemäße Verfahren
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Noch
ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind chemische Produkte, insbesondere
kosmetische Formulierungen, Nahrungsmittel, Getränke und
pharmazeutische Formulierungen, beinhaltend die Stilbenoide und/oder
das Resveratrol erhalten durch das erfindungsgemäße
Verfahren
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In
den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende
Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren
Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt,
auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt
sein soll.
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Folgende
Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:
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Die 1 zeigt
den Verlauf der Resveratrolbildung ohne bzw. mit Zugabe von PEG3350
oder PPG4000.
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Die 2 zeigt
die Auswirkung unterschiedlicher Konzentrationen von PEG3350 auf
die Resveratrolbildung.
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Die 3 zeigt
die Auswirkung unterschiedlicher PEG-Molekulargewichte auf die Resveratrolbildung bei
Vorlage von jeweils 50 g/l PEG.
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Beispiele:
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Beispiel 1: Klonierung eines Vektors zur
Expression der Coumaryl-CoA-Ligase- und der Stilben-Synthase-kodierenden
Gene in Escherichia coli
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Amplifikation
von DNA mittels PCR (Polymerase Chain Reaction), Restriktionsverdau,
DNA-Aufreinigung, Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter
E. coli-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Alle benötigten Enzyme wurden bezogen von New England Biolabs, Schwalbach.
Die Synthese von Oligonukleotiden erfolgte durch MWG Biotech, Ebersberg.
- – Zunächst wurde der den
LacI-Operator enthaltenden lac-Promotor im kommerziell erhältlichen
Vektor pUC19 (New England Biolabs, Schwalbach) durch Umklonierung
eines synthetischen Fragments des lac-Promotors ohne Operator ersetzt
in Anlehnung an Watts et al., "Biosynthesis of
plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered
Escherichia coli" (BMC Biotechnology 2006, 6:22).
Der Vektor pUC19 (2686 bp) wurde hierfür geschnitten mit
PvuII und NdeI gemäß den Angaben des Herstellers
(New England Biolabs, Schwalbach). Das synthetische Fragment des
lac-Promotors ohne Operator (SEQ-ID Nr. 1) wurde in derselben Weise
der modifizierte lac-Promotor geschnitten, und das resultierende
Fragment nach Aufreinigung über ein Agarosegel mittels
QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) mit dem verbliebenen,
gleichermaßen aufgereinigten Vektorrückgrat von
pUC19 (2240 bp) ligiert (T4 DNA Ligase, New England Biolabs, Schwalbach),
woraus der Vektor pUCmodII (2452 bp) resultierte. Ligation und Transformation
von kompetenten Escherichia coli DH5a erfolgten entsprechend der
Vorgaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach).
- – Der Vektor pUCmodII wurde im nächsten Schritt
mit XbaI und NotI geschnitten. Ausgehend von dem Vektor pCR2.1-TOPO-VvSTS
(SEQ-ID Nr. 2) wurde mittels PCR unter Verwendung von Phusion DNA
Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) und den Oligonukleotiden
VvSTScod-Xba1-fw (5'-TAT ATA TCT AGA AGG AGG ATT ACA AAA TGG CTT
CAG TCG AGG AAA TTAG-3') und VvSTScod-Not1-rv (5'-TAT ATA GCG GCC
GCT TTA ATT TGT AAC CAT AGG-3') das Gen der Stilben-Synthase aus
Vinis vinifera (VvSTS) gemäß den Angaben des Herstellers
amplifiziert, woraus ein ca. 1200 bp-Fragment (SEQ-ID Nr. 3) resultierte.
Dieses wurde über ein Agarosegel mittels QIAGEN QIAquick
Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Das PCR-Produkt
wurde anschließend analog zum Vektor pUCmodII mit XbaI
und NotI geschnitten und beide Fragmente ligiert, woraus der Vektor
pUCmod-VvSTS resultierte (3625 bp).
- – Das Gen der Coumaryl-CoA-Ligase At4Cl1 aus Arabidopsis
thaliana wurde ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA (United States
Biological, Swampscott, USA) mittels PCR und den Oligonukleotiden At4Cl1-Not-fw
(5'-TAT ATA GCG GCC GCA GGA GGA TTA CAA AAT GGC GCC ACA AGA AC-3')
und At4Cl1-Not (5'-TAT ATA GCG GCC GCT CAC AAT CCA TTT GCT AGT TTT-3')
amplifiziert.
Das erhaltene PCR-Produkt (SEQ-ID Nr. 4) wurde über
ein Agarosegel aufgereinigt und mit NotI geschnitten. Das hieraus
resultierende 1708 bp-Fragment wurde mit dem gleichermaßen
geschnittenen Vektor pUCmod-VvSTS nach dessen Dephosphorylierung
mit CIP (New England Biolabs, Schwalbach) gemäß den
Angaben des Herstellers ligiert, woraus der Vektor pUCmod-VvSTS-At4Cl1
(alternative Benennung: pUC-VvSTS-At4Cl1) resultierte (5333 bp).
Die Orientierung des Inserts wurde dabei so gewählt, dass VvSTS
und At4Cl1 gleichgerichtet transkribiert und translatiert werden.
- – Der Promotor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
(GAPDH) wurde mittels Kolonie-PCR mit Escherichia coli DH5a Zellen
(New England Biolabs), Phusion DNA Polymerase und den Oligonukleotiden EcGAP- SapI-fw
(5'-TAT ATA GCT CTT CAA GCG CGT AAT GCT TAG GCA CAG G-3') und EcGAP-XbaI-rv (5'-TAT
ATA TCT AGA TGA ATA AAA GGT TGC CTG TAA-3') amplifiziert. Das resultierende
PCR-Produkt (ca. 110 bp; SEQ-ID Nr. 5) wurde aufgereingt über
ein Agarosegel wie bereits beschrieben, und anschließend
einem SapI und XbaI-Verdau unterzogen. Der Vektor pUCmod-VvSTS-At4Cl1
wurde ebenfalls mit XbaI und SapI geschnitten, und das Vektorrückgrat
(5139 bp) mit dem den Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Promotor
enthaltenden PCR-Produkt ligiert, woraus der Vektor pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1
resultierte (5244 bp; SEQ-ID Nr. 6).
- – Zellen des Escherichia coli-Stammes BW27784 (E. coli
Genetic Resource Center, New Haven, USA) wurde mit pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1
transformiert. Die Herstellung und Transformation der kompetenten
Zellen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
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Beispiel 2: Kultivierung der rekombinanten
E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in An- und
Abwesenheit von PEG bzw. PPG
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3
ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1% Glycerin
als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9: 6,8
g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat,
0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/l Calciumchlorid
Dihydrat, 250 mg/l Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1% MEM Vitamin Solution
(Sigma-Aldrich), pH 7,0), welches 100 μg/ml Ampicllin enthielt,
wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1 von frisch
ausgestrichenen und über Nacht bei 37°C inkubierten
LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml
Ampicillin angeimpft, und für 6 h bei 37°C und
225 upm in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden
100 ml modifiziertes M9-Medium in einem 500-ml-Schüttelkolben
mit Schikanen mit Zellsuspension aus der Vorkultur mit einer optischen
Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 angeimpft. Die Inkubation der
Schüttelkolben erfolgte über Nacht für
16–18 h bei 37°C und 225 upm. Am nächsten
Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt
und diese bei 4000 upm für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 100 ml frischem modifiziertem M9-Medium
resuspendiert, supplementiert mit 3–4 mM 4-Hydroxyzimtsäure
sowie 100 g/l PEG 3350 (Sigma Aldrich) bzw. 5% PPG 4000 (v/v) (Sigma
Aldrich), und jeweils in einen 500-ml-Schüttelkolben mit
Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung
der Produktbildungsraten bei 37°C und 250 upm für
4–6 h inkubiert. Das Wachstum der E. coli-Zellen wurde
durch regelmäßige Messung der OD600 verfolgt.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
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Beispiel 3: Quantifizierung von Resveratrol
und 4-Hydroxyzimtsäure in der Zellsuspension
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Zur
Extraktion wurde 1 ml der Zellsuspension eingesetzt. Die Zellsuspension
wurde in 2-ml-Reaktionsgefäße überführt
und durch Zugabe von 50 μl 3 M HCl angesäuert.
Nach Zugabe von 950 μl Ethylacetat wurden die Proben in
einer Retschmühle MM100 (RETSCH, Hahn) für 30
sec bei 30 Hz extrahiert, und anschließend für
1 min bei 13.200 upm abzentrifugiert. Die Ethylacetat-Phase wurde
in ein 1,5-ml- HPLC-Gefäß (Agilent Technologies,
Waldbronn) überführt und fest verschlossen.
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2 μl
der Extrakte wurden auf eine Zorbax SB-C18-Säule (4.6 × 150
mm, 3.5 μm; Agilent Technologies, Waldbronn) mittels des
Agilent 1200 HPLC-Systems, ausgestattet mit einem Photodioden-Array-Detektor
und einem binären Gradientenmischer, injiziert. Resveratrol
wurde mit einer mobilen Phase bestehend aus 580 g Acetonitril, 265
g Wasser und 0,5 ml Trifluoressigsäure pro Liter (Laufmittel
A) und Wasser (Laufmittel B), beigemischt in einem Mischungsverhältnis
von 48:52 (A:B), mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0
ml/min und einer Säulentemperatur von 25°C eluiert.
Resveratrol als auch 4-Hydroxyzimtsäure wurde durch einen
Vergleich mit der Verweilzeit und dem UV/VIS-Spektrum einer Referenzsubstanz
(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen bzw. Merck, Darmstadt) identifiziert.
Zur Quantifizierung des Eduktes 4-Hydroxyzimtsäure bzw.
Produktes Resveratrol in den Extrakten wurden Standard-Kurven durch
das Auftragen der Peak-Flächen von Referenzproben mit bekannter
Konzentration gegen die entsprechende Konzentration in diesen Referenzproben
angefertigt. Die Detektion und Quantifizierung von Resveratrol und
4-Hydroxyzimtsäure erfolgte bei einer Wellenlänge
von 308 nm.
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1 zeigt,
dass die Kulturen des rekombinanten E. coli-Stammes BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1
in Anwesenheit von PEG bzw. PPG im Vergleich zur Kontrolle ohne
PEG oder PPG nach 4 h Kultivierung signifikant gesteigerte Resveratroltiter
aufweisen.
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Beispiel 4: Kultivierung der rekombinanten
E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in Anwesenheit verschiedener
Konzentrationen von PEG
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2,5
ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1% Glycerin
als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9: 6,8
g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat,
0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/l Calciumchlorid
Dihydrat, 250 mg/l Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1% MEM Vitamin Solution
(Sigma-Aldrich), pH 7,0), welches 100 μg/ml Ampicllin enthielt,
wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1 von frisch
ausgestrichenen und über Nacht bei 37°C inkubierten
LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml
Ampicillin angeimpft, und für 6 h bei 37°C und
225 upm in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden
50 ml modifiziertes M9-Medium in einem 250-ml-Schüttelkolben
mit Schikanen mit Zellsuspension aus der Vorkultur mit einer optischen
Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 angeimpft. Die Inkubation der
Schüttelkolben erfolgte über Nacht für
16–18 h bei 37°C und 225 upm. Am nächsten
Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt
und diese bei 4000 upm für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 50 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert,
supplementiert mit 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 0, 10, 25,
50 bzw. 100 g/l PEG 3350 (Sigma Aldrich), und jeweils in einen 250-ml-Schüttelkolben
mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung
der Produktbildungsraten bei 37°C und 250 upm für
6 h inkubiert.
-
2 zeigt,
dass die Kulturen des rekombinanten E. coli-Stammes BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1
bereits bei Anwesenheit von 10 g/l PEG3350 im Vergleich zur Kontrolle
ohne PEG nach 6 h Kultivierung signifikant gesteigerte Resveratroltiter
aufweisen, was im Wesentlichen durch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute
verursacht wird.
-
Beispiel 5: Kultivierung der rekombinanten
E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in Anwesenheit
von PEG unterschiedlicher Molekulargewichte
-
2,5
ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1% Glycerin
als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9: 6,8
g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat,
0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/l Calciumchlorid
Dihydrat, 250 mg/l Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1% MEM Vitamin Solution
(Sigma-Aldrich), pH 7,0), welches 100 μg/ml Ampicllin enthielt,
wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1 von frisch
ausgestrichenen und über Nacht bei 37°C inkubierten
LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml
Ampicillin angeimpft, und für 6 h bei 37°C und
225 upm in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden
50 ml modifiziertes M9-Medium in einem 250-ml-Schüttelkolben
mit Schikanen mit Zellsuspension aus der Vorkultur mit einer optischen
Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 angeimpft. Die Inkubation der
Schüttelkolben erfolgte über Nacht für
16–18 h bei 37°C und 225 upm. Am nächsten
Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt
und diese bei 4000 upm für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 50 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert,
supplementiert mit 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 50 g/l PEG
1000 (Fluka), PEG 3350 (Sigma Aldrich), PEG 6000 (Fluka) bzw. PEG
20000 (Fluka), und jeweils in einen 250-ml-Schüttelkolben
mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung
der Produktbildungsraten bei 37°C und 250 upm für
6 h inkubiert.
-
3 zeigt,
dass die Kulturen des rekombinanten E. coli-Stammes BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4Cl1
bei Anwesenheit von PEG im Vergleich zur Kontrolle ohne PEG nach
6 h Kultivierung signifikant gesteigerte Resveratroltiter aufweisen.
Das Molekulargewicht von PEG (MW 1000–20000) ist dabei
nahezu unerheblich für den beobachteten positiven Effekt
auf die Resveratrolbildung.
-
Beispiel 6: Kosmetische Formulierungen
enthaltend nach erfindungsgemäßem Verfahren hergestelltes
Resveratrol.
-
Die
folgenden kosmetischen Formulierungen werden nach dem Fachmann bekannter
Art und Weise hergestellt. F1.
O/W-Lotion mit 0,1% Resveratrol
| Decyl
Oleate | 5,7% |
| Ethylhexyl
Stearate | 6,5% |
| Glyceryl
Stearate | 0,5% |
| Stearinsäure | 0,7% |
| Cetearyl
Glucoside | 1,0% |
| Creatine | 0,5% |
| Glyzerin | 3,0% |
| Kathon
CG | 0,015% |
| Wasser | ad 100% |
| Carbomer | 0,2% |
| Ethylhexyl
Stearate | 0,8% |
| NaOH
(10%) | 0,7% |
| Resveratrol | 0,1% |
F2.
O/W-Creme mit 0,1% Resveratrol
| Glyceryl
Stearate | 2,5% |
| Stearinsäure | 1,0% |
| Stearylalkohol | 1,5% |
| Decyl
Cocoate | 8,0% |
| Ethylhexyl
Stearate | 7,0% |
| Caprylic- | 5,0% |
| /Caprictriglyceride | |
| Cetearyl
Glucoside | 1,0% |
| Glyzerin | 3,0% |
| Kathon
CG | 0,015% |
| Wasser | ad 100% |
| Carbomer | 0,2% |
| Ethylhexyl
Stearate | 0,8% |
| NaOH
(10%) | 0,75% |
| Polyglutaminsäure; | 5,0% |
| Hydrolised
Sclerotium | |
| Gum;
Betain; Harnstoff; | |
| Kaliumlaktat | |
| Resveratrol | 0,1% |
F3.
W/O-Lotion mit 0,1% Resveratrol
| Cetyl
PEG/PPG-10/1 | 2,0% |
| Dimethicone | |
| Ceresin | 0,5% |
| Hydriertes
Rizinusöl | 0,5% |
| Decyl
Oleate | 9,0% |
| Caprylic- | 10,0% |
| /Caprictriglyceride | |
| Diethylhexyl
Ccarbonate | 5,0% |
| PPG-3
Myristyl Ether; | 3,0% |
| Salicyloyl | |
| Phytosphingosine | |
| Wasser | ad
100% |
| Natriumchlorid | 0,5% |
| Kathon
CC | 0,015% |
| Resveratrol | 0,1% |
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 6552213 [0005]
- - WO 2005023740 [0005]
- - US 7235324 [0005]
- - WO 05084305 [0008]
- - WO 06089898 [0008]
- - WO 2006/089898 [0021]
- - WO 2006/124999 [0024]
- - GB 1009370 A [0036]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm [0018]
- - http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm [0018]
- - http://www.dsmz.de/species/fungi.htm [0018]
- - ”Manual of Methods for General Bacteriology” der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) [0025]
- - Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) [0036]
- - Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”,
Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) [0036]
- - Watts et al., ”Biosynthesis of plant-specific stilbene
polyketides in metabolically engineered Escherichia coli” (BMC
Biotechnology 2006, 6:22) [0048]