WO2011157496A1 - Zelle und verfahren zur herstellung von resveratrol - Google Patents

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WO2011157496A1
WO2011157496A1 PCT/EP2011/057754 EP2011057754W WO2011157496A1 WO 2011157496 A1 WO2011157496 A1 WO 2011157496A1 EP 2011057754 W EP2011057754 W EP 2011057754W WO 2011157496 A1 WO2011157496 A1 WO 2011157496A1
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coli
coa
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Nicolas Rudinger
Steffen Schaffer
Michaela Hauberg
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C12Y203/01095—Trihydroxystilbene synthase (2.3.1.95)
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    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01012—4-Coumarate-CoA ligase (6.2.1.12)

Definitions

  • the invention relates to a cell which is capable of forming resveratrol, the cell having at least one reduced activity of an enzyme Ei which is involved in a cataplerotic pathway related to malonyl-coenzyme A as compared to its wild-type, and a method for producing resveratrol.
  • an enzyme Ei which is involved in a cataplerotic pathway related to malonyl-coenzyme A as compared to its wild-type
  • Resveratrol (or 3, 4, 5-trihydroxystilbene) is a secondary metabolite of plants, which is of significant commercial interest because of its antioxidant properties and biological activity as an ingredient in cosmetic formulations and dietary supplements.
  • Resveratrol is a phytophenol belonging to the stilbene phytoalexin family that provides an active defense mechanism in plants in response to infection or other stress events.
  • Stilbene Phytoalexins have the skeleton of stilbene derivatives (trans-1, 2-diphenylethylene) as a common basic structure; this may be supplemented with substitution with other groups (Hart, J.H. (1981) Annu., Rev. Phytopathology 19, 437-458 and Hart, J.H.,shrimpton, D.M. (1979) Phytopathology 69, 1, 138-1, 143).
  • Stilbenes have been detected in certain trees (covered and naked), but also in some herbs (in species of the Myrtaceae, Vitaceae and Leguminosae families).
  • Stilbenes are toxic to pests, especially fungi, bacteria and insects. However, only a few plants are able to synthesize stilbenes in concentrations that confer sufficient resistance to pests.
  • resveratrol is currently only obtained by extractive methods from plants, especially Polygonum cuspidatum and Vitis vinifera.
  • Resveratrol is synthesized a.) By three or b.) Four enzymes. For the enzyme combination a.) Resveratrol synthesis takes place from the metabolites tyrosine and malonyl-coenzyme A (malonyl-CoA), which occur in all microorganisms instead.
  • the three enzymes are i) tyrosine ammonium lyase (TAL), which converts tyrosine into 4-coumaric acid by deamination, ii) 4-coumaryl CoA ligase, which catalyzes the activation of coumaric acid to 4-coumaryl CoA, and finally, iii) the stilbene synthase (resveratrol synthase, EC: 2.3.1.95), which condenses three molecules of malonyl-CoA with one molecule of 4-coumaryl-CoA to the resveratrol in three steps.
  • TAL tyrosine ammonium lyase
  • 4-coumaryl CoA ligase which catalyzes the activation of coumaric acid to 4-coumaryl CoA
  • stilbene synthase resveratrol synthase, EC: 2.3.1.95
  • Resveratrol synthesis is synthesized by four enzymes from the metabolites phenylalanine and malonyl-CoA, which are found in all microorganisms.
  • the four enzymes are i) phenylalanine ammonium lyase (EC: 4.3.1 .5) (PAL), which converts phenylalanine into trans-cinnamic acid by deamination, ii) cinnamate-4-hydroxylase (EC: 1 .14.13.
  • biosynthesis of resveratrol can only be achieved using the last two enzymes, 4-coumaryl-CoA ligase and stilbene synthase.
  • WO06124999 describes a method to increase the intracellular availability of malonyl-CoA, wherein an acetyl-CoA carboxylase (synthesis of malonyl-CoA by
  • malonyl-CoA synthetase substrate is designed to coexpress a malonate transporter that facilitates the transport of malonate
  • the acetyl-CoA carboxylase from E. coli and other Gram-negative bacteria is one
  • Heterotetramer and stoichiometry of the subunits is very important for both the activity and growth of the expression or production host. Additional load on the cell arises from heterologous recombinant protein expression.
  • malonate transporter and malonyl-CoA synthetase
  • the expression and functionality of the malonate transporter is problematic since it is a transmembrane protein, as well as the added burden of heterologous recombinant protein expression.
  • the object of the invention was therefore to provide a method which overcomes at least one of the described disadvantages of the prior art. Description of the invention
  • the present invention therefore relates to cells as described in claim 1, a process for the preparation of resveratrol using the cells according to the invention as well as the resveratrol prepared with the cells according to the invention or the process according to the invention.
  • the advantage of the cells according to the invention is a considerably simplified handling, since no additional enzymes synthesizing malonyl-CoA have to be prepared in the production strain.
  • no selection pressure has to be exerted on the culture.
  • Another advantage of certain embodiments of inventive cells or methods is that the desired effect can be induced; such as in the case of the use of specific inhibitors.
  • the method is that the desired effect can be induced as well as turned off and thus is completely time-controlled; such as in the case of the use of strains that have temperature-sensitive malonyl-CoA as substrate accepting enzymes.
  • An object of the present invention is therefore a cell which is capable of forming resveratrol, the cell having at least one reduced activity of an enzyme E-i which is involved in malonyl-coenzyme A cataplerotic pathway compared to its wild-type.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of resveratrol.
  • resveratrol is understood to mean not only the compound cis- / trans-3,4,5-trihydroxystilbene, but also oligomers of resveratrol such as trans-s-viniferin, Gnetin H, suffructicosol B, upunaphenol B / C / D / E, or glycosylated forms such as
  • Piceid / polydatin, resveratrol based prodrugs eg RT-A or mixtures thereof understood.
  • reduced activity of an enzyme is preferably used a factor of at least 0.5, more preferably at least 0.1, more preferably at least 0.01, even more preferably at least 0.001 and most
  • the activity of a particular enzyme can be reduced, for example, by targeted or non-directional mutation, by addition of competitive or non-competitive inhibitors or by other measures known to those skilled in the art to reduce the synthesis of a particular enzyme.
  • a malonyl-coenzyme A cataplerotic pathway refers to the naturally occurring metabolic pathways in a cell that require malonyl-CoA to drain and consume it.
  • fatty acid biosynthesis may be mentioned here.
  • directly cataplerotic is understood to mean that an enzyme directly converts malonyl-CoA, where going by the term "indirect
  • cataplerotic is understood to mean an enzyme which participates in the cataplerotic pathway catalyzed by malonyl-coenzyme A, but does not directly convert malonyl-CoA but its secondary products, using the term" activity of an enzyme which is present on a
  • ACP is used synonymously for “acyl carrier protein”.
  • a preferred cell according to the invention is characterized in that it has been genetically engineered such that it has at least one reduced activity of an enzyme E-1 compared to its wild-type.
  • a preferred cell according to the invention has a reduced activity compared to its wild type at least one of the enzyme E- ⁇ , which is selected from the group comprising, preferably consisting of: an enzyme E 1a , which is the reaction
  • PKSs Polyketide synthases
  • Polyketis synthases are grouped into 3 classes: Type I, II, and III Type I PKSs are large multidomain enzymes Type II PKSs have many single-function subunits, and Type III PKSs consist of only one protein, most commonly arranged as a homodimer, using as substrate both acetyl-CoA and malonyl-CoA);
  • apo- [ACP] catalyzes adenosine 3 ', 5'-bisphosphate + holo- [ACP];
  • pantothenate + ATP catalysed by pantothenate + ATP to D-4'-phosphopantothenate + ADP;
  • R-4'-phosphopantothenoyl-L-cysteine catalyzed to 4'-phosphopantetheine are particularly preferred in this context.
  • E 1a is a malonate semialdehyde dehydrogenase (EC: 1.2.1.15 or EC: 1.2.1.18), for example known and well characterized from L. casei, P. aeruginosa, P. fluorescens and C. aurantiacus,
  • Ei b is a malonyl-CoA decarboxylase (EC: 4.1.1.9), for example, known and well characterized is from P. fluorescens, P. putida, Rhizobium leguminosarum and S. cerevisiae, Ei c an [acyl carrier protein] - S-malonyltransferase (EC: 2.3.1.39), for example, known and well characterized from E. coli (FabD), M. tuberculosis (FabD2), H. pylori, P. aeruginosa,
  • Egg s a [acyl-Camer-ProteinJ-S-acetyltransferase (EC: 2.3.1.38) is known, for example, and is well characterized from E. coli or a [myelin proteolipid] -0 palmitoyltransferase (EC 2.3.1.100) (FabH), E. gracilis and S. oleracea,
  • Eg f is an enoyl [acyl carrier protein] reductase (EC: 1.3.1.9), for example, known and well characterized from E. coli (Fabl), M. tuberculosis, B. anthracis, S. aureus, S pneumoniae, H. pylori, A. thaliana, E. tenella and B. subtilis, E 1g is a beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I or II (EC: 2.3.1.41/179), for example known and well characterized from E. coli (FabB / F), S. aureus, S. oleracea , L. lactis, S. pneumoniae, M. tuberculosis and A. thaliana,
  • FabB / F beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I or II
  • E 1h represents a 3-oxoacyl [acyl carrier protein] reductase (EC: 1 .1 .1.100), for example, known and well characterized from £. coli (FabG), P. putida, M. tuberculosis, P. aeruginosa, S. pneumoniae and L. lactis,
  • E-ii is a 3-hydroxydecanoyl [acyl carrier protein] dehydratase or 3-hydroxyoctanoyl [acyl carrier protein] dehydratase (EC: 4.2.1.60 or EC: 4.2.1.59) or a crotonoyl- [acyl Carrier protein] hydratase (EC: 4.2.1.58) or a trans-2-decenoyl [acyl carrier protein] isomerase (EC: 5.3.3.14), for example, known and well characterized from E. coli FabA / Z),
  • Eg, j is a holo [acyl carrier protein] synthase (EC: 2.7.8.7), for example, known and well characterized from E. coli (Acps), B.subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, and S. ,
  • E 1k represents a fatty acid synthase or fatty acid-acyl-CoA synthase (EC: 2.3.1.85 or EC: 2.3.1 .86),
  • A is a pantothenate kinase (EC: 2.7.1.33), for example, known and well characterized from E. coli (CoaA), S. aureus, B. anthracis, B. subtilis, M. tuberculosis, P. aeruginosa, S. oleracea , H. pylori and A. thaliana,
  • E 1m is a panthenol-phosphate adenylyltransferase (EC: 2.7.7.3), for example known and well characterized from E. coli (CoaD), T. thermophilus, M. tuberculosis, H. pylori and A. thaliana,
  • E 1n is a dephospho-CoA kinase (EC: 2.7.1.24), for example known and well characterized from E. coli (CoaE) and T. thermophilus, and
  • E 10 is a phosphopantothenoylcysteine decarboxylase (EC: 4.1 .1.36), for example, known and well characterized from E. coli (CoaBC), M. tuberculosis and A. thaliana, or one
  • EC Enzyme Commission Number according to the systematic nomenclature of the Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry (IUB) and thus designates the affiliation of the enzyme concerned to the corresponding class of enzymes. It is straightforward for one skilled in the art having the above information and knowledge, especially with regard to bioinformatics, to identify the gene encoding a considered enzyme in the cell to be manipulated and its activity as described below
  • Preferred cells according to the present invention are microorganisms, in particular selected from the group of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus,
  • enzyme E 5 is exempted as enzyme E- ⁇ .
  • Enzyme activities are for example Zhang et. al. (2006) Inhibiting bacterial fatty acid synthesis
  • Another suitable inhibitor is, for example for FabD, the 3-HMG-CoA, whose use in Kizer et. al. (2008) Application of functional genomics to pathway optimization for increased isoprenoid production Applied and Environmental Microbiology 74 (10) pp.3229-3241 is described in detail.
  • Targeted mutations for example directed knockouts, in which, for example, promoter deletes active sequences of the target gene, active (necessary for the catalytic function of the enzyme) regions of the target gene or the entire target gene, can be used to reduce the activity of an enzyme E-1 by genetic manipulation Foreign DNA substituted or disrupted with foreign DNA.
  • Suppression may be transient, inducible, or constitutive, depending on the system chosen.
  • Cells in which the activity of the enzyme E- ⁇ can be reduced in a conditioned manner are particularly preferred.
  • IGPS indoleglycerol phosphate synthase
  • B-FIT B-factor iterative test
  • thermolability of the lipase from Pseudomonas aeruginosa could be achieved. Compared to the wild-type strain could thereby
  • Thermostability of the PAL can be reduced from 71, 6 ° C to 35.6 ° C.
  • E. coli JP1 1 1 containing a temperature-sensitive FabI and described in Egan et al. (1973)
  • Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli required saturated and unsaturated fatty acids for growth: Isolation and properties.
  • pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli J. Bacteriol. 169: 5795-5800, as well as in Vallari at al. (1988) Biosynthesis and degradation both contribute to the regulation of coenzyme A content in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170: 3961-3966;
  • E. coli M8 E. coli PAM155, E. coli CY53, E. coli CY55 and E. coli CY50
  • a preferred cell according to the invention is characterized in that the cell is genetically engineered such that it can already form more resveratrol compared to its wild type without the reduced activity of an enzyme E- ⁇ .
  • Components can be formed.
  • a wild-type cell is preferably referred to as a cell whose genome is in a state as naturally produced by evolution, and is used for both the entire cell and for individual genes. fall therefore in particular not such cells or genes whose
  • Gene sequences have been altered at least in part by humans by recombinant methods.
  • These cells are preferably genetically engineered to be able to produce more resveratrol from a carbon source compared to their wild type
  • Carbon sources are, for example, sugars, hexoses, pentoses, disaccharides,
  • Oligosaccharides Oligosaccharides, polysaccharides, fats, triglycerides, glycerol, fatty acids, alkanes, methane, methanol, ethanol, alcohols, carbon dioxide, carbon monoxide, lactate, pyruvate, acetate, propionate, butyrate or organic acids, and syngas and waste gases.
  • the genetically modified cell is genetically modified in such a way that it is metabolized within a defined time interval, preferably within a defined time interval of 2 hours, more preferably within 8 hours, and most preferably within 24 hours, at least 2 times, more preferably at least 10 times, more preferably at least 100 times, even more preferably at least 1000, and most preferably at least 10,000 times Resveratrol forms more than the wild-type cell.
  • the increase in product formation can be determined, for example, by culturing the cell according to the invention and the wild-type cell separately under the same conditions (same cell density, same nutrient medium, same culture conditions) for a specific time interval in a suitable nutrient medium and then the amount Target product (Resveratrol) is determined in the nutrient medium.
  • the cell has an increased activity of at least one of the following enzymes compared to its wild type:
  • an enzyme E 2 which catalyzes the conversion of tyrosine to 4-coumarate or the conversion of L-phenylalanine to trans-cinnamate;
  • an enzyme E 5 which catalyzes the conversion of 4-coumaryl coenzyme A to resveratrol.
  • an increased activity of an enzyme E x which is increased in comparison with its wild type, is preferably always a factor greater than or equal to at least 2, particularly preferably at least 10, more preferably at least 100, moreover even more preferably at least 1, 000 and most preferably at least 10,000 increased activity of the respective enzyme
  • the cell according to the invention which "has an increased compared to their wild type activity of an enzyme E x ", in particular a cell whose wild type has no or at least no detectable activity of this enzyme E x and which only after increasing the enzyme activity, for example by overexpression, a detectable activity of this enzyme E x .
  • the term includes
  • particularly preferred cells are those in which the activity of the following enzyme or the following enzymes is increased: E 2 , E 3 , E 4 , E 5 , E 2 + E 4 , E 2 + E 5 , E 4 + E 5 , E 2 + E 4 + E 5 , E 3 + E 4 , E 3 + E 5 , E 3 + E 4 + E 5 , E 2 + E 3 + E 4 + E 5 , where E 4 + E 5 is particularly preferred.
  • Canadensis, P. kitakamiensis, P. tremuloides, S. tuberosum, P. avium, P. persica, Vitus vinifera, Z. mays or from fungi such as Agaricus, Aspergillus, Ustilago, in particular A bisporus, A. oryzae, A. nidulans, A. fumigatus, U. maydis,
  • Rhodobacter in particular R. capsulatus
  • yeast or from yeast such as Rhodotorula, in particular R. rubra.
  • cinnamate-4-hydroxylase EC: 1 .14.13.1 1
  • plants such as Arabidopsis, Citrus, Phaseolus, Pinus, Populus, Solanum, Vitus, Zea, Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Glycine, Helianthus, Lotus,
  • a 4-coumarate-CoA ligase (EC: 6.2.1.12), in particular from plants such as Abies, Arabidopsis, Brassica, Citrus, Larix, Phaseolus, Pinus, Populus, Solanum, Vitus, Zea, Agastache, Amorpha, Cathaya r Cedrus, Crocus, Festuca, Glycine, Juglans, Keteleeria, Lithospermum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nothotsuga, Oryza, Pelargonium, Petroselinum, Physcomitrella, Picea, Prunus, Pseudolarix, Pseudotsuga Rosa, Rubus, Ryza, Saccharum, Suaeda, Thellungiella, Triticum, Tsuga, in particular A. beshanzuensis, B. firm
  • B. toleracea C. sinensis, L. decidua, L. gmelinii, L. birithiana, L. himalaica, L. kaempferi, L. laricina, L. mastersiana, L. occidentalis, L. potaninii, L. sibirica, L. speciosa, P. acutifolius, P. coccineus, P. armandii P. banksiana, P. pinaster, P. balsamifera, P. tomentosa, P. tremuloides,
  • fungus such as Aspergillus, Neurospora, Yarrowia, Mycosphaerella, in particular A. flavus,
  • bacterium such as Mycobacterium, Neisseria, Streptomyces, Rhodobacter, in particular M. bovis, M. leprae, M. tuberculosis, N. meningitidis, S. coelicolor, R. capsulatus or from a nematode such as Ancylostoma, Caenorhabditis, Haemonchus, Lumbricus,
  • contortus L. rubellus, M. hapla, S. rattii, S. stercoralis, P. pacificus, most preferably one encoded by the At4CI1 gene from Arabidopsis thaliana; in the case of the enzyme E 5 , a stilbene synthase, preferably a resveratrol synthase (EC: 2.3.1.95),
  • plants such as Arachis, Rheum, Vitus, Pinus, Pirent, Lilium, Eucalyptus, Parthenocissus, Cissus, Calochortus, Polygonum, Gnetum, Artocarpus, Nothofagus, Phoenix, Festuca, Carex, Veratrum, Bauhinia, Pterolobiumm, in particular A. glabatra, A Hypogaea, R. tataricum, V. labrusca, V. riparaia, V. vinifera,
  • the cell according to the invention may increase further enzyme activities, as described in the already mentioned documents WO-A-2006/089898 and WO-A-2005/084305, for example those of a malonate transporter protein.
  • Carbon source and or precursor molecules of resveratrol such as coumaric acid and / or cinnamic acid resveratrol to form and optionally
  • Suitable carbon sources for process step I) are, for example, sugars, hexoses,
  • Pentoses disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, triglycerides, glycerol, fatty acids, alkanes, methane, methanol, ethanol, alcohols, carbon dioxide, carbon monoxide, Lactate, pyruvate, acetate, propionate, butyrate or organic acids as well as synthesis gas and off-gases.
  • Cultivation in process step II) comprises both the anaerobic and the aerobic
  • the cells may be in growth under these conditions (existing cell division), but it is also possible to use so-called “resting cells”, which are reduced or inhibited in growth, for example by limiting a substance in the nutrient medium ) a cultivation in two steps IIa) and IIb), which is characterized in that in the first step IIa) cells according to the invention are attracted to high cell densities, without the activity of Enyzms E- ⁇ is reduced and in the second step IIb) the Reduction of the activity of the enzyme E- ⁇ is induced.
  • high cell density in this context is meant a cell density which corresponds to between 5 and 200 g, preferably between 10 and 200, particularly preferably between 10 and 100 g of cell dry matter per liter of total culture.
  • this method additionally includes the process step III) isolation of the resveratrol formed.
  • step III) of the method according to the invention the cell formed by the
  • Resveratrol optionally be isolated from the cells and / or the nutrient medium, wherein for isolation all methods known to those skilled in the isolation of low molecular weight substances from complex compositions into consideration.
  • the precipitation by means of suitable solvents the extraction by means of suitable
  • Solvent for example by means of cyclodextrins or cyclodextrin derivatives, the crystallization, the purification or isolation by means of chromatographic methods or the conversion of the Resveratrols formed in easily separable derivatives called.
  • a preferred method for isolating the resveratrol is a rinsectktraction with water from an organic solvent with which first the resveratrol from the Culture medium was extracted; this process is described in detail in DE102009054984.
  • the resveratrol after extraction with an organic solvent such as ethyl acetate, can also be isolated by common methods such as evaporation crystallization.
  • Solubility limit in the medium thereby crystallizing the resveratrol in the medium and can be separated by conventional separation methods. This is described in the patent application WO2009 / 016108.
  • a preferred method step III) comprises steps A) extracting the resveratrol from the cells and / or the nutrient medium with at least one water-immiscible solvent, B) contacting the at least one water-immiscible solvent with a aqueous phase,
  • the solvent is preferably an organic solvent, in particular selected from the group consisting of methyl isobutyl ketone, 3-pentanone, ethyl butyrate, myristyl alcohol polypropoxylate, diethyl adipate, octyl acetate, ethyl acetate, 2-heptanone, 1-octanol, tritolyl phosphate, triacetin, oleyl alcohol, nonanol, Dodecane, dibutyl adipate,
  • Phase preferably contains at least 50 wt .-% water, based on the total weight of the aqueous phase; Preferably, it has a pH of greater than 7.
  • the aqueous phase preferably contains alkali metal and / or alkaline earth metal hydroxides in a concentration of 0.1 mol / L to 20 mol / L, based on the total aqueous phase.
  • the separation of the aqueous phase by the use of separators, centrifuges, decanters and separators. More preferably, in step D) the isolation of the stilbenoid is carried out by evaporation of the solution surrounding the stilbenoid.
  • process step D) comprises a step in which the pH of the aqueous phase is adjusted to less than 7, wherein preferably in process step D) the temperature of the aqueous phase is lowered, based on the temperature at the beginning of process step III).
  • process step D comprises a step in which the pH of the aqueous phase is adjusted to less than 7, wherein preferably in process step D) the temperature of the aqueous phase is lowered, based on the temperature at the beginning of process step III).
  • Embodiments should be limited.
  • FIG. 1 Resveratrol production of E. coli JP111-1 and L48-pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 at 30 ° C. and 37 ° C.
  • Figure 3 Resveratrol production and OD 600 of £. coli JP1 1 1 1 -pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 at 30 ° C and 37 ° C.
  • Figure 4 Resveratrol production and OD 600 of E. coli L48-pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 at 30 ° C and 37 ° C.
  • FIG. 5 Resveratrol production and OD 600 of E. coli BW27784-pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 (reference) at 30 ° C. and 37 ° C.
  • FIG. 6 % increase of resveratrol per OD with a temperature increase from 30 ° C. to 37 ° C. Examples:
  • Example 1 Cloning of a vector for expressing the Coumaryl-CoA ligase and the stilbene synthase-encoding genes in Escherichia coli
  • the lac promoter containing the LacI operator was replaced in the commercially available vector pUC19 (New England Biolabs, Schwalbach) by recloning a synthetic fragment of the lac promoter without operator, based on Watts et al., Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli "(BMC
  • the vector pUC19 (2686 bp) was cut with Pvull and Ndel according to the manufacturer's instructions (New England Biolabs, Schwalbach).
  • the synthetic fragment of the lac promoter without operator (SEQ ID NO: 1) was cut the modified lac promoter in the same manner, and the resulting fragment (212bp; SEQ ID NO: 1) after purification on an agarose gel using QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) with the remaining, equally purified
  • the vector pUCmodll was cut in the next step with Xbal and Notl. Starting from the genomic DNA was determined by PCR using Phusion DNA Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) and the oligonucleotides VvSTScod-Xba1-fw, SEQ ID NO: 2
  • the Arabidopsis thaliana Coumaryl CoA ligase At4CI1 gene was obtained from Arabidopsis thaliana cDNA (United States Biological, Swampscott, USA) by PCR and the oligonucleotides
  • the resulting PCR product (SEQ ID NO: 7) was purified on an agarose gel and cut with NotI. The resulting 1708 bp fragment was ligated with the similarly cut vector pUCmod-VvSTS after its dephosphorylation with CIP (New England Biolabs, Schwalbach) according to the manufacturer's instructions, resulting in the vector pUCmod-VvSTS-At4CI1 (5333bp). The orientation of the insert was chosen so that VvSTS and At4CI1 are transcribed and translated in the same direction.
  • the promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was purified by colony PCR with Escherichia coli DH5a cells (New England Biolabs), Phusion DNA
  • the genes fab 1392 (ts) and fabD89 (ts) encode a temperature-sensitive enoyl [acyl carrier protein] reductase (enoyl-ACP reductase) or malonyl-CoA-ACP transacylase. Temperatures> 30 ° C it comes to inactivation of these enzymes,
  • the production of electrochemically and / or chemically competent E. coli JP1 11 / L48 cells and their transformation with pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 were carried out in a manner known to the person skilled in the art.
  • modified M9 medium M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer, base medium M9: 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l
  • Example 3 Quantification of resveratrol and 4-hydroxycinnamic acid in the cell suspension
  • Trifluoroacetic acid per liter (eluent A) and water (eluent B), mixed in a mixing ratio of 48:52 (A: B), eluted at a flow rate of 1 .0 ml / min and a column temperature of 25 ° C.
  • Resveratrol as well as 4-hydroxycinnamic acid became a reference by comparison with the residence time and the UVA / IS spectrum
  • Figure 6 shows the percentage increase in resveratrol production in the temperature-sensitive E. coli mutants.. coli L48 fabD (ts) and E. coli JP1 1 1 1 fabl (ts) at different

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, welche in der Lage ist, Resveratrol zu bilden, wobei die Zelle mindestens eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines Enzyms E1, welche an einem in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischen Stoffwechselweg beteiligt ist, aufweist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Resveratrol.

Description

Zelle und Verfahren zur Herstellung von Resveratrol
Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, welche in der Lage ist, Resveratrol zu bilden, wobei die Zelle mindestens eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines Enzyms E-i, welche an einem in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischen Stoffwechselweg beteiligt ist, aufweist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Resveratrol. Stand der Technik
Resveratrol (oder 3, 4, 5-Trihydroxystilben) ist ein pflanzlicher Sekundarmetabolit, der aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften und biologischen Wirksamkeit als Inhaltsstoff für kosmetische Formulierungen und Nahrungsergänzungsmittel von erheblichem kommerziellem Interesse ist.
Resveratrol ist ein Phytophenol aus der Gruppe der Stilben Phytoalexine, die einen aktiven Abwehrmechanismus in Pflanzen als Reaktion auf Infektionen oder andere Stress-Ereignisse darstellen. Stilben Phytoalexine haben das Skelett der Stilbenderivate (trans-1 , 2- Diphenylethylen) als gemeinsame Grundstruktur; dieses kann durch Substitution mit anderen Gruppen ergänzt werden (Hart, J. H. (1981 ) Annu. Rev. Phytopathology 19, 437-458 und Hart, J. H., Shrimpton, D. M. (1979) Phytopathology 69, 1 138-1 143).
Stilbene wurden in bestimmten Bäumen (Bedeckt- und Nacktsamer), aber auch in einigen Kräutern (in Arten der Myrtaceae, Vitaceae und Leguminosae Familien) nachgewiesen.
Stilbene sind giftig für Schädlinge, vor allem für Pilze, Bakterien und Insekten. Nur wenige Pflanzen sind allerdings in der Lage Stilbene in Konzentrationen zu synthetisieren, die ihnen ausreichend Resistenz gegen Schädlinge verleihen.
Dennoch wird Resveratrol aktuell ausschließlich durch extraktive Verfahren aus Pflanzen gewonnen, vor allem aus Polygonum cuspidatum und Vitis vinifera.
Nachteil der extraktiven Verfahren ist die geringe Ausbeute bei hohen Lösungsmittel- und Pflanzenmengen. Alternative Herstellverfahren für Resveratrol wurden sowohl in Form von chemischen
Synthesen (z. B. US6552213, WO2005023740, US7235324) als auch von biotechnologischen Verfahren in Mikroorganismen entwickelt (WO06089898, WO06124999). Die in biochemischen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen sind meist rekombinante, da der Biosyntheseweg hin zum Resveratrol lediglich wie oben bereits erwähnt in einigen Pflanzen realisiert ist und dieser Stoffwechselweg in Mikroorganismen übertragen werden muss.
Resveratrol wird a.) durch drei oder b.) vier Enzyme synthetisiert. Für die Enzymkombination a.) findet die Resveratrol-Synthese aus den Metaboliten Tyrosin und Malonyl-Coenzym A (Malonyl- CoA), die in allen Mikroorganismen vorkommen, statt. Die drei Enzyme sind i) die Tyrosin- Ammonium-Lyase (TAL), die Tyrosin durch Deaminierung in 4-Coumarsäure umwandelt, ii) die 4-Coumaryl-CoA-Ligase, die die Aktivierung der Coumarsaure zum 4-Coumaryl-CoA katalysiert, und schließlich, iii) die Stilben-Synthase (Resveratrol-Synthase, EC:2.3.1.95), die in drei Schritten drei Moleküle Malonyl-CoA mit einem Molekül 4-Coumaryl-CoA zum Resveratrol kondensiert. Für die Enzymkombination b.) findet die Resveratrol-Synthese durch vier Enzyme aus den Metaboliten Phenylalanin und Malonyl-CoA, die in allen Mikroorganismen vorkommen, synthetisiert. Die vier Enzyme sind i) die Phenylalanin-Ammonium-Lyase (EC:4.3.1 .5) (PAL), die Phenylalanin durch Deaminierung in trans-Zimtsäure umwandelt, ii) die Cinnamat-4- Hydroxylase (EC:1 .14.13.1 1 ), welche die Hydroxylierung von trans-Cinnamat zu 4-Coumarat katalysiert iii) die 4-Coumaryl-CoA-Ligase, die die Aktivierung der Coumarsaure zum 4- Coumaryl-CoA katalysiert, und schließlich, iii) die Stilben-Synthase (Resveratrol-Synthase, EC:2.3.1 .95), die in drei Schritten drei Moleküle Malonyl-CoA mit einem Molekül 4-Coumaryl- CoA zum Resveratrol kondensiert.
Wird Coumarsaure als Vorläufermolekül gefüttert, kann man auch nur unter Verwendung der letzten beiden Enzyme, 4-Coumaryl-CoA-Ligase und Stilben-Synthase, Resveratrol auf biotechnologischem Wege herstellen.
Eine funktionelle Expression von zwei der genannten Enzyme (4-Coumaryl-CoA-Ligase und Stilben-Synthase) bzw. des gesamten Stoffwechselweg wurde sowohl in Bakterien (Beekwilder et al., 2006; Watts et al., 2006, Katsuyama et al., 2007, WO05084305) als auch Hefen (Becker et al., 2003; Beekwilder et al., 2006, WO06089898) bereits gezeigt. Es konnte Resveratrol entweder aus dem Vorläufermolekül Coumarsäure und Glukose (als Kohlenstoff- und
Energiequelle für die Herstellung von Malonyl-CoA als zweitem Vorläufermolekül) oder auch ausschließlich aus Glukose hergestellt werden. WO06124999 beschreibt ein Verfahren, um die intrazelluläre Verfügbarkeit von Malonyl-CoA zu erhöhen, wobei eine Acetyl-CoA-Carboxylase (Synthese von Malonyl-CoA durch
Carboxylierung von Acetyl-CoA) oder eine Malonyl-CoA-Synthetase (Synthese von Malonyl- CoA aus Malonat und CoA) rekombinant exprimiert wird. Zusätzlich zu der Malonyl-CoA- Synthetase soll zur verbesserten Aufnahme von Malonat (Substrat der Malonyl-CoA- Synthetase) ein Malonat-Transporter coexprimiert werden, der den Transport von
extrazellulärem Malonat über die Plasmamembran in die Zelle vorantreibt. Dieser Ansatz hat den großen Nachteil, dass heterologe Expression von komplexen Enzymsystemen wie der Acetyl-CoA-Carboxylase und der Kombination aus Malonat-Transporter und Malonyl-CoA- Synthetase nicht trivial ist.
Die Acetyl-CoA-Carboxylase aus E. coli und anderen Gram-negativen Bakterien ist ein
Heterotetramer und die Stöchiometrie der Untereinheiten ist sowohl für die Aktivität als auch für das Wachstum des Expressions- bzw. Produktionswirtes sehr wichtig. Zusätzliche Last für die Zelle entsteht durch heterologe rekombinante Proteinexpression.
In Bezug auf die Kombination aus Malonat-Transporter und Malonyl-CoA-Synthetase ist insbesondere die Expression und Funktionalität des Malonat-Transporters problematisch, da es sich um ein Transmembranprotein handelt, sowie die auch hier vorhandene zusätzliche Last durch die heterologe rekombinante Proteinexpression.
Nachteil aller oben beschriebenen biotechnologischen Verfahren ist, dass trotz massiver Überproduktion der Resveratrol synthetisierenden Enzyme und weiterer Hilfsenzyme das Produkt lediglich in einer Konzentration von 100 mg/l bezogen auf die Kulturbrühe erreicht werden konnten. Dies ist sehr weit von Konzentrationen entfernt, die eine biotechnologische Herstellung sinnvoll machen.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, welches mindestens einen der beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwindet. Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebenen Zellen gemäß Anspruch 1 die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe lösen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Zellen wie in Anspruch 1 beschrieben, ein Verfahren zur Herstellung von Resveratrol unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen sowie das mit den erfindungsgemäßen Zellen bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Resveratrol. Vorteil der erfindungsgemäßen Zellen ist eine wesentlich vereinfachte Handhabung, da keine zusätzlichen Enzyme, die Malonyl-CoA synthetisieren im Produktionsstamm dargestellt werden müssen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren muss anders als bei zusätzlich eingebrachten Genen kein Selektionsdruck auf die Kultur ausgeübt werden.
Ein weiterer Vorteil bestimmter Ausführungsformen erfindungemäßer Zellen bzw. Verfahren ist es, dass der gewünschte Effekt induziert werden kann; so etwa im Falle des Einsatzes von spezifischen Inhibitoren.
Noch ein weiterer Vorteil bestimmter Ausführungsformen erfindungemäßer Zellen bzw.
Verfahren ist es, dass der gewünschte Effekt sowohl induziert als auch wieder abgestellt werden kann und somit komplett zeitlich zu steuern ist; so etwa im Falle des Einsatzes von Stämmen, die temperatursensitive Malonyl-CoA als Substrat akzeptierende Enzyme aufweisen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zelle, welche Resveratrol zu bilden vermag, wobei die Zelle mindestens eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines Enzyms E-i, welches an einem in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischen Stoffwechselweg beteiligt ist, aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Resveratrol.
Unter der verwendeten Formulierung„Resveratrol" wird nicht nur die Verbindung cis-/trans-3, 4, 5-Trihydroxystilben verstanden, sondern auch Oligomere von Resveratrol wie trans-s-Viniferin, Gnetin H, Suffructicosol B, Upunaphenol B/C/D/E, bzw. glykosylierte Formen wie
Piceid/Polydatin, Resveratrol basierte Prodrugs (z.B. RT-A) bzw. Mischungen derselben verstanden. Unter der verwendeten Formulierung„verminderte Aktivität eines Enzyms" wird vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1 , darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01 , darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte oder ungerichtete Mutation, durch Zugabe von kompetitiven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Synthese eines bestimmten Enzyms erfolgen. Unter der verwendeten Formulierung„ein in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischer Stoffwechselweg" werden die in einer Zelle natürlich vorkommenden Stoffwechselwege verstanden, die Malonyl-CoA benötigen, um abzulaufen, und dieses dabei verbrauchen. Als Beispiel sei an dieser Stelle die Fettsäurebiosynthese genannt.
In diesem Zusammenahn wird unter dem Begriff„direkt cataplerotisch" verstanden, dass ein Enzym unmittelbar Malonyl-CoA umsetzt, wohin gehend unter dem Begriff„indirekt
cataplerotisch" ein Enzym verstanden wird, welches in dem in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischen Stoffwechselweg beteiligt ist, aber nicht direkt Malonyl-CoA sondern seine Folgeprodukte umsetzt. Unter der verwendeten Formulierung„Aktivität eines Enzyms, welche an einem
Stoffwechselweges beteiligt ist" wird eine Enzymaktivität verstanden, die einen direkten Einfluss auf die Entstehung und/oder Entstehungsgeschwindigkeit des Stoffwechselweg Produktes besitzt. „CoA" wird im Folgenden synonym für„Coenzym A" verwendet.
„ACP" wird im Folgenden synonym für„Acyl Carrier Protein" verwendet.
Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Zelle ist dadurch gekennzeichnet, dass sie derart gentechnisch verändert wurde, dass sie mindestens eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines Enzyms E-ι aufweist.
Eine erfindungsgemäß bevorzugte Zelle weist eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität mindestens eines der Enzym E-ι auf, welches ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus: ein Enzym E1a, welches die Umsetzung
von Malonyl-CoA zu Malonsäure-Semialdehyd katalysiert;
ein Enzym E1b, welches die Umsetzung
von Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA katalysiert;
ein Enzym E1c, welches die Umsetzung
von holo-[ACP] + Malonyl-CoA zu Malonyl-[ACP] + Coenzym A katalysiert;
ein Enzym E1d, welches Polyketidsynthase-Aktivität aufweist; (Polyketidsynthasen (PKS) produzieren Sekundärmetabolite und sind im Genom von einer Vielzahl von Organismen, wie z.B. Bakterien, Pilze, marine Organismen und Pflanzen zu finden. Polyketisynthasen sind in 3 Klassen eingeteilt: Typ I, II und III. Typ I PKSs sind große Multidomänenenzyme, Typ II PKSs besitzen viele Einzelfunktionsuntereinheiten, und Typ III PKSs bestehen aus lediglich einem Protein, meistens als Homodimer angeordnet. Als Substrat dienen sowohl Acetyl-CoA und Malonyl-CoA);
ein Enzym E1e,welches die Umsetzung
von Acetyl-CoA + Malonyl-[ACP] zu Acetoacetyl-[ACP] und/oder
von holo-[ACP] + Acetyl-CoA zu Acetyl-[ACP] katalysiert;
ein Enzym E1f, welches die Umsetzung
von irans-A3-c/'s-A5-Dodecenoyl-[ACP] zu c/'s-A5-Dodecenoyl-[ACP] und/oder
von 2,3,4-gesättigtes acyl-[ACP] zu irans-A2-enoyl-acyl-[ACP] katalysiert;
ein Enzym E1g, welches die Umsetzung
von Octanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Decanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder von Decanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Dodecanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder von Dodecanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Meristoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder von Myristoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Palmitoyl-[ACP] + holo-[ACP]_und/oder von Butyryl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Hexanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder von Hexanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Octanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder von c/'s-A3-Decenoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu ß-keto-c/'s-A5-Dodecenoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] + Acetyl-[ACP] zu holo-[ACP] + Acetoacetyl-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] + 2,3,4-gesättigtes acyl-[ACP] zu holo-[ACP] + ß-Ketoacyl-[ACP] und/oder von Malonyl-[ACP] zu Acetyl-[ACP] katalysiert und/oder von Palmitoleoyl-[ACP] + Malonyl- [ACP] zu 3-oxo-c/'s-Vaccenoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] + Acetyl-[ACP] zu holo-[ACP] + Acetoacetyl-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] + 2,3,4-gesättigtes acyl-[ACP] zu holo-[ACP] + ß-Ketoacyl-[ACP] katalysiert; ein Enzym E1h, welches die Umsetzung
von ß-keto-c/s-A5-dodecenoyl-[ACP] zu ß-hydroxy eis A5-dodecenoyl-[ACP] und/oder von (3R)-3-hydroxyacyl-[ACP] zu ß-ketoacyl-[ACP] katalysiert;
ein Enzym E-n, welches die Umsetzung
von ß-hydroxy eis A5-dodecenoyl-[ACP] zu irans-A3-c/s-A5-dodecenoyl-[ACP] und/oder von (R)-3-hydroxydecanoyl-[ACP] zu irans-A2-Decenoyl-[ACP] und/oder
von (3R)-3-hydroxyacyl-[ACP] zu irans-A2-enoyl-acyl-[ACP] und/oder
von irans-A2-Decenoyl-[ACP] zu c/s-A3-Decenoyl-[ACP] katalysiert;
ein Enzym E-ij, welches die Umsetzung von
apo-[ACP] zu Adenosin-3',5'-Bisphosphat + holo-[ACP] katalysiert;
ein Enzym E1k, welches eine Fettsäure-Synthase-Aktivität aufweist;
ein Enzym En, welches die Umsetzung
von Pantothenat + ATP zu D-4'-Phosphopantothenat + ADP katalysiert;
ein Enzym E1m, welches die Umsetzung von
4'-Phosphopantethein + ATP zu Dephospho-CoA + Diphosphat katalysiert;
ein Enzym E1n, welches die Umsetzung von
Dephospho-CoA + ATP zu Coenzym A + ADP katalysiert und
ein Enzym E1o, welches die Umsetzung von
D-4'-Phosphopantothenat + L-Cystein + CTP zu Diphosphat + CMP + R-4'- Phosphopantothenoyl-L-Cystein und/oder
R-4'-Phosphopantothenoyl-L-Cystein zu 4'-Phosphopantethein katalysiert. In diesem Zusammenhang besonders bevorzugt sind Zellen, in denen die Aktivität der vorgenannten Enzyme in folgender Kombinationen vermindert ist:
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
insbesondere
Figure imgf000009_0003
und ganz besonders bevorzugt
Figure imgf000009_0004
In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass das Enzym
E1a eine Malonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC:1.2.1.15 oder EC:1.2.1.18), darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus L. casei, P. aeruginosa, P. fluorescens und C. aurantiacus,
Eib eine Malonyl-CoA-Decarboxylase (EC:4.1.1.9) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus P. fluorescens, P. putida, Rhizobium leguminosarum und S. cerevisiae, Eic eine [Acyl-Carrier-Protein]-S-Malonyltransferase (EC:2.3.1.39) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus E. coli (FabD), M. tuberculosis (FabD2), H.pylori, P. aeruginosa ,
Eis eine [Acyl-Camer-ProteinJ-S-Acetyltransferase (EC:2.3.1.38) oder eine [Myelin- Proteolipid]-0-Palmitoyltransferase (EC:2.3.1.100) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus E. coli (FabH), E. gracilis und S. oleracea,
Eif eine Enoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Reduktase (EC:1.3.1.9) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus E. coli (Fabl), M. tuberculosis, B. anthracis, S. aureus, S. pneumoniae, H. pylori, A. thaliana, E. tenella und B. subtilis, E1g eine beta-Ketoacyl-Acyl-Carrier-Protein-Synthase I oder II (EC:2.3.1.41/179) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £ coli (FabB/F), S. aureus, S. oleracea, L. lactis, S. pneumoniae, M. tuberculosis und A. thaliana,
E1h eine 3-Oxoacyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Reduktase (EC:1 .1 .1.100) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £. coli (FabG), P. putida, M. tuberculosis, P. aeruginosa, S. pneumoniae und L. lactis,
E-ii eine 3-Hydroxydecanoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Dehydratase oder 3-Hydroxyoctanoyl- [Acyl-Carrier-Protein]-Dehydratase (EC:4.2.1.60 oder EC:4.2.1.59) oder eine Crotonoyl-[Acyl- Carrier-Protein]-Hydratase (EC:4.2.1.58) oder eine trans-2-Decenoyl-[Acyl-Carrier-Protein]- Isomerase (EC:5.3.3.14) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £ coli (FabA/Z),
E-ij eine holo-[Acyl-Carrier-Protein]-Synthase (EC:2.7.8.7) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £ coli (AcpS), B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, und S.
cerevisiae,
E1k eine Fettsäure-Synthase bzw. Fettsäure-Acyl-CoA-Synthase (EC:2.3.1.85 oder EC:2.3.1 .86) darstellt,
En eine Pantothenate Kinase (EC:2.7.1.33) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus E. coli (CoaA), S. aureus, B. anthracis, B. subtilis, M. tuberculosis, P. aeruginosa, S. oleracea, H. pylori und A. thaliana,
E1m eine Pantethein-Phosphat-Adenylyltransferase (EC:2.7.7.3) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £ coli (CoaD), T. thermophilus, M. tuberculosis, H. pylori und A. thaliana,
E1n eine Dephospho-CoA-Kinase (EC:2.7.1.24) darstellt, beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £ coli (CoaE) und T. thermophilus, und
E10 eine Phosphopantothenoylcystein-Decarboxylase (EC:4.1 .1.36), beispielsweise bekannt und gut charakterisiert ist aus £ coli (CoaBC), M. tuberculosis und A. thaliana, oder eine
Phosphopantothenoylcystein-Ligase (6.3.2.5) darstellt.
Der Begriff„EC:" steht hier für die Enzyme Commission Nummer laut der systematischen Nomenklatur der Enzymkommission der International Union of Biochemistry (IUB) und benennt somit die Zugehörigkeit betreffendes Enzyms zu der entsprechenden Enzym-Klasse. Es ist für den Fachmann mit obigen Angaben und heutigem Wissen, insbesondere in Hinblick auf Bioinformatik, ein Einfaches, das Gen kodierend für ein betrachtetes Enzym in der zu manipulierenden Zelle zu identifizieren und seine Aktivität mit unten beschriebenen
gentechnischen Methoden zu vermindern
Bevorzugte Zellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mikroorganismen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus,
Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium, wobei Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Ralstonia eutropha H16, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris und Pichia ciferrii besonders bevorzugt sind, insbesondere E. coli.
Da zur Synthese von Resveratrol ebenfalls Malonyl-CoA als Substrat akzeptierende Enzyme benötigt werden, sollte deren Aktivität möglichst in den erfindungsgemäßen Zellen nur gering, bevorzugt gar nicht vermindert sein; daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass ein Enzym, welches die Umsetzung von 4-Coumaryl-Coenzym A zu Resveratrol katalysiert und im
Folgenden auch als Enzym E5 beschrieben wird, als Enzym E-ι ausgenommen ist.
Dies ist beispielsweise dann relevant, wenn Inhibitoren eingesetzt werden, die hochspezifisch eines oder mehrere der Enzyme E1a bis E1o inhibieren, aber dennoch eine unerwünschte leichte inhibitorische Nebenwirkung auf die Aktivität eines Enzyms E5 ausüben.
Zur Verminderung der Aktivität eines Enzyms E-ι kommen sämtliche dem Fachmann bekannten Inhibitoren in Betracht, die Enzyme inhibieren, welche an einem in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischen Stoffwechselweg beteiligt sind.
Beispielhafte Vertreter für geeignete Inhibitoren und die damit zu vermindernden
Enzymaktivitäten sind beispielsweise Zhang et. al. (2006) Inhibiting bacterial fatty acid synthesis
JBC 281 (26) pp. 17541 -17544, Wright, H. T, and Reynolds, K. A. Antibacterial targets in fatty acid biosynthesis Current Op. Microbiol., 10, 447-453, 2007 und der unten stehenden Tabelle zu entnehmen.
Figure imgf000012_0001
Ebenso sind die in der folgenden Tabelle gelistete Inhibitoren geeignet, welche ausführlich in Georgopapadakou et al. (1986) Effect of Antifungal Agents on Lipid Biosynthesis and
Membrane Integrity in Candida albicans ACC 31 (1 ) pp. 46-51 ) beschrieben werden.
Figure imgf000013_0001
Ein weitere geeigneter Inhibitoren ist beispielsweise für FabD das 3-HMG-CoA, dessen Einsatz in Kizer et. al. (2008) Application of functional genomics to pathway optimisation for increased isoprenoid production Applied and Environmental Microbiology 74(10) pp.3229-3241 ausführlich beschrieben wird.
Zur Verminderung der Aktivität eines Enzyms E-ι durch gentechnische Manipulation kommen gezielte Mutationen, beispielsweise gerichtete knockouts in Frage, bei denen beispielsweise Promotor aktive Sequenzen des Zielgens, aktive (zur katalytischen Funktion des Enzyms notwendige) Bereiche des Zielgens oder das gesamte Zielgen deletiert, mit Fremd-DNA substituiert oder mit Fremd-DNA unterbrochen werden.
Des Weiteren sind dem Fachmann verschiedene Techniken des gene-silencing bekannt, die über antisense-Nukleinsäuren oder small-interfering RNA (siRNA) spezifisch die Transkription bzw. die Translation einzelner Gene vermindern oder gar ganz verhindern. Diese
Unterdrückung kann je nach gewähltem System transient erfolgen, induzierbar sein oder konstitutiv vorliegen.
Ebenso sind dem Fachmann Methoden bekannt, mit denen man gezielt einzelne
Punktmutationen im Zielgen setzen kann. Besonders bevorzugt sind Zellen, bei denen sich die Aktivität des Enzyms E-ι konditioniert vermindern lässt.
Insbesondere Zellen, bei denen sich die Aktivität des Enzyms E-ι über Temperaturänderungen konditioniert vermindern lässt, haben sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen.
Anleitungen zur Beeinflussung von Proteineigenschaften durch Temperaturänderungen findet der Fachmann in der im Folgenden angeführten Literatur, deren Lehre auf die Beeinflussung der Aktivität des Enzyms E-ι übertragen werden kann:
In Wintrode et al. (2000) Cold Adaptation of a mesophilic subtilisin-like protease by laboratory evolution, J.Bio.Chem. 275 (41 ), pp. 31635-31640) wurde mittels direkter Evolution die mesophile Serinprotease (SSM) aus Bacillus sphaericus in ihren psychrophilen Gegenspieler umgewandelt. Die Halbwertszeit der SSM bei 70 °C konnte dabei um das 3,3-fache verglichen zum Wildtyp erniedrigt werden.
In Merz et al. (2000) Improving the catalytic activity of a thermophilic enzyme at low
temperatures, Biochemistry 39, pp. 880-889 wurde das Gen trpC aus dem hyperthermophilen Organismus Sulfolobus solfataricus, welches für eine Indolglycerol Phosphat Synthase (IGPS) codiert, mittels DNA-Shuffling mutagenisiert. Es konnten so IGPS-Varianten erzeugt werden, die sich bei 37°C durch eine erhöhte katalytische Aktivität gegenüber dem parentalen Enzym auszeichneten.
In Lebbink et al. (2000) Improving low-temperature catalysis in the hyperthermostable
Pyrococcus furiosus ß-Glucosidase CelB by directed evolution, Biochemistry 39 pp. 3656-3665 konnte die Aktivität der thermostabilen ß-Glucosidase (CelB) aus dem hyperthermophilen Organismus Pyrococcus furiosus bei niedrigen Temperaturen um das 3-fache erhöht werden. In Reetz et al. (2008) Knowledge-guided laboratory evolution of protein thermolability,
Biotechnology & Bioengineering 102(6), pp. 1712-1717) wurde der sogenannte B-factor iterative test (B-FIT) zur Generierung thermostabiler Enzyme eingeführt.
Mittels B-FIT konnte in eine Erhöhung der Thermolabilität der Lipase aus Pseudomonas aeruginosa erreicht werden. Im Vergleich zum Wildtyp-Stamm konnte dadurch die
Thermostabilität der PAL von 71 ,6 °C auf 35,6 °C reduziert werden.
In Knobling et al. (1975) Temperature-Sensitive Mutants of the Yeast Fatty-Acid-Synthetase Complex Eur.J.Biochem.59 pp. 415-421 wurde mittels genetischer Komplementationsanalyse temperatur-sensitive Fettsäure-Synthetase Hefemutanten (fas1 (ts)-/fasll(ts)-Mutanten)erzeugt. Mit Hilfe dieser Mutanten wurde die Abhängigkeit des Zellwachstums von der Temperatur und der Supplementierung des Mediums mit Fettsäuren gezeigt. Alle getesteten Mutanten waren nicht mehr in der Lage auf Medium ohne Fettsäuresupplementierug bei nicht-permissiven Temperaturen (34-37°C) zu wachsen. Hingegen zeigten diese Mutanten in Anwesenheit von Fettsäuren eine identische Wachstumsrate wie die Hefewildtyp-Zellen (Saccharomyces cerevisiae,). Die Wildtypzellen wuchsen bei allen getesteten Temperaturen auch
fettsäureunabhägig. Es wurde beobachtet, dass das Wachstum der temperatur-sensitiven Mutanten in Fettsäure freiem Medium bei 5 bis 10 °C niedrigerer Temperatur im Vergleich zu den Wildtypzellen bzw. im Vergleich zum Wachstum auf mit Fettsäure supplementiertem Medium stoppt. Insgesamt lässt sich festhalten, dass bei allen getesteten Mutanten das
Wachstum auf Fettsäure freiem Medium bei 37 °C zum Erliegen kommt, wohingegen diese Temperatur auf mit Fettsäuren supplementiertem Medium keine Auswirkungen auf das
Wachstum der ts-Mutanten hatte. Untersuchungen mit dem isolierten Fettsäure-Synthetase Komplex (fas) ergaben, dass die fas-Aktivität bei nicht-permissiver Temperatur entweder vollständig verloren ging oder stark reduziert war.
In C. Rieck (2006) Genetische und biochemische Charakterisierung der Fettsäure-Elongase in der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Dissertation) wurde mittels EMS-Mutagenese eine fasll (ts) Mutante erzeugt, die auf Festmedium mit und ohne exogene Fettsäuren ausplattiert und bei 22°C bzw. 35°C angezogen wurde. Es zeigte sich, dass die fasll(ts) Mutatante bei niedriger (permissiver) Temperatur auf beiden Medien gleich gut wachsen konnte. Im Gegensatz dazu war die temperatursensitive fasll-Mutante bei nicht-permissiven Temperaturen (35°C) nicht mehr in der Lage sich auf Fettsäure freiem Medium zu vermehren. Auf Fettsäure-haltigem YEPES-Medium hingegen waren keine Einschränkungen im Wachstum der Mutante bei 35°C ersichtlich.
Erfindungsgemäß bevorzugte und bereits beschriebene Zellen, bei denen sich die Aktivität des Enzyms E-ι über Temperaturänderungen konditioniert vermindern lässt umfassen insbesondere: E. coli JP1 1 1 1 , enthaltend ein temperatursensitives FabI und beschrieben in Egan et al. (1973) Conditional mutations affecting the cell envelope of Escherichia coli K-12. Genet.Res. 21 :139- £ coli L48 und £. coli LA2-89, enthaltend temperatursensitive FabD und beschrieben in Härder et al. (1972) Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli requiring saturated and unsaturated fatty acids for growth: Isolation and properties. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:310, sowie in Semple et al. (1975) Mapping of the fabD locus for fatty acid biosynthesis in
Escherichia coli. J. Bacteriol. 121 (3):1036-46, sowie in Verwoert et al. (1994) Molecular characterization of an Escherichia coli mutant with a temperature-sensitive malonyl Coenzym A- acyl carrier protein transacylase. FEBS Letters, 348(3), 31 1 -16.;
£ coli DV62, £ coli DV79 und £ coli ts9, enthaltend temperatursensitive CoaA und
beschrieben in Flaks et al. (1966) Mutations and genetics concerned with the ribosomes. Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol. 31 :623-631 , sowie in Song et al. (1992) coaA and rts are allelic and located at kilobase 3532 on the Escherichia coli physical map. J. Bacteriol. 174:1705-1706, sowie in Vallari at al. (1987) Isolation and characterization of temperature-sensitive
pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 169:5795-5800, sowie in Vallari at al. (1988) Biosynthesis and degradation both contribute to the regulation of Coenzym A content in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:3961 -3966;
£ coli M5 enthaltend ein temperatursensitives FabB Broekman et al. (1974) Effect of the osmotic pressure of the growth medium on fabB mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol.
1 17(3):971 -7.);
£ coli M8, £ coli PAM155, £ coli CY53, £ coli CY55 und £ coli CY50, enthaltend
temperatursensitive FabA und beschrieben in Broekman et al. (1973) Growth in high osmotic medium of an unsaturated fatty acid auxotroph of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol.
1 16(1 ):285-9, sowie in Broekman et al. (1974) Effect of the osmotic pressure of the growth medium on fabB mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1 17(3):971 -7, sowie in Johnson et al. (1975) Mapping of sul, the suppressor of Ion in Escherichia coli. J. Bacteriol. 122(2):570-4, sowie in Cronan et al. (1972) Mapping of the fabA locus for unsaturated fatty acid biosynthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1 12:206-21 1 ) und
£ coli CL37, £ coli CL48 und £ coli CL104, enthaltend temperatursensitive FabG und beschrieben in Lai et al. (2004) Isolation and characterization of .beta.-ketoacyl-acyl carrier protein Reduktase (fabG) mutants of Escherichia coli and Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology, 186(6), 1869-1878. Es ist dem Fachmann ein Leichtes, die hier gelisteten themolabilen Enzyme in Form ihrer Gene zu isolieren und den zu Grunde liegenden Mechanismus anhand etwa der festgestellten Punktmutationen im Vergleich zum Wildtyp-Gen auf andere Zellen zu übertragen. Dies kann beispielsweise in der Form geschehen, dass das Wildtyp-Gen der zu verändernden Zelle durch das für das thermolabile Enzym kodierende Fremd-Gen ersetzt wird.
Da nur wenige natürlich vorkommende Zellen überhaupt in der Lage sind, Resveratrol zu bilden oder dies nur in geringem Umfang tun, ist es erfindungsgemäß bevorzugt, die Zelle derart gentechnisch zu modifizieren, dass sie überhaupt oder mehr Resveratrol bildet als in der Natur vorkommend. Daher ist eine erfindungsgemäß bevorzugte Zelle dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle derart gentechnisch veränderte ist, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp ohne die verminderte Aktivität eines Enzymes E-ι bereits mehr Resveratrol zu bilden vermag.
Die Formulierung„dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Resveratrol zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt kein Resveratrol, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen, zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser
Komponenten gebildet werden können.
Unter einem„Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren
Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Diese Zellen sind vorzugsweise gentechnisch derart verändert, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Resveratrol aus einer Kohlenstoffquelle bilden können Geeignete
Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker, Hexosen, Pentosen, Disaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, Fette, Triglyceride, Glycerin, Fettsäuren, Alkane, Methan, Methanol, Ethanol, Alkohole, Kohlendioxid, Kohlenmonoxid, Lactat, Pyruvat, Acetat, Propionat, Butyrat oder organischen Säuren sowie Synthesegas und Abgase.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2mal, besonders bevorzugt mindestens 10mal, darüber hinaus bevorzugt mindestens 100mal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens I .OOOmal und am meisten bevorzugt mindestens 10.000mal mehr Resveratrol bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (Resveratrol) im Nährmedium bestimmt wird.
In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme aufweist:
eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Tyrosin zu 4-Coumarat oder die Umsetzung von L-Phenylalanin zu trans-Cinnamat katalysiert;
eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von trans-Cinnamat zu 4-Coumarat katalysiert;
eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von 4-Coumarat zu 4-Coumaryl-Coenzym A katalysiert;
eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von 4-Coumaryl-Coenzym A zu Resveratrol katalysiert.
Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung„eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1 .000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms
Ex zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche„eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff
„Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des Enzyms Ex induziert wird.
In diesem Zusammenhang besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, in denen die Aktivität des folgenden Enzyms bzw. der folgenden Enzyme gesteigert ist: E2, E3, E4, E5, E2 + E4, E2 + E5, E4 + E5, E2 + E4 + E5, E3 + E4, E3 + E5, E3 + E4 + E5, E2 + E3 + E4 + E5, wobei E4 + E5 besonders bevorzugt ist.
Zellen, in denen die Aktivität eines oder mehrerer dieser Enzyme erhöht worden ist, sind beispielsweise in WO-A-2006/089898 und WO-A-2005/084305 beschrieben und stellen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zellen dar. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften hinsichtlich rekombinanter Mikroorganismen, in denen die Aktivität eines oder mehrere der Enzyme E2, E3, E4, E5 erhöht wird, wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich
bei dem Enzym E2 um eine Tyrosin-Ammonium-Lyase (EC:4.3.1.23), insbesondere aus Hefe oder Bakterien, insbesondere aus Rhodotorula rubra oder Rhodobacter capsulatus, oder um eine Phenylalanin-Ammonium-Lyase (EC:4.3.1.25), insbesondere aus Pflanzen wie
Arabidopsis, Brassica, Citrus, Phaseolus, Pinus, Populus, Solanum, Prunus, Vitus, Zea, Agastache, Ananas, Asparagus, Bromheadia, Bambusa, Beta, Betula, Cucumis, Camellia, Capsicum, Cassia, Catharanthus, Cicer, Citrullus, Coffea, Cucurbita, Cynodon, Daucus, Dendrobium, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Lotus, Lycopersicon, Medicago, Malus, Manihot, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Olea, Oryza, Pisum, Persea, Petroselinum,
Phalaenopsis, Phyllostachys, Physcomitrella, Picea, Pyrus, Quercus, Raphanus, Rehmannia, Rubus, Sorghum, Sphenostylis, Stellaria, Stylosanthes, Triticum, Trifolium, Triticum, Vaccinium, Vigna, Zinnia, insbesondere aus
A. thaliana, B. napus, B. rapa, C. reticulata, C. clementinus, C. limon, P. coccineus, P. vulgaris, P. banksiana, P. monticola, P. pinaster, P. sylvestris, P. taeda, P. balsamifera, P. deltoides, P.
Canadensis, P. kitakamiensis, P. tremuloides, S. tuberosum, P. avium, P. persica, Vitus vinifera, Z. mays oder aus Pilzen wie Agaricus, Aspergillus, Ustilago, insebsondere A bisporus, A. oryzae, A. nidulans, A. fumigatus, U. maydis,
oder aus Bakterien wie Rhodobacter, , insbesondere R. capsulatus,
oder aus Hefe wie Rhodotorula, insbesondere R. rubra.
handelt; bei dem Enzym E3 um eine Cinnamat-4-Hydroxylase (EC:1 .14.13.1 1 ) insbesondere aus Pflanzen wie Arabidopsis, Citrus, Phaseolus, Pinus, Populus, Solanum, Vitus, Zea, Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Glycine, Helianthus, Lotus,
Mesembryanthemum, Physcomitrella, Ruta, Saccharum, Vigna, insbesondere aus A. thaliana, C. sinensis, C. paradisi, P. vulgaris, P. taeda, P. deltoides, P. tremuloides, P. trichocarpa, S. tuberosum, Vitus vinifera, Z. mays,
oder aus Pilzen wie Aspergillus, insbesondere A. oryzae
handelt; bei dem Enzym E4 um eine 4-Coumarat-CoA-Ligase (EC:6.2.1.12), insbesondere aus Pflanzen wie Abies, Arabidopsis, Brassica, Citrus, Larix, Phaseolus, Pinus, Populus, Solanum, Vitus, Zea, Agastache, Amorpha, Cathaya r Cedrus, Crocus, Festuca, Glycine, Juglans, Keteleeria, Lithospermum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nothotsuga, Oryza, Pelargonium, Petroselinum, Physcomitrella, Picea, Prunus, Pseudolarix, Pseudotsuga, Rosa, Rubus, Ryza, Saccharum, Suaeda, Thellungiella, Triticum, Tsuga, insbesondere A. beshanzuensis, B. firma, B. holophylla, A. thaliana, B. napus, B. rapa,
B.oleracea, C. sinensis, L. decidua, L. gmelinii, L. griffithiana, L. himalaica, L. kaempferi, L. laricina, L. mastersiana, L. occidentalis, L. potaninii, L. sibirica, L. speciosa, P. acutifolius, P. coccineus, P. armandii P. banksiana, P. pinaster, P. balsamifera, P. tomentosa, P. tremuloides,
S. tuberosum, Vitus vinifera oder
aus einem Pilz wie Aspergillus, Neurospora, Yarrowia, Mycosphaerella, insbesondere A. flavus,
A. nidulans, A. oryzae, A. fumigatus, N. crassa, Y. lipolytics, M. graminicola,
aus einem Bakterium wie Mycobacterium, Neisseria, Streptomyces, Rhodobacter, insbesondere M. bovis, M. leprae, M. tuberculosis, N. meningitidis, S. coelicolor, R. capsulatus oder aus einem Nematoden wie Ancylostoma, Caenorhabditis, Haemonchus, Lumbricus,
Meilodogyne, Strongyloidus, Pristionchus, insbesondere A. ceylanicum, C. elegans, H.
contortus, L. rubellus, M. hapla, S. rattii, S. stercoralis, P. pacificus, besonders bevorzugt eine kodiert durch das Gen At4CI1 aus Arabidopsis thaliana handelt; bei dem Enzym E5 um eine Stilben-Synthase, vorzugsweise eine Resveratrol-Synthase (EC:2.3.1.95),
insbesondere aus Pflanzen wie Arachis, Rheum, Vitus, Pinus, Piceea, Lilium, Eucalyptus, Parthenocissus, Cissus, Calochortus, Polygonum, Gnetum, Artocarpus, Nothofagus, Phoenix, Festuca, Carex, Veratrum, Bauhinia, Pterolobiumm, insbesondere A. glabatra, A. hypogaea, R. tataricum, V. labrusca, V. riparaia, V. vinifera,
ganz besonders bevorzugt um eine kodiert durch das Gen VvSTS von Vinis vinifera handelt.
Es kann für erfindungsgemäße Zelle von Vorteil sein, weitere Enzymaktivitäten zu erhöhen, wie es in den bereits angeführten Dokumenten WO-A-2006/089898 und WO-A-2005/084305 beschrieben wurde, beispielsweise die eines Malonat Transporterproteins.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Resveratrol, umfassend die Verfahrensschritte:
I) In Kontakt Bringen der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Zelle mit einem
Nährmedium beinhaltend mindestens eine Kohlenstoffquelle
II) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, aus der
Kohlenstoffquelle und oder Vorläufermolekülen von Resveratrol wie Coumarsäure und/oder Zimtsäure Resveratrol zu bilden und gegebenenfalls
III) Isolierung des gebildeten Resveratrols.
Es ist offenbar, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt die Zellen eingesetzt werden, die den bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zellen entsprechen. Für Verfahrensschritt I) geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker, Hexosen,
Pentosen, Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Fette, Triglyceride, Glycerin, Fettsäuren, Alkane, Methan, Methanol, Ethanol, Alkohole, Kohlendioxid, Kohlenmonoxid, Lactat, Pyruvat, Acetat, Propionat, Butyrat oder organischen Säuren sowie Synthesegas und Abgase.
Kultivierung in Verfahrensschritt II) umfasst sowohl die anaerobe als auch die aerobe
Kultivierung der Zellen; die Zellen können sich unter diesen Bedingungen im Wachstum befinden (vorhandene Zellteilung), es können aber auch sogenannte„resting cells" eingesetzt, die beispielsweise durch Limitierung einer Substanz im Nährmedium im Wachstum gemindert oder gehemmt sind. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass in Verfahrensschritt II) eine Kultivierung in zwei Schritten IIa) und IIb) erfolgt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass im ersten Schritt IIa) erfindungsgemäße Zellen zu hohen Zelldichten angezogen werden, ohne dass die Aktivität eines Enyzms E-ι vermindert ist und im zweiten Schritt IIb) die Verminderung der Aktivität des Enzyms E-ι induziert wird.
Unter„hoher Zelldichte" wird in diesem Zusammenhang eine Zelldichte verstanden, die zwischen 5 und 200 g, bevorzugt zwischen 10 und 200, besonders bevorzugt zwischen 10 und 100 g Zelltrockenmasse pro Liter Gesamtkultur entspricht.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet dieses Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt III) Isolierung des gebildeten Resveratrols.
Im Schritt III) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das durch die Zellen gebildete
Resveratrol gegebenenfalls aus den Zellen und/oder dem Nährmedium isoliert werden, wobei zur Isolierung alle dem Fachmann bekannten Methoden zur Isolierung von niedermolekularen Substanzen aus komplexen Zusammensetzungen in Betracht kommen. Beispielhaft seien an dieser Stelle die Fällung mittels geeigneter Lösungsmittel, die Extraktion mittels geeigneter
Lösungsmittel, die Komplexierung, beispielsweise mittels Cyclodextrinen oder Cyclodextrin- Derivaten, die Kristallisation, die Aufreinigung bzw. Isolierung mittels chromatographischer Methoden oder die Überführung des gebildeten Resveratrols in leicht abtrennbare Derivate genannt.
Eine bevorzugte Methode zur Isolierung des Resveratrols ist eine Rückexktraktion mit Wasser aus einem organischen Lösungsmittel, mit welche zunächst das Resveratrol aus dem Kulturmedium extrahiert wurde; dieses Verfahren ist in der DE102009054984 ausführlich beschrieben.
Das Resveratrol kann nach Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Ethylacetat auch durch gängige Verfahren wie Verdampfungskristallisation isoliert werden. Eine weitere Möglichkeit Resveratrol aus einem organischen Lösungsmittel, in welches hinein das Resveratrol aus dem Kulturmedium extrahiert wurde, zu isolieren ist die Verminderung des Wassergehaltes im entsprechenden Lösungsmittel. Durch das Entfernen des Wassers wird die Löslichkeitsgrenze des Resveratrols herabgesetzt und eine Kristallisation ausgelöst. Dieses Verfahren ist in DE102010028874 ausführlich beschrieben.
Eine weitere Methode zur Isolierung des Resveratrols ist ein Überschreiten der
Löslichkeitsgrenze im Medium, dadurch kristallisiert das Resveratrol im Medium aus und kann über herkömmliche Separationsverfahren abgetrennt werden. Dies ist in der Patentanmeldung WO2009/016108 beschrieben.
In Verfahrensschritt III) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt eine Isolierung des Resveratrols durchgeführt, welches dem in der DE102009054984 beschriebenen Verfahren entspricht.
Somit umfasst ein bevorzugter Verfahrensschritt III) die Schritte A) Extrahieren des Resveratrols aus den Zellen und/oder dem Nährmedium mit mindestens einem mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel, B) in Kontakt Bringen des mindestens einen mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittels mit einer wässrigen Phase,
C) Abtrennen der wässrigen Phase von dem mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel und gegebenenfalls
D) Isolierung des Stilbenoids aus der wässrigen Phase.
In diesem Zusammenhang ist das Lösungsmittel bevorzugt ein organisches Lösungsmittel, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylisobutylketon, 3-Pentanon, Ethylbutyrat, Myristylalkoholpolypropoxilat, Diethyladipat, Octylacetat, Ethylacetat, 2-Heptanon, 1 -Octanol, Tritolylphosphat, Triacetin, Oleylalkohol, Nonanol, Dodecan, Dibutyladipat,
Diethylsebacat, Polypropylenglycol 1000 bis 4000, 2-Octanon und 2-Undecanon. Die wässrige
Phase enthält bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht der wässrigen Phase; bevorzugt weist sie einen pH-Wert von größer 7 auf. Die wässrige Phase enthält bevorzugt Alkali- und/oder Erdalkali-Hydroxide in einer Konzentration von 0,1 mol/L bis 20 mol/L, bezogen auf die gesamte wässrige Phase. Bevorzugt erfolgt in Verfahrensschritt C) die Abtrennung der wässrigen Phase durch den Einsatz von Separatoren, Zentrifugen, Dekantern und Abscheidern. Besonderes bevorzugt erfolgt in Verfahrensschritt D) die Isolierung des Stilbenoids durch Verdampfen der das Stilbenoid umgebenden Lösung. Bevorzugt umfasst Verfahrensschritt D) einen Schritt, bei dem der pH-Wert der wässrigen Phase auf kleiner 7 eingestellt wird, wobei bevorzugt in Verfahrensschritt D) die Temperatur der wässrigen Phase erniedrigt wird, bezogen auf die Temperatur zu Beginn des Verfahrensschrittes III). In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten
Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Folgende Figuren sind Bestandteil der Beispiele:
Figur 1 : Resveratrolproduktion von £ coli JP1 1 1 1- und L48- pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 bei 30°C und 37°C.
Figur 2: Resveratrolproduktion bezogen auf die Biomasse (OD6oo) von £ co// JP1 1 1 1 - und L48- pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 bei 30°C und 37°C
Figur 3: Resveratrolprodukion und OD600 von £. coli JP1 1 1 1 -pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 bei 30°C und 37°C.
Figur 4: Resveratrolprodukion und OD600 von £ coli L48-pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 bei 30°C und 37°C.
Figur 5: Resveratrolprodukion und OD600 von £ coli BW27784- pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 (Referenz) bei 30°C und 37°C.
Figur 6: %- Zunahme von Resveratrol pro OD bei einer Temperatursteigerung von 30°C auf 37°C. Beispiele:
Beispiel 1: Klonierung eines Vektors zur Expression der Coumaryl-CoA-Ligase- und der Stilben-Synthase-kodierenden Gene in Escherichia coli
Amplifikation von DNA mittels PCR (Polymerase Chain Reaction), Restriktionsverdau, DNA- Aufreinigung, Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter £. co//-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Alle benötigten Enzyme wurden bezogen von New England Biolabs, Schwalbach. Die Synthese von Oligonukleotiden erfolgte durch MWG Biotech, Ebersberg.
Zunächst wurde der den Lacl-Operator enthaltenden lac-Promotor im kommerziell erhältlichen Vektor pUC19 (New England Biolabs, Schwalbach) durch Umklonierung eines synthetischen Fragments des lac-Promotors ohne Operator ersetzt in Anlehnung an Watts et al., "Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli" (BMC
Biotechnology 2006, 6:22). Der Vektor pUC19 (2686bp) wurde hierfür geschnitten mit Pvull und Ndel gemäß den Angaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach).
Das synthetische Fragment des lac-Promotors ohne Operator (SEQ-ID Nr.1 ) wurde in derselben Weise der modifizierte lac-Promotor geschnitten, und das resultierende Fragment (212bp; SEQ-ID Nr. 1 ) nach Aufreinigung über ein Agarosegel mittels QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) mit dem verbliebenen, gleichermaßen aufgereinigten
Vektorrückgrat von pUC19 (2240bp) ligiert (T4 DNA Ligase, New England Biolabs,
Schwalbach), woraus der Vektor pUCmodll (2452bp) resultierte. Ligation und Transformation von kompetenten Escherichia coli DH5a erfolgten entsprechend der Vorgaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach).
Der Vektor pUCmodll wurde im nächsten Schritt mit Xbal und Notl geschnitten. Ausgehend von dem genomischer DNA wurde mittels PCR unter Verwendung von Phusion DNA Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) und den Oligonukleotiden VvSTScod-Xba1 -fw, SEQ-ID Nr. 2
5'-tatatatctagaaggaggattacaaaATGGCTTCAGTCGA
GGAAATTAG-3' VvSTScod-Not1 -rv, SEQ-ID Nr. 3
5'-tatataGCGGCCGCtttaatttgtaaccatagg-3' das Gen der Stilben-Synthase aus Vinis vinifera (VvSTS) gemäß den Angaben des Herstellers amplifiziert, woraus ein 1201 bp-Fragment (SEQ-ID Nr. 4) resultierte. Dieses wurde über ein Agarosegel mittels QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Das PCR-Produkt wurde anschließend analog zum Vektor pUCmodll mit Xbal und Notl geschnitten und beide Fragmente ligiert, woraus der Vektor pUCmod-VvSTS resultierte (3625bp).
Das Gen der Coumaryl-CoA-Ligase At4CI1 aus Arabidopsis thaliana wurde ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA (United States Biological, Swampscott, USA) mittels PCR und den Oligonukleotiden
At4CI1 -Not-fw, SEQ-ID Nr. 5
5'- tatatagcggccgcaggaggattacaaaatgGCGCCACAAGAAC-3'
At4CI1 -Not, SEQ-ID Nr. 6
5'- tatatagcggccgctcacaatccatttgctagtttt-3' amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt (SEQ-ID Nr. 7) wurde über ein Agarosegel aufgereinigt und mit Notl geschnitten. Das hieraus resultierende 1708bp-Fragment wurde mit dem gleichermaßen geschnittenen Vektor pUCmod-VvSTS nach dessen Dephosphorylierung mit CIP (New England Biolabs, Schwalbach) gemäß den Angaben des Herstellers ligiert, woraus der Vektor pUCmod-VvSTS-At4CI1 resultierte (5333bp). Die Orientierung des Inserts wurde dabei so gewählt, dass VvSTS und At4CI1 gleichgerichtet transkribiert und translatiert werden. Der Promotor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde mittels Kolonie-PCR mit Escherichia coli DH5a Zellen (New England Biolabs), Phusion DNA
Polymerase und den Oligonukleotiden EcGAP-Sapl-fw, SEQ-ID Nr. 8
5'-TATATAGCTCTTCAAGCgcgtaatgcttaggcacagg-3' EcGAP-Xbal-rv, SEQ-ID Nr. 9
5'-TATATATCTAGAtgaataaaaggttgcctgtaa-3' amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt (ca.1 10bp; SEQ-ID Nr. 10) wurde aufgereinigt über ein Agarosegel wie bereits beschrieben, und anschließend einem Sapl und Xbal-Verdau unterzogen. Der Vektor pUCmod-VvSTS-At4CI1 wurde ebenfalls mit Xbal und Sapl
geschnitten, und das Vektorrückgrat (5139bp) mit dem Insert ligiert, woraus der Vektor pUC- GAP-VvSTS-At4CI1 resultierte (5244bp). Zellen des Escherichia coli-Stammes BW251 13 AptsG (Keio Collection, Japan) wurde mit pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 transformiert. Die Herstellung und Transformation der kompetenten Zellen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Beispiel 2: Kultivierung der temperatursensitiven rekombinanten E. coli-Stämme JP1111- und L48- pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 zur Herstellung von Resveratrol
Stamm Hintergrund
Tabelle 1 : Verwendeten £. co//-Stämme JP1 1 1 1 und L48, erhältlich über E. coli Genetic Resources at Yale
CGSC, The Coli Genetic Stock Center als CGSC#
Figure imgf000027_0001
Die Gene fabl 1392(ts) und fabD89(ts) codieren für eine tempereratursensitive Enoyl-[Acyl- Carrier-Protein] Reduktase (Enoyl-ACP Reduktase) bzw. Malonyl-CoA-ACP Transacylase. Temperaturen > 30°C kommt es zur Inaktivierung dieser Enzyme, Die Herstellung elektro- und/oder chemisch kompetenter E. coli JP1 1 1 1 -/L48-Zellen sowie deren Transformation mit pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise. 1 ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1 % Glycerol als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9: 6,8 g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/l
Calciumchlorid Dihydrat, 250 mg/l Magnesiumsulfat Heptahydrat, pH 7,0), welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde am Morgen mit E. coli JP1 1 1 1 -/L48-pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 von frisch ausgestrichenen und über Nacht bei 37°C inkubierten LB-Agar Platten (LB-Agar nach
MILLER, 37 g/l) mit 100 g/ml Ampicillin angeimpft, und für 6h bei 37°C und 250 UpM in 10-ml- Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden 50 ml modifiziertes M9-Medium (einschließlich 10 g/l Hefeextrakt) in einem 250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen mit der gesamten
Zellsuspension aus der Vorkultur angeimpft. Die Inkubation der Schüttelkolben erfolgte über Nacht für 16-18 h bei 37 °C und 250 UpM. Am nächsten Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml- Falconröhrchen überführt und diese bei 4000 UpM für 10 min und Raumtemperatur
abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 50 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert, supplementiert mit 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 100 g/l PEG 3350 (Sigma Aldrich) und jeweils in einen 250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung der Produktbildungsraten bei 30 °C und 37 °C bei 250 UpM für 7 h inkubiert. Das Wachstum der £. co//-Zellen wurde durch regelmäßige Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD6oo) verfolgt. Als Referenz wurde der Stamm E. coli BW27784, erhältlich über E. coli Genetic Resources at Yale, CGSC, The Coli Genetic Stock Center als CGSC# 7881 , transformiert mit pUC-GAP-VvSTS-At4CI1 in gleicher Weise wie für JP1 1 1 1 und L48 beschrieben eingesetzt. Die Ergebnisse der Resveratrolbildung sind in Figur 1 -5 gezeigt.
Beispiel 3: Quantifizierung von Resveratrol und 4-Hydroxyzimtsäure in der Zellsuspension
Zur Extraktion wurde 1 ml der Zellsuspension eingesetzt. Die Zellsuspension wurde in 2-ml- Reaktionsgefäße überführt und durch Zugabe von 50 μΙ 3 M HCl angesäuert. Nach Zugabe von
950 μΙ Ethylacetat wurden die Proben in einer Retschmühle MM100 (RETSCH, Hahn) für 30 sec bei 30 Hz extrahiert, und anschließend für 1 min bei 13.200 UpM abzentrifugiert. Die Ethylacetat-Phase wurde in ein 1 ,5-ml-HPLC-Gefäß (Agilent Technologies, Waldbronn) überführt und fest verschlossen.
2 μΙ der Extrakte wurden auf eine Zorbax SB-C18-Säule (4.6 χ 150 mm, 3.5 μηη; Agilent Technologies, Waldbronn) mittels des Agilent 1200 HPLC-Systems, ausgestattet mit einem Photodioden-Array-Detektor und einem binären Gradientenmischer, injiziert. Resveratrol wurde mit einer mobilen Phase bestehend aus 580 g Acetonitril, 265 g Wasser und 0,5 ml
Trifluoressigsäure pro Liter (Laufmittel A) und Wasser (Laufmittel B), beigemischt in einem Mischungsverhältnis von 48:52 (A:B), mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 .0 ml/min und einer Säulentemperatur von 25 °C eluiert. Resveratrol als auch 4-Hydroxyzimtsäure wurde durch einen Vergleich mit der Verweilzeit und dem UVA/IS-Spektrum einer Referenzsubstanz
(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen bzw. Merck, Darmstadt) identifiziert. Zur Quantifizierung des Eduktes 4-Hydroxyzimtsäure bzw. Produktes Resveratrol in den Extrakten wurden Standard- Kurven durch das Auftragen der Peak-Flächen von Referenzproben mit bekannter
Konzentration gegen die entsprechende Konzentration in diesen Referenzproben angefertigt. Die Detektion und Quantifizierung von Resveratrol und 4-Hydroxyzimtsäure erfolgte bei einer Wellenlänge von 308 nm.
In Figur 6 ist die prozentuale Zunahme der Resveratrolproduktion bei den temperatursensitiven £ coli Mutanten £. coli L48 fabD (ts) bzw. £ coli JP1 1 1 1 fabl (ts) bei verschiedenen
Tempereraturen (30 °C und 37 °C) bezogen auf den nicht-temperatursensitiven Referenzstamm BW27784 dargestellt. Dies bedeutet: Erfolgt die Biotransformation bei 30 °C und parallel bei 37 °C, so ist eine Zunahme der Resveratrolproduktion bei 37 °C auf Grund der Inaktivierung von FabD bei £ coli L48 fabD (ts) bzw. von Fabl bei £ coli JP1 1 1 1 fabl (ts) von bis zu 300 % (für £ coli L48 fabD (ts)) bzw. von 100 % (für £ coli JP1 1 1 1 fabl (ts)) zu verzeichnen. Während bei dem Referenzstamm BW 27784 die Enzyme FabD/FabI auch bei 37 °C aktiv sind, kommt es bei den temperatursensitiven £ coli Mutanten bei Temperaturen > 30 °C zur Inaktivierung von FabD bzw. Fabl.

Claims

Ansprüche
1 . Eine Zelle, welche Resveratrol zu bilden vermag, wobei die Zelle mindestens eine im
Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines Enzyms E-i, welches an einem in Bezug auf Malonyl-Coenzym A cataplerotischen Stoffwechselweg beteiligt ist, aufweist.
2. Zelle gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym E-i ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:
ein Enzym E1a, welches die Umsetzung
von Malonyl-CoA zu Malonsäure-Semialdehyd katalysiert;
ein Enzym E1b, welches die Umsetzung
von Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA katalysiert;
ein Enzym E1c, welches die Umsetzung
von holo-[ACP] + Malonyl-CoA zu Malonyl-[ACP] + Coenzym A katalysiert; ein Enzym E1d, welches Polyketidsynthase-Aktivität aufweist;
ein Enzym E1e,welches die Umsetzung
von Acetyl-CoA + Malonyl-[ACP] zu Acetoacetyl-[ACP] und/oder
von holo-[ACP] + Acetyl-CoA zu Acetyl-[ACP] katalysiert;
ein Enzym E1f, welches die Umsetzung
von irans-A3-c/'s-A5-Dodecenoyl-[ACP] zu c/'s-A5-Dodecenoyl-[ACP] und/oder von 2,3,4-gesättigtes acyl-[ACP] zu irans-A2-enoyl-acyl-[ACP] katalysiert; ein Enzym E1g, welches die Umsetzung
von Octanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Decanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Decanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Dodecanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Dodecanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Meristoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Myristoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Palmitoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Butyryl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Hexanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder von Hexanoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-Octanoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von c/'s-A3-Decenoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu ß-keto-c/'s-A5-Dodecenoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] + Acetyl-[ACP] zu holo-[ACP] + Acetoacetyl-[ACP] und/oder von Malonyl-[ACP] + 2,3,4-gesättigtes acyl-[ACP] zu holo-[ACP] + ß-Ketoacyl-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] zu Acetyl-[ACP] katalysiert und/oder von Palmitoleoyl-[ACP] + Malonyl-[ACP] zu 3-oxo-c/'s-Vaccenoyl-[ACP] + holo-[ACP] und/oder
von Malonyl-[ACP] + Acetyl-[ACP] zu holo-[ACP] + Acetoacetyl-[ACP] und/oder von Malonyl-[ACP] + 2,
3,4-gesättigtes acyl-[ACP] zu holo-[ACP] + ß-Ketoacyl-[ACP] katalysiert;
zym E1h, welches die Umsetzung
von ß-keto-c/s-A5-dodecenoyl-[ACP] zu ß-hydroxy eis A5-dodecenoyl-[ACP] und/oder
von (3R)-3-hydroxyacyl-[ACP] zu ß-ketoacyl-[ACP] katalysiert;
zym E-n, welches die Umsetzung
von ß-hydroxy eis A5-dodecenoyl-[ACP] zu irans-A3-c/s-A5-dodecenoyl-[ACP] und/oder
von (R)-3-hydroxydecanoyl-[ACP] zu irans-A2-Decenoyl-[ACP] und/oder
von (3R)-3-hydroxyacyl-[ACP] zu irans-A2-enoyl-acyl-[ACP] und/oder
von irans-A2-Decenoyl-[ACP] zu c/s-A3-Decenoyl-[ACP] katalysiert;
zym E-ij, welches die Umsetzung von
apo-[ACP] zu Adenosin-3',5'-Bbisphosphat + holo-[ACP] katalysiert;
zym E1k, welches eine Fettsäure-Synthase-Aktivität aufweist;
zym En, welches die Umsetzung
von Pantothenat + ATP zu D-4'-Phosphopantothenat + ADP katalysiert;
zym E1m, welches die Umsetzung von
4'-Phosphopantethein + ATP zu Dephospho-CoA + Diphosphat katalysiert;
zym E1n, welches die Umsetzung von
Dephospho-CoA + ATP zu Coenzym A + ADP katalysiert und
zym E1o, welches die Umsetzung von
D-4'-Phosphopantothenat + L-Cystein + CTP zu Diphosphat + CMP + R-4'- Phosphopantothenoyl-L-Cystein und/oder
R-4'-Phosphopantothenoyl-L-Cystein zu 4'-Phosphopantethein katalysiert. 3. Zelle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
Eia eine Malonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC:1.2.1.15 oder EC:1.2.1 .18),
Eib eine Malonyl-CoA-Decarboxylase (EC:4.1.1 .9),
E1c eine [Acyl-Carrier-Protein]-S-Malonyltransferase (EC:2.3.1.39),
Eie eine [Acyl-Carrier-Protein]-S-Acetyltransferase (EC:2.3.1.38) oder eine [Myelin-
Proteolipid]-0-Palmitoyltransferase (EC:2.3.1 .100),
Eif eine Enoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Reduktase (EC:1.3.1 .9),
E1g eine beta-Ketoacyl-Acyl-Carrier-Protein-Synthase I oder II (EC:2.3.1.41/179),
Eih eine 3-Oxoacyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Reduktase (EC:1.1.1 .100),
Ei, eine 3-Hydroxydecanoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Dehydratase oder 3-
Hydroxyoctanoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Dehydratase (EC:4.2.1.60 oder EC:4.2.1.59) oder eine Crotonoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Hydratase (EC:4.2.1.58) oder eine trans-
2-Decenoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-lsomerase (EC:5.3.3.14),
Eij eine holo-[Acyl-Carrier-Protein]-Synthase (EC:2.7.8.7),
Eik eine Fettsäure-Synthase bzw. Fettsäure-Acyl-CoA-Synthase (EC:2.3.1.85 oder
EC:2.3.1 .86),
En eine Pantothenate Kinase (EC:2.7.1.33),
Elm eine Pantethein-Phosphat-Adenylyltransferase (EC:2.7.7.3),
E1n eine Dephospho-CoA-Kinase (EC:2.7.1.24) und
E1o eine Phosphopantothenoylcystein-Decarboxylase (EC:4.1 .1.36) oder eine
Phosphopantothenoylcystein-Ligase (6.3.2.5)
ist. 4. Zelle gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Enzyms E-ι vermindert wird durch einen Inhibitor ausgewählt aus Gruppe bestehend aus: Sch 538415, 4H-Oxazol-5-one, Anthranilsäure, Corytuberin, HR12, RWJ- 3981 , Indolanaloga, SB418001 , 1 ,2-Dithiole-3-one, Benzoylaminobenzoesäuren,
Platensimycin, Platencin Phomallensäure, Cerulenin, Thiolactomycin , BABX,
Phomallensäuren, Polyphenole, Allensäuren, 3-Decynoyl-NAC, NAS-91 , NAS-21 , Isoniazid, Triclosan, Diazoborin, Aminopyridine, Bischloroanthrabenzoxocinon, BABX, Aminopyridin, Pantothenamide, Clotrimazol, Econazol, Ketoconazol, Miconazol, Naftifin, Tolnaftat, Azaterol, Cerulenin, 3-HMG-CoA,
5. Zelle gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Enzyms E-ι konditioniert, insbesondere durch eine Temperaturänderung, vermindert wird.
6. Zelle gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie asugewählt ist aus der
Gruppe bestehend aus:
£ coli JP1 1 1 1 , enthaltend temperatursensitives Fabl;
£ coli L48 und £ coli LA2-89, enthaltend temperatursensitive FabD;
£. coli DV62, £ coli DV79 und £ coli ts9, enthaltend temperatursensitive CoaA ;
£ coli M5 enthaltend ein temperatursensitives FabB;
£ coli M8, £ coli PAM155, £ coli CY53, £ coli CY55 und £ coli CY50, enthaltend
temperatursensitive FabA und
£ coli CL37, £ co// CL48 und £ co// CL104, enthaltend temperatursensitive FabG.
7. Zelle gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp ohne die verminderte Aktivität eines Enzymes E-ι bereits mehr Resveratrol zu bilden vermag.
8. Zelle gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme aufweist:
eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Tyrosin zu 4-Coumarat oder die
Umsetzung von L-Phenylalanin zu trans-Cinnamat katalysiert;
eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von trans-Cinnamat zu 4-Coumarat katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von 4-Coumarat zu 4-Coumaryl-Coenzym A katalysiert;
eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von 4-Coumaryl-Coenzym A zu Resveratrol katalysiert.
9. Eine Zelle gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Zelle die Aktivität des folgenden Enzyms bzw. der folgenden Enzyme gesteigert ist: E2, E3, E4, E5, E2 + E4, E2 + E5, E4 + E5, E2 + E4 + E5, E3 + E4, E3 + E5, E3 + E4 + E5, E2 + E3 + E4 + E5, wobei E4 + E5 besonders bevorzugt ist.
10.) Verfahren zur Herstellung von Resveratrol, umfassend die Verfahrensschritte:
I) In Kontakt Bringen der Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem Nährmedium beinhaltend mindestens eine Kohlenstoffquelle
II) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, aus der Kohlenstoffquelle Resveratrol zu bilden und gegebenenfalls
III) Isolierung des gebildeten Resveratrols.
1 1.) Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt II) die Schritte umfasst
A) Extrahieren des Resveratrols aus den Zellen und/oder dem Nährmedium mit
mindestens einem mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel
B) in Kontakt Bringen des mindestens einen mit Wasser im Wesentlichen nicht
mischbaren Lösungsmittels mit einer wässrigen Phase,
C) Abtrennen der wässrigen Phase von dem mit Wasser im Wesentlichen nicht
mischbaren Lösungsmittel und gegebenenfalls
D) Isolierung des Stilbenoids aus der wässrigen Phase.
12.) Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt II) die Schritte umfasst:
IIa) Anziehen von Zellen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 zu hohen
Zelldichten, ohne dass die Aktivität eines Enzyms E-ι vermindert ist und IIb) Induktion der Verminderung der Aktivität des Enzyms Ei.
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