DE102008001581A1

DE102008001581A1 - Ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton

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Publication number: DE102008001581A1
Application number: DE200810001581
Authority: DE
Inventors: Achim Dr. Marx; Li Dr. Li; Juraj Obuch; Thomas Dr. Haas; Volker F. Prof. Dr. Wendisch
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2008-05-06
Publication date: 2009-11-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton, mindestens beinhaltend die Verfahrensschritte: a) Kultivieren von Mikroorganismen, welche in der Lage sind, Kohlenhydrate zu Dihydroxyaceton umzusetzen, in einem Nährmedium, vorzugsweise bis zum Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse im Nährmedium von mindestens 12 g/l; b) i) Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0, und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75, und/oder ii) Inkontaktbringen der Zellen mit einer Base mit einem pKB-Wert von weniger als 4,75; c) Kultivieren der Mikroorganismen in Gegenwart von Kohlenhydraten, so dass die Zellen Dihydroxyaceton aus den Kohlenhydraten bilden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten Dihydroxyaceton-Phase, das durch dieses Verfahren erhaltene Dihydroxyaceton bzw. die durch dieses Verfahren erhältliche Dihydroxyaceton-Phase, ein Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen durch eine Oxidations-, Reduktions- oder Kondensationsreaktion, bei der Dihydroxyaceton als Edukt eingesetzt wird, die durch dieses Verfahren erhältliche organische Verbindung sowie eine kosmetische Zusammensetzung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton bzw. einer stabilisierten Dihydroxyaceton-Phase, das durch dieses Verfahren erhaltene Dihydroxyaceton bzw. die durch dieses Verfahren erhältliche Dihydroxyaceton-Phase, ein Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen durch eine Oxidations-, Reduktions- oder Kondensationsreaktion, bei der Dihydroxyaceton als Edukt eingesetzt wird, die durch dieses Verfahren erhältliche organische Verbindung sowie eine kosmetische Zusammensetzung.
Dihydroxyaceton (abgekürzt DHA, Glyceron) ist ein einfach gebautes Kohlenhydrat mit der Summenformel C₃H₆O₃. Dihydroxyaceton ist der wesentliche Inhaltsstoff von Selbstbräunern und reagiert mit Eiweißen in der Hornschicht, der obersten Hautschicht, die sich dabei bräunlich einfärbt. Neben seinem Einsatz als Inhaltsstoff von Selbstbräunern dient Dihydroxyaceton auch als Ausgangsverbindung für die Herstellung einer Vielzahl chemisch wichtiger Edukte, wie etwa Acrolein oder Acrylsäure.
Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere im industriellen Maßstab wird Dihydroxyaceton gegenwärtig zumeist biochemisch aus Glycerin gewonnen (Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, Band 14, Seite 211). Gemäß der DE-A-1 136 994 sind hierfür zum Beispiel Enzyme von Acetobacter suboxidans geeignet, wobei sich besonders zufrieden stellende Ergebnisse dann einstellen, wenn das Nährmedium neben Glycerin nur corn steep liquor und Harnstoff enthält. Gemäß der DE-A-43 41 238 gelangt man auch mittels dehydrogenaseaktiven Mikroorganismen ausgehend von Glycerin zu Dihydroxyaceton, wenn die Reaktion durch Titration mit einer Calciumhydroxid-Suspension konstant bei einem pH-Wert gehalten wird, der im Bereich von 3,8 und 4,8 liegt.
Neben der mikrobiologischen Herstellung von Dihydroxyaceton aus Glycerin kann Dihydroxyaceton auch durch die Umsetzung von Kohlenhydraten, wie etwa Glukose oder Fruktose, erhalten werden. So beschreiben Kiefer et al. in „Comparative Metabolic Flux Analysis of Lysine-Producing Corynebacterium glutamicum Cultured on Glucose or Fructose", Applied And Environmental Microbiology, Vol. 70 (1), Seiten 229–239 (2004), Wittmann et al. in „Metabolic Network Analysis of Lysine Producing Corynebacterium glutamicum at a Miniaturized Scale", Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87 (1), Seiten 1–6 (2004) oder Gubler et al. in "Cloning of the Pyruvate Kinase Gene (pyk) of Corynebacterium glutamicum and Site-Specific Inactivation of pyk in a Lysine-Producing Corynebacterium lactofermentum Strain", Applied And Environmental Microbiology, Vol. 60 (7), Seiten 2.494–2.500 (1994) die Bildung von Dihydroxyaceton bei der Umsetzung von Glukose und Fruktose durch rekombinante Corynebacterium glutamicum- bzw. in Corynebacterium lactofermentum-Zellen, wobei jedoch Dihydroxyaceton nicht als Hauptprodukt, sondern als eines von vielen Nebenprodukten gebildet wird.
Ein Nachteil der bisher aus dem Stand der Technik beschriebenen Verfahren ist jedoch, dass die Ausbeute an Dihydroxyaceton vergleichsweise gering ist. Insbesondere bei der Umsetzung von Kohlenhydraten, wie etwa Glukose oder Fruktose, konnten bisher keine Dihydroxyaceton-Ausbeuten erzielt werden, welche die Herstellung von Dihydroxyaceton in wirtschaftlich sinnvoller Weise ermöglichen. Ein weiterer Nachteil der bisher aus dem Stand der Technik bekannten, mikrobiologischen Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton besteht darin, dass Nährmedien, welche in der Wachstumsphase der eingesetzten Mikroorganismen verwendet werden, sich in ihrer Zusammensetzung von denjenigen Nährmedien unterscheiden, die bei der letztendlichen Dihydroxyaceton-Bildung Verwendung finden. Dieses liegt darin begründet, dass Dihydroxyaceton in höheren Konzentrationen toxisch für viele Mikroorganismen ist und daher in der Phase der Biomassebildung die Bildung größerer Mengen an Dihydroxyaceton unterbunden werden muss. So wird beispielsweise bei dem in DE-A-44 44 404 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton aus Glycerin während der Biomassebildung ein Nährmedium mit Kohlenhydraten als Kohlenstoffquelle eingesetzt. Nach Abschluss der Biomassebildung werden die Zellen dann von diesem Nährmedium abgetrennt und in einem Glycerin-enthaltenden Nährmedium resuspendiert.
Auch sind die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Aufreinigung von Dihydroxyaceton aus den jeweils erhaltenen Fermentationslösungen durchaus verbesserungswürdig, da in der Regel zahlreiche Verfahrensschritte bis zum Erhalt einer aufgereinigten Dihydroxyaceton-Phase zu befolgen sind. Aufgrund der polaren Eigenschaften des Dihydroxyacetons ist nämlich insbesondere die Isolierung des Dihydroxyacetons aus einem komplexen Gemisch an Edukt- und Reaktionskomponenten aus einem wässrigen System durchaus problematisch. Schwierigkeiten, die mit der Isolierung und Reinigung von Dihydroxyaceton aus Fermentationsgemischen einhergehen, werden eindrucksvoll in der EP-A-0 245 976 beschrieben. Danach ist es erforderlich, das Fermentationsgemisch zunächst zu filtern, Wasser und andere Lösungsmittel unter reduziertem Druck destillativ zu entfernen, sodann Ethanol hinzuzufügen, erneut zu filtern, Ethanol destillativ zu entfernen, Aceton zuzugeben, erneut zu filtern, Aceton zu verdampfen und das Produkt auszukristallisieren.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile im Zusammenhang mit der mikrobiologischen Herstellung von Dihydroxyaceton, insbesondere aus Kohlenhydraten, zu überwinden.
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem auf mikrobiologischem Weg Dihydroxyaceton aus Kohlenstoffquellen, wie etwa Glukose oder Fruktose, mit einer so hohen Ausbeute erhalten werden kann, dass dieses Verfahren in wirtschaftlich sinnvoller Weise zur großtechnischen Dihydroxyaceton-Herstellung angewandt werden kann.
Auch lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem auf mikrobiologischem Weg Dihydroxyaceton aus Kohlenstoffquellen, wie etwa Glukose oder Fruktose, hergestellt werden kann, wobei dieses Verfahren die Herstellung von aufgereinigtem Dihydroxyaceton in möglichst wenigen Verfahrensschritten ermöglicht. Insbesondere soll das Verfahren so durchführbar sein, dass auf eine Änderung des Nährmediums beim Übergang von der Biomasse-Bildung zur Dihydroxyaceton-Bildung gegebenenfalls verzichtet werden kann.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton, mindestens beinhaltend die Verfahrensschritte:

a) Kultivieren von Mikroorganismen, welche in der Lage sind, Kohlenhydrate zu Dihydroxyaceton umzusetzen, in einem Nährmedium, vorzugsweise bis zu Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse im Nährmedium von mindestens 12 g/l;
b) i) Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6.5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75, und/oder, vorzugsweise und ii) in Kontakt bringen der Zellen mit einer Base mit einem vorzugsweise bei 25°C bestimmten pK_B-Wert von weniger als 4,75, besonders bevorzugt von weniger als 0 und noch mehr bevorzugt von weniger als –1,5 erfolgt;
c) Kultivieren der Mikroorganismen in Gegenwart von Kohlenhydraten, so dass die Zellen Dihydroxyaceton aus den Kohlenhydraten bilden.

Überraschenderweise, dafür aber nicht minder vorteilhaft, wurde festgestellt, dass sich durch die Kultivierung von Mikroorganismen in einem pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6.5 (Alternative i), oder aber durch den Zusatz einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 (Alternative ii), insbesondere jedoch dann, wenn der pH-Wert mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 auf einen Bereich von 4,5 bis 6.5 eingestellt wird (Alternative i) und ii), die Ausbeute an Dihydroxyaceton bei der mikrobiologischen Umsetzung von Kohlenhydraten, beispielsweise von Glukose, signifikant steigern lässt. Auch führt die Umsetzung der Kohlenhydrate unter den vorstehend genannten Bedingungen i) oder ii) bzw. i) und ii) zu eine selektiveren Umsetzung der Kohlenhydrate zu Dihydroxyaceton, so dass weniger Nebenprodukte gebildet werden.
Unter dem Begriff „Dihydroxyaceton”, wie er hierin verwendet wird, wird grundsätzlich das Dihydroxyaceton in derjenigen Form verstanden, in der es unter den gegebenen Temperatur- und Druckbedingungen vorliegt. So umfasst der Begriff „Dihydroxyaceton” insbesondere auch das Additionsprodukt, welches durch die Anlagerung von Wasser an Dihydroxyaceton gebildet wird, als auch dimeres Dihydroxyaceton.
Im Verfahrensschritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens, der hauptsächlich der Biomasse-Herstellung dient, werden zunächst Mikroorganismen, welche in der Lage sind, Kohlenhydrate zu Dihydroxyaceton umzusetzen, in einem Nährmedium bis zu Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse im Nährmedium von mindestens 12 g/l, vorzugsweise mindestens 16 g/l, noch mehr bevorzugt mindestens 19 g/l und darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens 24 g/l, kultiviert.
Als Mikroorganismen können im Verfahrensschritt a) alle Mikroorganismen eingesetzt werden, die in der Lage sind, Kohlenhydrate, insbesondere Glukose und Fruktose, zumindest zum Teil zu Dihydroxyaceton umzusetzen. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Mikroorganismen um Hefen, Pilze oder Bakterien, wobei Bakterien und Hefen besonders bevorzugt und Bakterien am meisten bevorzugt sind.
Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind und die in der Lage sind, Kohlenhydrate zumindest teilweise zu Dihydroxyaceton umzusetzen. Erfindungs gemäß besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium, wobei Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens und Corynebacterium lactofermentum besonders bevorzugt sind. Unter diesen wiederum besonders bevorzugt sind Corynebacterium glutamicum ATCC 21526, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13058, Corynebacterium glutamicum ATCC 13287, Corynebacterium glutamicum ATCC 21543, Corynebacterium lactofermentum 21799, Corynebacterium glutamicum 1412, Corynebacterium glutamicum 10150, Corynebacterium glutamicum 20137, Corynebacterium glutamicum 20300, Corynebacterium glutamicum 20163, Corynebacterium glutamicum 20297, Corynebacterium glutamicum 20301, Corynebacterium glutamicum 20411, Corynebacterium glutamicum 20412, Corynebacterium glutamicum 20598, Corynebacterium glutamicum 44475, Corynebacterium glutamicum 46307 sowie die von Gubler et al. in "Cloning of the Pyruvate Kinase Gene (pyk) of Corynebacterium glutamicum and Site-Specific Inactivation of pyk in a Lysine-Producing Corynebacterium lactofermentum Strain", Applied And Environmental Microbiology, Vol. 60 (7), Seiten 2.494–2.500 (1994) beschriebenen pyk-Mutanten von Corynebacterium lactofermentum.
Die Kultivierung der Mikroorganismen im Verfahrensschritt a) kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder im repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung von Biomasse bis zum Erreichen der eingangs genannten Mindestkonzentration an Biotrockenmasse erfolgen. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.
Beispielsweise erfolgt die Kultivierung von Mikroorganismen im Verfahrensschritt a) dergestalt, dass zunächst eine Vorkultur (auch Aussaatkultur genannt) der einzusetzenden Mikroorganismen in einem Komplexmedium (zum Beispiel Nutrient Broth-Agar, kurz NBAgar, welche komplexe Nährstoffgemische enthalten, wie etwa enzymatisch verdautes tierisches oder pflanzliches Protein, Fleischextrakt oder getrocknetes Hefezellenlysat) mit Zellen aus einer Kulturvorlage, beispielsweise aus einer mit den Mikroorganismen besiedelten Agar-Platte, als Inokulum hergestellt wird. Die so erhaltenen Zellen können sodann beispielsweise durch Zentrifugation (beispielsweise bei 8.800 g für 2 Minuten) geerntet und in einem geeigneten Wachstumsmedium, bei dem es sich ebenfalls um ein Komplexmedium handeln kann, resuspendiert und sodann gemäß dem Verfahrensschritt a) kultiviert werden, bis die eingangs genannte Mindestkonzentration an Biotrockenmasse erreicht wird (= Wachstumskultur).
Das im Verfahrensschritt a) zu verwendende Kulturmedium bzw. die im Verfahrensschritt a) zu verwendenden Kulturmedien muss/müssen in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle in dem bzw. in den im Verfahrensschritt a) eingesetzten Nährmedium/Nährmedien werden Kohlehydrate, wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Aminosäuren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäure verwendet. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle in dem bzw. in den im Verfahrensschritt a) eingesetzten Nährmedium/Nährmedien können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle in dem bzw. in den im Verfahrensschritt a) eingesetzten Nährmedium/Nährmedien können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das im Verfahrensschritt a) eingesetzte Nährmedium bzw. die im Verfahrensschritt a) eingesetzten Nährmedien sollten weiterhin Salze von Metallen enthalten, die für das Wachstum notwendig sind, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Mangansulfat oder Eisensulfat. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Kultivieren der Mikroorganismen im Verfahrensschritt a) bei einem pH-Wert von mehr als 5,75, vorzugsweise von mehr als 6,00 und besonders bevorzugt von mehr als 6,50, wobei vorzugsweise ein pH-Wert von 8,5, besonders bevorzugt von 8,0 und noch mehr bevorzugt von 7,5 nicht überschritten wird. Gemeint ist hiermit derjenige Kultivierungsschritt des Verfahrens a), der letztendlich zu den Zelldichten mit der eingangs genannten Mindestkonzentration an Biotrockenmasse führt. Umfasst also beispielsweise der Verfahrensschritt a), wie vorstehend beschrieben, die Vorkultur und die Wachstumskultur, so ist es insbesondere bevorzugt, dass die Wachstumskultur bei einem pH-Wert von mehr als 5,75, vorzugsweise von mehr als 6,00 und besonders bevorzugt von mehr als 6,50 erfolgt. Unter diesen pH-Bedingungen kann sichergestellt werden, dass die Bildung von Dihydroxyaceton während der Biomassebildung möglichst gering gehalten wird.
Zu beachten ist, dass alle im Zusammenhang mit dem Verfahrensschritt a) angegebenen pH-Werte und insbesondere auch die in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem Verfahrensschritt b) angegebenen pH-Werte „unter den Kultivierungsbedingungen” zu mes sen sind. Wenn also beispielsweise die Mikroorganismen im Verfahrensschritt a) oder im Verfahrensschritt b) bei 37°C kultiviert werden, ist auch der pH-Wert bei 37°C zu bestimmen.
Zur pH-Kontrolle der Kultur im Verfahrensschritt a) werden basische Verbindungen eingesetzt, die vorzugsweise einen pK_B-Wert von mindestens 4,75 aufweisen, wobei die Kontrolle des pH-Wertes im Verfahrensschritt a) vorzugsweise durch den Zusatz von Ammoniak bzw. Ammoniakwasser als Neutralisierungsmittel erfolgt.
Des Weiteren können im Verfahrensschritt a) dem eingesetzten Nährmedium bzw. den eingesetzten Nährmedium zur Kontrolle der Schaumentwicklung Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester, zugesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium bzw. den Medien geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur bzw. der Kulturen liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C, wobei eine Temperatur um etwa 33°C besonders bevorzugt ist.
Im Verfahrensschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird i) das die Mikroorganismen umgebende Nährmedium auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 geändert, oder aber es werden ii) die Zellen mit einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 in Kontakt gebracht, wobei es besonders bevorzugt ist, dass der pH-Wert mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 auf den Bereich von 4,5 bis 6,5 eingestellt wird (und mithin die Alternativen i) und ii) beide realisiert werden). Wenn also im Verfahrensschritt a) eine Konzentration an Biotrockenmasse von vorzugsweise mindestens 12 g/l erreicht ist, dann wird von diesem Zeitpunkt an i) der pH-Wert auf einen Bereich von 4,5 bis 6,5 eingestellt, oder ii) es wird von diesem Zeitpunkt an der pH-Wert der Kultur anstelle mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von mindestens 4,75 mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 kontrol liert oder es wird von diesem Zeitpunkt an der pH-Wert auf einen Bereich von 4,5 bis 6,5 mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 eingestellt.
Dabei sind grundsätzlich verschiedene Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens denkbar. So können gemäß einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens (Variante A) die Mikroorganismen in der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension zunächst vom Nährmedium abtrennt, sodann gegebenenfalls gewaschen und anschließend mit einem neuen Nährmedium in Kontakt gebracht werden, i) dessen pH-Wert mittels geeigneter Basen auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 gehalten wird, ii) welches eine Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 enthält oder, was besonders bevorzugt ist, dessen pH-Wert mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 gehalten wird. Gemäß einer anderen besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens (Variante B) werden die Mikroorganismen in der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension nicht vom Nährmedium abtrennt. Vielmehr wird, gemäß der Alternative i), durch den Zusatz geeigneter Basen, der pH-Wert der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension auf einen Wert im Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 eingestellt, oder es wird gemäß der Alternative ii) eine Base mit einem mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 zugesetzt oder es wird, was besonders bevorzugt ist, der pH-Wert des Nährmediums mittels einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 eingestellt.
Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die Änderung des pH-Wertes des Nährmediums gemäß der Alternative i) im Verfahrensschritt b) durch den Zusatz einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75, besonders bevorzugt von weniger als 0 und noch mehr bevorzugt von weniger als –1,5 erfolgt. Vorzugsweise handelt es sich bei dieser Base um ein Alkali- oder ein Erdalkalihydroxid, wobei Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid und Kalziumhydroxid besonders bevorzugt und Natriumhydroxid am meisten bevorzugt ist. Gleiches gilt auch für die Base gemäß der Alternative ii) im Verfahrensschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Weiterhin ist es insbesondere bevorzugt, dass es sich bei dieser Base um eine Base handelt, die keine Aminogruppe aufweist.
Wenn gemäß der vorstehend beschriebenen Variante A des erfindungsgemäßen Verfahrens die Mikroorganismen in der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension zunächst vom Nährmedium abtrennt, sodann gegebenenfalls gewaschen und anschließend mit einem neuen Nährmedium in Kontakt gebracht werden, in dem mittels einer der vorstehend genannten Basen der pH-Wert auf einen Wert im Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 eingestellt wird oder welches eine Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 enthält, so kann diese Base dem neuen Nährmedium vor oder nachdem die Mikroorganismen in diesem suspendiert werden, zugesetzt werden, wobei der Zusatz in trockener Form oder aber in Form einer wässrigen Stammlösung der Base zugesetzt werden kann. Wenn gemäß der vorstehend beschriebenen und erfindungsgemäß bevorzugten Variante B des erfindungsgemäßen Verfahrens die Mikroorganismen in der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension nicht vom Nährmedium abtrennt, sondern vielmehr durch den Zusatz einer der vorstehend genannten Basen in der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension der pH-Wert auf einen Wert im Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 eingestellt wird, so kann der Zusatz der Base zu der im Verfahrensschritt a) erhaltenen Zellsuspension ebenfalls in trockener Form oder aber in Form einer wässrigen Stammlösung erfolgen. Unabhängig davon, ob das Verfahren gemäß der Variante A oder der Variante B durchgeführt wird, wird gemäß der Alternative i) die Base stets in einer solchen Menge zugesetzt, dass der pH-Wert der Zellsuspension in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 liegt.
Im Verfahrensschritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismen in Gegenwart von Kohlenhydraten, vorzugsweise unter den vorstehend beschriebenen pH-Bedingungen kultiviert, so dass die Zellen Dihydroxyaceton aus den Kohlenhydraten bilden (Fermentationskultur). Als Kohlenhydrate, in deren Gegenwart die Zellen im Verfahrensschritt c) kultiviert werden, kommen insbesondere Kohlenhydrate ausgewählt aus der Gruppe umfassend, vorzugsweise bestehend aus, Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose in Betracht, wobei Glucose und Fructose besonders bevorzugt sind und Glucose am meisten bevorzugt ist. Die Konzentration dieser Kohlenhydrate im Nährmedium liegt üblicherweise in einem Bereich von 5 bis 100 g/l, besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 100 g/l und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 30 bis 40 g/l, wobei sich diese Mengenangaben vorzugsweise auf denjenigen Zeitpunkt beziehen, an dem i) der pH-Wert erstmals auf einen Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 eingestellt wurde, an dem ii) die Mikroorganismen erstmals in Kontakt mit der Base aufweisend einen pK_B-Wert von weniger als 4,75 in gebracht werden oder, was besonders bevorzugt ist, an dem erstmals der pH-Wert mittels einer Base aufweisend einen pK_B-Wert von weniger als 4,75 auf einen Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75 eingestellt wurde. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn während des gesamten Verfahrensschrittes c) durch den kontinuierlichen Zusatz von Kohlenhydraten die Kohlenhydrat-Konzentration innerhalb der vorstehend beschriebenen Bereiche gehalten wird, wobei dieser kontinuierliche Zusatz von Kohlenhydraten, insbesondere von Glukose in Form einer 30 bis 50 gew.-%igen Glukoselösung erfolgen kann.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Zellen im Verfahrensschritt c), vorzugsweise unter den im Verfahrensschritt b) gemäß Alternative i) eingestellten pH-Bedingungen bis zum Erreichen einer Dihydroxyaceton-Konzentration von mindestens 15 g/l, vorzugsweise mindestens 20 g/l und am meisten bevorzugt von mindestens 40 g/l in Gegenwart der Kohlenhydrate kultiviert werden. Üblicherweise dauert es etwa 5 bis 60 Stunden, besonders bevorzugt etwa 10 bis 35 Stunden, bis derartige Dihydroxyaceton-Konzentrationen im Nährmedium erhalten werden.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet dieses Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt der

d) Aufreinigung des Dihydroxyacetons aus dem die Mikroorganismen beinhaltenden Nährmedium,

Dieses, die Mikroorganismen beinhaltenden Nährmedium, welches nach Durchführung des Verfahrensschrittes c) die vorstehend genannten Konzentrationen an Dihydroxyaceton aufweist, basiert vorzugsweise auf

(α1) 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt 1 bis 10 Gew.-% Dihydroxyaceton,
(α2) 50 bis 99,98 Gew.-%, vorzugsweise 60 bis 97 Gew.-% und besonders bevorzugt 75 bis 93 Gew.-% Wasser,
(α3) 0,01 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-% und besonders bevorzugt 1 bis 5 Gew.-% Mikroorganismen, sowie
(α4) 0 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt 5 bis 10 Gew.-% von den Komponenten (α1), (α2) und (α3) verschiedene Zusatzstoffe beinhaltet,

In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die Aufreinigung des Dihydroxyacetons aus dem die Mikroorganismen beinhaltenden Nährmedium die folgenden Verfahrensschritte beinhaltet:

d1) Abtrennen zumindest eines Teils der Mikroorganismen aus dem Nährmedium unter Erhalt einer wässrigen Phase P1 beinhaltend Wasser und Dihydroxyaceton;
d2) Zugabe eines wasserlöslichen, organischen Lösungsmittels zu der wässrigen Phase P1 beinhaltend Wasser und Dihydroxyaceton unter Erhalt einer Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel;
d3) Abtrennen des Dihydroxyacetons zusammen mit dem organischen Lösungsmittel aus der Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel unter Erhalt einer stabilisierten Dihydroxyaceton-Phase beinhaltend Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel.

Im Verfahrensschritt d1) des Aufreinigungsverfahrens wird zumindest ein Teil der Mikroorganismen aus dem Nährmedium unter Erhalt einer wässrigen Phase P1 beinhaltend Wasser und Dihydroxyaceton abgetrennt. Diese Abtrennung kann mittels aller dem Fachmann bekannten Verfahren zur Abtrennung von Mikroorganismen aus Fermentationsbrühen erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Abtrennen der Mikroorganismen, in dem die Fermentationsbrühe über einen Filter mit einer geeigneten Ausschlußgröße geführt wird. Denkbar ist weiterhin der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder einer Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es sich als besonders vorteilhaft erweisen kann, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroor ganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.
Gemäß einer besonderen Ausgestaltung des Aufreinigungsverfahrens können die im Verfahrensschritt d1) erhaltenen, abgetrennten Mikroorganismen zumindest teilweise wieder in das erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Dihydroxyaceton zurückgeführt werden, in dem diese abgetrennten Mikroorganismen erneut in dem im Verfahrensschritt a) vorliegenden Nährmedium resuspendiert werden oder aber, nach der Änderung des pH-Wertes im Verfahrensschritt b), in dem im Verfahrensschritt c) vorliegenden Nährmedium resuspendiert werden.
Im Verfahrensschritt d2) des Aufreinigungsverfahrens wird der wässrigen Phase P1 beinhaltend Wasser und Dihydroxyaceton ein wasserlösliches, organisches Lösungsmittel zu unter Erhalt einer Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel zugesetzt. Denkbar ist auch, zumindest ein Teil dieses wasserlöslichen, organischen Lösungsmittels vor dem Abtrennen der Mikroorganismen aus dem im Verfahrensschritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen, Dihydroxyaceton beinhaltenden Zellsuspension dieser Zellsuspension zuzusetzen. Werden aus der so erhaltenen Zusammensetzung dann gemäß Verfahrensschritt d1) die Mikroorganismen abgetrennt, so wird ebenfalls eine Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel erhalten. Erfindungsgemäß bevorzugt ist jedoch der Zusatz des wasserlöslichen, organischen Lösungsmittels zum Nährmedium erst nach dem Abtrennen der Mikroorganismen.
Bei dem im Verfahrensschritt d2) zugesetzten, vorzugsweise wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel handelt es sich vorzugsweise um ein Polyalkylenglykol, vorzugsweise um einen Polyalkylenglykol, insbesondere um einen Polyethylenglykol oder einen Polypropylenglykol, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Diethylenglykol, Dipropylenglykol, Triethylenglykol, Tripropylenglykol, oder aber um Glycerin, wobei Glycerin als wasserlösliches, organisches Lösungsmittel am meisten bevorzugt ist.
Weiterhin ist es im Zusammenhang mit dem Zusatz des organischen Lösungsmittels zur wässrigen Phase P1 bevorzugt, dass das vorzugsweise wasserlösliche, organische Lösungsmittel in einem Gewichtsverhältnis organisches Lösungsmittel: in wässriger Phase P1 enthaltenem Dihydroxyaceton in einem Bereich von 1:1 bis 10:1, besonders bevorzugt in einem Bereich von 1:1 bis 5:1 und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 1:1 bis 3:1 eingesetzt wird.
Im Verfahrensschritt d3) des Aufreinigungsverfahrens wird das Dihydroxyaceton zusammen mit dem organischen Lösungsmittel aus der Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel unter Erhalt einer stabilisierten Dihydroxyaceton-Phase beinhaltend Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel abgetrennt. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass dieser Verfahrensschritt d3) durch Destillation in einer Destillationsvorrichtung, aufweisend mindestens eine Verdampfungsfläche und mindestens eine Kondensationsfläche, durchgeführt wird, wobei das Verhältnis der kürzesten Strecke x, die ein Molekül in der Dampfphase zurücklegen muss, um von einem beliebigen Punkt auf einer Verdampfungsfläche zu einem beliebigen Punkt auf der diesem Punkt am nächsten liegenden Kondensationsfläche zu gelangen, und der Fläche des Verdampfers A (x/A) höchstens 500 cm/m², besonders bevorzugt höchstens 250 cm/m², noch mehr bevorzugt höchstens 100 cm/m² und am meisten bevorzugt höchstens 50 cm/m² beträgt. Destillationsverfahren mit derart geringen Verhältnissen von x/A werden in der Fachliteratur auch als Kurzwegdestillation („Short Path Distillation”) bezeichnet. Es ist daher gemäß einer besonders Ausführungsform des Aufreinigungsverfahrens bevorzugt, dass der Verfahrensschritt d3) eine Kurzwegdestillation umfasst, mittels derer zumindest ein Teil des in der Phase P2 enthaltenen Wassers abgetrennt wird.
In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass die Destillation im Verfahrensschritt d3), insbesondere die Kurzwegdestillation, bei einem Druck in einem Bereich von 0,0001 bis 5 mbar, besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,0005 bis 1 mbar und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 0,001 bis 0,01 mbar und bei einer Temperatur in einem Bereich von 80 bis 140°C, besonders bevorzugt in einem Bereich von 90 bis 130°C und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 100 bis 120°C durchgeführt wird.
Weiterhin kann es im Zusammenhang mit dem Aufreinigungsverfahren vorteilhaft sein, wenn vor der Durchführung des Verfahrensschrittes d3) aus der wässrigen Phase P1 oder aus der Phase P2 zumindest ein Teil des Wassers, vorzugsweise mindestens 30 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mindestens 40 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 50 Gew.-% des in der wässrigen Phase P1 bzw. in der Phase P2 enthaltenen Wassers abgetrennt wird, wobei dieses Abtrennen vorzugsweise mittels Destillation erfolgt. Diese Destillation wird vorzugsweise in herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Destillationsvorrichtungen bei einem Druck in einem Bereich von 0,05 bis 0,1 bar und bei einer Temperatur in einem Bereich von 80 bis 120°C durchgeführt.
Die nach Durchführung des Aufreinigungsverfahrens erhaltene, stabilisierte Dihydroxyaceton-Phase beinhaltend Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel kann ohne weitere Aufreinigung beispielsweise zur Herstellung kosmetischer Zusammensetzungen eingesetzt werden. Es kann sich jedoch auch als vorteilhaft erweisen, wenn das Aufreinigungsverfahren den weiteren Verfahrensschritt

d4) des Abtrennens zumindest eines Teils des organischen Lösungsmittels aus der im Verfahrensschritt d3) erhaltenen, stabilitierten Phase unter Erhalt von Dihydroxyaceton,

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet Dihydroxyaceton, welches durch das eingangs beschriebene Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton umfassend die Verfahrensschritte a) bis c) erhältlich ist, insbesondere jedoch eine stabilisierte Phase, beinhaltend Dihydroxyaceton und ein organisches Lösungsmittel, welche durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton umfassend die Verfahrensschritte a) bis d) erhältlich ist.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen durch eine Oxidations- oder durch eine Reduktionsreaktion oder aber durch eine Kombination dieser Umsetzungsverfahren, bei der Dihydroxyaceton als Edukt eingesetzt wird, mindestens umfassend die Verfahrensschritte:

(β1) Bereitstellen von Dihydroxyaceton durch das eingangs beschriebene Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton umfassend die Verfahrensschritte a) bis c) oder Bereitstellen einer stabilisierten Phase, beinhaltend Dihydroxyaceton und ein organisches Lösungsmittel, erhalten durch das eingangs beschriebene Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton umfassend die Verfahrensschritte a) bis d);
(β2) Umsetzen des im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellten Dihydroxyacetons oder des Dihydroxyacetons, welches in der im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellten, stabilisierten Phase enthalten ist, in einer Oxidations- oder in einer Reduktionsreaktion oder aber in einer Kombination dieser Umsetzungsverfahren.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens zur Herstellung organischer Verbindungen wird das im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellte Dihydroxyaceton oder das Dihydroxyaceton, welches in der im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellten, stabilisierten Phase enthalten ist, in einer Oxidationsreaktion zu Acrolein oder weitere zu Acrylsäure umgesetzt. Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens zur Herstellung organischer Verbindungen wird das im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellte Dihydroxyaceton oder das Dihydroxyaceton, welches in der im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellten, stabilisierten Phase enthalten ist, in einer Reduktionsreaktion zu Glycerin umgesetzt.
Insbesondere kann die Umsetzung des Dihydroxyacetons zu Nachfolgeprodukten über eine Oxidations- oder eine Reduktionsreaktion auf chemischem oder auf biochemischem Weg erfolgen. Bei einer Kombination dieser Umsetzungsverfahren ist auch eine Kombination aus chemischen oder biochemischen Wegen denkbar.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin eine organische Verbindung, welche durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich ist.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin eine kosmetische Zusammensetzung, beinhaltend Dihydroxyaceton, welches durch das eingangs beschriebene Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton umfassend die Verfahrensschritte a) bis c) erhältlich ist, oder aber eine stabilisierte Phase, beinhaltend Dihydroxyaceton und ein organisches Lösungsmittel, welche durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton umfassend die Verfahrensschritte a) bis d) erhältlich ist, wobei es sich bei dieser kosmetischen Zusammensetzung vorzugsweise eine kosmetische und/oder dermatologische Lichtschutzformulierung oder aber um einen Selbstbräuner handelt. Derartige kosmetische Zusammensetzung enthalten üblicherweise neben dem Dihydroxyaceton bzw. neben der stabilisierten Phase, beinhaltend Dihydroxyaceton und ein organisches Lösungsmittel, Phospholipide sowie kosmetische Hilfsstoffe. Einzelheiten zur Zusammensetzung derartiger kosmetischer Zusammensetzungen können unter anderem DE-A-103 42 369 oder DE-A-199 49 826 entnommen werden.
Die Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Figuren, Testverfahren und Beispiele näher erläutert.
Es zeigt die 1 den Einfluss der Änderung des pH-Wertes des Nährmediums auf die Dihydroxyaceton-Bildung am Beispiel von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
Testverfahren
Bestimmung der optischen Dichte
Zur Bestimmung der OD₆₀₀ wurden dem Fermenter, im dem Verfahrensschritt a) durchgeführt wurde, Proben entnommen und entsprechende Verdünnungen mit Leitungswasser hergestellt, um eine Messung im linearen Bereich zu gewährleisten. Die Messung der Proben erfolgte mit dem Spektrophotometer Nicolet Evolution 100 gegen Wasser. Aus dem auf diese Weise erhaltenen Wert der vermessenen Probe für die optische Dichte wurde, unter Berücksichtung des zuvor gewählten Verdünnungsfaktors, auf die optische Dichte der unverdünnten, aus dem Fermenter genommenen Probe umgerechnet. Aus der optischen Dichte errechnet sich die Konzentration an Biotrockenmasse durch Multiplikation mit dem Faktor 0,2433: Biotrockenmassen-Konzentration [g/l] = 0,2433 g/l × OD600
Beispiel

Folgende Nährmedien wurden zur Kultivierung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-Wildtypzellen eingesetzt:

Komponenten	Aussaatmedium (g/l)	Wachstummedium (g/l)	Fermentationsmedium (g/l)
KH₂PO₄	1,0	2,0	2,0
K₂HPO₄	8,0	0	0
(NH₄)₂SO₄	5,0	5,0	5,0
MgSO₄ × 7H₂O	0,2	0,2	0,2
FeSO₄ × 7H₂O	0,02	0,02	0,02
MnSO₄ × H₂O	0,002	0,002	0,002
ZnSO₄ × 7H₂O	0,0005	0,0005	0,0005
CuSO₄ × 5H₂O	0,0002	0,0002	0,0002
CaCO₃	5,0	5,0	5,0
Citrat/Protocatechin	0,3	0,3	0,3
Biotin	0,0005	0,0005	0,0005
CSL¹⁾	5,0	5,0	5,0
NaCl	1,0	1,0	1,0
Threonin	0,15	0,15	0,15
Leucin	0,1	0,1	0,1
Methionin	0,04	0,04	0,04
Thiamin/B₁	0,001	0,001	0,001
Cyanocobalmin/B₁₂	0,001	0,001	0,001
Glucose	20,0	40,0	40,0

¹⁾ Caseinpepton-Sojabohnenpepton-Lösung

Vergleichsbeispiel
Herstellung einer Vorkultur:
Zunächst werden 40 ml des Aussaatmediums mit Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-Wildtypzellen inokuliert. Der pH-Wert des Mediums zu Beginn des Experimentes betrugt 6,8 und wurden nach 10 Stunden, sofern erforderlich, noch einmal auf 6,8 mittels Ammoniakwasser eingestellt. Die Kultivierungstemperatur betrug 33°C und die Anfangskonzentration an Glucose 20 g/l. Die Zellen wurden vermehrt, bis eine optische Dichte von etwa 20 (bzw. eine Biotrockenmasse-Konzentration von etwa 4,9 g/l) erreicht war.
Herstellung einer Wachstumskultur (Verfahrensschritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens):
Nachdem eine optische Dichte von etwa 20 bzw. eine Biotrockenmasse-Konzentration von etwa 4,9 g/l erreicht war, wurden in einem Fermenter 1 Liter Wachstumsmedium mit 40 ml der Zellkultur inokuliert. Dabei wurde der Fermenter mit einem Luftstrom (0,5 bis 1,5 Liter; pO₂ = 20%) begast und das Wachstumsmedium wurde mit 400 bis 1.800 UpM gerührt. Der pH-Wert wurde mittels 25%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,8 eingestellt. Die Anfangskonzentration an Glucose betrug 40 g/l. Die Biomasse-Produktion wurde bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 50 (bzw. einer Biotrockenmasse-Konzentration von etwa 12,1 g/l) fortgeführt. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Glucose-Konzentration 0,1 g/l.
Durchführung der Fermenationskultur (würde den Verfahrensschritten b) und c) des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen, sofern die Bedingungen i), ii) oder i) und ii) eingehalten würden):
Anschließend erfolgte die Bildung von Dihydroxyaceton. Dazu wurden zu 300 ml der vorstehend erhaltenen Wachstumskultur 700 ml Fermentationsmedium gegeben. Während der nunmehr erfolgenden, geringfügigen Bildung von Dihydroxyaceton wurde der pH-Wert weiterhin mittels 25 gew.-%igem Ammoniakwasser bei 6,8 gehalten. Über den Zusatz einer 40 gew.-%igen Glucoselösung wurde die Glucose-Konzentration im Fermenter auf einen Bereich von 5 bis 10 g/l gehalten. Die Bildung von Dihydroxyaceton wurde für einen Zeitraum von 21 Stunden verfolgt, wobei nach 3 Stunden, nach 5 Stunden, nach 14 Stunden und nach 21 Stunden Proben der Fermentationslösung genommen und die Zusammensetzung der Fermentationslösung mittels HPLC bestimmt wurde.
Beispiel 1
Es wurde wie im Vergleichsbeispiel verfahren, jedoch wurde zu einem Zeitpunkt, an dem die optische Dichte in der Fermentationskultur einen Wert von mehr als 100 (bzw. die Biotrocken masse-Konzentration einen Wert von mehr als etwa 24,3 g/l) erreicht hat oder zu einem Zeitpunkt, an dem sich die optische Dichte innerhalb eines Zeitraumes von 2 Stunden um nicht mehr als 5 (bzw. die Biotrockenmasse-Konzentration sich um nicht mehr als etwa 1,2 g/l) geändert hat (je nachdem, welches Ereignis früher eintritt), der pH-Wert nicht mittels 25 gew.-%igem Ammoniakwasser, sonders mittels einer 5 molaren NaOH-Lösung auf einen Wert von 6,8 gehalten (= Alternative ii) in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens).
Beispiel 2
Es wurde wie im Vergleichsbeispiel verfahren, jedoch wurde zu einem Zeitpunkt, an dem die optische Dichte in der Fermentationskultur einen Wert von mehr als 100 (bzw. die Biotrockenmasse-Konzentration einen Wert von mehr als etwa 24,3 g/l) erreicht hat oder zu einem Zeitpunkt, an dem sich die optische Dichte innerhalb eines Zeitraumes von 2 Stunden um nicht mehr als 5 (bzw. die Biotrockenmasse-Konzentration sich um nicht mehr als etwa 1,2 g/l) geändert hat (je nachdem, welches Ereignis früher eintritt), der pH-Wert nicht auf 6,8 gehalten, sondern auf einen pH-Wert 5,5 eingestellt (= Alternative i) in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens).
Beispiel 3
Es wurde wie im Vergleichsbeispiel verfahren, jedoch wurde zu einem Zeitpunkt, an dem die optische Dichte in der Fermentationskultur einen Wert von mehr als 100 (bzw. die Biotrockenmasse-Konzentration einen Wert von mehr als etwa 24,3 g/l) erreicht hat oder zu einem Zeitpunkt, an dem sich die optische Dichte innerhalb eines Zeitraumes von 2 Stunden um nicht mehr als 5 (bzw. die Biotrockenmasse-Konzentration sich um nicht mehr als etwa 1,2 g/l) geändert hat (je nachdem, welches Ereignis früher eintritt), der pH-Wert mittels einer 5 molaren NaOH-Lösung auf einen pH-Wert 5,5 eingestellt (= Alternative i) und ii) in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens).
Die im Vergleichsbeispiel und in den Beispielen 1 bis 3 ermittelten Dihydroxyaceton-Konzentrationen können der 1 entnommen werden. Aus der 1 wird ersichtlich, dass sowohl die Änderung des Neutralisierungsmittels (Ammoniakwasser ↔ Natronlauge) ohne Änderung des pH-Wertes als auch die Änderung des pH-Wertes (6,8 ↔ 5,5) ohne Änderung des Neutralisierungsmittels schon zu einer signifikanten Erhöhung der Dihydroxyaceton-Bildung führt. Die stärkste Dihydroxyaceton-Bildung lässt sich jedoch erzielen, wenn mittels der Zugabe von Natronlauge der pH-Wert auf einen Wert von 5,5 vermindert wird (siehe Beispiel 3).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 1136994 A [0003]
- DE 4341238 A [0003]
- DE 4444404 A [0005]
- EP 0245976 A [0006]
- GB 1009370 A [0016]
- DE 10342369 A [0049]
- DE 19949826 A [0049]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, Band 14, Seite 211 [0003]
- Kiefer et al. in „Comparative Metabolic Flux Analysis of Lysine-Producing Corynebacterium glutamicum Cultured on Glucose or Fructose”, Applied And Environmental Microbiology, Vol. 70 (1), Seiten 229–239 (2004) [0004]
- Wittmann et al. in „Metabolic Network Analysis of Lysine Producing Corynebacterium glutamicum at a Miniaturized Scale”, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87 (1), Seiten 1–6 (2004) [0004]
- Gubler et al. in ”Cloning of the Pyruvate Kinase Gene (pyk) of Corynebacterium glutamicum and Site-Specific Inactivation of pyk in a Lysine-Producing Corynebacterium lactofermentum Strain”, Applied And Environmental Microbiology, Vol. 60 (7), Seiten 2.494–2.500 (1994) [0004]
- Gubler et al. in ”Cloning of the Pyruvate Kinase Gene (pyk) of Corynebacterium glutamicum and Site-Specific Inactivation of pyk in a Lysine-Producing Corynebacterium lactofermentum Strain”, Applied And Environmental Microbiology, Vol. 60 (7), Seiten 2.494–2.500 (1994) [0015]
- Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) [0016]
- Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) [0016]
- Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) [0018]

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyaceton, mindestens beinhaltend die Verfahrensschritte: a) Kultivieren von Mikroorganismen, welche in der Lage sind, Kohlenhydrate zu Dihydroxyaceton umzusetzen, in einem Nährmedium, vorzugsweise bis zu Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse im Nährmedium von mindestens 12 g/l; b) i) Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums auf einen pH-Wert in einem Bereich von 4,5 bis 6.5, vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 5,25 bis 5,75, und/oder ii) in Kontakt bringen der Zellen mit einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75; c) Kultivieren der Mikroorganismen in Gegenwart von Kohlenhydraten, so dass die Zellen Dihydroxyaceton aus den Kohlenhydraten bilden.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kultivieren der Mikroorganismen im Verfahrensschritt a) bei einem pH-Wert von mehr als 5,75, vorzugsweise von mehr als 6,00 und besonders bevorzugt von mehr als 6,50 erfolgt.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Kontrolle des pH-Wertes im Verfahrensschritt a) durch den Zusatz von Ammoniak erfolgt.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei den im Verfahrensschritt a) eingesetzten Mikroorganismen um Bakterien-Zellen oder um Hefe-Zellen handelt.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei den Mikroorganismen um Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corynebakterium glutamicum-Zellen oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen handelt.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Kohlenhydrat um Glukose oder um Fruktose handelt.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums gemäß Alternative i) Verfahrensschritt b) i) durch den Zusatz einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 erfolgt.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums gemäß Alternative i) Verfahrensschritt b) i) durch den Zusatz einer Base mit einem pK_B-Wert von weniger als 4,75 erfolgt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die im Verfahrensschritt b) zur Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums ein Alkalihydroxid ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die im Verfahrensschritt b) zur Änderung des pH-Wertes des die Mikroorganismen umgebenden Nährmediums eingesetzte Base Natriumhydroxid ist.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen im Verfahrensschritt c) in dem im Verfahrensschritt b) neutralisierten Nährmedium bis zum Erreichen einer Dihydroxyaceton-Konzentration von mindestens 15 g/l in Gegenwart der Kohlenhydrate kultiviert werden.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt der d) Aufreinigung des Dihydroxyacetons aus dem die Mikroorganismen beinhaltenden Nährmedium beinhaltet.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Aufreinigung folgende Verfahrensschritte beinhaltet: d1) Abtrennen zumindest eines Teils der Mikroorganismen aus dem Nährmedium unter Erhalt einer wässrigen Phase P1 beinhaltend Wasser und Dihydroxyaceton; d2) Zugabe eines wasserlöslichen, organischen Lösungsmittels zu der wässrigen Phase P1 beinhaltend Wasser und Dihydroxyaceton unter Erhalt einer Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel; d3) Abtrennen des Dihydroxyacetons zusammen mit dem organischen Lösungsmittel aus der Phase P2 beinhaltend Wasser, Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel unter Erhalt einer stabilisierten Dihydroxyaceton-Phase beinhaltend Dihydroxyaceton und das organische Lösungsmittel.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Verfahrensschrott d3) durch Destillation in einer Destillationsvorrichtung, aufweisend mindestens eine Verdampfungsfläche und mindestens eine Kondensationsfläche, durchgeführt wird, wobei das Verhältnis der kürzesten Strecke x, die ein Molekül in der Dampfphase zurücklegen muss, um von einem beliebigen Punkt auf einer Verdampfungsfläche zu einem beliebigen Punkt auf der diesem Punkt am nächsten liegenden Kondensationsfläche zu gelangen, und der Fläche des Verdampfers A (x/A) höchstens 500 cm/m² beträgt.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verhältnis x/A höchstens 100 cm/m² beträgt.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verhältnis x/A höchstens 50 cm/m² beträgt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die Destillation bei einem Druck in einem Bereich von 0,0001 bis 5 mbar durchgeführt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei das Nährmedium im Verfahrensschritt d1) (α1) 0,01 bis 20 Gew.-% Dihydroxyaceton, (α2) 50 bis 99,98 Gew.-% Wasser, (α3) 0,01 bis 15 Gew.-% Mikroorganismen, sowie (α4) 0 bis 15 Gew.-% von den Komponenten (α1), (α2) und (α3) verschiedene Zusatzstoffe beinhaltet, wobei das Gesamtgewicht der Komponenten (α1) bis (α4) 100 Gew.-% beträgt.
Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das Abtrennen der Mikroorganismen aus der Fermenationslösung im Verfahrensschritt d1) durch Ultrafiltration erfolgt.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei vor Durchführung des Verfahrensschrittes d3) aus der wässrigen Phase P1 oder aus der Phase P2 zumindest ein Teil des Wassers abgetrennt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Abtrennen des Wassers aus der wässrigen Phase P1 oder aus der Phase P2 im Verfahrensschritt mittels Destillation erfolgt.
Das Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Destillation bei einem Druck in einem Bereich von 0,05 bis 0,1 bar und bei einer Temperatur in einem Bereich von 80 bis 120°C durchgeführt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei mindestens 50 Gew.-% des in der wässrigen Phase P1 oder in der Phase P2 enthaltenen Wassers abgetrennt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 23, wobei es sich bei dem im Verfahrensschritt d2) zugesetzten, vorzugsweise wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel um ein Polyalkylenglykol, vorzugsweise um ein Polyethylenglykol, oder um Glycerin handelt.
Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem im Verfahrensschritt d2) zugesetzten, vorzugsweise wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel um Glycerin handelt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 25, wobei im Verfahrensschritt d2) das vorzugsweise wasserlösliche, organische Lösungsmittel in einem Gewichtsverhältnis organisches Lösungsmittel: in wässriger Phase P1 enthaltenem Dihydroxyaceton in einem Bereich von 1:1 bis 10:1 eingesetzt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 26, wobei das Verfahren den Verfahrensschritt den weiteren Verfahrensschritt d4) Abtrennen des organischen Lösungsmittels aus der im Verfahrensschritt d3) erhaltenen, stabilisierten Phase unter Erhalt von Dihydroxyaceton, umfasst.
Dihydroxyaceton, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 12 oder 27.
Eine stabilisierte Phase, beinhaltend Dihydroxyaceton und ein organisches Lösungsmittel, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 26.
Ein Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen durch eine Oxidation- oder durch eine Reduktionsreaktion oder durch eine Kombination dieser Umsetzungsverfahren, bei der Dihydroxyaceton als Edukt eingesetzt wird, mindestens umfassend die Verfahrensschritte: (β1) Bereitstellen von Dihydroxyaceton durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 26, oder Bereitstellen einer stabilisierten Phase, beinhaltend Dihydroxyaceton und ein organisches Lösungsmittel, erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 26; (β2) Umsetzen des im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellten Dihydroxyaceton oder des Dihydroxyacetons, welches in der im Verfahrensschritt (β1) bereitgestellten, stabilisierten Phase enthalten ist, in einer Oxidation- oder in einer Reduktionsreaktion oder durch eine Kombination dieser Umsetzungsverfahren.
Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Umsetzen des Dihydroxyacetons auf chemischem oder auf biochemischem Weg erfolgt.
Eine organische Verbindung, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 31 oder 32.
Eine kosmetische Zusammensetzung, beinhaltend Dihydroxyaceton nach Anspruch 28 oder eine stabilisierte Phase nach Anspruch 29.
Die kosmetische Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei die kosmetische Zusammensetzung ein Selbstbräuner ist.