DE19838011A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Fettsäuremethylestern ("Biodiesel") auf Molkebasis - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Fettsäuremethylestern ("Biodiesel") auf MolkebasisInfo
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Description
Es wird ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von in
der Zusammensetzung mit Rapsölmethylester ("Biodiesel")
vergleichbaren Fettsäuremethylestern auf Basis von zuvor auf
verschiedenen Molkefraktionen hergestellten mikrobiellen
Triglyceriden angegeben. Dieses Verfahren ermöglicht sowohl
eine sinnvolle Verwertung des in großen Mengen und mit hoher
organischer Belastung und hohen CSB- und BSB-Werten als
landwirtschaftliches Abfallprodukt anfallenden Rohstoffes Molke
aus der milchverarbeitenden Industrie - weltweit fallen
jährlich ca. 115 Mio. Tonnen Molke pro Jahr an (Castillo, 1990,
in "Yeast", Marcel Dekker, New York), einige Firmen in
Deutschland verarbeiten bis zu 1 Mio. Liter Molke am Tag - als
auch die einfache und wirtschaftliche Herstellung von
Fettsäuremethylestern ("Biodiesel"), die zum Betreiben von
Dieselmotoren eingesetzt werden können.
Mikrobielle Triglyceride werden von verschiedenen
Mikroorganismen vor allem der Gattungen Cryptococcus,
Lipomyces, Rhodotorula, Trichosporon - sogenannten "Fetthefen" - und
Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Rhizopus,
Aspergillus und Penicillium bevorzugt unter
Stickstofflimitierung in Konzentrationen von bis zu 70% der
Zelltrockenmasse als Speicherstoffe gebildet (C. Ratledge
(1993) TIBTECH 11: 278-284).
Die Hefe Cryptococcus curvatus hat sich in verschiedenen
Screeningverfahren als besonders geeigneter Produzentenstamm
für die "Single Cell Oil"-Bildung erwiesen (M. Hassan et al.
(1994 a) J. Microbiol. Biotechnol. 10: 534-537; M. Hassan et
al. (1994 b) Biotechnol. Lett. 16: 819-824; L. Heredia and C.
Ratledge (1988) Biotechnol. Lett. 10: 25-30; N. J. Moon et al.
(1978) J. Dairy Sci. 61: 1537-1547).
Die mikrobiell gewonnenen Triglyceride zeigen nach den oben
genannten Arbeiten in etwa dieselbe Zusammensetzung wie
Pflanzenöle und lassen sich ohne Schwierigkeiten z. B. auf
Molkebasis ohne weitere Zusätze (N. J. Moon et al. (1978) J.
Dairy Sci. 61: 1537-1547) oder auch auf Holzhydrolysaten (L.
Heredia and C. Ratledge (1988) Biotechnol. Lett. 10: 25-30)
herstellen. Das mikrobielle Triglycerid aus der genannten Hefe
Cryptococcus curvatus ist mit ca. 50% der enthaltenen
Fettsäuren sehr reich an ungesättigter Ölsäure, die eine
Kettenlänge von 18 C-Atomen hat und auch Hauptbestandteil von
Rapsöl ist.
In Neuseeland gab es bereits Ende der achtziger Jahre
Bestrebungen, solche mikrobiellen Triglyceride großtechnisch
auf Molkebasis herzustellen und als Lebensmittel zu nutzen, um
so die enormen Abfälle der dortigen milchverarbeitenden
Industrie sinnvoll zu verwerten (C. Ratledge (1993) TIBTECH
11: 278-284). Trotz ihrer mit hochwertigen Pflanzenölen
vergleichbaren Zusammensetzung und Qualität, der Möglichkeit
zur schnellen und preiswerten Herstellung (1 Liter
entproteiniertes 20%iges Molkekonzentrat, das sich als Substrat
für die o.g. Mikroorganismen gut eignet, kostet in Deutschland
z. Zt. ca. 0,10 DM, daraus lassen sich innerhalb von 3-5
Tagen im Bioreaktor ca. 40 g/L Biotrockenmasse herstellen, die
bis zu 50% entsprechend ca. 20 g/L Triglycerid enthält), die im
Vergleich zu den pflanzlichen Produkten unter genau definierten
Bedingungen witterungsunabhängig und ohne Zusatz von Herbiciden
im Bioreaktor erfolgen kann, konnten sich diese Produkte jedoch
bisher am Lebensmittelmarkt nicht gegen pflanzliche Öle, wie z. B.
Sonnenblumenöl, Canolaöl oder Kokosfett und tierische Fette
behaupten. Der Grund dafür besteht einerseits in der
Kostenverzerrung durch die Subventionen für landwirtschaftliche
Verfahren im Gegensatz zu biotechnologischen, andererseits aber
auch darin, daß die mikrobiellen Produkte intrazellulär
vorliegen und sich die für einen späteren Einsatz als Speiseöl
oder Speisefett notwendige Freisetzung und Reindarstellung aus
den Mikroorganismen aufwendiger gestalten als bei den
vergleichbaren pflanzlichen und tierischen Produkten. Zur Zeit
gehen neuere Forschungsarbeiten dahin, durch gezieltes
Eingreifen in den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen
zu ungewöhnlichen Fettsäuren mit wesentlich höherer
Wertschöpfung (Vitaminvorstufen) zu kommen (Kettenlängen von
<18 C-Atomen mit bis zu 5 Doppelbindungen), die so nicht in
tierischen und pflanzlichen Fetten zu finden sind.
Mikrobiell gewonnene Triglyceride sind jedoch aufgrund ihrer
Zusammensetzung und einfachen und preiswerten Herstellung gut
dazu geeignet, um daraus Fettsäuremethylester, vor allem
Ölsäuremethylester herzustellen, die als Hauptkomponente bei
der Verarbeitung des landwirtschaftlich hergestellten Rapsöles
auftreten und als "Biodiesel" verwendet werden.
Ein entsprechendes Verfahren wurde in unserer Arbeitsgruppe
etabliert: In einem 2-stufigem kombiniertem
mikrobiellen/chemischen Prozeß wird dazu zunächst auf zuvor
kalt-sterilfiltrierten Molkefraktionen, bevorzugt auf
entproteiniertem Molkekonzentrat mit 20% Trockensubstanz, ohne
weitere Zusätze die fettbildende Hefe Cryptococcus curvatus
angezogen. Nach Eintreten der Stickstofflimitierung (nach ca.
24 h) bildet dieser Organismus intrazellulär ein Triglycerid,
das sehr reich an Ölsäure ist. Schließt man nach Beendigung der
Züchtung die Biomasse z. B. mechanisch mit einer Glasperlenmühle
oder einem Hochdruckhomogenisator auf und trennt - evtl. nach
vorheriger Pasteurisierung, die zu einer schnelleren Abtrennung
des Öls von den Zelltrümmern führt - das gewonnene Öl durch
Sedimentation oder Zentrifugation ab, kann dieses direkt nach
dem bekannten chemischem Verfahren zur Herstellung von
Fettsäuremethylestern verwendet werden, wobei als weiteres
Produkt von Wertschöpfung Glycerin entsteht, das einfach
abgetrennt werden kann.
Als weiteres wichtiges Ergebnis beobachtet man nach der
Kultivierung der Hefe Cryptococcus curvatus auf dem
Molkekonzentrat und der anschließenden Abtrennung der Biomasse
bzw. der Zelltrümmer und des Öls eine starke Reduktion der
CSB- und BSB-Werte in dem als Rest von der eingesetzten Molke
verbleibendem Kulturüberstand. Da die deproteinisierte Molke
bisher in das Abwasser gegeben wird und aufgrund der hohen
organischen Belastung für die molkeverarbeitenden Betriebe hohe
Abwassergebühren verursacht, könnten diese mit dem angegebenem
Verfahren ebenfalls deutlich reduziert werden.
Die Wirtschaftlichkeit des oben beschriebenen Verfahrens kann
deutlich gesteigert werden, wenn man zur Gewinnung der Biomasse
und des Triglycerides einen sognannten "repeated-batch"-Prozeß
einsetzt: Dabei trennt man nach erfolgter Kultivierung den
größten Teil (90-95%) der Kulturbrühe ab und arbeitet diesen
wie oben beschrieben auf. Die verbleibenden 5-10% beläßt man
im Bioreaktor und benutzt diese als Startkultur, nachdem man
diesen mit steriler Molke wieder aufgefüllt hat. Experimentell
konnte in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, daß sich dieses
Verfahren beliebig oft wiederholen läßt.
Einige molkeverarbeitende Unternehmen in Deutschland setzen am
Tag bis zu 1.000.000 Liter Molke um. Würde man nun eine Kaskade
großer Bioreaktoren (Volumen 100-200 m3) zur
biotechnologischen Herstellung der mikrobiellen Triglyceride
einsetzen und dieses "repeated batch"-Verfahren zur ihrer
Herstellung verwenden, wäre es möglich, parallel zu der täglich
anfallenden großen Molkemenge kontinuierlich mikrobielles
Triglycerid und daraus wiederum Fettsäuremethylester zu
produzieren.
Der jährliche Bedarf an Dieselöl liegt in der Bundesrepublik
Deutschland jährlich z. Zt. bei ca. 25 Mio. Tonnen. Davon sind
bisher jedoch nur 80.000 Tonnen, entsprechend 0.32%,
"Biodiesel" (aktuelle Auskunft des Bundesministeriums für
Landwirtschaft). Aus 1.000.000 Liter Molke (dem
durchschnittlichem täglichem Durchsatz eines mittelständischen
milchverarbeitenden Unternehmens) könnte man auf diese Art
täglich ca. 20.000 kg bzw. 20 Tonnen Triglycerid gewinnen, bzw.
im Jahr 7.300.000 kg entsprechend 7300 Tonnen. Stöchiometrisch
entspricht diese Menge nach Methylierung etwa derselben Menge
an Fettsäuremethylester. Diese Menge würde damit rechnerisch
schon 10% der jährlichen "Biodiesel"-Produktion der BRD auf
Rapsölbasis entsprechen. Bei flächendeckender Einführung des
Verfahrens könnte die biotechnologische "Biodiesel"-Herstellung
auf Molkebasis einen entscheidenden Beitrag zur Deckung des
"Biodiesel"-Bedarfes der BRD leisten und gleichzeitig die
Abwasserbelastung durch die Molkeeinleitung deutlich
reduzieren. Aus den nach Zellaufschluß verbleibenden
Zelltrümmern könnte zusätzlich vitaminreicher und fettarmer
Hefeextrakt für eine Verwendung im Lebensmittel- oder
Tierfutterbereich hergestellt werden.
Kostenmäßig könnte ein entsprechendes biotechnologisches
Verfahren - das im Gegensatz zur Rapsölherstellung unabhängig
von Jahreszeit und Klimaeinflüssen durchführbar wäre - eine
interessante Ergänzung zur bisherigen landwirtschaftlichen
Herstellung von Rapsölmethylester ("Biodiesel") darstellen.
Auch kostenmäßig sollte ein solches Verfahren durchaus
konkurrenzfähig sein. Der Herstellungspreis für "Biodiesel"
beträgt z. Zt. ca. 1.07 DM/Liter, die Rohstoffkosten für das
verwendete 20% deptoteinisierte Molkekonzentrat sind äußerst
niedrig, und Kosten wie für den Einsatz landwirtschaftlicher
Maschinen, die Anwendung von Herbiciden und Düngemitteln und
evtl. auch von Wasser zum Sprengen würden ebensowenig entstehen
wie für Ernte und den Transport der Rapspflanzen zur Ölmühle
und eine Entsorgung des Pflanzenmaterials. Die für das
biotechnologische Verfahren notwendigen Investitionen für
Bioreaktoren, Zellaufschlußgeräte und Separatoren für die
Ölabtrennung und Methylierung wären überschaubar.
Das vorgestellte Verfahren könnte industriell für alle
mittelständischen und großen molkeverarbeitenden Betriebe von
großem Interesse sein, da sie so nicht nur ein wichtiges
Massenprodukt aus den anfallenden Molkeabfallfraktionen
herstellen könnten, sondern gleichzeitig auch die
Umweltbelastung aufgrund der hohen BSB- und CSB-Werte der
Molkeabfallfraktionen deutlich reduzieren und somit
Abwassergebühren sparen bzw. auf z. Zt. durchgeführte
aufwendige Verfahren zum Aufkonzentrieren der Molke z. B. für
die Schweinemast - auch hier bereitet Molke aufgrund der hohen
Lactosekonzentration und der damit verbundenen
Unverträglichkeit Probleme - verzichten könnten.
Der Mikroorganismus Cryptococcus curvatus ATCC 20509 wird in
einem 3-l-Bioreaktor auf zuvor steril filtrierten
deproteinisierten Molkekonzentrat mit 20% Trockengewichtsanteil
(Firma Milei GmbH Leutkirch-Adrazhofen, Allgäu;
Zusammensetzung: 110 g/l Lactose, 2 g/l Galaktose, 1 g/l
Glukose, 0.1 g/l Ammonium, Proteingehalt <1g/l) als einziger
Kohlen- und Stickstoffquelle bei 30°C, 400 Upm und
Sauerstoffsättigung gezüchtet. Der pH-Wert wird dabei mit
steriler 10% NaOH-Lösung (w/w) bzw. 10% Phosphorsäure (v/v)
auf pH 5.5 bis 5.8 konstant gehalten. Zum Beimpfen des
Bioreaktors werden 200 ml einer 24 Stunden zuvor bei 30°C und
100 Upm im Schüttelkolben auf einer Schüttelmaschine
kultivierten Vorkultur der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC
20509 auf Molkekonzentrat mit 20% Trockengewichtsanteil, pH
5.8, genommen. Diese Vorkultur ist zuvor beimpft worden mit
einer Impföse von einem Schrägagarröhrchen von Cryptococcus
curvatus ATCC 20509 auf ME-Agar (Zusammensetzung: 200 g/l
Malzextrakt, 5 g/l Pepton, 15 g/l Agar in 1000 ml destilliertem
Wasser).
Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 im
Bioreaktor ist nach ca. 100-140 h beendet, sobald die Lactose
vollständig verbraucht ist. Unter dem Mikroskop ist erkennbar,
daß die Hefezellen sich nicht mehr teilen und intrazellulär
Triglycerid in Form deutlich erkennbarer Fetttröpfchen gebildet
haben. Pro Liter sind bei Abbruch der Kultur ungefähr 30-40
g/l Biotrockenmasse entsprechend 120-160 g/l Biofeuchtmasse
mit ca. 15-20 g/l Triglycerid gebildet worden. Dessen
Zusammensetzung ist so, daß je ein Molekül Glycerin mit ca.
zwei Molekülen Ölsäure und einem Molekül Palmitin- oder
Stearinsäure verestert ist.
Die so gewonnene Kulturbrühe wird direkt in bekannter Weise mit
einer Glasperlenkugelmühle (Bedingungen: Dyno-Mill KDL, Firma
Bachofen, ausgestattet mit einem 150 ml Mahlgefäß, das zu
80-85% mit 0.3 mm großen Glasperlen gefüllt ist und während des
Aufschlusses auf 20°C gekühlt wird; 3200 Upm; Aufschlußzeit ca.
20 min) oder einem Hochdruckhomogenisator aufgeschlossen und in
ein Sedimentationsgefäß überführt. Dort erfolgt eine Trennung
in Zelltrümmer, wäßrige Phase und Fettphase.
Zur Herstellung der Fettsäuremethylester werden 155 g der
Ölphase mit 1,5 g KOH, die zuvor in 45 ml Methanol gelöst
wurden, versetzt und zwei Stunden lang durch Rühren vermischt.
Danach ergeben sich zwei Phasen: Glycerin als schwerere Phase
sammelt sich am Boden an, die Fettsäuremethylester als
leichtere Phase darüber. Die obere Phase wird abgenommen, und
vorsichtig mit Wasser gewaschen, um ein Emulgieren zu
verhindern. Als Endausbeute werden 128 g Fettsäuremethylester
gewonnen, die eine Zusammensetzung von ca. 50% Ölsäure- und je
25 Palmitinsäure- und Stearinsäuremethylester haben.
Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 erfolgt
wie in Beispiel 1 beschrieben. Direkt nach Verbrauch der
Kohlenstoffquelle Lactose werden 90% der Kulturbrühe abgelassen
und durch frisches, steriles Molkepermeat ersetzt. Die im
Bioreaktor verbleibenden 10% Kulturbrühe dienen als Inokulum
für eine erneute Kultivierung der Hefe Cryptococcus curvatus
ATCC 20509. Diese als "repeated batch-Prozeß" bezeichnete
Verfahrensweise wird fünfmal wiederholt.
Die Aufarbeitung der Kulturbrühe und die Herstellung der
Fettsäuremethylester erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 erfolgt
wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben. Nach Abbruch der
Kultivierung wird die Kulturbrühe bei 4-8°C bis zum
Aufschluß und der anschließenden Herstellung der
Fettsäuremethylester gelagert.
Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 erfolgt
wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben. Nach Abbruch der
Kultivierung wird die Kulturbrühe bei -20°C eingefroren und bis
zum Aufschluß und der anschließenden Herstellung der
Fettsäuremethylester gelagert.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Fettsäuremethylestern
("Biodiesel") mit Mikroorganismen der Gattungen Cryptococcus,
Lipomyces, Rhodotorula, Trichosporon, Cunninghamella, Rhizopus,
Aspergillus oder Penicillium auf Basis von Molke als einziger
assimilierbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle ohne weitere
Zusätze gewonnene Triglyceride eingesetzt werden, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus die Hefe
Cryptococcus curvatus auf verschiedenen Molkefraktionen
züchtet, die Zellen aufschließt, und das so gewonnene
Triglycerid im Anschluß zur chemischen Herstellung von
Fettsäuremethylestern einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Anzucht des und zur Triglyceridbildung durch den Mikroorganismus
Cryptococcus curvatus Süßmolke, Sauermolke, Konzentrate davon
oder in Wasser gelöstes Molkepulver verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Zellen des Mikroorganismus Cryptococcus curvatus durch
chemische, enzymatische oder physikalisch-mechanische Methoden,
vorzugsweise mit Glasperlenmühlen oder Hochdruck
homogenisatoren, aufschließt.
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