Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 durch anaerobe Fermentation In der britischen Patentschrift Nr. 748043 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin-B12 Konzentraten beschrieben, in welchem als Ausgangs stoffe Faulschlamm oder andere durch Methan gärung erzeugte Produkte verwendet werden. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass das Vitamin B12 im Laufe der Methangärung von Bakterien ge bildet wird.
Es war jedoch bisher ungeklärt, ob in der Produktion der Substanz sämtliche Bakterien der Methangärung eine Rolle spielen oder aber nur ein zelne Stämme Vitamin 1312 produzieren und daneben auch indifferente, ja sogar vitaminverbrauchende Bakterien zugegen sind.
Es wurde versucht, durch Isolierung der einzelnen Bakterienstämme der gemischten Bakterienflora des Faulschlammes festzustellen, welche vitaminproduzie rend sind, zu dem Zwecke, durch Sicherstellung der optimalen Lebensbedingungen dieser Stämme die Vitaminausbeute im Faulschlamm zu erhöhen. Im Laufe dieser Versuche ist es auch gelungen, etwa 20 verschiedene Bakterienstämme aus dem Faulschlamm zu isolieren.
Bei der Untersuchung dieser Stämme hinsichtlich ihrer B12 Erzeugung wurde aber fest gestellt, dass der überwiegende Teil derselben über haupt kein Vitamin B12 produziert, während man auch von der restlichen geringeren Anzahl der Stämme nur unbedeutende Mengen dieses Vitamins erhalten kann.. Hierdurch wurde die Annahme be stätigt, dass in der reichen Flora des Faulschlammes eine grosse Anzahl der Bakterienstämme hinsichtlich der Vitamin-B12 Produktion nicht ausschlaggebend ist. Die Frage jedoch, welches Bakterium bzw. welche Bakteriengruppe die aktive Substanz erzeugt, blieb unbeantwortet.
Zur Lösung dieser Frage musste daher eine andere Methode herangezogen werden, und zwar die Ermittlung derjenigen Phase der Faulschlamm gärung, in welcher man im Laufe der bakteriellen Zersetzung des ausserordentlich komplexen Nähr bodens Vitamin B12 erhalten kann.
Es wurde derart vorgegangen, dass Versuchs- fermentoren mit Faulschlamm beschickt wurden, und dieser wurde mit einer anorganische Salze enthalten den Nährflüssigkeit versetzt;
dann wurde dieser Nährboden bei den einzelnen Versuchen noch jeweils mit variablen Komponenten - Proteinen, Kohlehydra ten, Alkoholen, Fettsäuren usw. - ergänzt. Der Ver lauf der Vitamin-B"-Produktion während der Fer mentation wurde beobachtet und auch das Verhältnis von Vitamin B12 zu den B12 artigen Faktoren jeweils ermittelt, ferner wurde der Verlauf der Gasentwick lung beobachtet.
Es konnte festgestellt werden, dass eine bedeutende Vitamin-B12 Ausbeute lediglich bei jenen Versuchen erreicht werden konnte, bei welchen niedrige Alkohole, vorzugsweise Äthylalkohol, dem synthetischen Nährboden zugesetzt worden sind, und zwar bei jenen Versuchen, bei welchen auch Car- bonate bzw. C02 in der Gärflüssigkeit anwesend waren.
In jenen Versuchen, die mit Zusatz von hoch molekularen Kohlehydraten (Stärke, Zellulose) durch geführt wurden, konnte ebenfalls eine erhöhte Vitamin-B12 Produktion beobachtet werden, die aber in einer späteren Phase der Fermentation eingetragen ist; dies ist vermutlich auf die Bildung von Alkoholen im Laufe der Vergärung zurückzuführen.
Diese Versuche führten somit zum Ergebnis, dass die Produktion von Vitamin B12 <B>Im</B> Laufe der Methangärung durch die Gegenwart von Alkoholen mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gefördert wird; es können sowohl primäre als auch sekundäre Alkohole, ferner auch andere Stoffe, die im Laufe der Methan gärung derartige Alkohole bilden, die Erzeugung von Vitamin B12 günstig beeinflussen. Auch die Gegen wart von C02 oder von Stoffen, z.
B. Carbonaten, die im Laufe der Methangärung C02 bilden können, ist erforderlich.
Die Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 durch anaerobe Kultivierung von Vitamin B12 erzeugenden Mikro organismen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man dem Nährmedium oder der Kultur einen primären oder sekundären Alkohol mit 2 bis 5 C-Atomen und Kohlendioxyd zusetzt.
Es ist selbstverständlich, dass durch die verschie den zusammengesetzten Nährflüssigkeiten jeweils die Entwicklung bzw. das überhandnehmen verschie dener Bakterienarten gefördert worden ist. Insofern diese Umwandlung der Flora von einer Veränderung der Vitamin-B.2Ausbeute begleitet wird, kann man daraus folgern, dass diese Veränderung von der ge steigerten oder erhöhten Vitamin-B12-Erzeugung des fraglichen Bakteriums hervorgerufen wird.
Ausser der Tatsache, dass eine optimale Ausbeute durch Zu- Satz von Alkoholen der genannten Art und CO, er reicht wird, wurde ferner in einigen Fällen festge stellt, dass sich im Laufe der Gärung Methangas bildet, was auf eine bestimmte Bakterienart schlie ssen lässt, nämlich auf das Methanobakterium Ome- lianskii aus der Gruppe der Kyver van Nielschen Methanobakterien (s. Bergeys Manual of Det. Bact., 6. Auflage, 1948;
H. Henkelekian, H. Heinemann, Sewage Works J., 11-426, 1939, und H. A. Barker, J. Biol. Chem. 137,<B>153,</B> 1941). Dies ist um so über raschender, als Methanobakterium Omelianskii bisher nicht als Vitamin B12 erzeugender Mikroorganismus gegolten hat, obwohl seine Gegenwart im Faul schlamm nachgewiesen wurde.
Gemäss der vorgangs zitierten Literatur gewinnt das genannte Bakterium die zum Wachstum erfor derliche Energie vorzugsweise aus der Umwandlung von Alkoholen und C02 in Fettsäuren und Methan z. B. nach der folgenden Gleichung:
-2C2H50H + C02 + 2H20 --> 2CH3COOH + CH4 + 2H,0 Die entstandene Fettsäure wird dann, falls Faul schlamm im Nährmedium enthalten ist, im weiteren Verlauf der Methangärung von den übrigen im Faul schlamm enthaltenen Bakterien zu C02 und CH4 zersetzt.
So wird durch den Zusatz von Alkoholen auch das Wachstum der mit dem Methanobakterium Omelianskii symbiotisch lebenden fettsäurezersetzen- den Bakterien des Faulschlammes aufrechterhalten. Diese Symbiose kann und soll auch nicht vermieden werden, da die säurezersetzenden Mikroorganismen durch Zersetzung der metabolischen Produkte des Vitamin Bi. erzeugenden Methanobakterium Ome- lianskii und durch Erzeugung eines Teils der erfor derlichen Kohlensäure für die Vermehrung desselben förderlich sind.
Aus den hohen Ausbeuten an Vitamin B1, beim erfindungsgemässen Verfahren und aus den mit an dern Nährbodenzusätzen erzielten negativen Ergeb nissen sowie aus den oben beschriebenen physiolo gischen Eigenschaften des Methanobakterium Ome- lianskii kann mit Sicherheit gefolgert werden, dass das Vitamin B12 nicht ausschliesslich, jedoch hauptsäch lich, von Methanobakterien und in erster Linie vom Methanobakterium Omelianskii erzeugt wird.
Vorzugsweise wird derart verfahren, dass man ein mit Methanobakterium Omelianskii beimpftes synthetisches Nährsubstrat verwendet.
Die Nährflüssigkeit der Fermentation enthält in der Regel die bei bekannten Verfahren verwendeten üblichen anorganischen Salze. Zusätzlich zu den Al koholen und dem CO, können auch Kohlehydrate zugesetzt werden, die durch alkoholische Gärung entsprechende Alkohole und C02 liefern, wie. z. B. Melasse, sofern in der Fermentationslösung auch Mikroorganismen anwesend sind, die als Erreger der alkoholischen Gärung wirken, was man z. B. durch Zusatz von Hefe erreichen kann.
Man kann derart verfahren, dass man ein synthe tisches Nährsubstrat, das z. B. Hefe enthält, mit Me- thanobakterium Omelianskii beimpft. Das Nähr medium kann aber auch mit Faulschlamm beimpft werden.
Die Fermentation kann in einem einfachen, mit Rührwerk versehenen geschlossenen Behälter unter septischen Bedingungen durchgeführt werden. Man kann z. B. so vorgehen, dass man die Gärflüssigkeit mit Faulschlamm beimpft und täglich eine gewisse Menge Nährflüssigkeit zusetzt, bis der Fermentor aufgefüllt ist. Danach wird der normale kontinuier liche Betrieb des Fermentors derart fortgesetzt, dass gleichzeitig mit den täglichen Nährbodenzusätzen eine gleiche Menge Fermentationsflüssigkeit abge zogen wird.
<I>Beispiel 1</I> Ein 1000-ml-Gefäss wird mit 480 ml gut gären dem Faulschlamm (Vitamin-Bi.-Gehalt etwa 0,3 ;"\ml) versetzt. Hierzu werden 120 ml der folgenden Nähr lösung zugesetzt:
EMI0002.0085
Äthylalkohol <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> NH4C1 <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 0,04 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> * <SEP> 7<B><U>11</U></B>1)0 <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> CoCh <SEP> - <SEP> 6H,0 <SEP> 0,0004 <SEP> g
<tb> Lufttrockenes <SEP> Bierhefepulver <SEP> 0,002 <SEP> g ergänzt mit Wasser auf<B>100</B> ml.
Es werden pro Stunde etwa 200 ml CO<B><U>.,</U></B> gleich mässig eingeleitet und das Reaktionsgemisch während <B>150</B> Tagen bei 28 C und bei einem pH - 7,0 bis 7,4 gehalten. Nach je 3 Tagen werden jeweils 120 ml Gärmischung abgezogen und gleichzeitig eine iden tische Menge der Nährlösung eingetragen. Vitamin- B12-Gehalt der abgezogenen Proben: 0,5 bis 0,6 ;,,\ml, Trockensubstanzgehalt: <B>1,1</B> gi100 ml. Tägliche Aus beute: 37 ;,JLiter Fermentorvolumen.
<I>Beispiel 2</I> In einem 20-Liter-Gärbottich wird mittels 5 1 eines gut gärenden Faulschlammes eine Fermentation bei 37 C in Gang gesetzt. Der Schlamm enthält 0,44 ;@(ml Vitamin Bi., bei einem Trockensubstanz- gehalt von 2,7 g(100 ml. Zu Beginn der Fermentation wird zweitägig eine Nährlösung folgender Zusammen setzung zugesetzt:
EMI0003.0004
Äthylalkohol <SEP> 5,6 <SEP> ml
<tb> CaCO3 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> NH4C1 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> Co(N03)3 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> 0,003 <SEP> g
<tb> gemahlene <SEP> Rübenschnitzel
<tb> (ausgelaugt) <SEP> 2,8 <SEP> g
<tb> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 560 <SEP> ml <SEP> ergänzt.
Nach der Auffüllung des Fermentors entnimmt man (stets nach Verrühren des Bodensatzes) täglich 560 ml Fermentsaft und ergänzt den Inhalt des Fermentors mit der gleichen Menge der obigen Nähr lösung. Der Vitamin-131.-Gehalt der abgezogenen Proben wird nach Ablauf von 2 Wochen konstant, 0,6 ;,(ml, bei einem Trockensubstanzgehalt von 1,2 g/100 ml.
Gebildete Gasmenge: täglich etwa 7 bis 9000 ml. Ausbeute: täglich 22 ;, Vitamin B12 pro Liter Fermentorvolumen.
<I>Beispiel 3</I> Man beschickt einen 800-m3-Fermentor mit 680 m- Faulschlamm mit einem Vitamin-B"-Gehalt von 0,18 y(ml, und setzt 120 m3 Nährlösung folgen der Zusammensetzung zu: Alkohol 1,0 Q/0- Na2C03 0,411/9 und die üblichen Nährsalze gemäss den vorangehen den Beispielen.
Vom dritten Tage an werden nach Durchrühren des Fermentorinhalts täglich 40 m3 Fermentationsflüssigkeit abgezogen und gleichzeitig das gleiche Volumen der obigen Nährlösung eingetra gen. Die abgezogene Flüssigkeit wird immer klarer und ihr Vitamin-Bi.-Gehalt entsprechend höher.
Nach 20 bis 25 Tagen wird der Saft gleichmässig klar und enthält im Durchschnitt 0,35 y/ml Vitamin B12 bei einem Trockensubstanzgehalt von 0,54 g/100 ml. Ausbeute: täglich 17 y , berechnet auf 1 Liter Fer- mentor-Volumen.
Die täglich abgezogene Fermentationsflüssigkeit kann zur Gewinnung des Vitamins B12 in üblicher Weise aufgearbeitet werden. Da der gebildete Wirk stoff in Bakterienkörper eingelagert ist, bringt man vorzugsweise lediglich die durch Filtrieren oder Sedi- mentation getrennten Bakterienkörper zur Weiter verarbeitung. <I>Beispiel 4</I> In einem 200-Liter-Fermentor wird als Methano- bakterium-Impfmaterial 100 Liter nach dem Beispiel 2 hergestellte Fermentationsflüssigkeit eingesetzt.
Die Fermentationsflüssigkeit wurde mit 500 ml einer auf einem Melasse-Nährboden in üblicher Weise herge stellten Saccharomyces-Kultur beimpft, und danach setzt man zwei- bis viertägig 20 1 Nährlösung folgen der Zusammensetzung zu:
EMI0003.0051
Alkohol <SEP> <B>1,0,1/0</B>
<tb> Na2C03 <SEP> 0,4,1/0
<tb> Melasse <SEP> 1,Ofl/o C0C12 <SEP> ' <SEP> 6H20 <SEP> <B>0,000111/0.</B> Sobald das Volumen 200 1 erreicht hat, werden täglich 12 1 Fermentationsflüssigkeit abgezogen und die gleiche Menge Nährlösung eingetragen. Die ent nommenen Anteile enthalten 0,80 yiml Vitamin B12, die tägliche Ausbeute beträgt pro Liter Fermentor <I>48 y.</I>
Aus den nach den Beispielen erhaltenen Roh produkten kann die aktive Substanz mittels bekann ter Methoden gewonnen werden.
Die Fermentation mittels Methanobakterium Omelianskii kann auch mit andern alkoholbildenden Bakterien, wie z. B. mit butylogenen Clostridien, auf einem stärkehaltigen Nährboden verbunden werden oder mit zellulosezersetzenden Bakterien auf einem zellulosehaltigen industriellen Abfallmaterial. Die symbiotische Funktion dieser Stämme ermöglicht die Verwendung billiger Nährbodenquellen; anderseits können, wie bekannt, einzelne dieser Stämme, wie z.
B. die butylogenen Clostridien, das Vitamin-B1.- Niveau erhöhen.
Process for the production of vitamin B12 by anaerobic fermentation In the British patent specification No. 748043 a process for the production of vitamin B12 concentrates is described, in which digested sludge or other products produced by methane fermentation are used as starting materials. It was also possible to prove that vitamin B12 is formed by bacteria during methane fermentation.
However, it has not yet been clarified whether all methane fermentation bacteria play a role in the production of the substance or whether only individual strains produce vitamin 1312 and also indifferent, even vitamin-consuming bacteria are present.
Attempts were made to isolate the individual bacterial strains of the mixed bacterial flora of the digested sludge to determine which vitaminproduzie rend, for the purpose of increasing the vitamin yield in the digested sludge by ensuring the optimal living conditions of these strains. In the course of these experiments it was also possible to isolate around 20 different bacterial strains from the digested sludge.
When examining these strains with regard to their B12 production, it was found that the majority of them produce no vitamin B12 at all, while only insignificant amounts of this vitamin can be obtained from the remaining smaller number of strains. This led to the assumption be confirms that in the rich flora of digested sludge, a large number of bacterial strains are not decisive for vitamin B12 production. However, the question of which bacterium or which group of bacteria produced the active substance remained unanswered.
To solve this question, another method had to be used, namely the determination of the phase of digested sludge fermentation in which vitamin B12 can be obtained in the course of bacterial decomposition of the extremely complex nutrient medium.
The procedure was such that test fermentors were charged with digested sludge, and this was mixed with a nutrient liquid containing inorganic salts;
then this nutrient medium was supplemented with variable components - proteins, carbohydrates, alcohols, fatty acids, etc. - in the individual experiments. The course of vitamin B "production during fermentation was observed and the ratio of vitamin B12 to the B12-like factors was determined in each case, and the course of gas development was also observed.
It was found that a significant vitamin B12 yield could only be achieved in those experiments in which lower alcohols, preferably ethyl alcohol, were added to the synthetic nutrient medium, namely in those experiments in which carbonates or CO 2 were present in the fermentation liquid.
In those experiments that were carried out with the addition of high molecular weight carbohydrates (starch, cellulose), an increased vitamin B12 production could also be observed, but this is entered in a later phase of the fermentation; this is probably due to the formation of alcohols in the course of fermentation.
These experiments thus led to the result that the production of vitamin B12 is promoted in the course of methane fermentation by the presence of alcohols with 2 to 5 carbon atoms; Both primary and secondary alcohols, as well as other substances that form such alcohols in the course of methane fermentation, can favorably influence the production of vitamin B12. Even the presence of C02 or substances, e.g.
B. Carbonates, which can form C02 in the course of methane fermentation, is required.
The invention now relates to a process for the production of vitamin B12 by anaerobic cultivation of vitamin B12-producing microorganisms, which is characterized in that a primary or secondary alcohol with 2 to 5 carbon atoms and carbon dioxide is added to the nutrient medium or the culture .
It goes without saying that the various nutrient fluids that have been put together have promoted the development or the prevalence of various types of bacteria. Insofar as this transformation of the flora is accompanied by a change in the vitamin B.2 yield, it can be concluded from this that this change is caused by the increased or increased vitamin B12 production of the bacterium in question.
In addition to the fact that an optimal yield is achieved by adding alcohols of the type mentioned and CO, it was also found in some cases that methane gas is formed in the course of fermentation, which suggests a certain type of bacteria, namely to the methanobacterium Omelianskii from the group of Kyver van Nielschen methanobacteria (see Bergeys Manual of Det. Bact., 6th edition, 1948;
H. Henkelekian, H. Heinemann, Sewage Works J., 11-426, 1939, and H. A. Barker, J. Biol. Chem. 137, 153, 1941). This is all the more surprising as methanobacterium omelianskii has not yet been considered a microorganism producing vitamin B12, although its presence in the digested sludge has been proven.
According to the literature cited in the process, said bacterium gains the energy required for growth, preferably from the conversion of alcohols and CO 2 into fatty acids and methane z. B. according to the following equation:
-2C2H50H + C02 + 2H20 -> 2CH3COOH + CH4 + 2H, 0 The resulting fatty acid is then, if digested sludge is contained in the nutrient medium, decomposed by the other bacteria contained in the digested sludge to C02 and CH4 in the further course of the methane fermentation.
By adding alcohols, the growth of the digested sludge symbiotically living fatty acid-decomposing bacteria with the methanobacterium Omelianskii is maintained. This symbiosis cannot and should not be avoided, since the acid-decomposing microorganisms are conducive to its reproduction by decomposing the metabolic products of the vitamin B-producing methanobacterium Omelianskii and by producing part of the carbonic acid required.
From the high yields of vitamin B1, in the process according to the invention and from the negative results achieved with other nutrient additives as well as from the physiological properties of the methanobacterium Omelianskii described above, it can be concluded with certainty that vitamin B12 is not exclusively, but mainly lich, is produced by methanobacteria and primarily by the methanobacterium Omelianskii.
The preferred procedure is to use a synthetic nutrient substrate inoculated with Methanobacterium Omelianskii.
The nutrient liquid of the fermentation usually contains the usual inorganic salts used in known processes. In addition to the alcohols and the CO, carbohydrates can also be added which, through alcoholic fermentation, provide corresponding alcohols and CO 2, such as. z. B. molasses, provided that microorganisms are also present in the fermentation solution that act as the causative agent of alcoholic fermentation, which can be done e.g. B. can be achieved by adding yeast.
One can proceed in such a way that one synthe tical nutrient substrate that z. B. contains yeast, inoculated with methanobacterium Omelianskii. The nutrient medium can also be inoculated with digested sludge.
The fermentation can be carried out in a simple closed container with a stirrer under septic conditions. You can z. B. proceed in such a way that the fermentation liquid is inoculated with digested sludge and a certain amount of nutrient liquid is added daily until the fermentor is filled. The normal, continuous operation of the fermenter is then continued in such a way that an equal amount of fermentation liquid is drawn off at the same time as the daily nutrient additions.
<I> Example 1 </I> 480 ml ferment well digested sludge (vitamin B content approx. 0.3; "\ ml) is added to a 1000 ml vessel. 120 ml of the following nutrient solution are added to this :
EMI0002.0085
Ethyl alcohol <SEP> 1.0 <SEP> g
<tb> NH4C1 <SEP> 0.1 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 0.04 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> * <SEP> 7 <B> <U> 11 </U> </B> 1) 0 <SEP> 0.01 <SEP> g
<tb> CoCh <SEP> - <SEP> 6H, 0 <SEP> 0.0004 <SEP> g
<tb> Air-dry <SEP> brewer's yeast powder <SEP> 0.002 <SEP> g supplemented with water to <B> 100 </B> ml.
About 200 ml of CO <B> <U>., </U> </B> are introduced evenly per hour and the reaction mixture for <B> 150 </B> days at 28 C and at a pH of 7, 0 to 7.4 held. After every 3 days, 120 ml of fermentation mixture are withdrawn and an identical amount of the nutrient solution is entered at the same time. Vitamin B12 content of the withdrawn samples: 0.5 to 0.6; ,, \ ml, dry matter content: <B> 1.1 </B> gi100 ml. Daily yield: 37;, 1 liter fermentor volume.
<I> Example 2 </I> A fermentation at 37 ° C. is started in a 20-liter fermentation vat using 5 liters of well-fermenting digested sludge. The sludge contains 0.44; @ (ml of vitamin Bi., With a dry matter content of 2.7 g (100 ml. At the beginning of the fermentation) a nutrient solution of the following composition is added every two days:
EMI0003.0004
Ethyl alcohol <SEP> 5.6 <SEP> ml
<tb> CaCO3 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> NH4C1 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> K2HP04 <SEP> 0.2 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> '<SEP> 7H20 <SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> Co (N03) 3 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> 0.003 <SEP> g
<tb> ground <SEP> beet pulp
<tb> (depleted) <SEP> 2.8 <SEP> g
<tb> with <SEP> water <SEP> added to <SEP> 560 <SEP> ml <SEP>.
After the fermenter has been refilled, 560 ml of fermented juice is removed daily (always after the sediment has been stirred up) and the contents of the fermentor are supplemented with the same amount of the above nutrient solution. The vitamin 131 content of the withdrawn samples becomes constant after 2 weeks, 0.6; (ml, with a dry matter content of 1.2 g / 100 ml.
Amount of gas formed: about 7 to 9000 ml per day. Yield: 22% daily, vitamin B12 per liter of fermentor volume.
<I> Example 3 </I> A 800 m3 fermentor is charged with 680 m3 digested sludge with a vitamin B "content of 0.18 y (ml, and 120 m3 nutrient solution is added according to the composition: alcohol 1 , 0 Q / 0- Na2C03 0.411 / 9 and the usual nutrient salts according to the previous examples.
From the third day on, after stirring through the fermentor content, 40 m3 of fermentation liquid are withdrawn daily and at the same time the same volume of the above nutrient solution is entered. The withdrawn liquid becomes clearer and its vitamin B content is correspondingly higher.
After 20 to 25 days the juice becomes uniformly clear and contains an average of 0.35 y / ml vitamin B12 with a dry matter content of 0.54 g / 100 ml. Yield: 17 y daily, calculated on 1 liter fermentor volume.
The fermentation liquid withdrawn daily can be processed in the usual way to obtain vitamin B12. Since the active substance formed is stored in bacterial bodies, it is preferable to only bring the bacterial bodies separated by filtration or sedimentation for further processing. <I> Example 4 </I> In a 200-liter fermentor, 100 liters of fermentation liquid prepared according to Example 2 is used as the methano-bacterium inoculum.
The fermentation liquid was inoculated with 500 ml of a Saccharomyces culture prepared in the usual way on a molasses culture medium, and 20 l of nutrient solution are then added every two to four days, following the composition:
EMI0003.0051
Alcohol <SEP> <B> 1,0,1 / 0 </B>
<tb> Na2C03 <SEP> 0,4,1 / 0
<tb> Molasses <SEP> 1, Ofl / o C0C12 <SEP> '<SEP> 6H20 <SEP> <B> 0.000111 / 0. </B> As soon as the volume has reached 200 1, 12 liters of fermentation liquid are made daily deducted and entered the same amount of nutrient solution. The extracted portions contain 0.80 yiml of vitamin B12, the daily yield per liter of fermentor is <I> 48 yl. </I>
The active substance can be obtained from the raw products obtained according to the examples by means of known methods.
The fermentation by means of Methanobacterium Omelianskii can also be used with other alcohol-forming bacteria, such as. B. with butylogenic clostridia, on a starchy nutrient medium or with cellulose-decomposing bacteria on a cellulosic industrial waste material. The symbiotic function of these strains allows the use of cheap nutrient sources; on the other hand, as is known, some of these strains, such as.
B. the butylogenic clostridia, increase the vitamin B1 level.