DE1668677A1

DE1668677A1 - Verfahren zur Herstellung von 1-Dehydrotestololacton

Info

Publication number: DE1668677A1
Application number: DE19681668677
Authority: DE
Inventors: Diassi Patrick A; Principe Pacifico A
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1967-02-28
Filing date: 1968-02-27
Publication date: 1971-09-16
Also published as: NL6801912A; GB1220829A; CH491960A; FR1555202A

Description

DN. ELISABETH JUNG, DR. VOLKER VOSSIUS. DIPL.-ING. GERHARD COLDEWEY PATENTANWÄLTE

• MÖNCHEN 23 · SIEGESSTRASSE 26 ■ TELEFON 3480 87 · TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MDNCHEN

UoZ,: D 157 (Vo/kä) Februar^ 271 1968

619 205-S

EoR» SQUIBB & SONS, INC. New York, N.Y·, V.St.A.

"Verfahren zur Herstellung von l-Dehydrotestololacton"

Priorität: 28. Februar 1967, V.St.A., Anmelde-Nr.: 619 205

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung der bekannten Verbindung 1-Dehydrotestololacton. Das Verfahren iet dadurch gekennzeichnet, dass man Pregnenolcn, 16-Dehydropregnenolon oder Cholesterin oder deren 3-Acylderivate der Einwirkung von Enzymen von Mikroorganismen der Gruppe Cylindrocarpon radicicola, Cylindrocarpon album, Cylindrocarpon ianthothele, TuBarium javanicum var, ensiforme_P Fusarium moniliforme, ?usariua oxysporum, Fusarium roseum und Fusarium solani aussetzt.

Bei Verwendung von Cholesterin als Ausgangssteroid bzw. Substrat ist eine zweistufige mikrobiologische umwandlung erforderlich, um das gewünschte l~Dehydrotestololaoi;on zu erhaltene In diesem

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Falle setst man zunächst das Cholesterin. der Einwirkung von Enzymen e.us, die von einem die 1-Stellung dehydx'jtfrßiule/i Kiiiro-Organismus gebildet werden.

In den 3-Acylderivaten der erfimiungsgeraäs.* eingesetzten Ausgange steroide leitet sich die Acylgruppe von Kohlemvaaseratofi'carbonsäuren mit vorzugsweise weniger als 12 Köhler-st off at omen ab, Beispiele hierfür sind niedere aliphatische Carbonsäuren_r wie Essigsäure, Propionsäure und Hexansäure,-niedere olefinisch ungesättigte aliphatische Garbonsäuren, wie 3-Hexencax*bonsäure, die monooyclisehen aromatischen Carbonsäuren, wie Benzcc 3äure, die durch raonocyclische aromatische Reste substituierten niederen aliphatischen Carbonsäuren, wie Phenylessigsäure und ß-Phenylpropionsäure, die Cycloalkanearboneäuren, wie Gyclohexancarbonsäure und Cyclopentancarbonsäuren sowie die Cycloalkencarbonsäuren, wie CyolohexencarboiiüRure.

Zur Herstellung des 1-Dehydrotestololactons wird" eines der genannten AusgangBsteroide der Einwirkung der Enzyme eines der genannten Mikroorganismen unter oxydierenden und vorzugsweise aeroben Bedingungen ausgesetzt. Die Oxydation kann am besten durchgeführt werden, indem man entweder das Staroid einer aeroben Kultur des Mikroorganismus einverleibt oder indem man das Ausgangssteroid in wäösrigea Hsdiuin den Enzyewn der nicht» proliferierenden Zellen des Mikroorganismus und in Gegenwart von Luft aussetzt.

Im allgemeinen sind die Bedingungen zur Züchtung der Hi'Kroorgafcsn im f)rfini3.ungst;vi-Mässen Verfahren die gleichen, wie aid· «ur

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Züchtung Ton Mikroorganismen zur Herstellung von Antibiotika angewendet werden, d.h. der Mikroorganismus wird aerob in oder auf einen geeigneten lährmedium waohsen gelassen» Bin geeignetes

. Btiokitoff-Hähmedium enthält eine Kohlenstoff-|/Ώηα Energiequelle. Als Energiequelle kann ein Kohlenhydrat, wie Rohrzucker, Heiasse, Glukose, Maltose, Stärke Oiler Dextrin, eine Fettsäure, ein Fett und/oder das Ausgangesteroid selbst dienen. Vorzugsweise enthalt Jedoch das Nährmedium eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffliund Energie neben dem Ausgangssteroid. Beispiele für verwendbare Fette sind SpeckÖl, Sojabohnenöl, Leinöl, Baumwollsamen-Öl, Erdnussöl, Kokosnussöl, Maisöl, Castoröl, Sesamöl, rohes Palmkemöl, Hammeltalg, Spermöl, Olivenöl, Tristearin, TrijpäÄltin, Triolein und Trilaurin. Beispiele für verwendbare Fettsäuren sind Stearinsäure, Palmitinsäure, ölsäure, Linolsäure Myristinsäure.

Die stickstoffhaltigen Verbindungen können organischen oder synthetischen Ursprungs sein, wie Sojabohnenmehl* Maisquellwasser, Fleischextrakt und bzw. oder lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, ferner einfache organische oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsalze, Alkalinitrate j Aminosäuren oder Harnstoff.

V t.

Während der Vergärung muss für ausreichende Zufuhr steriler Luft gesorgt werden, beispielsweise indem man in herkömmlicher V/eise eine groese Oberfläche des Nährmediums der Luft aussetzt oder mit belüfteter Submerekultur arbeitet. Das Ausgangesteroid kann der Kultur während der Inkubationszeit oder dec. Nährmedium vor der Sterilisation oder Beimpfung einverleibt werden. Der bevor- '

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zugte Konzentrationsbereioh dee Auegangssteroids liegt bei 0,01 bis 1,0 Gew.-56. Die Vergärungszeit kann beträchtlich sohwanken, ia allgemeinen sind etwa 6 bis 96 Stunden erforderlich.

Bei Verwendung von Cholesterin oder eines 3~Acyloholesterins als Auegangs steroid wird in der ersten Stufe das Cholesterin der Einwirkung eines die 1-Stellung dehydrierenden Mikroorganismus unterworfen, wie Oorynebacterium simplex· Han erhält das l,4-Andro8tadien->3,17~dion. Biese Stufe wird unter den gleichen allgemeinen Reaktionabedingungen durchgeführt, wie sie oben an» gegeben sind· Danach wird das l_t4~Androetadien-3',17--dion der Einwirkung von Enzymen von Mikroorganismen der vorgenannten Gruppe ausgesetct. Man erhält ebenfalls das 1-Dehydrotestololacton.

Ein Verfahren zur Herstellung von 1-Dehydrotestololacton auf mikrobiologischem Wege ist bekannt. Bei Verwendung der erfindungsgemäss eingesetzten Ausgangssterolde lässt sich jedoch das Verfahren in einfacherer und wirtschaftlicherer Weise durchführen. Ib G«g«nsats au den bisher eingesetzten Ausgangs steroiden sind dl· im erfindungsgemässen Verfahren verwendbaren Steroide leichter suganglich und verhältnisnässlg billig. Dies ist ein erheblicher Vorsug, wenn I-Dehydrolestololaoton in technischem Ausmaes. hergestellt werden soll.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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BAD C?:SINAL

Beispiel 1 A) Corynebrtoterium simplex ASOC 6946 wird auf Agarsohrägen in

folgendem liährraedium (A) gesichtet:

Gramm

Glukose · 10

Hefeextrakt 2,5

K₂HPO₄	Vfeeaer	auf	1	Liter
Agar		20
destillierte«		1

Da« Oberflächenwaohstum von 2 Wochen alten Agarschrägen wird in 5 ml 0,01 jfiger wässriger Natriumlaurylaulfatlb'aung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden aum Beimpfen von fünf 250 ml fassenden Erleniaeyerkolben verwendet, die jeweils 50 ml des.sterilisierten HähraediumB (B) enthielten:

	Gramm
Rindfleischextrakt	1,5
Hefetxtrakt	3
Pepton	6
Glukose	1
destilliertes Wasser auf	1 Liter.

Nach 24-Btündiger Inkubation bei 3O⁰C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer Drehschüttelmaschine mit 280 Oyclen pro Minute und 5 cm Hub werden 5 volum #~ige Übertragungen auf vierunddreiβeig 250 ml fassende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml frisch steriliaiertss Nähraodium B enthielten. Nach 24-otündiger fortgesetzter Inlcub^ttion unter den ·

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BAD ORIGINAL

gleichen Bedingungen wie vorstehend te achrieben; wird in jeden Kolben 0,25 al einer sterilen l'oeuni von 60 mg/al Cholesterin in M, !-Dimethylformamid gegeben. Ee v/erden insgesamt 510 mg Steroid eingesetzt ₃

Sie Inkubation wird weitere 5 Stunden auf die vorstehend beschriebene Welse fortgesetzt. Danach wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung von 20 mg/ml Qf, Of '-Dipyridyl in Aceton ale Komplexbildner'versetzt.

HaQh etwa 4~tägiger weiterer Inkubation unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen werden in jeden Kolben 50 ml einer 24 Stunden alten Kulturbrühe von Cylindrooarpon radicicola (ATCC-11011) gegeben. Diese Kulturbriihe wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen für die sekundäre Fermentation hergestellt« Danach werden die KuIturgemiache auf die unter B) beschrieben· Weise inkubiert.

B) Cylindrocarpon radicicola (ATCC 11011) wird in Agarachrägen in dem vorstehend beschriebenen Nährmedium A geaUchtet. Bas Oberflttchenwachstus von 2 Wochen alten Agarsohrägen wird in 5 ml einer 0,01 jC-igen wässrigen Nat riumlauryleulfat lösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden sum Beimpfen von 'sechs 250 ml fassenden Brlenmeyerkolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nähmnediums (C) enthielten.

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BAD

Glukose

Maisquellwasser

Gramm	,5
10	,5 .
6	Liter.
2
2
1

Hefeextrakt

CaCO^

destilliertes Wasser auf

Nach 72-etündiger Inkubation bei 25⁰C unter kontinuierlichem SohUtteln auf einer Drehschüttelmaschine mit 280 Cyclen/Minute und 5 om Hub werden 10 volum-£ige Übertragungen auf vierunddreissig 250 ml fassende Srlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des frisoh sterilisierten Hährmediums C) enthielten. Die beimpften Kolben werden hierauf 24 Stunden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen inkubiert. Danach werden die sekundären Kulturbrühen (50 ml) eu den 4 Tage alten primären Fermentationskolben (50 ml) gegeben. Die gemischten KulturbrUhen (100 ml in 250 ml fassenden Erienmeyerkolben) werden hierauf 48 Stunden bei 25⁰C unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen inkubiert. Danach werden die Kolben zusammengegossen, und die Gärbrühe wird mit 12 η Schwefelsäure auf p_H 5,0 eingestellt. Anechliessend wird die angesäuerte Gärbrühe durch ein Querfilter filtriert. Die Kolben, das Kycel und der Filterrückatand werden mit 50 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte Ϊ11-trat und die Waaehlöeungen haben ein Volumen von 4530 ml.

Das Piltrat wird dreimal mit 1500 ml Anteilen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chlorofonnextrakte werden mit Wasser ge-,

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waschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach Um-

icriatallisation aus einer Mischung von Aceton und Hexan erhält man 145 mg l-Dehydrotestololacton.

Beispiel 2	11011) wird auf Agarschrägen	Gramm
A) Cylindrocarpon radioicola (ATCC -	in folgendem Nährmedium (A) gezüchtet:	10
		2,5
Glukose	1 •
Hefeextrakt	20
K₂HPO₄	1 Liter.
Agar
destilliertes Wasser auf

Das Oberflächenwachstum von 2 Wochen alten Agar schrägen wird in 5 ml 0,01 #-iger wässriger Natriumlaurylsulfatlösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden sum Beimpfen von acht 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, die'jeweils 50 ml des sterilisierten Nährmediums (B) enthielten:

Glukose 10 Maisquellwasser 6

NH₄H₂PO₄ 3

Hefeextrakt 2,5

CaCO₃ 2,5

destilliertes Wasser auf 1 Liter

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Naoh 67—stündiger Inkubation bei 25⁰C unter fortwährendem Schütteln auf einer DrehsohUttelmaschine mit 280 C3^relen pro Minute und 5 cm Hub werden 10 volum-$6ige Übertragungen auf viersig 250 ml fassende Brlenmeyerkolben durchgeführt _f die jeweils 50 ml frisch, sterilisiertes üiährmadium B enthielten.

Danach wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung von 100 mg/ml Pregnenolon in ^»-Dimethylformamid versetzt. Ss werden insgesamt 1,0 g Steroid eingesetzt.

tfach etwa 26-atündiger weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingungen· wie vorstehend beschrieben^wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen und die Gärbrühe mit Eisessig auf p_H 4,5 angesäuert. Die angesäuerte Gärbrühe wird hierauf durch ein Klärfilter filtriert. Die Kolben, das Myeel und der Filterrückstand werden mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte Piltrat und die Waschlösungen haben ein Volumen von etwa 2200 ml. Das Piltrat wird dreimal mit 700 ml Anteilen Chloroform extrahiert. Die Chloroforraextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung von Aoeton und Hexan umkristallisiert. Man erhält 1-Dehydrotestololaoton.

Beispiel 3

A) Cylindrocarpon radioicola (ATCC 11011) wird in Agarschrägen gezüchtet, das folgendes Nährroedium (A) enthält:

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	Gramm	1668677
	10
Olukoee	2,5
Hofeextrakt	1
K₂HPO₄	20
Agar	1 Liter.
destilliertes Wasser auf

Das Oberfläohenwach^tum von 2 Wochen alten Agarsohrägen wird in 5 ral 0,01 jC-iger wässriger Natriuialaurylsulfatlösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden zum Beimpfen von acht 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, die' jeweils 50 ml dee sterilisierten Nährmediums (B) enthielten»

Gramm

Glukose	10
Maisquellwasser	6
NH₄H₂PO₄	3
Hefeextrakt	2,5
GaCO₅	2,5
destilliertes Wasser auf	1 Liter

Nach 67-etündiger Inkubation bei 25°C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer Drehschüttelmaschine wit 280 Cyclen/Minute und 5 cm Hub werden 10 volum~#ige Übertragungen auf zwanzig 250 ml fassende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des frisch sterilisierten IJährmediutis (BJ

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Hierauf wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung Ton 100 og/ral 16-Dehydropregnenolon in N,N-Dimethylformamid versetzt« £s werden insgesamt 5OC mg Steroid eingesetzt. Nach etwa 48 stündiger weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beeohrieben.vd.rd der Inhalt der Kolben zusammen« gegossen, und die Gärbrühe mit 12 η Schwefelsäure auf p_fl 2,5 eingestellt.. Die angesäuerte GärbrUhe wird hierauf durch ein Klärfilter filtriert. Die Kolben, das Mycel und der Pilterrtiokstand werden mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat und die Waschlöeungen haben.ein Volumen von etwa 1500 al. Das Filtrat wird dreimal mit 500 al Anteilen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einen Gemisch von Aceton und Hexan umkristallisiert. Kan erhält das l-Dehydrotestololacton.

Beispiel 4

A) Fusarium javanicum var. ensiforme (QH - 524; Army Quartermaster, Katick, Hass., V.St.A.) wird in Agarschrägen gezüchtet, das folgendes Kähraedium (A) enthält:

alukose	10
Hefeextrakt	2.5
K₂HPO₄	1
Agar	20
destilliertes Wasser auf	1 Liter.

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Sa· Oberfläohenwachstuai von 2 Wochen alten Agaraehrägen wird in 5 al 0,01 56-iger wässriger Natriumlaurylsulfatlösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden zum Beimpfen von acht 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nährniediums (B) enthielten:

Gramm

Glukose 10

Maisquellwasser 6

NH₄H₂PO₄ 3

Hefeextrakt 2,5

CaCO₅ 2,5

destilliertes Wasser auf 1 Liter

Nach 67-atündiger Inkubation bei 25⁰C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer DrehschUttelmaeohine mit 280 Cyelen pro Minute und 5 om Hub werden 10 volum-^ige Übertragungen auf awansig 250 ml fassende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jewells 50 ml frisch sterilisiertes Hährmedlum (B) enthielten.

Danaoh wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung von 100 rag/al 16-Dehydropregnenolon-aeetat in Κ,Β-Dimethylformamid versetst. Ee werden insgesamt 500 mg Steroid eingesetzt.

Nach etwa 7-tagiger weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingung en_; wie vorstehend beschrieben!wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen und die GärbrUhe mit 12 η Schwefelsäure auf Pjj 2,5 eingestelltt Die angesäuerte Gärbrühe wird hierauf durch ein Klärfilter filtriert» Die Kolben, das Mycel und der Filter-

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rückstand werden mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat und die Wafcchlösungen haben ein Volumen von etwa 1500 ml ο J)ae Piltrat wird dreimal mit 500 ral Chloroform extrahiertα Die Vereinigten Chloroformextrakte werden mit Wasser gowasohen und unter vermindertem Druok eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton und Hexan umkristallisiert. Es wird l-Dehydrotestololacton erhalten.

Patentansprüche

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Claims

" 1668877 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von l-Dehydrotestololacton, dadurch gekennzeichnet, dass aan Preguenolon, 16-Dehydropregnenolon oder Cholesterin oder deren 3-Acylderivate der Einwirkung τοη Enzymen von Mikroorganismen der Gruppe Cylindrocarpon radioicola. Cylindrooarpon album, Cylindrocarpon ianthothele, Fusarium javanicum var. ensiforme, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Fusarium roseum und Pusarium solani aussetzt.

2. Verfahren naoh Anepruoh 1, dadurch g e k e η η~ se lohnet, dass man als Mikroorganismus Cylindrocarpon radicioola oder Fusarium javanioum var. eneiforae verwendeg.

3. Verfahren naoh Anspruch Z₁ dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangesteroid Pregnenolon verwendet.

4* Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid 16-Behydro~ pregnenolon verwendet.

5. Verfahren naoh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Auegangssteroid 16-Dehydropregnenolon-aoetat verwendet.

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6_O Verfallren nach Anapruen ?., dadurch gekennzeichnet, daes man als Ausgangssteroid Cholesterin verwendet und dieses zunächst der Einwirkung von Enzymen eines die !-Stellung dehydrierenden Mikroorganiemus unterwirft.

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