DE1915417A1 - Verfahren zur Herstellung von OEstrololacton und 19-nor-Testololacton als Zwischenprodukt - Google Patents

Description

DR. EUSABETH JUNG, DR. VOLKER VOSSIUS. DIPL-ING. GERHARD COLDEWEY PATENTANWÄLTE

• MÖNCHEN SS · βΙΕΟΕ8βΤΗΑ88Ε2· · TELEFON 34·β·7 · TELEaRAMM-AORESSEi INVENT/MONCHEN

TELEX 5 29 688

2 6. MRZ. 1969

u.Z.t B 209 (Vo/kä) "717 936 - S

E.R. SQUIBB & SOKS₁ New York, N.Y., V.St.A

" Verfahren zur Herstellung von Östrololacton'und 19-nor-Testololacton als Zwischenprodukt "

Priorität: 1. April 1968, V.St.A₀, Nr. 717 936

Se ist bekannt, Öetrololacton z.Bc durch Oxydation von Östron mit alkalischem Wasserstoffperoxyd oder aus I9^nor-Progesteron auf mikrobiologischem Wege herzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von östrololacton, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man 19-nor-Testooteron oder 19-nor-A-Andresten-3,17~dion der Einwirkung der Enzyme von Aspergillus flavipesp Aspergillus tamarii, Penicillium chrysogenum, Penicillium oitrinum oder Penicillium

ioiilaceum aussetzt und das erhaltene 19-nor-Testoiolacton der ο

j£ Einwirkung der Enzyme eines die 1-Stellung dehydrierenden Mikroo>Organismus unterwirft.

•A -

■*Das im Verfahren der Erfindung erhaltene 19-nor-»Testololacton

~*ist eine neue Verbindung, die suitiandrogene Aktivität zeigt und daher zur Behandlung von hypsrandrogener Akne oder in ähnlicher

POSTSCHECKKONTO: MÖNCHEN IMTI- SANKKONTOi 0EUT8CHE BANK A. Q. MÖNCHEN. LEOPOLO8TR. 71. KTO. NR.

Weise, wie Aldosteroa, verwendet werden kann.

Im Verfahren der Erfindung werden als die !-Stellung dehydrierende Mikroorganismen vorzugsweise Corynebacterium simples, Hoeardia restrietue, Pseudomonae testosteron!, Cylindrocarpon radicicola oder Myeobacterium rhodochrous verwendet·

östrololaoton zeigt bekanntlich antiöatrogene Wirkung^ und kann daher zur Behandlung von Brust- und Uterustumoren verwendet werden.

Sie Bedingungen zur Züchtung der Mikroorganismen im Verfahren der Erfindung sind im wesentlichen die gleichen, wie sie sux Züchtung verschiedener anderer Bakterien zur Herstellung organischer Säuren oder Glykole angewendet werden· Der Mikroorganismus wird in oder auf einem geeigneten Nährboden aerob gezüchtet. Ein geeigneter Nährboden enthält im wesentlichen eine Quelle für Stickstoffverbindungen sowie eine Quelle für Kohlenstoff und Energie. Als Kohlenstoffquellen kommen Kohlenhydrate, wie Rohrzucker, Melasse, Glucose, Maltose, Stärke oder Dextrin, Fett-Bäuren, Fette und bzw. oder das Steroid in Frage«, Vorzugsweise enthält jedoch der Nährboden eine assimilierbare Kohlenstoff» und Energiequelle ausser dem Steroid« Als Stickstoffquellen kommen organische Verbindungen, wie So^abohnenmelils, Maisquellwasser, Sieischextrakt und bzw. oder die löslichen Rückstände der Alkoholdestillation oder synthetische, organische oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsalze, Alkalinitrate, Aminosäuren, oder Harnstoffe in !tage.

Während der Fermentation jausa für eine ausreichende Zufuhr ateriler Luft gesorgt werden, indem man z.B. eine grosse Oberfläche

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des Nährbodens der.Luft auesetzt, oder indem man nach dem Submere verfahr en unter Belüftung arbeitet· Due Steroid kann der Kultur während der Inkubationszeit oder dem Nährmedium vor der Sterilisation oder BeImpfung einverleibt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von 19-nor~Testololacton

A) Fermentation

Aspergillus tamarii (ATCC 1C836) wird in Agarschrägröhrchen auf folgendem Hährboden (A) gezüchtet;

Glucose 10 g

Hefeextrakt 2,5 g

K₂HK)₄ Ig

Agar 20g

destilliertes Wasser auf 1 Liter.

Das Oberfläohenwachetuffl von zwei 10 Tage alten Agarschrägröhrchen wird in 5 ml einer 0,01 jt-igen wässrigen Natriumlaurylsulfatlö"-eung suspendiert. 1 al Anteile der Suspension werden zum Beimpfen

von acht 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nährmediums B enthalten:

Glucose	6	g
Maiequellwaeβer	3	&
NH4H2PO4	2,5	g
Hefeextrakt	2,5	S
CaCO3	1	ß
destilliertes V/asser auf	Liter

Nach 4S-stündiger Inicubation bei 25°C auf einer Drehschüttelaaßchirxe mit eiiieir Hub von etwa 5 cn und 280 u/Hin, werden

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5 Volo-^ige Übertragungen auf fünfzig 250 ml faseende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des frisch sterilisierten Nährroediums B enthalten« Nach 24~stündiger Inkubation unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung (40 mg/ml) 19-nor-A -Andrösten-3,17-dion in Ν,Ν-Dimethylformamid versetzt. Es werden insgesamt 500. mg Steroid eingesetzt, liach 26-stündlger Inkubation unter den vorstehend beschrie Denen Bedingungen wi ;d die Gäruaische aufgearbeitet. Der Inhalt der Kolben wird vereinigt, mit Schwefelsäure auf p_H 2 angesäuert und durch ein Klärfilter filtrierte Das FiItrat hat ein Volumen von 2700 ml.

B) Isolierung und Charakterisierung

Die vereinigten Filtrate und Waschlösunken (2700 ml) werden dreimal mit 800 ml Anteilen Methylisobutylketon extrahiert» Die vereinigten MethyIisobutylketonextrakte werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Es hinterbleiben 300 mg Rohprodukt. Ideses Produkt wird an Kieselgel GF (Merck) mit Chloroform, das 5 Vol.-$6 Methanol enthält, als -cintwicklungslösungsiaittel dünnschichtchromatographiert. Die im UV-Licht sichtbare Bande, die mit 3/4 der Beweglichkeit des Substrate, d.h. des 19-nor-Androstendions, wandert, wird mit einem Gemisch gleicher Volumteile Methanol und Chloroform eluiert. Das Eluat wird eingedampft und der Kückstand zwischen Chloroform und einem Geraisch gleicher Volumteile Wasser und Methanol verteilt» Die Chloroformphase wird unter vermindertem üruck zur Trockene eingedampft. Sie ergibt kristallines 9-nor-Testololaeton. Kach ümlcrietallisation aus einer Mischung von Aceton und Hexan werden 200 mg reine""Verl>in—

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dung vom F, 197⁰C erhalten; fotj^ - 11,9° (C « 1,0, CHCl₃);

238 mj* («f = 18 COG); ^ J^ 1723, 1652, 1610 oo""¹;

NMR-Signale (in CDCl₃ mit TMS-Standard), 8,67V» 4,16 . T

Beispiel 2

Gemäse Beispiel 1, jedoch unter Verwendung einer äquivalenten

4 Menge 19-nor-Testosteron anstelle von 19-ηοΓ-Ά -Androsten-3,17 dion, wird ebenfalls das 19-nor-Testololacton erhalten«,

Beispiel 3 Herstellung von Östrololacton mittels einer wachsenden Kultur

von Corynebacterium simplex

A) Fermentation

Sas Corynebacterium simplex (ATGC 6946) wird in Agarschrägröhrchen auf folgendem Nährboden (A) gezüchtet.

Glucose	10	S
Hefeextrakt	2,	5 g
K2HPO4	1	g
Agar	20	g
destilliertes Wasser auf	1	Liter.

Das Oberflächenwaohetum eines 2 Wochen alten Agarsehrägröhrchene wird in 5 ml einer 0,01 ?U>igen wässrigen Katriumlauryloulfatlusuug suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden zum Beimpfen von vier 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nährmediuma (B) enthalten:

Rindfleischextrakt 1,5g

Hefeextrakt 3g

_m Pepton 6g

Glucose 1 g

destilliertes Wasser auf 1 Liter«

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BAD

Nach 24-stündiger Inkubation bei 25⁰C auf einer 2>reheehüttela&- 8chine mit einem Hub von 5 cm und 260 U/Hin« werden 5 VoL-JUge Übertragungen auf acht 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des frisch sterilisierten Sährmediuise (B) enthalten. Nach 24-stündiger Inkubation unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wird jeder Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung (100 mg/ml) 19-nor-Testololacton in N,H-Dimethylformamid versetzt. Es werden insgesamt 200 aig Steroid eingesetzt. Nach 48-stündiger weiterer Inkubation unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen, die Gärmaische wird mit Schwefelsäure auf p_H 2 augesauert und zweimal mit 200 ml Anteilen Methylisobutylketon extrahiert. Sie Methylisobutylketonphase, in der die Bakterienzellen suspendiert sind, wird zentrifugiert« Das Zellensediment wird mit 50 ml Aceton aufgerührt und erneut zentrifugiert. Danach werden die Zellen zweimal mit $0 al Anteilen eines Gemisches gleicher Seile Methanol und Chloroform aufgerührt· Die Zellen werden jedes Mal absentrifugiert. Die Methylisobutylketonlö'sung, die Acetonlöeung und die Methanol-Ghloroformlb*eung werden vereinigt. Die vereinigten Extrakte werden Über wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und unter vermindertera Druck zur Trockene eingedampft. Ώθτ kristalline Rückstand wird dreimal aus Aceton umkristallisierto Es werden 110 mg reine Verbindung vom P. 337°C erhalten;

281 mu U - 2 050), 285 au <£ » 1 880).

Beispiel 4 Herstellung von Öetrololacton mittels gewaschener Zellen von

Oorynebacterium simplex

Gemäss Beispiel 3 werden die Zellen einer Kultur von

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BAD ORJGfNAL

Corynetoäcterium simplex nach 72 Stunden Fermentation durch Abschleudern geerntete Die sedimentierten Zellen werden dreimal mit einem Phosphatpuffer gewaschen, der jeweils 0,005 Mol KH₂PO^ und Na₂H₂PgO im Liter enthält und auf p_H 7,0 eingestellt istc Danach werden die gewaschenen Zellen in deiu gleichen Phosphatpuffer in einem Volumen suspendiert, das 1/4 des Volumens der ursprünglichen Kultur entspricht. Das Substrat 19-nor-Testo~ lolacton und der Wasserstoffaeceptor, ZoB. 2-Methylnaphthochinon_p werden als Lösungen in Äthanol zu einer Endkonzentration von 100y/ml bzw. 0,4 mMol zugesetzte Die Äthanolmenge beträgt 5 ί> der Gesamtmenge der Flüssigkeit. Das Reaktionsgemisch wird 4 bis

6 Stunden bei 30 C stehengelassen, danach mit Methylisobuty!keton, Aceton und einem Gemisch aus Methanol und Chloroform gemäss Beispiel 3 extrahierte Die vereinigten Extrakte werden ebenfalls gemäss Beispiel 3 aufgearbeitet. Man erhält reines östrololacton vom Po 337°C.

Beispiel 5

Herstellung von Östrololaoton mittels getrockneter Zellen von Gorynebacteriun simplex . ■ "

Gemäss Beispiel 4 werden die sedimentierten Zellen von ourynebacterium simplex mit einem gleichen Volumen Phosphatpuffer auf Pu 7,0 verdünnt. Die Zelleneuepension wird tropfenweise unter konstantem Rühren in das 10-fache Voluuen Aceton gegeben_s das auf eine Temperatur unterhalb 5°C gekühlt ietc Der Bodensatz wird sofort auf einem Büchner-Trichter abgesaugt, mit wenig Aceton gewaschen und anschliessend an der Luft getrocknet. Hierauf wird eine Suspension voiv 10 mg der Bi it Aceton getrockneten Zellen prc «1 des Phocphatpuffers p,. 7_s0 in einem Varing-Hischer hsrge-

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otellt. Diese Suspension wird anstellt der Suspension der ft« " waschenen Zellen in Beispiele verwendet. Da· Substrat und dir Waeseretoffacoeptor werden in gleicher Welse vi· in Beispiel 4 zugegeben. Sa« Verfahren wird ebenfalls genäse Beispiel 4 durchgeführt. Man erhält kristallines üetrololaoton rom P. ⁰

Beispiel 6

Herstellung von östrololaoton mittelB eines zellfreien Enzympräparat s aus Corynebaeterium simplex Gemäss Beispiel 4 werden die sedimentierten Zellen ron Corynebaoterium simplex zusammen mit einer gleichen Gewiohtsmenge fein pulverisiertem Aluminiumoxyd in einen Mörser gegeben und 20 Minuten mit Ultraschall behandelt. Danach wird das Gemisch 10 Minuten bei 200C G zentrifugiert.

1 ml 19-nor-Testololacton, 500 y·* 2-Methylnaphthochinon und 2*0 ml des zellfreien Snsymprttparats werden In ein Reagensglas gegeben und mit 0,0? molarem latriumphosphatpuffer auf 5_f0 ml aufgefüllt· Bas Gemisch wird eine Stunde bei 30⁰Q stehengelassen, danach mit MethylisQbutylketon, Aceton und einem Gemisch aus Methanol und'Chloroform "gemäas Beispiel 3 ausgeschüttelt. Die rereinigten Extrakte werden der Papierchronatographie mit Xthylenglykol als stationäre Phase und Toluol' als bewegliche Phase chromatographiert. Es wird ein Fleck erhalten, der mit dem gleichen R_f-Wert von 0,17 sich bewegt und,die gleichen charakteristischen Farbreaktionen ergibt, wie das in Beispiel 3 erhaltene östrolölacton. - -

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Claims (3)

1. Patentansprüche

   Yerfahren tür Herstellung von östrololaeton, d a d u r ο h ,fekennseiohnet, dass nan l?^nor~Testosteron oder 19-nor-*A*-Androsten-3»17-dion der Einwirkung der Knsjaie τοη Aspergillus flavipea, Aspergillus tamarli, Penioillium ohrysogenuB, Pen!οillium citrinum oder Penicillium lilaceum aussetst und das erhaltene 19-nor-Testololaöton der Einwirkung der Snsyae eines die 1-Stellung dehydrierenden Mikroorganismus unterwirft.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -»•lohnet, dass man als die 1-Stellung dehydrierenden Mi« kroorganlSBUS CorynebaöterlUB siaplsx, Mocardia restriötüs, PeeudoBonaa testoateroni, Cylindrocarpon rad!oiCola* oder Myoobacteriuä rhodöchroue Terwendet.
3. 3. 19-nor-$estololacton.

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