DE1693041B1

DE1693041B1 - Steroid-Oxazoline und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1693041B1
Application number: DE19681693041
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Lancini; Giangiacomo Nathansohn; Joseph Thiemann
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1967-01-13
Filing date: 1968-01-11
Publication date: 1971-07-29
Also published as: FI45173B; GB1205026A; FR1557144A; BE709323A; CH471108A; ES349266A1; DK118402B; AT281314B; IL29200A; FI45173C; NL6717534A; US3452005A; NO128153B; SE338045B

Description

Die Erfindung betrifft Steroid-Oxazoline der Formel

C-R'

worin R entweder Wasserstoff, die Hydroxyl- oder Acetoxygruppe und R' Wasserstoff oder den Methylrest bedeutet.

Die neuen Verbindungen besitzen als entzündungshemmende und hormonähnliche Mittel einen hohen Grad an pharmakologischer Wirksamkeit.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Steroid-Oxazoline besteht darin, daß man ein Steroid-Oxazolin der Formel

CH₁R

i
CO

C-R'

in der R und R' die oben angegebene Bedeutung haben, durch Fermentation mit Curvularia lunata NRRL 2380 bzw. Cunninshamella blackesleeana NRRL 868SA bzw. Absidia orchidäs ATCC 6647 enzymatisch hydroxyliert.

Zur Durchführung dieses Verfahrens züchtet man die genannten Mikroorganismen und läßt sie unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium auf ein Steroid-Oxazolin der vorsiehenden Formel einwirken. Auf Grund der Oxydationswirkung der durch die Mikroorganismen gebildeten Enzyme wird hierbei in die 11 -Stellung des Steroid-Oxazolins eine Hydroxygruppe eingeführt.

Ein geeignetes Nährmedium muß eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie mineralische Grundstoffe enthalten. Brauchbare Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrose. Saccharose. Galactose, Xylose, Glycerin und andere Kohlehydrate und mehrwertige Alkohole, sowie andere natürliche Kohlehydratquellen, wie Maisquellwasser, Baumwollsatmehl. Zu den brauchbaren Stickstoffquellen gehören einige der obengenannten Stoffe, wie z. B. Maisquellwasser, Baumwollsatmehl, andere Substanzen, wie Rindfieischextrakt. Hefe, Peptone. Aminosäuren, im allgemeinen enzymatisch hydrolysierte Proteine und andere proteinhaltige Stoffe. Auch anorganische Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Nitrate, Ammoniumsalze u. dgl., sind verwendbar.

Die erforderlichen Minerale sind entweder in den gleichen oben angeführten Stoffen, wenn sie in rohem Zustand verwendet werden, oder im Wasser, das zur Herstellung des Mediums verwendet wird, vorhanden. Soll das Medium einen Zusatz erhalten, wird eine geeignete Menge anorganischer Substanzen, wie Phosphat, Sulfat, Chlorid, Alkali- und Erdalkalimetalle, Eisen, Mangan, Kobalt zugesetzt, um das Medium mit Kationen und Anionen zu versehen.

Das Steroid, das der 11-Hydroxylierung ausgesetzt werden soll, kann man vor oder nach Impfen des Mediums mit der Kultur des Mikroorganismus zusetzen.

Die Fermentierung wird dann bei einer Temperatur zwischen etwa 26 und 32° C 12 bis 120 Stunden fortgesetzt. Nach Beendigung der Fermentierung wird gegebenenfalls das Medium vom Myzel abfiltriert, das 11-hydroxylierte Steroid mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel, in dem sich das Steroid löst, extrahiert und anschließend der organische Extrakt im Vakuum bis zur Trockne oder zu einem kleinen Volumen eingedampft. Im letzteren Fall bildet sich durch den Zusatz eines mit dem zur Extraktion verwendeten Lösungsmittel mischbaren Lösungsmittels, in dem das Steroid jedoch unlöslich ist, zur konzentrierten Steroidlösung ein Niederschlag des Produktes. Dieser kann anschließend chromatographisch oder durch ein anderes geeignetes Verfahren, wie Umkristallisation, gereinigt werden.

Nach einer weiteren Verfahrensweise wird nach Erzielung eines guten Myzelwuchses in einem Medium der angeführten Zusammensetzung ein Teil des Myzels abgetrennt und in eine Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 übergeführt, wo es mit dem umzuwandelnden Steroid in Berührung gebracht wird. Das Steroid wird anschließend, wie oben beschrieben, durch Extraktion aus der Flüssigkeit isoliert.

Im Vergleich mit anderen bekannten, die gleichen pharmakologischen Eigenschaften besitzenden Steroiden, wie Hydrocortison, zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine starke entzündungshemmende Wirksamkeit. Die Ergebnisse dieser Wirksamkeit, die bei Granulompellets in Ratten ausgewertet wurden, sind aus Tabelle I ersichtlich. Die in 10° oigem Gummiarabikum gelösten oder aufgeschlämmten Produkte wurden männlichen, etwa 120 bis 150 g wiegenden Wistar-Ratten oral verabreicht.

Tabelle I

Verbindung des Beispiels	Dosis in mg/kg per os	Zahl der Tiere
1	5	7
2	5	7
3	5	7
Hydrocortison	5	7

Abnahme des
Granuloms in "'<

-39.6
-34

-38.4

Es wurde festgestellt, daß die Verbindung des Beispiels 3 zudem eine gluconeogenetische Wirksamkeit aufwies. Die Versuche wurden entsprechend der von Olsen u.a. in Endocrinol 35 (1944). S. 40, beschriebenen Methode an surrectomisierten männlichen Wistar-Ratten durchgeführt. Vergleicht man die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Verbindung mit dem Ergebnis, das mit Hydrocortison unter den gleichen Versuchsbedingungen erzielt wurde, stellt man eine größere Wirksamkeit des ersteren fest. Die folgende Tabelle II faßt die in beiden Fällen gefundenen Ergebnisse zusammen.

ORIGINAL INSPECTED Tabelle II

	Dosis	Zahl der	Leberglycogen
Verbindung	in 3»/Ratte	Ratten	±S.E.y(ng)Glucose
des Beispiels	(ng/rat)	10	pro 100 g Gewicht der Ratte
3	500	10	12,84 ± 1,14
	2000	10	33.79 ± 2,34
Hydrocortison	500	10	7,04 ± 0,97
	2000	10	20,05 ± 1,43
Kontroll	—		1,18 ± 0,46
versuche

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

Pregn-4-en-ll/>',21-diol-3,20-dion-[17a,16a-d]-2'-methyloxazolin-21 -acetat

Mehrere 500-ml-Erlenmeyerko!ben, von denen jeder 100 ml des folgenden Nährmediums enthielt:

Dextrose 10,0 g

Sojabohnenmehl 5.0 g

Pepton 5,0 g

Basamin Busch 3,0 g

KH^PO₄ 5,0 si

NaCl 5,0 g

Silikonöl 0,1 ml

mit destilliertem Wasser zu 1 1 aufgefüllt (wobei der pH-Wert vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 6.8 eingestellt wird), werden mit einer 4 Tage alten Schräg-Kultur von Curvularia iunata NRRL 2380 geimpft. Nach 24stündiger Inkubationszeit bei 2S^:C auf einem rotierenden Schüttelgerät (250 U-'Min.) wird ein gutes Myzelwachstum erzielt.

41 eines Mediums der angegebenen Zusammensetzung werden in einem Vorfermeniationsgefäß mit 5 Volumprozent (V/V) der vorstehend erhaltenen Kultur geimpft und unter folgenden Bedingungen inkubiert: 1,51 Luft pro Liter Medium pro Minute (1.5 1 I Min.). Rührgeschwindägkeit 800 U/Min., Temperatur 28 C, Zeit 24 Stunden.

In einem neuen Fermeniationsgefäß werden 4 1 des gleichen, vorstehend beschriebenen Mediums mii 200 ml der bei der vorstehenden Fermentierung entstandenen Nährbrühe geimpft. Die Fermentierung wird unter gleichen Bedingungen durchgeführt wie in der vorhergehenden Stufe. Nach 24 Stunden wird aas Myzel durch Filtration abgetrennt.

Das isolierte, feuchte Myzel (Gewicht etwa 30ö gj wird in 41 eines Phosphatpuffers M/l 5 bei einem pH-Wert von 7,3 in einem Fermentationsbehälter aufgeschlämmt und die Aufschlämmung 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 800 U/Min, gerührt. Die Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 1.5 1 pro Liter Flüssigkeit pro Minute zugeführt und die Temperatur auf 28°C eingestellt.

Pregn-4-en-21 -ol-3,20-dion-[ 17«, 16a-d]-2'-methyloxazolin-21 -acetat wird in einer Menge, die 0,5% (Gew. Vol.) des Mediums entspricht, in 40 ml Aceton gelöst, dem Medium zugesetzt und die Masse 24 Stunden lang den oben angeführten Rühr-, Luftzufuhr- und Temperaturbedingungen ausgesetzt. An dieser Stelle wird die Umsetzung durch Zuführung von Chloroform gestoppt.

Das Gemisch wird filtriert, das Myzel mehrmals mit Chloroform gewaschen und das Filtrat mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten, beim Waschen erhaltenen Chloroformanteile und -extrakte werden im Vakuum zu einem kleinen Volumen eingedampft. Anschließend wird zur Bildung eines Niederschlages Petroläther zugesetzt. Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung mit einem Gemisch aus Methanol : Wasser: Chloroform : Ligroin im Verhältnis

ίο 2:1:2:1 gereinigt. Die Ausbeute beträgt 0,5 g Pregn-4-en-ll/?,21-diol-3,20-dion-[17a,16a-d]-2'-methyloxazolin, das mit Essigsäureanhydrid in Pyridin das 21-Acetat bildet. Schmelzpunkt 224 bis 225°C, [a]f: +108° (c = 0,5, CHCl₃).

Die Identität der erhaltenen Verbindung wird festgestellt, indem man sie der Wirkung des Enzyms aussetzt, das während der Fermentierung von Corynebacterium simplex SCH 2141 unter den Bedingungen gebildet wurde, die allgemein bei Einführung einer Doppelbindung in die l-(2)-Stellung des Steroidkerns angewendet werden. Durch dieses Verfahren erhält man das bekannte Pregna-l,4-dien-l lp',21-diol-3,20-dion-[l7a,16a-d]-2'-methyloxazolin-21-acetat, Schmelzpunkt 256 bis 257° C l_max 241 bis 243 (CH₃OH).

Die zur Durchführung des in diesem Beispiel beschriebenen Verfahrens notwendige Ausgangsverbindung wird durch folgende Verfahrensschritte hergestellt : Eine Mischung aus 5 g Pregn-5-en-3/;-ol-20-on-[17ct,16«-d]-2'-rnethyloxazolin, 40 ml Tetrahydrofuran, 40 ml Methanol, 7,5 g Calciumoxyd und 0,11g Azo-bis-isobutyronitril wird unter kräftigem Rühren nach und nach einer Lösung von 5 g Jod in 25 ml Tetrahydrofuran und 15 ml Methanol versetzt. Das Gemisch wird anschließend filtriert, das Filtrat im Vakuum bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 80 mi .Methylenchlorid gelöst. Die organische Lösung wird zunächst mit Natriumthiosulfat und anschließend mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum bis zur Trockne eingedampft.

Dieser Rückstand (das 21-Jodderivat des Steroids) wird in 40 mi aceton gelöst und einer auf 50 bis 60^; C erwärmten Lösung aus 28 ml Essigsäure. 14 ml Aceton und 50 ml Triäthyiamin zugesetzt. Anschließend wird das Gemisch 90 Minuten am Rückfluß erhitzt.

Das Aceton wird abdestilliert und dann die Mischung nach und nach mit 350 ml warmem Wasser versetzt. Nach der Abkühlung wird der gebildete Niederschlag abgetrennt und gewaschen. Die Ausbeute beträgt 4.8 g Pregn-5-en-3/:;.21-diol-20-on-[i7a,16c!-d]-2'-methyloxazolin-21-acetat. Schmelzpunkt 232 bis 234 C, [</H^:: -20.4^: (c = 0,5, CHCl₃).

Nach bekannten Verfahren wird an dem gewonnenen Steroid unter Verwendung von Aluminiumisopropylat und Cyclohexanon in Toluol eine Oppenauer-Oxydation durchgeführt. Aus 35 g des Ausgangs-Pregn-5-ens werden 30 g (Ausbeute 86%) Pregn-4-en-21 - öl - 3.20 - dion - [17«,16« - d] - 2' - methyloxazolin-21-acetat gewonnen. Schmelzpunkt 204 bis 206 C. [α] ¥: + 86^; (c = 0,5, CHCl₃), Ej £ 401,8, ;„,, 240 v.

(CH₃OH).

Beispiel 2

Pregn-4-en-l 1 />-ol-3,20-dion-[ 17 a, 16«-d]-oxazolin

Die Herstellung erfolgt genau wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei Pregn-4-en-3,20-dion-[17a,16a-d]-oxazolin als Ausgangsverbindung und Cunninghamella blackesleeana NRRL 8688A als Fermentierungsorganismus verwendet wird.

Der Schmelzpunkt des gewonnenen Steroid-Oxazolins liegt bei 198 bis 200⁰C.

Beispiel 3

Pregn-4-en-llß21-diol-3,20-dion-[17a,16a-d]-2'-methyloxazolin

Die Herstellung erfolgt genau wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei als Ausgangsverbindung Pregn-4-en-21-ol-3,20-dion-[17a,16a-d]-2'-methyloxazolin und Absidia orchidis ATCC 6647 als Fermentierungsorganismus verwendet wird.

Der Schmelzpunkt des gewonnenen Steroidoxazolins liegt bei 235° C.

Claims

Patentansprüche :
1. Steroid-Oxazoline der allgemeinen Formel

C-R'

3. Verfahren zur Herstellung eines Steroid-Oxazolins der allgemeinen Formel

C-R'

in der R Wasserstoff, die Hydroxyl- oder Acetoxygruppe und R' Wasserstoff oder den Methylrest darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Steroid-Oxazolin der allgemeinen Formel

worin R Wasserstoff, die Hydroxyl- oder Acetoxygruppe und R' Wasserstoff oder den Methylrest darstellt.
2. Pregn - 4 - en -11&21 - diol - 3,20 - dion - [17a, 16a-d]-2 -methyloxazolin.

in der R und R' die angegebene Bedeutung haben, durch Fermentation mit Curvularia lunata NRRL 2380 bzw. Cunninghamella blackesleeana NRRL 86688A bzw. Absidia orchidis ATCC 6647 enzymatisch hydroxyliert.