NO128153B

NO128153B -

Info

Publication number: NO128153B
Application number: NO00085/68A
Authority: NO
Inventors: J Thiemann; G Lancini; G Nathansohn
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1967-01-13
Filing date: 1968-01-09
Publication date: 1973-10-08
Also published as: ES349266A1; AT281314B; FR1557144A; BE709323A; SE338045B; IL29200A; CH471108A; US3452005A; FI45173C; DE1693041B1; DK118402B; NL6717534A; FI45173B; GB1205026A

Description

Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive llB-hydroksy-pregn-4-en-3,20-dion- Vila,16a-dJ-oksazoliner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte

til fremstilling av nye steroid-oksazolinforbindelser med den generelle formel:

hvor R er hydrogen, hydroksyl eller acyloksy med 2-4 karbonatomer, og R' er hydrogen, laverealkyl eller fenyl.

De nye forbindelsene har en høy farmakologisk aktivitet som anti-inflammatoriske og hormonlignende midler.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles de nye steroid-oksazolin-forbihdelséne ved å utsette en steroid-oksazolinforbindelse" med formelen:

hvor R og R' har den ovenfor angitte betydning, for den enzymatiske aktivitet som frembringes ved fermentering av en sopp fra slektene Curvularia, Cunnighamella eller Absidia. Egnede arter er Curvularia lunata, Cunninghamella blackesleeana eller Absidia orchidis og andre arter, dyrket aerobt i et egnet næringsmedium og disse får innvirke på en steroid-oksazolinforbindelse med den ovenfor angitte formel og vil således oppta utgangsstoffene. Under veksten av mikroorganismen innføres en hydroksygruppe i 11-stillingen i steroid-oksazolinforbind-elsen på grunn av den oksyderende virkning til enzymene som frembringes av mikro-organismen.

Et egnet næringsmedium må inneholde en karbonkilde, en nitro-genkilde og mineralelementer. Egnede karbonkilder omfatter stivelse, dextrose, sukrose, galaktose, xylose, glycerol og andre karbohydrater og polyalkoholer samt andre naturlige karbohydratkilder slik som mais-støpsettingsvæske, bomullsfrømel og andre. Egnede nitrogenkilder omfatter noen av de ovenfor nevnte materialer slik som maisstøpsettings-væske, bomullsfrømel og andre stoffer slik som kjøttekstrakt, gjær, peptoner, aminosyrer, oppløste proteiner generelt og andre protein-holdige materialer. Uorganiske nitrogenkilder er også nyttige slik som f.eks. urea, nitrater, ammoniumsalter og lignende.

De nødvendige mineralene er enten tilstede i de samme "mate-rialene som er nevnt ovenfor når de anvendes i ubehandlet tilstand eller de er tilstede i det vann som anvendes for.prepareringen av mediet. Når det ønskes et supplement til mediet tilsettes en mengde uorganiske stoffer som er egnet for tilføring til mediet av kationer og anioner slik som fosfat, sulfat, klorid, alkali og jordalkalimetal-ler, jern, mangan, kobolt og andre..

Steroidfprbindelsen som skal 11-hydroksyleres kan tilsettes før eller etter podning av mediet med mikro-organismekulturen.

Fermentering fortsettes deretter i 12 -. 120 timer ved en temperatur mellom ca. 26° og 32°C. Ved slutten av fermenteringen blir mediet om ønsket filtrert fra myceliet og det 11-hydroksylerte steroid ekstraheres med et vann-uoppløselig organisk oppløsningsmiddel hvori steroidet oppløses og det organiske ekstrakt inndampes- under forminsket trykk til tørrhet eller til et lite volum. I sistnevnte tilfelle forårsaker tilsetning til den konsentrerte oppløsning av steroidet av et oppløsningsmiddel som er blandbart, med det til ek-straksjonen anvendte oppløsningsmiddel, men hvori steroidet er uopp-løselig, en utfelling av produktet. Dette kan deretter renses kroma-tografisk eller ved hjelp av en hvilken som helst egnet fremgangsmåte slik som omkrystallisering.

Alternativt, etter at en god myceliumvekst er oppnådd i et medium med den ovenfor angitte sammensetning, blir en mengde av myceliet oppsamlet og overført til en fosfatbufferoppløsning med pH mellom 7.0 og 7.5 og bragt i kontakt med den steroidforbindelsen som skal om-dannes. Steroidet blir deretter isolert fra væsken ved ekstraksjon som omtalt ovenfor.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen utviser en høy anti-inflammatorisk aktivitet sammenlignet med andre kjente steroider som er i besittelse av de samme farmakologiske egenskaper, som f.eks. hydrocortison. Resultatene av denne aktivitet, bestemt på grunnlag av granulom-knutedannelse hos rotter, er angitt i tabell 1. Produkt-ene, oppløst eller suspendert i 10 % akacie-gummi, ble administrert ad oral vei til hånlige' Wistar-rotter, med vekt 120 - 150 g.

Forbindelsene i eksempel 3 ble også funnet å ha en glukoneo-genetisk aktivitet. Forsøkene ble utført ved bruk av surrectomizte Wistar hanrotter, ifølge den metode som er beskrevet av Olson et al. i Endocrinol 35» 40, 1944. Ved å sammenligne resultatene fra bruk av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen med de resultater som ble oppnådd med hydrocortison under samme forsøksbetingelser, er det tyde-lig at forbindelsen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har den høyeste aktivitet. Tabell 2 oppsummerer dé resultater som ble funnet i de to tilfellene.

Følgende eksempler illustrerer fremgangsmåten.

Eksempel 1 Pregn- 4- en- 113, 21- diol- 3J2Q- dion-[ 17a, l6a- d]- 2'- metyloksazolin- 21- acetat En rekke 500 ml's Erlenmeyer-kolber hver inneholdende 100 ml av følgende medium:

(pH før sterilisering stilt til 6.8 med NaOH), podes med en 4-dagers kultur av Curvularia lunata NRRL 2380 på skrå-substrat. Etter 24 timers inkubering i en roterende rysteanordning (250 omdr./minutt) ved 28°C, oppnåes en god mycelium-vekst. 4 liter av mediet med den ovenfor angitte sammensetning podes i en forfermenteringsbeholder med 5 % vol/vol av den ovenfor tilveiebragte kultur og inkuberes under de følgende betingelser: luft 1.5 l/l/minutt; rysting 800 omdr./minutt, temperatur 28°C, i 24 timer.

200 ml av kraften fra den ovenfor omtalte fermentering be-nyttes, til å pode en ny fermenteringsbeholder .inneholdende 4 liter av det samme medium som nevnt ovenfor.. Fermentering foretas, under samme forhold som før. Etter.24. timer oppsamles myceliet ved filtrering.

Det isolerte fuktige mycelium . (vekt ca. 300 g) suspenderes

i 4 liter fosfatbuffer M/15 med pH 7.3 i en fermenteringsbeholder og suspensjonen omrøres ved 800 omdr./minutt i 10 minutter. Luft inn-føres i en mengde på 1.5 liter per liter væske per minutt og tempera-turen stilles til 28°C.

Pregn-4-en-21-ol-3,20-dion-[17a,l6a-d]-2'-metyloksazolin 21-acetat i en mengde tilsvarende til 0.5 % (vekt/volum) av mediet, oppløses i 40 ml aceton og tilsettes til mediet, og massen -holdes under de ovenfor beskrevne betingelser for omrøring, luftinnføring og temperatur i 24 timer. Omdannelsen stoppes ved dette punkt ved tilsetning av kloroform.

Blandingen filtreres, myceliet vaskes gjentatte ganger med kloroform og filtratet ekstraheres med kloroform. De kombinerte kloroformvaskingene og ekstraktene inndampes under forminsket trykk til et lite volum og petroleumeter tilsettes slik at det dannes et bunnfall. Det urene produkt renses ved motstrøms-adskillelse med en blanding av metanol:vann:kloroform:ligroin på 2:1:2:1. Utbytte 0.5 g av pregn-4-en-113,21-diol-3,20-dion-[17a,l6a-d]-2'-metyloksazolin, som med eddiksyreanhydrid i pyridin gir 21-acetatet, smeltepunkt 224° - 225°C, [a]^° + 108° (c=0.5, CHClj).

Identiteten til den oppnådde forbindelse fastslåes ved å utsette den for aktiviteten til .det enzym som frembringes under fermenteringen av Corynebacterium simplex SCH 2141 under slike betingelser som vanligvis anvendes for innføring av et dobbelt bånd i stilling 1(2), i steroidkjernen. Herved oppnås den kjente pregna-1,4-dien--113,21-diol-3>20-dion-[17a,l6a-d]-2'-metyloksazolin 21-acetat, smeltepunkt 256° - 257°C, X meiles • 241 - 243.(CH, j0H). Denne forbindelse er beskrevet i norsk søknad nr. 166 241.

Den utgangsforbindelse som trenges for å utføre den beskrevne metode i dette eksempel, fremstilles på følgende måte.

Til en blanding av 5 g av pregn-5-en-33-ol-20-on[17a,l6a-d]--2'-metyloksazolin, 40 ml tetrahydrofuran, 40 ml metanol, 7.5 g kal-siumoksyd og 0.11 g azo-bis-isobutyronitril, tilsettes en oppløsning av 5 g jod i 25 ml tetrahydrofuran og 15 ml metanol gradvis under kraftig omrøring. Blandingen blir deretter filtrert, filtratet inndampet til tørrhet under forminsket trykk .og resten oppløses i 80 ml diklormetan. Den organiske oppløsning vaskes.med natriumtiosulfat, deretter med vann, og blir så inndampet til tørrhet under forminsket trykk.

Claims

Denne rest (21-jodderivatet av steroidforbindelsen) opp-løses i 40' ml aceton og tilsettes til en oppløsning, varmet til 50° - 60°C, av 28 ml eddiksyre, 40 ml aceton og 50 ml trietylamin, og deretter kokes blandingen under tilbakeløp i 90 minutter. Acetonen avdestilleres og deretter tilsettes 350 ml varmt vann gradvis. Etter avkjøling blir det tildannede bunnfall oppsamlet og vasket. Utbytte 4.8 g av pregn-5-en-30,21-diol-20-on- [17ct,l6ord]- -2'-metyloksazolin 21-acetat, smeltepunkt 232° - 234°C, [a]p° -20.4° (c=0.5, CHCl^). Det utføres en Oppenauer oksydasjon på den tilveiebragte steroidforbindelsen ifølge velkjente metoder ved bruk av aluminium-isopropoksyd og cykloheksanon i toluen. Fra 35g utgangsforbindelsen pregn-5-en oppnåes 30 g (utbytte 86 %) av pregn-4-en-21-ol-3,20-dion-[17a,l6a-d]-2'-metyloksazolin 21-acetat, smeltepunkt 204° - 206°C, [aj^° + 86°, (c = 0.5, CHC13), E^m 401.8,. *maks_ 240 my (CHjOH). Eksempel 2 Pregn- 4- en- llg- ol- 3, 20- dion-[ 17aal6a- d]- oksazolin: Denne forbindelsen fremstilles nøyaktig på samme måte som beskrevet i eksempel 1 ved å utgå fra pregn-4-en-3,20-dion-[17a,l6a-d]-oksazolin og ved bruk av Cunninghamella blackesleeana NRRL 8688A som fermenteringsorganisme. Den oppnådde steroid-oksazolinforbindelse har et smeltepunkt på 198° - 200°C.

Eksempel 3

Pregn- 4- en- llg, 21- diol- 3, 20- dion-[ 17a, l6q- d]- 2- metyloksazolin. Denne forbindelse fremstilles på samme måte som beskrevet i eksempel 1 ved å utgå fra pregn-4-en-21-ol-3,20-dion-[17a,l6a-d]-2'-metyloksazolin og ved bruk av Absidia orchidis ATCC 6647 som fermenteringsorganisme. Den oppnådde steroid-oksazolinforbindelse har et smeltepunkt på 235°C. P_a_t_e_n_t_k_r_a_v Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive 113-hydroksy-pregn-4-en-3,20-dion-[17a,l6a-d]-oksazoliner med formelen:

hvor R er hydrogen, hydroksyl eller acyloksy med 2-4 karbonatomer, og R' er hydrogen, laverealkyl eller fenyl, karakterisert ved at en steroid-oksazolinforbindelse med formelen:

hvor R og R' har den ovenfor angitte betydning, utsettes for den enzymatiske aktivitet som frembringes ved fermentering av en sopp fra slektene Curvularia, Cunninghamella eller Absidia.