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Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur enzymatischen 1-Dehydrierung
eines Steroids der 16a,17a-Dihydroxy-3-keto-44-pregnen-Reihe unter aeroben Bedingungen.
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Es ist bereits bekannt, in der 1,2-Stellung gesättigte Steroide auf
enzymatischem Wege in die 1-Dehydrosteroide überzuführen, indem man entweder das
Steroid einer Kultur eines wachsenden Mikroorganismus einverleibt; der diese Dehydrierung
bewerkstelligt, oder indem man das Steroid der Einwirkung von aus demWachstumsmediumabgetrenntenZellendesMikroorganismus
aussetzt, welcher diese Dehydrierung bewirkt,oder indem man das Steroid mit einem
1-Dehydraseferment behandelt, das aus den-Zellen solcher Mikroorganismen isoliert
wurde. Diese Methoden werden nachstehend zusammen als »enzymatische 1-Dehydrierungu
bezeichnet. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß zur Herstellung des 1-Dehydroderivats:
eines Steroids der 16ac;17a-Dihydroxy-3-keto-44-pregnen-Reihe diese Umwandlung technisch
vorteilhafter durchgeführt werden kann; wenn als Ausgangssteroid der cyclische 16;17-Borsäureester
das Cycloborat eines solchen Steroids: in wäßriger Lösung in Gegenwart von Dimethylformamid
oder ein wasserlösliches Salz eines solchen Borsäureesters verwendet wird.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur enzymatischen
1-Dehydrierung eines Steroids der 16a,17ä-Dihydroxy-3-keto-44-pregnen-Reihe unter
aeroben Bedingungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Ausgangssteroid
den cyclischen 16,17-Borsäureester des entsprechenden 16a,17a-Dihydroxy-3-keto-44-pregnens
in wäßriger Lösung in Gegenwart von Dimethylformamid bzw. ein wasserlösliches Salz
eines solchen Borsä_ ureesters in wäßriger, Lösung verwendet.
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Die enzymatische 1-Dehydrierung kann entweder erfolgen, indem man
das Steroid einer wachsenden oder voll entwickelten Kultur eines Mikroorganismus
einverleibt, welcher Steroide in der 1-Stellung dehydriert, oder indem man das Steroid
mit den Zellen oder dem Mycel einer solchen Kultur behandelt, die vom Wachstumsmedium
abgetrenntwurde, oder indem man das Steroid mit Fermenten behandelt, die aus Zellen
solcher Mikroorganismen isoliert wurden und welche Steroide in der 1-Stellung dehydrieren
können.
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Verfahrensgemäß geeignete Mikroorganismen sind z. B. die folgenden
Arten: Corynebacterium; z. B. C. simpler, Nocardia, z. B. N. aurantia und N. asteroides,
Bacterium, z. B. B.cyelooxydans, Mycobacterium, z. B: M.rhodochrous, Bacillus, z.
B. B.sphaericus; Septomyxa, z. B: S. affmis, Didymella, z. B. D.lycopersici, Calonectria,
z. B. C. decora, Fusarium, z. B. F.solani; Cylindrocarpon, z. B. C.radicicola; Pseudomonas,
z. B. P. testosteroni, Streptomycesz. B: S.lavendulae, sowie auch bestimmte Artender
Genera Protaminobacter, Alcaligenes, Alternaria, Ophiobolus und Pycinodithis.
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Wenn der Mikroorganismus selbst verwendet wird, wird er aerob in einem
geeigneten Nährmedium bekannter Art kultiviert. Das betreffende Steroid kann in
der 1-Stellung dehydriert werden, indem man es entweder zu Beginn oder während des
Züchtungsverfahrens zusetzt.
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Im allgemeinen sind die Bedingungen zur Züchtung der Mikroorganismen
im erfindungsgemäßen Verfahren die gleichen wie die Züchtungsverfahren zur Herstellung
von Antibiotica öder Vitaminen. Der Mikroorganismus wird in oder auf einem geeigneten
Nährmedium und in Gegenwart von Sauerstoff oder Luft kultiviert: Ein geeignetes
Nährmedium enthält im wesentlichen Stickstoffverbindungen sowie assimilierbare Quellen
für Kohlenstoff und Energie. Als Energiequellen können Kohlenhydrate, wie Rohrzucker,
Melassen, Glukose, Maltose, Stärke oder Dextrin, verwendet werden. Als Stickstoffverbindungen
können organische Verbindungen, wie Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt,
lösliche Destillationsrückstände der Alkoholdestillation (distillers solubles),
Peptone und/oder. Hefeextrakt, oder künstliche Stickstoffverbindungen, d. h. einfache
anorganische und organische Verbindungen, wie Ammoniumsalze, Alkalinitrate, Aminosäuren
oder Harnstoff, verwendet werden.
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Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens besteht darin, vorinduzierte Zellen eines der vorgenannten Mikroorganismen
zu isolieren .und .zu verwenden. In diesem Fall wird die Dehydrierung in der 1-Stellung
vorzugsweise in Gegenwart einer Jodessigsäureverbindung, wie Jodessigsäure selbst;
oder einem Salz, z: B. einem Alkalisalz, wie dem Natrium- oder Kaliumsalz, einem
Erdalkalisalz; dem Ammoniumsalz, oder einem .A#minsalz, oder einem Ester der Jodessigsäure
z. B. einem niedrigmolekulaxen Alkylester, wie dem Methyl- oder Äthylester, oder
einem monocyelischen Aralkylester durchgeführt: Die Jodessigsäureverbindung liegt
vorzugsweise in einer. Konzentration von etwa 0,001- bis etwa 0,lmolar: und optimal
in einer Konzentration von etwa 0;005= bis etwa 0,02molar vor. Während der enzymatischen
Dehydrierung in der 1-Stellung muß auch für eine-ausreichende Zufuhr von Sauerstoff
gesorgt werden, vorzugsweise entweder -durch Belüften und/oder Schütteln des Gemisches.
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Als Ausgangssteroid wird der cyclische 16,17-Borsäureester eines Steroids
der 16oc,17a-Dihydroxy-3-keto-44-pregnen-Reihe in wäßriger Lösung in Gegenwart von
Dimethylformamid oder ein wasserlösliches Salz eines solchen Borsäureesters verwendet.
Zu solchen Verbindungen gehören insbesondere die Alkalisalze, wie die Natrium- und
Kaliumsalze, und das Ammoniumsalz der cyclischen 16;17-Borsäureester. Besonders
bevorzugte Ausgangssteroide haben die allgemeine Formel -
in der R ein Wasserstoffatom, R' ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe oder
R und R' zusammen ein Carbonylsauerstoffatom und X ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom,
eine Hydroxyl-, niedrigmolekulare Alkoxy- oder Alkylgruppe bedeutet, mindestens
einer der Substituenten X ein Wasserstoffatom ist; Y ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe,
ein Chlor-oder Fluoratom, Z ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Hydroxyl-
oder Acyloxygruppe und R"' ein
Kation, vorzugsweise. ein Alkalimetall-
oder A_mmoniumkation ist.
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Beispiele für geeignete Ausgangssteroide sind die Alkali- und Ammoniumsalze
der cyclischen 16,17-Borsäureester von 16oc,17a-Dihydroxyprogesteron, 16a, 17a,21
- Trihydroxyprogesteron, hoc - Methyl - 16a, 17a-dihydroxyprogesteron, 6a-Chlor-
und 6a-Fluor-16a,17oc-dihydroxyprogesteron, 16a,17a-Dihydroxy-21-Iiuorprogesteron,
16a,17a - Dihydroxy - 21- chlorprogesteron, 16a - Hydroxyhydrocortison, 16a -Hydroxycortison,
9a-Halogen-16a-hydroxyhydrocortisone, wie 9a-Fluor-16oc-hydroxyhydrocortison, 9a-Halogen-16a-hydroxycortisone,
12a-Halogen-16a-hydroxyhydrocortisone, wie 12a-Fluor-16oc-hydroxyhy--drocortison,
12a-Halogen-1,6a-hydroxycortisone, 6a -Methyl -16a - hydroxyhydrocortison, 6ec -Methyl-16a-hydroxycortison,
6a-Fluor-16a-hydroxyhydrocortison, 6x;Chlor-16a-hydroxyhydrocortison, 9cc-Halogen-6a-methyl-16a-hydroxyhydrocortisone,
12a-Halogen-6oc-methyl-16a-'hydroxyhydrocortisone, 9oc-Halogen-6oc-fluor-16a-hydroxyhydrocortisone,
_ wie 6a, 9a-Difluor-16a-hydroxyhydrocortison, 9a-Halogen-6a.-chlor-16ca-hydroxyhy
drocortisone, wie 6a,9a-Dichlor-16oc-hydroxyhydrocortison, 11ß,16ä,17a-Trihydroxyprogesteron,
11-Keto-16oc,17a-dihydroxyprogesteron, 9oc-Halogen-11ß,16a,17oc-trihydroxyprogesterone,
wie. 9oc-Fluor-11ß;16oc,17a-trihydroxyprogesteron, 9oc-Halogen-11-keto-16oc,17oc-dihydroxyprogesterone,
12a-Halogen-llß,16oc,17oc-trihydroxyprogesterone; 12a-Halogen-11-keto-16ca,17a-dihydroxyprogesterone,
.21-Halogen-11ß,16a,17a-trihydroxyprogesterone, 9a,21-Dihaiogen-11ß,16ca,17a-trihydroxyprogesterone@
6a,9a,21-Trifluor-I1ß,16a,17oc-trihydroxyprogesteron und 6a,9a,21-Trichlor-I1ß,16a,17a-trihydroxyprogesteron
und Ester solcher Steroide mit einer Hydroxylgruppe in 21-Stellung. Besonders bevorzugt
verwendete Ester sind die Ester von Carbonsäuren mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen,
bei--spielsweise:, aliphatischen Carbonsäuren mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen,
olefinisch ungesättigten Fettsäuren:mit weniger als 12 Kohlenstoffatömen, monocyclischen
aromatischen Carbonsäuren, niedrigmolekularen aliphatischen Carbonsäuren, die durch
einkernigeArylrestesubstituiertsind, cycloaliphatischen Carbonsäuren und Cycloalkencarbonsäuren.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Ausgangssteroide sind .im Gegensatz
zu herkömmlichen Steroiden in Wasser sehr leicht löslich bzw. können in eine wasserlösliche
Form übergeführt werden. Sie liegen daher im Dehydrierungsmedium als wäßrige Lösung
vor. Dies bietet mehrere Vorteile beim erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber den
bekannten Verfahren. Es ermöglicht nämiich eine höhere Konzentration des zu dehydrierenden
Substrats in löslicher Form, als es bisher möglich war. Bei den bisher bekannten
Verfahren wurde nämlich das dabei verwendete Steroid vorzugsweise als Lösung in
einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, zugesetzt. Die Konzentration
dieser Steroidlösungen war relativ gering; und ihre enzymatische 1-Dehydrierung
wurde durch die Gegenwart der organischen Lösungsmittel gehemmt. Wenn das Steroid
in fester Form zugesetzt wurde, hingen die Reaktionsgeschwindigkeit und das Ausmaß
der Umsetzung von der Geschwindigkeit des Inlösunggehens und letzten Endes der Löslichkeit
des Steroids ab. Bei Verwendung der erfindungsgemäß eingesetzten Ausgangssteroide
lassen sich jedoch Konzentrationen bis zu etwa 0;0025molar an Ausgangssteroid in
Verfahrensweisen verwenden, bei denen das Substrat einer verdünnten Kultur des Mikroorganismus
zugesetzt wird. Konzentrationen bis zu etwa 0,lmolar an Ausgangssteroid können bei
Verfahrensweisen verwendet werden, bei denen das Substrat einem System zugesetzt
wird, welches abgetrennte, konzentrierte Zellen oder das 1-Dehydrasefexment enthält.
Vorzugsweise be:. trägt die Konzentration an Substrat in dem erstgenannten System
etwa 0,0002- bis etwa 0,002molar. Im letztgenannten Fall liegt die Konzentration
bei etwa .0,000Z-bis etwa 0;02molar.
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Das in wäßriger Lösung vorliegende Ausgangssteroid wird entweder vor
oder während der Kultivierung des Mikroorganismus zugesetzt, wenn der Mikroorganismus
allein verwendet wird, oder es wird einemwäßrigen Medium zugesetzt, das die abgetrennten
Zellen oder das zollfreie 1-Dehydraseferment und die Jodessigsäureverbindung enthält,
wenn nach dieser Verfahrensweise gearbeitet wird. Nach etwa 1 bis etwa 48 Stun--den,
entsprechend der Konzentration des Steroids und des Ferments ist praktisch das gesamte
Substrat in das entsprechende 1-Dehydroderivat umgewandelt. Der erhaltene cyclische
16;17-Borsäureester des 1-Dehydroderivats kann dann abgetrennt werden. Vorzugsweise
wird jedoch das Medium gegebenenfalls nach Abtrennung der Zellen oder des Mycels,
wenn ein Mikroorganismus verwendet wird, auf einen pH-Wert von mindestens 4,5 und
vorzugsweise etwa 2 bis etwa 4 angesäuert, z. B.. mit einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure,
um die Borsäureestergruppierung zu verseifen. Man erhält so das freie 16oc,17a-Dihydroxyderivat.
Das gewünschte Steroid kann dann in herkömmlicher Weise abgetrennt werden, z. B.
durch Filtration oder Abschleudern oder durch Gegenstromextraktion.
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Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
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Beispiel 1 Nocardia restrictus, Waksman Collection Nr. 545, Rutgers
University, New Brunswick, New Jersey, wird 4 Wochen bei 25°C auf einem Schrägagar
folgender Zusammensetzung kultiviert: Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 1,5 g . Hefeextrakt ........... ... .............
3,0 g Pspton . ............................ 6,09
Glukose..............................
1;0 g Destilliertes Wasser auf . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Dieses Nährmedium
A wurde vorher 30 Minuten bei 121'C im Autoklav sterilisiert.
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1-ml-Portionen einer Suspension, die durch Waschen der Oberfläche
des Schrägagars mit 5,0 ml sterilem Wasser erhalten worden ist, werden zum Beimpfen
von 50-mi-Anteilen eines Nährmediums verwendet, das in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben
enthalten ist, die mit Watte verstopft sind. Dieses Nährmedium B hat folgende Zusammensetzung:
Popton .............................. 5,0 g Trypton .............................
5,0 g Hefeextrakt .........................5,0 g Glukose .............................
20,0 g CaC03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g Destilliertes
Wasser auf . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Das Nährmedium wurde."
vorher 30 Minuten -bei 121'C im Aütoklav sterilisiert.' ' Die -beimpften Kolben
werden bei 25'C auf einer Drehschüttelmaschine mit einem Hub von 50 min bei :280
U/min geschüttelt. Nach 23 Stünden werden 6 VoiJumprozent auf eine andere Reihe
von Kolben über-_ragen, welche das gleiche Nährmedium B enthalten. -Die zweite Reihe
voü.Kolberi wird in gleicher Weise wie die ersten: Kolben 17 Stunden bebrütet. Dann
werden jedem Kolben 0,25 ml einer Lösung des cyclischen 16,17-Borsäureesters von
16öä-Hydroxy-9a-fluorhydro-,cortison in NN-Dimethylformaniid zugegeben., Die ,»imetbylformamidlösung
enthält 20`mg Steroid - je -'Milliliter; und somit liegt das Steroid in einer Konzentration
von 100-y/nil Kulturflüssigkeit vor. 41/2 und 29 Stunden nach der Zugäbe des Sterods
zur Kulturflüssigkeit werden Proben entnommen, auf pii 3;0 ..±0,05 .eingestellt
und die freien Steroide mit Methylisobutylketon extrahiert und mit Benzol-Äthanol-,
'Wasser an Whatman-Papier Nr:1 chromatographiert. 'Es wird festgestellt, daß nach
4 bis 5 Stünden die De-.hydrierung in der 1-Stellung zu 700/,-erfolgt und nach -.etwa
29 Stunden praktisch quantitativ- abgelaufen ist. ._ , Beispiel 2: ".Eine .-lyöphilisierte.
Reagenzglaskultur von Corynebacteriüm simplex ATCC 6946 wird zum Beimpfen "eines
250-m1-Kolbens verwendet, der 50 ml des Nährmediums B enthält; das im Beispiel,
1 verwendet wurde. "Der beimpfte Kolben wird bei 25°C 24 Stunden auf `einer Drehschüttelmäsehine
rnit 50 mm Hub und '_2ß0 U/min geschüttelt. Etwa 0,05-inl-Anteile. des Mediu"ms
werden dannzum Beimpfen mehrerer 50-m1 -Anteile "eines Nährmediums C folgender Zusammerisetzung-verwendet:
Hefeextrakt . . . . . . . . ...: . . .-. . . . . . . . . . . . . 1,0 g KH2P04 .
. . . . . . . . : : . . . . . . . . . . . . . . : 1,0 g `- KIHP04 '. .. : . . .
. . . . . . . . . . . ... . .". . . . . . : . . 1,0 g Glukose-monohydrat . . . .
. . . . . . . . . . 1;0 g '@''Leitungswasser auf . .-. .. . . . . . . . . 11 Dieses
Nährmedium C wurde vorher 20 Minuten bei 121'C im Autöklav sterilisiert: Diese-
Reihe von Kolben wird in gleicher Weise wie der erste Kolben 48 Stunden bebrütet.
Dann werden 60volumprozentige Übertragungen auf mehrere Kolben durchgeführt, welche
das-- gleiche Nährmedium C enthalten. Diese in der dritten Stufe verwendeten kol-,ben
werden 24 Stunden in gleicher- Weise wie die vorhergehenden Stufen bebrütet. Dann
wird jeder Kolben ,mit 1,0 ml einer wäßrigen -Lösung versetzt, die Na-'triumtetraborat
(als Borax, 23 mg/ml) sowie 60 mg/ml l16x-Hydroxy-9a-fluor-liydrocortison enthält.
Das Ste- ` roid liegt in wäßrger Lösung als Natriumsalz des cyclischen Borsäureesters
vor. Somit beträgt die Konzentration an Steroid in der Gärmaische 600 y/ml. In Zeitäbständenwerden
aliquote Teile. entnommen, mit konzentrierter Phosphorsäure auf pH 3,0 iL0;5 eingestellt;
' und die freien Steroide werden mit Methylisobutylketon extrahiert und päpierchromatographisch
analysiert. 17 Stunden nach der Steroidzugabe liegen etwa 83 °/o des eingesetzten
Steroids in Form von Triamcinolon, i d. h.. 16a-Hydroxy-9a-fluorprednisolon, vor:
Nach 41 Stunden ist die Dehydrierung in der 1-Stellung praktisch quantitativ.- .
-_3. _ V . Beispiel Eine Kultur- von Corynebacterium simplex`ATCC _..6946--wird
7 Tage bei 25'C auf einem Schrägagar falgender Zusammensetzung kultiviert: Rindfleischextrakt
-s . . . . . . . . . . . . . . =1,5 g% Hefeextrakt .... . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . ... 3;0 g Pepton . . . . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . 6;0
g Glukose . ....................... 1;0 g Agar . - . . . . : . .-. . . . . . . .
. . 15,0 g . . Destilliertes Wasser auf . . . . . . . . . . . . . 11 Dieses Nährmedium
wurde vorher 30 Minuten bei 121'C im Autoklav sterilisiert.
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3-ml-Anteile einer Suspension werden -hergestellt; ,die durch Abwaschen
des Oberflächenwachstums .des Schrägagars mit 10 ml eines Mediums.. folgender Zusammensetzung
(Medium F1) erhalten wurden: .
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KH2P04 ....... - _ . . . . . - _ . . . . . 1,0 ,g Pepton .:............
..... - ...:. 10,0 g _ Hefeextrakt . . . : . . . . . . . . . . . . : .
... 2,5 g. Glukose 30;0 g-._ Wasser auf ..... ....... : . . . . .
. ., . . 11'-Das Medium- würde vorher i auf ipH 72 eingestellt und dann .30 Minuten
bei 121'C im Autoklav sterili-. siegt.
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Diese 3-ml-Ämteile werden zum = Beimpfen von 50-ml-Anteilen des gleichen
Mediums Fi verwendet, das in 25Ö-ml-Erlenmeyer-Kolben, mit Wattestopfen -.versehen,
enthalten ist. Die Kolben werden 3 Tage bei .25'C auf einer brehschüttelmaschine
mit 50 mm Hub rund 280 U/min bebrütet. Der gesamte Inhalt der Kol .ben wird dann,
aseptisch auf'..41 fassende Erlenmeyer-.Kolben übergeführt, die 11 des MediumsF1
enthalten. Diese Kolben (die FZ-Kolben) werden 2Tage bei-251C ,auf einer
Drehschüttelmaschine mit, 32 mm Hub und 120 U/min geschüttelt. Sechs F2-Kolben werden
zum Beimpfen von 1891 FZ-Medium in einem. belüfteten @Rührfermenter. verwendet.
Nach 48 Stunden.: Zell-Wachstum wird: eine durch Filtration sterilisierte Lösung
von _15 g Testosteron in .300 ml Methanol dem Fermenter zugesetzt.- 24 Stunden später
werden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, als Paste ab-,getrennt und in eineni@Gefrierschrank
bei -17'C auf-'bewahrt..
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Die enzyiriätische Dehydrierung in der 1-Stellung des cyclischen 16,17-Borsäureesters
von..9a-Fluor-16a-hydroxyhydrocortison wird in einem Medium folgender .Zusammensetzung
bewirkt: -Gefrorene Zellen . . . . . . . . . . . 3 Gewichtsprozent/Vol: 'KH2P04
.- ..: - .....`
....... 0,05molar 'Na211,P20. ............... 0;05molar. Natriumsalz
der Jodessigsäure 0;003molar .. (Nach 121/Zstündiger Umsetzung werden weitere 20/,
Zellen und 0,002molares Natriumsalz der Jodessigsäure zugegeben.) Die Umsetzung
wird irreinem Gesamtvolumen von 50 ml Medium in einem 250-ml-.Erlenmeyer-Kolben,
durchgeführt. Das Ausgangssteroid wird hergestellt durch Vermischen -von 20Ö mg
einer Mischung von 82 °/a 9a-Fluor-16a-hydroxyhydrocortison und'12,2°/0 9oc-Fluor-16ac-hydroxypredniso-
Ion,
2,4m1 Methanol und 25 mg Na2B407# 10H20, gelöst in 0,4 ml Wasser, in einem Kolben
und Erhitzen auf 95°C im Dampfbad. Nach etwa 5 Minuten ist das Material in Lösung
gegangen und wird dann mit 50 ml des vorstehend beschriebenen Mediums vermischt.
Der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt und der Kolben auf eine Drehschüttelmaschine
bei 25°C gegeben. Proben werden zur chromatographischen Analyse in Zeitabständen
entnommen und der Fortgang der Dehydrierung verfolgt. Es werden folgende Ergebnisse
erhalten:
| 9a-Fluor-16a-hy- Triamcinolon |
| Zeit, Stunden droxyhydrocortison |
| mg/ml mg/ml |
| 3,5 1,5 2,8 |
| 12,5 0,3 3,7 |
| 24 0 3,7 |
Das Steroid wird folgendermaßen analysiert: Eine angesäuerte Probe wird mit Methylisobutylketon
extrahiert und der Extrakt im System Benzol-Äthanol-Wasser papierchromatographiert.
Hierbei trennen sich die Bestandteile, die eluiert werden. Die Konzentration wird
durch Vergleich der Absorption im Ultravioletten mit Standardproben bestimmt. Bei
einem zweiten Versuch gemäß Beispiel 3 werden 4 mg des cyclischen Borsäureesters
von 9a-Fluor-16oc-hydroxyhydrocortison innerhalb 21 Stunden in 3,48 mg Triamcinolon
je Milliliter umgewandelt.
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Ähnlich können nach den Verfahrensweisen der Beispiele 1, 2 und 3
die cyclischen Borsäureester anderer 16a,17x-Dihydroxysteroide der 3-Keto-d4-pregnen-Reihe
in die entsprechenden 1-Dehydroderivate umgewandelt werden.