DE1810586A1

DE1810586A1 - Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1810586A1
Application number: DE19681810586
Authority: DE
Inventors: Du Chaffaut Jean Amaudric; Bernard Maurice
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1967-11-27
Filing date: 1968-11-23
Publication date: 1969-07-10
Also published as: IE32923L; ZM16468A1; DOP1968001538A; IL31097A0; AT290443B; TR17045A; CS161751B2; IE32923B1; BE724512A; NL6816623A; OA02957A; GB1241957A; SE358656B; IL31097A; FR1603540A; LU57379A1; SU495843A3

Description

DR.-ING.VON KREISLER DIL-INA DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES Dr.-lrgJh.A¹^^ ür.-^c r;,.i.--:!i_;n.A:_akvanKreis!qt

DipL-Ci'.srii.Cui^ig i,i.:-ir i):.-!nfj- Kiopsch

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS Köln, DeLfar.annhaus

Köln, 25.November 1968 Fu/Ax/Bt

The British Petroleum Company Limited,

Britannic House, Moor Lane, London, E.C,2, England

Verfahren_zur_Kultivierung_von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen I Mikroorganismus in Gegenwart einer ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Erdölfraktion, eines wässrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert, wobei man die Erdölfraktion und das wässrige Medium kontinuierlich in einen Fermenter einführt, der den Mikroorganismus enthält und in dem man den Mikroorganismus in einer ersten Stufe kultiviert, einen Produktstrom, der den Mikroorganismus enthält, kontinuierlich in einen als zweite Kultivierungsstufe betriebenen Fermenter einführt, in dem der Mikroorganismus mit einem wässrigen Nährmedium der zweiten Stufe behandelt wird, einen den Mikroorganismus enthaltenden Produktstrom kontinuierlich aus dem . g Fermenter der zweiten Stufe abzieht und das Produkt einer Behandlung zur Gewinnung des Mikroorganismus unterwirft, wobei man in der ersten Kultivierungsstufe die Menge der wesentlichen Nährstoffe in der wässrigen Phase des Fermenters der ersten Stufe so bemißt, daß die Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus .nicht durch Mangel an Nährstoffen herabgesetzt wird,

und in der zweiten Stufe die Menge wenigstens eines Nährstoffes in der wässrigen Phase im Fermenter der zweiten Stufe geringer ist als die Menge, die für ungehemmtes Wachstum des Mikroorganismus erforderlich ist, und/oder wenigstens ein Nährstoff,der in der wässrigen Phase des Fermenters der ersten Stufe vorhanden ist, in der wässrigen Phase des Fermenters der'zweiten Stufe fehlt.

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vorzugsweise

Das wässrige Nähmedium von der zweiten Stufe besteht/aus · einem Gemisch des gesamten wässrigen Nährmediums der ersten Stufe, das aus dem Fermenter der ersten Stufe abgezogen wird, oder eines Teils dieses wässrigen Nährmediums mit zusätzlichem Wasser. Gegebenenfalls kann das zusätzliche Wasser Nährstoffe, z-.B. Mineralsalze, enthalten.

Die Wassermenge, die dem Fermenter der zweiten Stufe zugesetzt wird, oder die mit einem Einsatzmateriaistrom zum zweiten Permenter gemischt wird, genügt vorzugsweise, um die Konzentration von etwaigem Toxin, das in dem wässrigen Nährmedium der ersten Stufe gebildet wird, so herabzusetzen, daß das Toxin das Wachstum in der zweiten Stufe nicht wesentlich hemmt. Insbesondere wird die zugesetzte Wassermenge so gewählt, daß der gesamte Gewichtsanteil der Toxine im Produktstrom der zweiten Stufe nicht größer ist als der Anteil dieser Toxine im Produktstrom der ersten Stufe.

Die Wassermenge, die dem Fermenter der zweiten Stufe zugesetzt oder mit einem Einsatzstrom zum Permenter der zweiten Stufe gemischt wird, wird vorzugsweise so gewählt, daß die VerdUnnungsrate im Betrieb des zweiten Fermenters nicht niedriger ist als die Verdünnungsrate im Betrieb des Fermenters der ersten Stufe. Die zugesetzte Wassermenge hängt somit vom Verhältnis des effektiven Volumens der Fermenter der ersten und zweiten Stufe ab. In gewissen Fällen wird natürlich die gewünschte Verdünnungsrate im. zweiten Fermenter ohne Wasserzusatz erreicht. Da es jedoch auch erwünscht ist, eine niedrigere Toxinkonzentration im Fermenter der' zweiten Stufe durch Zusatz von Wasser aufrecht zu erhalten, führt die Kombination der Regelung der Verdünnungsrate in der oben beschriebenen Weise und der Herabsetzung der Konzentration der Toxine zur Verwendung eines Fermenters in der zweiten Stufe, der größer ist als der in der ersten Stufe verwendete Fermenter. Im allgemeinen hat das zugesetzte Wasser das 1- bis 8-faehe, vorzugsweise das 1- bis 5-fache Volumen des Produktstromes, der stündlich vom ersten in

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den zweiten Fermenter geführt wird, jedoch ist dies nicht unbedingt notwendig.

Wenn das wässrige Nährmedium der zweiten Stufe aus dem gesamten wässrigen Nährmedium der ersten Stufe, das aus dem Fermenter der ersten Stufe abgezogen wird, und im wesentlichen aus dem gleichen Wasservolumen besteht, hat der Fermenter der zweiten Stufe vorzugsweise im wesentlichen das doppelte effektive Volumen des Fermenters der ersten Stufe.

Wenn die Verdünnungsrate in der oben beschriebenen Weise ge- f wählt wird, kann die Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus in der zweiten Stufe trotz des Mangels an einem oder mehreren Nährstoffen annehmbar hoch gehalten werden,und insgesamt ergibt sich ein Verfahren, das einen annehmbaren Wirkungsgrad hinsichtlich der Ausnutzung von Nährstoffen und des Gesamtwachstums des Mikroorganismus im Verhältnis zu den Anlagen- und Betriebsvariablen hat.

Die Verweilzeit im Fermenter der zweiten Stufe beträgt zweckmäßig 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise weniger als 3 bis 4 Stunden.

Der hier gebrauchte Ausdruck "Toxin" bezeichnet jedes im Ver- " lauf des Wachstums des Mikroorganismus gebildete Material, das das Wachstum des Mikroorganismus hemmt.

Der hier gebrauchte Ausdruck "Verdünnungsrate" bezeichnet das Verhältnis der Gesamtmenge der Plüssigphase (in Raumteilen pro Zeiteinheit), die einem Fermenter zugeführt wird, zum Betriebsvolumen des Fermenters.

Gegebenenfalls können die beiden Stufen mit einer solchen zugeführten Menge einer Komponente oder eines Ions des wässrigen Nährstoffs zu jeder Stufe betrieben werden, da^die Komponente oder das Ion im ausgebrauohten wässrigen Nährmedium

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aus der zweiten Stufe effektiv verbraucht ist. Auf diese Weise wird eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erzielt, da die Bedingungen so eingestellt werden können, daß eine wirksamere Ausnutzung eines oder mehrerer Nährstoffe im Verhältnis zur Ausbeute an Mikroorganismus erzielt wird. Beispielsweise kann die Menge von Nährstoffen, wie Phosphat oder Kalium, die im ausgebrauchten wässrigen Nährmedium vorhanden ist, auf ein Minimum reduziert werden. Insbesondere kann eine vollständige Ausnutzung der Kaliumionen erreicht werden.

Alle Verfahrensstufen können kontinuierlich oder chargenweise durchgeführt werden. Das Verfahren umfasst wahlweise durchgeführt Stufen, die nachstehend ausführlicher beschrieben wenden.

Als Mikroorganismen, die auf die hier beschriebene Weise kultiviert werden, kommen Hefen, Kleinpilze und. Bakterien in Frage. Der hier gebrauchte Ausdruck "Mikroorganismus" umfasst auch Gemische von Mikroorganismen.

Bei Verwendung einer Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococcoideae. Gegebenenfalls können jedoch augh beispielsweise ascosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycetoideae verwendet werden. Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie Cryptoeoccoideae sind Torulopsis und Candida. Bevorzugte Hefespezies sind nachstehend genannt. Besonders bevorzugt werden die Stämme, deren Hinterlegungsnummem genannt sind. Hierbei sind die mit "CBS" gekennzeichneten Stämme beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland, die mit "CMl" gekennzeichneten Stämme beim Commonwealth Mycological Institute, Kew, England, und die mit "NCYC" gekennzeichneten Stämme bei der National Collection of Yeast Cultures, Nutfield, England, hinterlegt.

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Spezies Candida Candida Candida Candida Candida Candida Candida

Bevorzugter Stamm

brumptii

catenulata

clausenii

humicola

intermedia

krusei

lipolytica

Candida melibiosi Candida parapsilosis Candida pulcherrima Candida rugosa Candida stellatoidea Candida tropicalis Candida utilis Debaryomyces kloeckeri Hansenula anomala Pichia guilliermondii Rhodotorula glutinis Torulopsis famata Torulopsis magnoliae

CBS Nr. 2078; Nr. 599 CMI Nr. 937^3

NCYC Nr. 376; Nr. 153

CMI Nr. 83350. NCYC Nr.

NCYC Nr. 4
CMI Nr. 233I

CBS Nr. 2084; Nr. 203I

Von den vorstehend genannten Stämmen werden Candida lipolytica und C. tropicalis besonders bevorzugt.

Gegebenenfalls können auch Kleinpilze als Mikroorganismen verwendet werden. Geeignet sind Pilze der Familie Moniliaceae. Eine geeignete Gattung ist Penicillium, wobei vorzugsweise Penicillium expansum verwendet wird. Eine weitere geeignete Gattung ist Aspergillus.-

Als Bakterien können im Rahmen der Erfindung die folgenden Ordnungen verwendet werden: Pseudomonadales, Eubacteriales und Actinomycetales.

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Vorzugsweise gehören die verwendeten Bakterien zu den Familien Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actinoraycetaceae, Rhizobiaeeae, Bacillaceae und Pseudomonadaceae. Bevorzugte Spezies sind Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa. Weitere 'geeignete Spezies sind:

Achromobacter sp. Nocardia erythropolis Brevibacterium sp. Nocardia minima Corynebacterium sp. Nocardia opaca Plavobacterium sp* Nocardia polychromogenes Micrococcus sp. Nocardia rubra

Pseudomonas sp. Nocardia rubropertincta

Mycobacterium smegmatis Streptomyces griseolus Mycobacterium sp. Streptomyces rimosus

Streptomyces sp.

Diese Bakterien wachsen in einem wässrigen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

^l 0,5 g
NaCl 4 ff

MgSO₄	o,	5	g
Na₂HPO₄	0,	5	g
KH₂PO₄	0,	5	g
Wasser zur
Auffüllung	auf:		1000 ml

Der PtrWert dieses Mediums wird vorzugsweise bei 7 gehalten.

Ein geeignetes Nährmedium für Hefen und Pilze hat folgende Zusammensetzung:

Diammonium-phosphat 2g

Kaliumchlorid ■ 1,15 g

Magnesiumsulphatheptahydrat 0,65 g

Zinksulphat 0,17 g

Mangansulphatmonohydrat 0,045 g

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Eisen(II)-sulphatheptahydrat 0,068 g Leitungswasser 200 g

Hefeextrakt 0,025 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml)

Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zum Kulturmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextrakts (ein durch Hydrolyse von Hefe erhaltenes, an Vitaminen der Gruppe B reiches industrielles Produkt) oder allgemein an essentiellen Hefe-Nutriliten zusetzt. Zu den essentiellen Hefe-Nutriliten gehören Biotin, " Thiamin, Inosit, Nikotinsäure, Pantothensäure und Pyridoxin. Die zugesetzte Menge des Hefeextrakts liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million, bezogen auf das wässrige Fermentationsmedium. Die Menge jedes Nutriliten variiert zwischen 0,1 Teil/Million für Biotin und 10 Teilen/ Million für Inosit.

Das wässrige Nährmedium wird vorzugsweise beim gewünschten P_H-Wert gehalten, indem ein wässriges Medium von hohem p_H~ Wert stufenweise oder kontinuierlich zugesetzt wird. Im allgemeinen wird bei Verwendung von Pilzen oder Hefen, insbesondere bei Verwendung von Candida tropicalis der p_H-Wert des Nährmediums im Bereich von 3 bis 6, vorzugsweise im Bereich von 4 bis 5> gehalten (Bakterien erfordern einen höheren PjT-Wert von gewöhnlich 6,5 bis 8). Als alkalische Materialien für den Zusatz zum Wachstumsgemisch eignen sich Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak entweder in freier Form oder in wässriger Lösung.

Die optimale Temperatur des Wachstumsgemisches ist verschieden je nach der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis 35 C. Bei Verwendung von Candida tropicalis wird ein Temperaturbereich von 28 bis .32 C bevorzugt.

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Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum des Mikroorganismus wesentlich. Der Säuerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Um die Wachstumsgeschwindigkeit hoch zu halten, sollte die für die Zuführung des Sauerstoffs verwendete Luft durch Rühren in feine Blasen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingeführt werden. Geeignet ist Jedoch auch das als "Wirbelbelüftung" bekannte System der innigen Belüftung.

Ein möglichst großer Teil des wässrigen Nährmediums wird vom Mikroorganismus durch Dekantieren abgetrennt. Zusätzlich oder stattdessen kann eine Abtrennung durch Zentrifugieren erreicht werden. Die erhaltene Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, wird dann mit Wasser gewaschen und einem weiteren Trennprozeß, z.B. einer Zentrifuglerung oder Dekantierung, unterworfen. Diese Aufeinanderfolge von Waschen und Trennen wird wiederholt, bis die gewünschte Menge an restlichem Nährmittel aus der den Mikroorganismus enthaltenden Fraktion entfernt worden ist. Die Waschflüssigkeiten können mit oder ohne weitere Behandlung in die Fermenter zurückgeführt werden.

Der Mikroorganismus wird dann vorzugsweise getrocknet und einer Lösungsmittelextraktion unterworfen. Die Lösungsmittelextraktion wird mit einem Lösungsmittel durchgeführt, das

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aus einem Kohlenwasserstoff besteht, oder dies/enthält. Bevorzugt wird ein Kohlenwasserstoff mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen im Molekül. Vorzugsweise wird ein Paraffin als Kohlenwasserstoff verwendet, wobei wiederum geradkettige Paraffine bevorzugt werden. Geeignet als Lösungsmittel sind n-Pentan und n-Hexan.

Gegebenenfalls wird vor der Extraktion der Kohlenwasserstoffe mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel eine Extraktion mit einem Alkohol, vorzugsweise Äthanol oder Isopropanol, vorgenommen. Gegebenenfalls kann eine Extraktion vorgenommen

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werden, für die als Lösungsmittel ein Gemisch eines Kohlenwasserstoffs mit beispielsweise Äthanol und Isopropanol verwendet wird. Geeignet ist beispielsweise ein Lösungsmittel, das aus 80 Gew.-% Hexan und 20 Gew.-% Äthanol oder Isopropanol besteht.

Die in der Extraktphase durch die Lösungsmittelextraktion zurückgewonnenen Kohlenwasserstoffe können, wenn sie abbaufähig sind, in die Kultivierungsstufe des Mikroorganismus zurückgeführt werden.

Eine Hefe, die ganz oder teilweise von ihren Lipiden und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden befreit und im Geschmack verbessert worden ist, ist ein neues industrielles Produkt, das für die menschliche Ernährung wertvoll ist.

Gemäß einem bevorzugten Kennzeichen umfasst die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus auf die vorstehend beschriebene Weise in Gegenwart einer Erdölfraktion, die teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert und vom Gemisch einerseits den Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion abtrennt, die einen verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen aufweist oder frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist, und anschließend den Mikroorganismus auf die vorstehend beschriebene Weise behandelt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist vom besonderen Wert für die Behandlung von Gasölfraktionen aus Erdöl, die geradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten,

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da beim Verfahren gemäß der Erfindung ein Gasö'l mit verbessertem Stockpunkt erhalten wird, während die Wachse in ein wertvolles Produkt umgewandelt werden.

Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind in den Einsatzmaterialien gemäß der Erfindung gewöhnlich als Paraffine enthalten, können jedoch auch als Olefine vorliegen. Geeignet sind auch Gemische, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten. ' -

Wenn dieses Verfahren unter Bedingungen durchgeführt wird, die die Assimilierung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begrenzen, ist es möglich, unter Entfernung nur eines gewünschten Anteils dieser Kohlenwasserstoffe zu arbeiten.

Zu den geeigneten Einsatzmaterialien des Verfahrens gemäß der Erfindung gehören Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle. Diese Einsatzmaterialien können unraffiniert oder einer gewissen raffinierenden Behandlung unterworfen worden sein, jedoch müssen sie einen Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten, um für die Zwecke der Erfindung geeignet zu sein. Zweckmäßig enthält die Erdölfraktion 3 bis 45 Gew.-% geradkettige Kohlenwasserstoffe.

Bevorzugte Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen und zur Produktabscheidung sind in den folgenden Patentschriften und Patentanmeldungen beschrieben:

Britische Patentschriften 9l4 567, 91* 568, 1 017 584, 1 017 585, 1 021 697, 1 021 698, 1 049 O65, 1-049- 066, 1 049 067, 1 049 929, 1 059 891 und 1 059 881 bis 1 059 8.9Oj britische Patentanmeldung 45 005/63 und deutsche Patentanmeldungen P 14 70 517.O, P 14 42 058.7, P 15 17 736.3, p 15 *5 252.5, ρ 16 45 690.9, ρ 16 45 691.0, p 16 45 692.1;

P 16 42 595.9, P 17 67 856.7 und P 17 70 705.0.

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Die Erfindung wird durch das folgende Beispie], veranscteulicht. Die Versuche 1 und 2 werden für Vergleichszwecke beschrieben.

Beispiel

Die Hefe Candida tropicalis, wurde in einem kontinuierlich betriebenen ersten Fermenter (F.1), der ein Arbeitsvolumen von 6,3 m hatte, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums gezüchtet, das die folgende Zusammensetzung hatte: ' |

H₃PO₄ 1,55 g/l

KCl 0,93 g/l

Mg(OH)₂ 0,063 g/l

H₂O 0,02 g/l

FeSO₄ . 7 H₂O 0,048 g/l

ZnSO₄ . 7 H₂O 0.126 g/l

Hefeextrakt 0,05 g/l .

H₂SO₄ 1,72 g/l

Wasser zur Auffüllung auf 1000 ml

Als Kohlenstoffquelle diente ein Gasöl, das aus irakischem Rohöl erhalten worden war und folgende Kennzahlen hatte:

Spezifisches Gewicht 0,866 Stockpunkt +12⁰C

Siedebereich 270 bis 350⁰C

Das wässrige Nährmedium wurde pro Liter mit l80 g dieses Gasöls gemischt. Das Gemisch wurde in einer Menge von 1260 l/ Stunde in den Fermenter eingeführt. Der Fermenter wurde bei 30⁰C und durch kontinuierliche Zugabe von gasförmigem Ammoniak bei einem p_H~Wert von 4,2 gehalten. Luft wurde in einer Menge von 120 V/v/Stunde zugeführt und durch Wirbelbelüftung verteilt.

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Die Gesamtmenge von I260 l/Stunde des kontinuierlich abgezogenen Produktstromes wurde in einen zweiten Fermenter (P.2) eingeführt, der ein Arbeitsvolumen von 12,4 vor hatte. Diesem Produktstrom von 12βΟ l/Stunde, wurden stündlich 49 1 Gasöl und 285Ο 1 Frischwasser zugesetzt. Das Gemisch wurde in den zweiten Fermenter eingeführt, der bei 30⁰C gehalten wurde. Luft wurde in diesen zweiten Fermenter in einer Menge·von 40 V/V/Stunde eingeführt und durch Wirbelbelüftung verteilt. Eine Verdünnungsrate von 0,33 V/V/Stunde wurde aufrechterhalten.

Aus dem zweiten Fermenter wurde kontinuierlich ein Produktstrom abgezogen und dekantiert. 65 Gew.-^ der wässrigen Phase wurden kontinuierlich abgezogen und durch 65Jä»ew.-$ Leitungswasser ersetzt. Pro nr des Gemisches aus Hefe, restlichem öl und Wasser wurden 0,8 kg eines anionaktivem Detergens zugesetzt, das durch Kondensation eines Gemisches von Laurylalkohol mit Äthylenoxid und Sulf-atierung des Produkts erhalten worden war Ckaural 746"). Dieses Gemisch wurde gut gerührt und zentrifugiert, wobei eine Hefepaste, eine wässrige Phase und eine GasÖlphase als getrennte Produkte erhalten wurden. Die Hefepaste wurde erneut mit Leitungswasser im Verhältnis von 1 Gew.-Teil Trockensubstanz auf 10 Gew.-Teile Wasser gemischt. Das Gemisch wurde gut gerührt und erneut zentrifugiert. Die Hierbei erhaltene Hefepaste enthielt 65 bis 70 Gew.-^ Wasser. Sie wurde in einem Zerstäubungstrockner getrocknet. Der Feuchtigkeitsgehalt der Hefe am Ausgang des Trockners betrug 5 Gew.-%.

Dieses Produkt wurde in eine kontinuierlich arbeitende Extraktionbatterie eingeführt, die im Gegenstrom mit 3~Stufenarbeitete. In dieses System wurde (in der ersten Stufe) 1 Teil der zerstäubungsgetrockneten Hefe pro 8 Teile eines azeotropen Gemisches von Isopropanol und Wasser (12$ Wasser, 88$' Isopropanol) (der letzten Stufe zugeführt) einge-

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führt. Jede Stufe wurde unter Rühren bei 8o°C gehalten. Die aus der letzten Stufe abgezogene Hefe wurde bis zu einem Wassergehalt von 25 Gew.-^ befeuchtet und in einen Zerstäubungstrockner eingeführt, in dem sie von oben nach unten geführt wurde. Die während dieser abschließenden Trocknung gebildeten Kdinglomerate wurden zerkleinert. Die Arbeitsbedingungen und die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle am Schluß der Beschreibung zusammengestellt.

Versuche 1 und 2

Zum Vergleich wurden zwei getrennte Versuche (Versuche 1 und 2) mit einem einzelnen Fermenter durchgeführt. Hierbei wurde wie folgt gearbeitet:

Versuch 1

Die Hefe Candida tropicalis.. wurde in einem kontinuierlich betriebenen Fermenter (F.l), der ein Arbeitsvolumen von 6,3 m hatte, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung kultiviert:

H₅PO₄ . 1,55 g/l J

KCl 0,93 g/l

Mg(OH)₂ 0,063 g/l

MnSO₄HgO 0,02 g/l

FeSO₄ 7HgO 0,&8 g/l

ZnS0₄7Hg0 0,126 ^₁

Hefeextrakt 0,05 g/l

H₂SO₄ 1,72 g/l

Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 ml.

Als Kohlenstoffquelle wurde ein Gasöl verwendet, das aus irakischem Rohöl erhalten wordener und folgende Kennzahlen hatte:

Spezifisches Gewicht ' 0,866

Stookpuntt ₊12°C 80*828/11 OS

Siedebereich 270 bis 350⁰C.

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Dieses GasÖl wurde in einer Menge von 270,1/Stuhde und das wässrige Nährmedium in einer Menge von 98O l/Stunde zugeführt. Der Fermenter wurde bei 3O⁰C und durch kontinuierliche Zugabe von wässrigem Ammoniak bei Ρττ 4,2 gehalten. Luft wurde in einer Menge von 765 m'/Stunde zugeführt. Die Verdünnungsrate betrug 0,2 "V/V/Stunde.

Ein Produktstrom von 12βθ l/Stunde wurde kontinuierlich aus dem Fermenter ausgetragen und der Dekantierung unterworfen. 65 Gew.~% der dekantierten wäßrigen Phase wurden kontinuierlieh abgezogen und durch 65 Gew.-^ Leitungswasser ersetzt. Pro nr des Gemisches aus Hefe, restlichem öl und Wasser wurden 0,8 kg des im Beispiel genannten anionaktivemDdbergens zu-

gesetzt. Dieses Gemisch wurde gut gerührt und zentrifugiert, wobei eine Hefepaste, eine wässrige Phase und eine Gasölphase als getrennte Produkte erhalten wurden. Die Hefepaste wurde erneut mit Leitungswasser im Verhältnis von 1 Gew.-Teil Trokkensubstanz auf 10 Gew.-Teile Wasser gemischt. Das Gemisch wurde gut gerührt und erneut zentrifugiert. Die gewonnene Hefepaste enthielt 65 bis 70 Gew.-% Wasser. Diese Paste wurde in eine)! Zerstäubungstrockner eingeführt, an dessen Ausgang das erhaltene Produkt etwa 5$ Wasser enthielt.

Dieses Produkt wurde in eine kontinuierlich betriebene Extraktionbatterie eingesetzt, die auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise arbeitete. Die am Ausgang dieser Extraktionsbatterie gewonnene Hefe wurde bis zu einem Wassergehalt von 25Gew.-$ befeuchtet und dann in einen Bodentrockner eingeführt, in dem sie vom oberen Ende (bei einer Temperatur von 60°C) zum unteren Ende (bei einer Temperatur von 110 C) geführt wurde. Während dieser abschließenden Trocknung gebildete Konglomerate wurden zerkleinert.Die Arbeitsbedingungen und die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle am Schluß der Beschreibung zusammengestellt.

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Versuch 2

Ein ähnlicher Versuch wie der Versuch 1 wurde in einem kontinuierlich betriebenen Fermenter (P.2) durchgeführt, der ein Arbeitsvolumen von 12,4 nr hatte, wobei das gleiche wässrige Nährmedium wie im Versuch 1 verwendet wurde»

Die Arbeitsbedingungen, die Produktabseheidung und die Lösungsmittelextraktion der Hefe waren die gleichen wie im Versuch 1 mit den Unterschieden, die sich aus den in i der folgenden Tabelle genannten Arbeitsbedingungen ergeben.

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	Versuch 1	Versuch 2	Beispiel 1 Fermenter hintereinander- geschaltet	F.2	0,22	30	30	19,2	19,2	.0,350	0,155 .
	F.l allein	F.2 allein	F.l	12,4	4,2	4,2	0,170	0
Arbeitsvolumen, nr	6,3	12,4	6,3	0,33	120	40
Verdünnungsrate, V/V/Std.	0,2	0,2	0,2			10 16 1,6 2/3	12 0>6 1^81
Gesamtverdünnungsrate, V/V/Std.	0,2	0,2	180	zugesetzter Ant *fhQ\*
Temperatur, ⁰C	30	30	65 ^Λ7"
Pti-Wert co H	. 4,2	4	I
o.Belüftung, V/V/Std.	120	80	0,505 j keitf frischer N 0 488 ^ stoff zugesetzt
co Frisches Gasöl, g/l			10
^ einzeln	65	63
_* insgesamt	65	63
Q Frisches Nährmediura
«° Phosphor, g/l Kalium, g/l	0,505 0,488	0,510 0,480
Produktmenge, kg/Std.	9,5	11
Gesamtprodukt, kg/Std.	9,5	- ii
Nährstoffverbrauch Phosphor, g/l	0,34p	0,300
Kalium, g/l	0,170	0,188
Analyse des Produkts in Gew.-% auf Trockenbasis:
Stickstoff Gesamtlipide Phosphor ' Kalium	10,9 0,8 1,75 2,3	11,0 0,9 1,9 2,2 .

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus in Gegenwart einer ganz oder teilweise» aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Erdölfraktion, eines wäßrigen Nährmediums und eines freien 'Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert, wobei man die Erdölfraktion und das wäßrige Medium kontinuierlich in einem Permenter einführt, der den Mikroorganismus enthält und in dem man den Mikroorga- ™ nismus in einer ersten Stufe kultiviert, einen Produktstrom, der den Mikroorganismus enthält, kontinuierlich in einen als zweite Kultivierungsstufe betriebenen Permenter einführt, in dem der Mikroorganismus mit einem wäßrigen Nährmedium der zweiten Stufe behandelt wird, einen den Mikroorganismus enthaltenden Produktstrom kontinuierlich aus dem Permenter der zweiten Stufe abzieht und das Produkt einer Behandlung zur Gewinnung des Mikroorganismus unterwirft, wobei man in der ersten Kultivierungsstufe die Menge der wesenblichen Nährstoffe in der wäßrigen Phase des Permenters der ersten Stufe so bemißt, daß die Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus nicht durch i Mangel an Nährstoffen herabgesetzt wird und in der zweiten Stufe die Menge wenigstens eines Nährstoffs in der wäßrigen Phase im Permenter der zweiten Stufe geringer ist als die Menge, die für ungehemmtes Wachstum des Mikroorganismus erforderlich ist, und/oder wenigstens ein Nährstoff, der in der wäßrigen Phase des Permenters der ersten Stufe vorhanden ist, in der wäßrigen Phase des Permenters der zweiten Stufe fehlt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Nährmedium der zweiten Stufe aus einem Gemisch des gesamten oder eines Teils des aus dem Permenter der ersten Stufe abgezogenen wäßrigen Nährmediums

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zusammen mit zusätzlichem VJasser besteht.

J>) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch· gekennzeichnet, daß die Wasserzugabe·das ein- bis fünffache des Volumens/ Stunde des Produktstroms beträgt, der aus dem Fermenter der ersten Stufe'in den der zweiten Stufe geleitet wird.

4) Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ausreichend viel Wasser zusetzt, um den Gehalt an in der ersten Stufe im wäßrigen Nährmedium erzeugtem Toxin so herabzusetzen, daß das Wachstum in der zweiten Stufe nicht wesentlich beeinträchtigt wird.

5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das gesamte aus dem Fermenter der ersten Stufe abgezogene flüssige Produkt, welches in Suspension den Mikroorganismus enthält, in den Fermenter der zweiten Stufe einführt»

6) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5> dadurch.gekennzeichnet, daß die Verdünnungsrate im Betrieb des Fermenters der zweiten Stufe nicht niedriger ist als diejenige im Fermenter der ersten Stufe.

7) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Nährstoff, der in der zweiten Stufe in geringerer Menge als für ungehemmtes Wachstum erforderlich oder vollständig abwesend ist, Kalium ist,

8) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Hefe einsetzt..

9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurdi gekennzeichnet, daß man Hefe der Familie Cryptococcaceae, vorzugsweise der Gattung Candida und insbesondere Candida tropicalis einsetzt.

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lo) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9* dadurch gekennzeichnet, daß man eine Erdölfraktion einsetzt, die ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit einem mittleren Molekuelargewicht üi das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen/MolekUl entspricht₀

11) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Erdölfraktion ein GasÖl einsetzt.

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