Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen. gemäss welchem ein Mikroorganismus insbesondere Hefe in einem Gärbottich in Gegenwart einer Petroleumfraktion insbesondere aus Kohlenwasserstoffen, als Kohlellstoffquellew eines wässerigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet wird, wobei die Petroleumfraktion in Form von kleinen Partikeln im Gärbottich vorhanden ist.
Vorzugsweise weisen die Stoffteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 30 Mikron auf. Besonders vorteilhaft ist es. wenn der mittlere Durchmesser dieser Teilchen weniger als 10 Mikron beträgt.
Diese kleinen Stoffteilchen können durch Zersprühen eines flüssigen Materials in eine wässerige Phase oder in eine (Gasphase gebildet werden. Die in Gasphase gebildeten kleinen flüssigen Teilchen müssen in ein flüssiges Medium. z.B. eine wisserige Phase übergeführt werden. Die Dispersion von kleinen Teilchen im flüssigen Trägermedium kann dann in den G.irbottich gebracht werden. Die kleinen, flüssigen, gegebenenfalls festen Partikel können aber auch im Gärbottich selbst erzeugt werden indem das Material direkt im Gärbottich zersprüht wird. Das wässerige Medium zur Bildung der Dispersion ausserhalb des Gärbottichs kann aus einem nvlisserigen Nährmedium bestehen.
Die flüssige Phase. welche durch den Zersprüher geleitet u-ird. kann gewiinschtenfalls eine Mischung von Kohlenwasserstoff entweder mit Luft oder einem wässerigen Mittel sein.
Gex iinschtenfalls wird eine flüssige Phase durch den Zersprüher geleitet, um eine Suspension von feinen flüssigen Partikeln in einem Gas zu bilden, worauf das dispergierte Material auf eine bewegte Flüssigkeitsoberfläche geleitet wird, z. B. derjenigen eines wässerigen Nährmediums.
Die kleinen Flüssigkeitspartikel können gegebenenfalls auch durch Dispersion, z.B. einer flüssigen Petroleumfraktion in eine wässerige Phase oder in eine Gasphase unter der Wirkung von Ultraschallwellen hergestellt werden. Vorzugs weise wird eine flüssige Phase. welche eine Mischung eines Kohlenwasserstoffes entweder mit Luft oder einem wässerigen Medium durch einen Ultraschallwellengenerator geleitet.
Gewiinschtenfalls wird eine flüssige Phase durch einen Liltraschallwellengenerator geleitet, um eine Dispersion von feinen fliissigen Partikeln in einem Gas zu bilden, worauf das dispergierte Material auf eine sich bewegende Flüssigkeitsober fläche. z. B. die eines wässerigen Nährmediums geleitet wird.
Gemäss einer anderen Ausführungsart des erfindungsge miisoen Verfahrens kann die Petroleumfraktion auch in Form von kleinen festen Partikeln vorliegen. und ist hierbei ein Material, welches bei der Züchtungstemperatur fest ist.
Vorzugsweise werden die kleinen festen Teilchen als Suspension in einem flüssigen Medium durch Zerstäuben einer geschmolzenen Petroleumfraktion in Gegenwart oder in Abwesenheit von anderen Bestandteilen, in ein flüssiges Medium, welches eine Temperatur aufweist. die niedriger als der Schmelzpunkt des Stoffes ist, erzeugt, wobei eine Abschrekkung desselben eintritt.
Gemäss einer anderen bevorzugten Methode wird eine Emulsion oder eine Lösung des Ausgangsstoffes in einem flüssigen Medium gebildet und die Emulsion oder Lösung einer Abschreckung unterworfen, um eine Suspension des Stoffes im fliissigen Medium zu bilden. Die Emulsion kann durch Zersprühen des ursprünglich festen, geschmolzenen Stoffes in einem flüssigen Medium. das eine Temperatur aufweist, die höher ist als der Schmelzpunkt des Stoffes, hergestellt werden.
Als flüssiges Medium für die Zersprühung verwendet man vorzugsweise eine wässerige Phase oder einen flüssigen Kohlenwasserstoff.
Eine geeignete wässerige Phase ist das Nährmedium selbst.
Als flüssiger Kohlenwasserstoff eignet sich ein solcher, welcher durch den Mikroorganismus keine Umwandlung erfährt. Deshalb eignet sich dafür im allgemeinen ein wachsfreies Gasöl.
Zur Bildung von feinen Partikeln führen vorzugsweise Bedingungen, welche eine starke Ausfällung ergeben. Wenn eine Petroleumfraktion verwendet wird, die schon in Form von kleinen Partikeln vorliegt, können diese feinen Partikel leicht agglomerieren, was jedoch durch Zusatz eines Emulgiermittels vermindert werden kann.
Gemäss einer anderen Ausführungsart des Verfahrens kann eine Dispersion der Petroleumfraktion, z.B. eines Kohlenwasserstoffes, in einem flüssigen Medium hergestellt werden und mit einem Mikroorganismusgemisch in einen Gärbottich gebracht werden, der bereits einen Mikroorganismus, ein wässeriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und fortlaufend ein Strom Zuchtbrühe aus dem Gärbottich abgezogen werden.
Bei den beschriebenen Ausführungsarten des erfindungsge mässen Verfahrens kann der Mikroorganismus, welcher in der zugeführten Gärbrühe enthalten ist, und der Mikroorganismus, welcher im Gärbottich gezüchtet wird, verschieden oder gleich sein. Es wurde festgestellt, dass die Gegenwart des Mikroorganismus im dispergierten Ausgangsstoff die Agglomerierungstendenz der Partikel vermindert.
Vorzugsweise ist der eingespeiste Mikroorganismus eine Hefeart. Bei der Züchtung einer Hefe kann ein Teil der aus dem Gürbottich gewonnenen Hefe zur Bildung des Zustromes verwendet werden.
Vorzugsweise ist das flüssige Medium, welches als kontinuierliche Phase bei der Bildung des Zustromes benützt wird, ein wässeriges Mittel. Mit Vorteil ist dieses flüssige Medium im Kreislauf geführtes wässeriges Nährmedium.
Vorzugsweise wird die aus dem Gärbottich abgezogene Flüssigkeit zentrifugiert, und in (a) eine Phase mit dem grösseren Teil des Mikroorganismus, (b) eine wässerige Phase mit dem kleineren Teil des Mikroorganismus und (c) eine aus der Petroleumfraktion bestehende Phase getrennt.
Zumindest ein Teil der wässerigen Phase, welche den kleineren Teil des Mikroorganismus enthält, kann dann als Kreislaufphase, in welcher die Petroleumfraktion dispergiert wird, verwendet werden. Wenn die in der wässerigen Phase vorliegende Menge an Mikroorganismus nicht genügt, um die Petroleumfraktion in disperser Form aufrecht zu erhalten, können, wenn erwünscht, weitere Mengen an solchem Mikroorganismus nach der Dispergierungsstufe zugesetzt werden.
Zweckmässig verwendet man dazu einen Teil der durch Zentrifugieren gewonnen Fraktion (a). Grössere Agglomerate an Mikroorganismus werden aus der wässerigen Phase abgeschieden und nur die davon befreiten Teile werden von der wässerigen Phase in die Dispergierungsstufe übergeführt. Da die Dispergierung der Petroleumfraktion zu teilweiser Zerstörung kleinerer Gruppen Mikroorganismus oder sogar einzelner -Zellen führen kann, ist es von Vorteil wenn man wenigstens einen Teil der Mikroorganismen, welcher zur Stabilisierung der Dispersion benützt wird, von der Dispergierungsstufe ausnimmt, insbesondere denjenigen Teil, welcher wegen grösserer Agglomerate, die er enthält, anfälliger ist, Schaden zu leiden.
Geeignete Dispergierungsmethoden sind z. B. 1. Verwendung einer Einspritzdüse, 2. Verwendung einer Kolloidmühle, z. B. eines Hurrel-Homogenisators, 3. Verwendung von Ultraschallwellen.
Vorzugsweise verwendet man Petroleumfraktionen, welche Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette oder eine Mischung von Kohlenwasserstoffen mit vorwiegend unverzweigter Kette enthalten. Vorzugsweise enthält der Kohlenwasserstoff 10 oder mehr C-Atomen.
Es ist wohlbekannt, dass gewisse Petroleum-Fraktionen, insbesondere Gasöle, Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette enthalten, hauptsächlich Paraffine, bzw. Wachse. Sie haben eine nachteilige Wirkung auf den Stockpunkt der Fraktion, d. h. durch teilweise oder gänzliche Entfernung dieser Kohlenwasserstoffe wird der Stockpunkt der Fraktion herabgesetzt. Gewöhnlich wird das Wachs durch Ausfällen mittels Lösungsmitteln entfernt.
Die Petroleum-Fraktion, welche einen niedrigeren Siedepunkt als das Gasöl aufweist, z. B. schwere Naphtene und Kerosine, enthalten ebenfalls Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette, welche für die Umwandlung in andere Produkte wertvoll sind. Dies wurde jedoch früher dadurch erschwert, dass es notwendig war, diese Kohlenwasserstoffe aus den Petroleum-Fraktionen abzutrennen, bevor sie in andere Produkte umgewandelt werden konnten.
Wenn man zur Züchtung eine Petroleum-Fraktion verwendet, die zum Teil aus Kohlenwasserstoffen mit unverzweigter Kette von mindestens 10 C-Atomen besteht, so erfolgt gleichzeitig eine Umwandlung in ein Gemisch, dessen Anteil an Kohlenwasserstoffen mit unverzweigter Kette geringer ist oder überhaupt frei von solchen ist.
Von besonderem Wert ist die Möglichkeit, auf diese Weise Petroleum-Gasöl-Fraktionen, welche Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette in Form von Wachsen enthält, in ein Gasöl mit verbessertem Stockpunkt überzuführen, während andererseits die abgetrennten Wachse in wertvollere Produkte umgewandelt werden.
Verwendbare organische Stoffe enthalten die Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette im allgemeinen in Form von Paraffinen. Diese Kohlenwasserstoffe können jedoch auch Olefine sein, oder man verwendet eine Mischung dieser Stoffe.
Wichtig ist, dass, wenn Hefe in Gegenwart eines Ausgangsstoffes der vorbeschriebenen Art unter Bedingungen, welche das Wachstum der Hefe auf Kosten der Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette fördern, gezüchtet wird, die anderen Kohlenwasserstoffe, z.B. Isoparaffine, Naphthene, aromatische Kohlenwasserstoffe, nicht umgewandelt werden oder dass der Anteil, welcher umgewandelt wird, sehr klein ist. Weiterhin ist, im Gegensatz zu chemischen Prozessen, welche durch das Gesetz der Massenwirkung beherrscht werden, die Geschwindigkeit der Entfernung von Kohlenwasserstoffen mit unverzweigter Kette nicht abhängig von deren Konzentration in der Mischung, allerdings ausgenommen in den allerletzten Stadien des Prozesses.
So kann gewünschtenfalls ein Umwandlungsgrad von gegen 100% der Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette erreicht werden, ohne dass es notwendig ist, die Kontaktzeit unverhältnismässig zu erhöhen, um eine kleine Verbesserung zu erzielen. Auch kann im kontinuierlichen Verfahren dieser hohe Umwandlungsgrad erzielt werden, ohne dass zu einem langen Reaktionsweg Zuflucht genommen werden muss.
Die Anwendung des Verfahrens kann auch so durchgeführt werden, dass nur ein Teil der Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette entfernt werden.
Geeignete Petroleumfraktionen für das Verfahren sind unter anderem Kerosine, Gasöle und Schmieröle. Diese können gegebenenfalls einer gewissen Raffinierung unterzogen worden sein. Geeignete Petroleum-Fraktionen enthalten 345 Gew% Kohlenwasserstoffe mit unverzweigter Kette.
Mikroorganismen, welche in der beschriebenen Weise gezüchtet werden können, sind im allgemeinen Hefe, Schimmelpilze oder Bakterien.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren züchtbare Hefen sind vorzugsweise solche der Gattung Cryptococcacae, insbesondere der Art Cryptococcoidae; man kann gewünschtenfalls auch Ascosporogeneus-Hefen der Art Saccharomyceloidae verwenden.
Bevorzugte Arten der Gattung Cryptococcoidae sind Torulopsies, auch als Torula bekannt, und Candida. Bevorzugte Stämme von Hefen sind die nachstehend aufgeführten. Im allgemeinen ist es von Vorteil, einen spezifischen Stamm der angegebenen Baarn-Referenz-Nummer zu verwenden. Diese Referenz-Nummern beziehen sich auf solche Stämme, welche beim Centraal Bureau vor Schimmelculture , Baarn, Holland, auf Vorrat gehalten werden.
Candida lipolytica Candida pulcherrima CBS 610 Candida utilis Candida utilis, Variati major CBS 841 Candida tropicalis CBS 2317 Torulopsis collisculosa CBS 133 Hansenula anomala CBS 110 Oidium lactis Neurospora sitophila
Von den Obenerwähnten ist Candida lipolytica besonders bevorzugt.
Geeignete Bakterien sind solche der Gattungen Pseudomonales, Eubacteriales und Actinomycetales.
Vorzugsweise verwendet man Bakterien der Gattungen Bacillaceae und Pseudomonadaceae. Bevorzugte Arten sind Bacillus megatherium, Bacillus subtilis und Pseudonomas aeruginosa. Andere Arten, welche verwendet werden können, sind z.B.
Bacillus amylebacter,
Pseudonomas natriegens,
Arthrobacter sp.,
Micrococcus sp.,
Corynebacterium michiganense,
Pseudomonas syringae,
Xanthomonas begoniae,
Flavobacterium sp. devorans,
Acetobacter sp.,
Actinomyces sp.,
Agrobacterium sp.,
Aplynobacter sp.
Geeignete Schimmelpilze sind solche der Gattung Aspergillaceae. Eine geeignete Art ist Penicillium.
Vorzugsweise wird Penicillium expansum verwendet. Eine andere geeignete Art ist Aspergillus.
Im Nährmedium können auch gewisse feste Stoffe verwendet werden.
Penicillium expansum ist geeignet zur Züchtung in einem wässerigen Nährmedium, welches Kohlenwasserstoffe enthält.
Zur Züchtung vom Penicillium Roqueforti. Penicillium Notatum, Aspergillus fussigatus und Aspergillus niger.
Aspergillus versicolor können auch feste Nährmittel zugegen sein.
Ein typisches Nährmedium für das Gedeihen von Nocardia hat ausser der Kohlenstoffquelle zum Beispiel folgende Zusammensetzung: Ammoniumsulfat 1 g Magnesiumsulfat 0,20 g Ferrosulfat, 7 H2O 0,005 g Mangansulfat, 1 H2O 0,002 g Monokaliumphosphat 2 g Dinatriumphosphat 3 g Calciumchlorid 0,1 g Natriumcarbonat ' 0,1 g Hefe-Extrakt 0.008 g
Destilliertes Wasser bis zur Ergänzung auf 1000 cm3.
Ein für andere Bakterien geeignetes Nährmedium hat ausser der Kohlenstoffquelle z. B. die Zusammensetzung: Monokaliumphosphat 7 g Magnesiumsulfat, 7 H2O 0,2 g Natriumchlorid 0.1 g Ammoniumchlorid 2,5 g.
Leitungswasser (Spurenelemente) 100 cm3 Hefe-Extrakt 0,008 g
Destilliertes Wasser bis zur Ergänzung auf 1000 cm3.
Ein für Hefen und Schimmelpilze geeignetes Nährmittel hat ausser der Kohlenstoffquelle z. B. die Zusammensetzung: Diammoniumsulfat 2 g Kaliumchlorid 1,15 g Magnesiumsulfat, 7 H2O 0,65 g Zinksulfat 0,17 g Mangansulfat, 1 H2O 0,045 g Ferrosulfat, 7 H2O 0,068 g Leitungswasser 200 g Hefe-Extrakt 0,025 g
Destilliertes Wasser bis zur Ergänzung auf 1000 cm3.
Mikroorganismen, und insbesondere Hefen, gedeihen, wenn sie zuerst unter Verwendung einer Kohlenwasserstoff Fraktion als Ausgangsstoff gezüchtet werden, manchmal nur mit Schwierigkeit und es ist manchmal notwendig, die Kultur mit einem Mikroorganismus zu impfen, welcher vorgängig fähig gemacht wurde, auf der Kohlenwasserstoff-Fraktion, welche man zu verwenden beabsichtigt, zu gedeihen. Ebenso kann ein Mikroorganismus, welcher in Gegenwart eines wässerigen, mineralischen Mediums, welches die geeigneten Nährstoffe enthält, gezüchtet wird, nur mit Schwierigkeit gedeihen. Wenn die Kohlenwasserstoff-Fraktion die das Wachstum fördernden Faktoren, welche in Kohlehydrat-Ausgangsstoffen vorhanden sind, nicht enthält.
Das Wachstum des zu züchtenden Mikroorganismus wird durch Zusatz eines Züchtungs-Mediums, bestehend aus einer sehr kleinen Menge eines Hefe-Extraktes, das ist ein industrielles Erzeugnis, welches reich an Vitaminen der Gruppe B ist und durch Hydrolyse von Hefe gewonnen wird, oder allgemeiner von Vitaminen der Gruppe B und/oder Biotin, gefördert. Die Menge dieses Zusatzes beträgt vorzugsweise etwa 25 Teile pro Million Teile in Bezug auf das wässerige Fermentiermittel. Je nach den Bedingungen, unter welchen die Züchtung erfolgt.
kann diese Menge auch grösser oder kleiner sein.
Das Wachstum des Mikroorganismus erfolgt auf Kosten der organischen Verbindungen unter Bildung von Säuren, hauptsächlich von Fettsäuren, wobei der pH-Wert des wässerigen mineralischen Mediums progressiv ahnimmt. Tritt dies nicht ein, so wird das Wachstum ziemlich schnell aufgehalten und die Konzentration des Mikroorganismus im Medium, d. h. die Zelldichte, nimmt nicht mehr zu, so dass eine sogenannte stationäre Phase erreicht ist.
Vorzugsweise wird deshalb das wässerige Nährmedium durch schrittweisen oder kontinuierlichen Zusatz eines wässerigen Mediums von hohem pH-Wert auf dem gewünschten pH-Wert gehalten. Üblicherweise, wenn Schimmelpilze oder Hefen und insbesondere wenn Candida lipolytica gezüchtet werden, wird der pH-Wert des Nährmediums im Bereiche von 3-6. vorzugsweise im Bereiche von W5, gehalten. Bakterien benötigen einen höheren H-Wert, gewöhnlich einen solchen von 6,5-8. Als alkalischeZusätze zurZüchtungs-Mischung kann man z.B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrophosphat oder Ammoniak verwenden.
Die optimale Temperatur der Züchtungs-Mischung ändert mit dem Typ des zu züchtenden Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereiche von 25-35 "C. Wenn Candida lipolytica gezüchtet wird, ist eine Temperatur von 28-32 "C vorteilhaft.
Die Aufnahme von Sauerstoff ist für die Züchtung des Mikroorganismus wichtig. Der Sauerstoff wird in der Regel in Form von Luft vorgesehen. Um ein schnelles Wachstum aufrechtzuerhalten, soll die als Sauerstofflieferant dienende Luft in Form von feinen Blasen in der Züchtungs-Mischung, die ständig umgerührt wird, vorhanden sein. Die Luft kann durch eine poröse Wand eingeführt werden. Es kann jedoch auch ein wirksames Durchlüftungssystem, welches unter der Bezeichnung Vortex-Aeration bekannt ist, verwendet werden.
Es wurde festgestellt, dass, wenn eine Durchlüftung durch Vortes-Aeration erfolgt, bei der Züchtung von Hefe des Stammes Candida lipolytica ein rasches Wachstum erzielt werden kann, bei welchem das Generationenalter im Bereiche von 2-5 Stunden liegt und die Zellkonzentration in zwei Tagen bis auf das Zwölffache zunimmt.
Bei ansatzweiser Züchtung gedeiht der Mikroorganismus anfänglich gewöhnlich nur mit geringer Zunahme der Zelldichte. Diese Periode nennt man die Verzugsphase. In der Folge nimmt das Wachstum zu. Die Periode des erhöhten Wachstums wird Exponentialphase genannt. Hernach wird die Zelldichte konstant, d. h. die stationäre Phase ist erreicht.
Vorzugsweise entnimmt man einen Vorrat vom Mikroorganismus für den nächsten Ansatz vor Beendigung der Exponentialphase.
Der Züchtungsvorgang wird üblicherweise vor Erreichung der stationären Phase abgebrochen.
In dieser Stufe wird der Mikroorganismus gewöhnlich aus dem wässerigen Nährmedium und aus der nicht ausgenützten organischen Fraktion ausgeschieden, z. B. durch Zentrifugieren oder Dekantieren. Die abgetrennte wässerige Phase enthält gewöhnlich eine grössere Konzentration an nicht-nährenden Jonen, als sie im zurückgeleiteten Strom geduldet werden kann, und wenn dies so ist, kann lediglich ein Teil der zurückgewonnenen wässerigen Phase zurückgeleitet werden. So ist es üblicherweise möglich, etwa 96 Gew. % der im Erzeugnis enthaltenen wässerigen Phase abzuscheiden, von welcher, auf der gleichen Prozentbasis, etwa 20 Gew% in Abgang kommen.
Der Rückleitungsstrom wird mit einer Menge des aufbereiteten erforderlichen Nährstoffes versehen und in den Gärbottich zurückgeleitet. Gewünschtenfalls kann das Aufbereitungsmaterial als separater Strom in den Gärbottich eingeleitet werden.
Wenn das Verfahren zur Züchtung von Hefe, und in einigen Fällen auch von anderen Mikroorganismen, verwendet wird, kann die Trennung des Erzeugnisses z. B. wie folgt durchgeführt werden:
Durch Zentrifugieren des aus dem Gärbottich kommenden
Erzeugnisses werden drei Fraktionen gewonnen. Dies sind in der Reihenfolge wachsender Dichte:
I. eine Ölphase, welche Hefe enthält,
II. eine wässerige Phase mit Spuren von Ö1 und Hefe, und
III. eine Hefe- Creme bestehend aus Hefe, an deren
Zellwänden ein Quantum Öl zusammen mit wässeriger Phase anhaftet.
Nach der Gewinnung der Fraktion II wird die Fraktion III oder eine Mischung der Fraktionen I und III mit einer wässeri gen Lösung eines auf die Zelloberflächen wirkenden Mittels gemischt.
Der Zweck dieses Vorgehens ist, das Öl von den Hefezellen, an welchen es anscheinend durch Adsorption gehalten ist, zu trennen.
Es kann von Vorteil sein geniessbares Mittel zu verwenden, z. B. Saccharoseester, welches es ermöglicht, das nachfolgende
Waschen zu vermindern, welches erforderlich ist, um ein Mittel, welches nicht geniessbar ist, von der Hefe zu trennen.
Die in dieser Weise gebildete Emulsion wird durch Zentri fugieren zerlegt, um folgende drei Fraktionen zu erhalten:
IV. eine Ölphase,
V. eine wässerige, das auf die Zelloberflächen wirkende Mittel enthaltende Phase, welche zur weiteren Behandlung der Fraktionen I und III zurückgeleitet wird, und
VI. eine Hefe- Creme , welche aus Hefe, die immer noch durch Öl zusammen mit einer wässerigen, auf die Zelloberflächen wirkenden Phase verunreinigt ist.
Um den Verbrauch an dem auf die Zelloberflächen wirkenden Mittel so weit als möglich zu vermindern, wird die dieses enthaltende Waschlösung zurückgeleitet.
Die Fraktion VI kann weiter durch wechselndes Waschen mit dem auf die Zelloberflächen wirkenden Mittel und Zentrifugieren behandelt werden, bis die an der Hefe haftende Ölphase den gewünscht niedrigen Stand erreicht hat. Die Hefe Creme , welche jetzt aus Hefe und der wässerigen, auf die Zelloberflächen wirkenden Phase besteht, wird hierauf mit Wasser gewaschen und nochmals zentrifugiert. Gewünschtenfalls können zwei oder mehr Waschungen dieser Hefe Creme vorgenommen werden. Gewünschtenfalls kann für eine Waschung oder für mehrere Waschungen mit Wasser, aber vorzugsweise nicht für die letzte, Salzwasser, z. B. Meerwasser, verwendet werden. Für die letzte Waschung wird zweckmässig weiches Wasser verwendet.
Im Hinblick auf Einsparung an weichem Wasser für den Waschprozess wird das gesamte von der letzten Waschung kommende Wasser zur Aufbereitung des Nährmediums für die Fermentation verwendet, wo es in der Stufe des Wachstums mit der das auf die Zelloberflächen wirkende Mittel enthaltenden Lösung benötigt wird, und der Rest wird dem zum Waschen verwendeten Salzwasser zugesetzt, um dessen Salzkonzentration herabzusetzen. Schliesslich wird die Hefe unter Bedingungen, welche für ihre nachfolgende Verwendung als Nährstoff geeignet sind, getrocknet.
Andere Schritte, welche im Zuge des beschriebenen Verfahrens unternommen werden können, um einen gereinigten Mikroorganismus oder ein aus einem solchen abgeleiteten Erzeugnis zu erhalten, oder das Verfahren in Bezug auf die Erzeugung einer unveränderten Kohlenwasserstoff-Fraktion zu verbessern, sind in den nachstehend aufgeführten Patentschriften beschrieben: Schweizerische Patentschriften Nr.
471 159; 476 834; 483 491; 469 081; 469 082; 476 835; 469 083 und 482 007; Britische Patentschrift Nur.914567 und französische Patentschrift Nr. 924 254.
Die erfindungsgemässe Kultivierung kann chargenweise oder teilweise oder ganz kontinuierlich durchgeführt werden.
In den Beispielen ist die Zelldichte als Trockengewicht der Hefe pro Liter Kultur ausgedrückt.
Beispiel 1
Gasöl und die übrigen Komponenten des Nährmediums werden aus zwei Behältern mittels zweier Kolbenpumpen den beiden Anschlussstutzen eines Injektors zugepumpt. Zwischen den beiden Pumpen und dem Injektor sind Pufferbehälter angeordnet, um den Gegendruck auf gleicher Höhe zu halten, welcher auf den Bereich von 14-16 kg/cm2 einreguliert wurde.
Der Injektor bestand aus einem Kapillarrohr aus rostfreiem Stahl, welches einen Innnendurchmesser von 0,5 mm aufwies und dessen freies Ende sich zu einer Austrittsöffnung mit einem Durchmesser von 0,05-0,08 mm verengerte. Das andere Ende des Kapillarrohres war an die beiden Anschlussstutzen für das Gasöl enthaltende Nährmedium angeschweisst und bildete somit ein Y.
Die beiden Pumpen waren steuerbar, derart, dass sie einen Durchfluss ergaben, welcher zwischen 0,3 und 1 Liter pro Stunde ändern konnte.
Das Gasöl anthaltende Nährmedium wurde vom Injektor in einen 5 Liter fassenden, kontinuierlich arbeitenden Gärbottich gespeist, welcher ausgerüstet war mit einem Rührwerk (Drehzahl 1000 t/min, Verhältnis des Schaufeldurchmessers zum Bottichdurchmesser 1/3, Schaufelzahl 8), einem Ring von kapillaren Luftinjektoren, Elektroden für pH-Kontrolle (der pH-Wert wurde auf 4 gehalten), einem äusseren Doppelmantel, um die Temperatur auf 30 "C durch Wasserzirkulation konstant zu halten, einer Einrichtung zum Abziehen von Flüssigkeit mittels einer Kolbenpumpe.
Für die Injektion des Gasöl enthaltenden Nährmediums unter Verwendung der vorstehend erwähnten Injektionseinrichtung kann die Kapillaröffnung des Injektors entweder in dem mit Flüssigkeit gefüllten Teil des Bottichs, vorzugsweise unterhalb des Rührwerkes, oder oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche und gegen den Boden des Bottichs gerichtet angeordnet sein.
Die verwendeten Materialien waren folgende: Hefe-Vorrat Candida lipolytica Gasöl Irakisches schweres Gasöl,
Gew% n-Paraffine 12,
Stockpunkt + 17 "C Übrige Komponenten des wässrigen mineralischen Nährmediums: Diammoniumphosphat 2 g Kaliumchlorid 1,15 g Magnesiumsulfat, 7 H2O 0,65 g Zinksulfat 0,17 g Mangansulfat, 1 H2O 0,045 g Ferrosulfat, 7 H2O 0,068 g Hefe-Extrakt 0,025 g Leitungswasser 200 g
Destilliertes Wasser bis zur Ergänzung auf 1000 cm3.
Luft filtriert und verdichtet.
Um die Bedeutung der Druckinjektionseinrichtung darzulegen, wurden folgende Versuche durchgeführt:
1. Züchtung mit Zuführung von Gasöl enthaltendem Nährmedium in getrennten Bahnen ohne vorherige Zerstäubung.
2. Züchtung mit Zerstäubung des Gasöl enthaltenden Nährmediums mittels des Kapillardruckinj ektionseinrichtung bei untergetauchter Kapillaröffnung des Injektors.
3. Züchtung wie unter 2. aber bei über der Flüssigkeitsoberfläche angeordneter Kapillaröffnung, d. h. Injektion in den Luftraum.
Dabei wurden folgende Resultate erzielt:
Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
Ohne Zer stäu- Zerstäu bung Zerstäu bung bung in Flüssig- in Luft keit Volumen der Flüssig- 3 3 3 keit im Gärbottich Liter Verdünnungsgrad 0,07 0,10 0,11 Luftzufluss v/v/h 70 70 70 Gasöl pro Liter Aus- 180 180 180 gangsstoff in g Zelldichte g/l 5 5 5,5 Durchschnittliche 100 10 6 Grösse der Gasöl Kügelchen Zellteilungszeit h 10 7 6,5 % konsumierte 41 40 43 n-Paraffine
Es ist festzustellen, dass die Dispersion durch Kapillarinjektion die Zellteilungszeit merklich herabsetzt bei Einhaltung des gleichen Entwachsungsgrades, d.h. das Verhältnis der Erzeugung von Hefe zur Entwachsung des Gasöles ist erhöht, ohne dass der Entwachsunsgrad geändert wird.
Beispiel 2
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung eines Ausgangsstoffes durch Dispersion von festem Paraffinwachs.
Das feste Substrat, z.B. festes Paraffinwachs, wurde in einem Gefäss geschmolzen und als feine Dispersion in Luft in das Nährmedium im Gärbottich injiziert, zu welchem Zwecke ein Luftzerstäuber, welcher aus einem Kapillarrohr, das in einem koaxialen Lufteinlassrohr montiert war, benützt wurde.
Die Injektion kann entweder in die Flüssigkeit oder in den Raum über der Flüssigkeitsoberfläche vorgenommen werden.
Der verwendete Gärbottich hatte einen Inhalt von 5 Litern und war gleich ausgerüstet wie beim Beispiel 1.
Die verwendeten Materialien waren folgende: Dunkirk hard gatsch Schmelzpunkt 60 cc, Paraffinwachs Schmelzpunkt 60-70 "C, Schweres irakisches Gasöl Stockpunkt + 17 "C; normale Paraffine Gew% 12, Hefe Candida lipolytica,
Das wässerige mineralische Nährmedium entsprach dem im Beispiel 1 beschriebenen.
Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, zum Zwecke, ein fein verteiltes festes Substrat herzustellen, welches reich angereichert mit normalen Paraffinen zur Verfügung der Hefe war.
1. Züchtung mit gewöhnlichem schweren Gasöl ohne vorherige Zerstäubung,
2. Züchtung mit einer Dispersion von hard gatsch .
3. Züchtung mit schwerem Gasöl, welches mit Paraffin angereichert und zerstäubt wurde.
Folgende Resultate wurden erhalten:
1. Gasöl 2. Gatsch 3. Gasöl nicht zer- zerstäubt und Wachs stäubt zerstäubt Volumen der Fliis- 3 3 3 sigkeit (1) Verdünnungsverhältnis 0,10 0,10 0,10 Luftzufluss vlvXh 70 70 70 Flüssigkeitszufluss l/h 0,3 0,3 0,3 Gasöl-Substrat g/l 180 180 180 des Nährmediums Zelldichte 4 8,5 9 Grösse der 100 5 10 Substratteilchen Entwachsung in Gew% der 32 69 73 Paraffine im Ausgangsstoff
Die Verwendung einer feinen Dispersion von gatsch oder mit festen Paraffinen angereichertem Gasöl, welche durch den Luftzerstäuber erzeugt wurde, ergibt ein markantes Zunehmen der Zelldichte für die gleiche Verdünnung.
Dies zeigt, dass die Brauchbarkeit von normalen Paraffinen in dieser Weise verbessert werden kann. Das praktische
Scherung durch gezahntes Rad,
Scherung durch zwei konische Flächen.
Der Auslass der Kolloidmühle war durch ein flexibles Rohr mit dem Gärbottich verbunden. Um die gebildete Emulsion zu stabilisieren, wurde eine Züchtungslösung von etwa 5 % des Volumens der Emulsion, welche 8-9 g/l Hefe enthielt in das flüssige Material, entweder am Einlass oder am Auslass der Kolloidmühle injiziert.
Der Gärbottich wurde mit 1000 t/min umgerührt und hatte ein Fassungsvermögen von 3 Litern. Er war mit einer Abzugseinrichtung und einer Pumpe ausgerüstet.
Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Elektroden und einem automatischen Potentiometer kontrolliert.
Die folgenden Materialien wurden verwendet: Hefe Candida lipolytica, Gasöl Schweres Gasöl mit einem Stockpunkt von +17 "C und einem n-Paraffingehalt von
12%, Übrige Komponenten des wässrigen mineralischen Nährmediums wie im Beispiel 1 Luft filtriert und verdichtet.
Um die Bedeutung der Kolloidmühle und der Stabilisation der Dispersion durch Hefen zu demonstrieren, wurden folgende Versuche durchgeführt:
1. Züchtung auf Gasöl ohne vorherige Dispersion.
2. Züchtung auf Gasöl mit vorheriger Dispersion durch die Kolloidmühle, aber ohne Stabilisation durch Hefe.
3. Züchtung auf Gasöl mit Dispersion und Stabilisation durch Rückleitung von etwas der erzeugten Hefe in den Einlass der Kolloidmühle.
Versuch 1. 2. 3.
Volumen der Flüssigkeit, 1, 3 3 3 Verdünnung 0,10 0,10 0,10 Flüssigkeitszufluss, l/h 0,3 0,3 0,3 Gasölgehalt, g/l 180 180 180 Belüftung, v/v/h 70 70 70 Mittlere Grösse der Gasöl- 100 10 5 kügelchen, Mikron Zelldichte, g/l 4 8 10 Konsumiertes Paraffin, Gew% 32 65 81
Es ist offensichtlich, dass die Verwendung der Kolloidmühle eine Emulsion ergibt, welche genügend dispergiert ist, um die Zelldichte deutlich zu erhöhen.
Das Vorhandensein von Hefe in der Emulsion hält den hohen Dispersionsgrad aufrecht und verbessert das Wachstum der Hefen merklich.