DE1442070B - Verfahren zum Züchten von geradkettige Kohlenwasserstoffe verwertenden Hefen. Ausscheidung aus: 1470507 - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von geradkettigen Kohlenwasserstoffe verwertenden Hefen in einem η-Paraffine enthaltenden Nährmedium.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, Paraffine verwertende Hefen in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart von Kohlenwasserstoffgemischen, die η-Paraffine enthalten, unter gleichzeitiger Entparaffinierung des eingesetzten Kohlenwasserstoffgemisches (z. B. einer Gasölfraktion) und einer Hefe zu züchten.

Es wurde nun gefunden, daß man in einem solchen vorgeschlagenen Verfahren die Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe noch erheblich steigern kann, wenn man das kohlenwasserstoffhaltige Einsatzmaterial im Nährmedium fein dispergiert.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Züchten von geradkettige Kohlenwasserstoffe verwertenden Hefen, vorzugsweise der Gattung Candida, unter üblichen Bedingungen in einem Kohlenwasserstoffe mit n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kohlenwasserstoffe mit n-Paraffin-Kohlenwasserstoffen im Nährmedium sehr fein dispergiert sind.

Vorzugsweise werden die Teilchen bis zu einem mittleren Durchmesser von weniger als 30 μ, insbesondere von weniger als 10 μ, dispergiert.

Die kleinen Teilchen können durch Zerstäuben eines in der Flüssigphase verwendeten Ausgangsmaterials in eine wäßrige Phase oder in eine Gasphase gebildet werden. Die in der Gasphase gebildeten kleinen Flüssigkeitsteilchen müssen in ein flüssiges Medium, z. B. in eine wäßrige Phase, überführt werden. Die Dispersion kleiner Teilchen im flüssigen Trägermedium kann dann in den Fermenter eingeführt werden. Es ist auch möglich, die kleinen Flüssigkeitsteilchen im Fermenter durch direkte Zerstäubung in das im Fermenter vorhandene flüssige Material zu bilden. Das wäßrige Medium, das zur Bildung der Dispersion außerhalb des Fermenters verwendet wird, kann aus wäßrigem Nährmedium bestehen. Die gasförmige oder flüssige Phase, die durch den Zerstäuber geführt wird, kann gegebenenfalls ein Gemisch der Ausgangskohlenwasserstoffe mit Luft oder wäßrigem Medium sein. Gegebenenfalls wird eine flüssige

ίο Phase durch den Zerstäuber geleitet und dadurch eine Suspension feiner Flüssigkeitsteilchen in einem Gas gebildet, worauf man das suspendierte Material auf eine sich bewegende Flüssigkeitsoberfläche, z. B. aus wäßrigem Nährmedium, fallen läßt.

Es ist auch möglich, die kleinen Flüssigkeitsteilchen zu bilden, indem man ein in der Flüssigphase vorliegendes Ausgangsmaterial unter der Einwirkung von Ultraschallwellen in eine wäßrige Phase oder in eine Gasphase dispergiert. Vorzugsweise wird durch einen Ultraschallerzeuger eine Phase geführt, die ein Gemisch von Ausgangskohlenwasserstoffen mit Luft oder einem wäßrigen Medium darstellt. Gegebenenfalls führt man eine fließfähige Phase durch den Ultra- ( schallerzeuger unter Bildung feiner Flüssigkeitsteilchen in einem Gas und läßt das suspendierte Material auf eine sich bewegende Flüssigkeitsoberfläche, z. B. aus wäßrigem Nährmedium, fallen. Nach einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren, bei dem eine Hefe in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Ausgangsmaterials, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet wird, wobei das Ausgangsmaterial in Form von kleinen Feststoffteilchen anwesend ist, wobei das Einsatzmaterial ein Stoff ist, der bei der Temperatur, bei der der Fermenter gehalten wird, fest ist.

Vorzugsweise werden die kleinen Feststoffteilchen als Suspension in einem flüssigen Medium gebildet, indem das geschmolzene Ausgangsmaterial (in Gegenwart oder Abwesenheit anderer Bestandteile) in ein flüssiges Medium zerstäubt wird, das sich bei einer Temperatur unterhalb des Schmelzpunktes des Ausgangsmaterials befindet, wodurch eine plötzliche Abkühlung des letzteren stattfindet.

Bei einer anderen Arbeitsweise bildet man eine " Flüssigkeit-in-Flüssigkeit-Suspension oder Lösung \ des Ausgangsmaterials in einem flüssigen Medium und schreckt diese Suspension oder Lösung ab, wobei eine Fest-Flüssig-Suspension des kohlenstoffhaltigen Materials im flüssigen Medium gebildet wird, j Die Flüssig-Flüssig-Suspension kann durch Zerstäuben ! des geschmolzenen festen Ausgangsmaterials in ein flüssiges Medium gebildet werden, das sich bei einer Temperatur oberhalb des Schmelzpunktes des Aus- j gangsmaterials befindet.

Als flüssiges Medium (gleichgültig, ob es oberhalb oder unterhalb des Schmelzpunktes des Ausgangsmaterials sich befindet) wird vorzugsweise eine wäßrige Phase oder eine Kohlenwasserstoffphase gebraucht. Als wäßrige Phase eignet sich das wäßrige Nährmedium. Eine geeignete Kohlenwasserstoffphase besteht aus Kohlenwasserstoffen, die durch die Hefe nicht aufgespalten werden. Im allgemeinen eignet sich beispielsweise ein entparaffiniertes Gasöl.

Vorzugsweise werden Bedingungen angewendet, bei denen eine hohe Fallgeschwindigkeit erzielt wird, um die Bildung von Feinteilchen zu begünstigen. Bei Verwendung des Ausgangsmaterials in Form von

feinen Teilchen haben diese gewöhnlich die Neigung, zu agglomerieren. Diese Neigung kann durch Verwendung von Emulgatoren verringert werden.

Nach einem weiteren Aspekt ist das Verfahren gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dispersion aus einem Ausgangskohlenwasserstoff in einem flüssigen Medium bildet, die Dispersion mit einem Mikroorganismus mischt, das Gemisch in einen Fermenter gibt, der die Hefe, ein wäßriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und einen Produktstrom abzieht, der die im Fermenter gewachsene Hefe enthält.

Nach einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren gemäß der Erfindung dadurch möglich, daß man eine Dispersion eines Ausgangskohlenwasserstoffs in einem flüssigen Medium bildet, das eine Dispersion der Hefe enthält, anschließend das Gemisch in einen Fermenter leitet, der die Hefe, ein wäßriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und einen Produktstrom abzieht, der eine im Fermenter gewachsene Hefe enthält. Bei den beiden vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung können die Hefen, die in dem in das Gärgefäß eingeführten Ausgangsmaterial enthalten sind, und die Hefen, die im Fermenter gezüchtet werden, gleich oder verschieden sein. Durch die Anwesenheit der Hefe im dispergierten Ausgangsmaterial wird die Agglomerierneigung der Teilchen verringert.

Ein Teil der aus dem Fermenter gewonnenen Hefe kann zur Bildung des Einsatzmaterials verwendet werden. Vorzugsweise ist das flüssige Medium, das als geschlossene Phase bei der Bildung des Einsatzmaterials verwendet wird, ein wäßriges Medium. Dieses wäßrige Medium ist vorzugsweise ein Kreislaufstrom des wäßrigen Nährmediums.

Vorzugsweise wird die aus dem Gärgefäß abgezogene gesamte. Flüssigphase in eine Zentrifuge gegeben. In dieser Zentrifuge werden gewonnen: a) eine Phase, die den größeren Teil der im Produktstrom vorhandenen Hefe enthält, b) eine wäßrige Phase, die einen geringeren Anteil der Hefe enthält und c) wahlweise eine Kohlenwasserstoffphase je nach der Art der Ausgangskohlenwasserstoffe.

Wenigstens ein Teil der wäßrigen Phase, die einen Teil der Hefe enthält, kann dann als geschlossene Phase verwendet werden, in der die Ausgangskohlenwasserstoffe dispergiert werden. Es ist möglich, daß die Menge der in der wäßrigen Phase vorhandenen Hefe nicht ausreicht, um den Einsatz in Dispersion zu halten. In diesem Fall (und immer dann, wenn gewünscht) kann die Menge der Hefe durch Zusatz weiterer Mengen der Hefe nach der Dispergierung erhöht werden. Zweckmäßig ist diese weitere Menge der Hefe ein Teil der durch Zentrifugieren erhaltenen Fraktion a) oder davon abgeleitet. Die größeren Agglomerate der Hefe werden von der wäßrigen Phase abgetrennt, und nur die kleineren Gruppen von Hefen gehen weiter in der wäßrigen Phase zur Dispergierstufe. Da der Vorgang der Dispergierung des Einsatzmaterials zu einer gewissen Zerstörung der Gruppen von Hefen oder sogar der Einzelzellen führen kann, ist es zweckmäßig, mit einem System zu arbeiten, bei dem wenigstens ein Teil des zur Stabilisierung der Dispersion verwendeten Hefen, die Dispergierstufe umgeht. Hierbei sollte es sich um den Teil handeln, der (auf Grund der in ihm enthaltenen größeren Agglomerate) leichter einer Schädigung unterliegt.

Zur Dispergierung des Einsatzmaterials in einem flüssigen Medium kann jede beliebige Methode angewendet werden. Geeignet ist beispielsweise die Verwendung von 1) Injektordüsen, 2) Kolloidmühlen, beispielsweise eines Hurrel-Homogenisators, oder 3) von Ultraschallwellen.

Als Einsatzmaterial wird ein geradkettiger Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch, das einen geradkettigen Kohlenwasserstoff enthält, verwendet. Vorzugsweise werden C₁₀- oder höhere Kohlenwasserstoffe gebraucht. Zweckmäßig werden Kohlenwasserstofffraktionen eingesetzt, die von Erdöl erhalten wurden.

Gewisse Erdölfraktionen, insbesondere Gasöle, enthalten bekanntlich geradkettige Kohlenwasserstoffe, hauptsächlich Paraffine, die Wachse darstellen und sich nachteilig auf den Stockpunkt der Fraktion auswirken. Mit anderen Worten, wenn diese Kohlenwasserstoffe ganz oder teilweise entfernt werden, wird der Stockpunkt der Fraktion erniedrigt. Gewöhnlich wird das Wachs durch Ausfällung mit Hilfe von Lösungsmitteln entfernt, wobei das ursprünglich in der Fraktion vorhandene Wachs als solches, d. h. ohne Umwandlung in wertvollere Produkte gewonnen wird.

Die unterhalb des Gasöls siedenden Erdölfraktionen, z. B. schwere Naphthene und Leuchtpetroleum, enthalten ebenfalls geradkettige Kohlenwasserstoffe, die potentiell wertvoll für die Umwandlung in andere Produkte sind. Bisher wurde jedoch im allgemeinen die Ausnutzung dieser Kohlenwasserstoffe durch die Notwendigkeit erschwert, diese Kohlenwasserstoffe von den Erdölfraktionen, in denen sie enthalten sind, abzutrennen, bevor sie in andere Produkte umgewandelt werden können.

Nach der bevorzugten Arbeitsweise züchtet man gemäß der Erfindung einen Mikroorganismus auf die vorstehend beschriebene Weise in Gegenwart einer Erdölfraktion, die teilweise aus geradkettigen Kohlen-Wasserstoffen besteht und ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 C-Atomen im Molekül entspricht, und in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums sowie eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases und trennt vom Gemisch einerseits den Mikro-Organismus und andererseits eine Erdölfraktion ab, die einen verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthält oder frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders vorteilhaft für die Behandlung von Gasölfraktionen aus Erdöl, die geradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten, da nach dem Verfahren gemäß der Erfindung ein Gasöl mit verbessertem Stockpunkt erhalten wird, während die Wachse in ein wertvolles Produkt umgewandelt werden.

Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind im erfindungsgemäß verwendeten Einsatzmaterial gewöhnlich als Paraffine vorhanden. Sie können jedoch auch als Olefine anwesend sein, und ferner können Gemische verwendet werden, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten.

Es ist ein wichtiges Kennzeichen der Erfindung, daß bei der Züchtung von Hefe in Gegenwart der vorstehend beschriebenen Einsatzmaterialien unter Bedingungen, die das Wachstum der Hefe auf Kosten der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begünstigen, die übrigen Kohlenwasserstoffe, z. B. Isoparaffine, Naphthene und Aromaten, nicht aufgespalten werden oder

ihr aufgespaltener Anteil bestenfalls sehr gering ist. Ferner wird im Gegensatz zu üblichen chemischen Verfahren, die dem Massenwirkungsgesetz gehorchen, die Geschwindigkeit der Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit kleiner werdendem Anteil dieser Kohlenwasserstoffe im Gesamtgemisch der Kohlenwasserstoff nicht wesentlich geringer (ausgenommen natürlich in den letzten Phasen der Entfernung). So kann, falls gewünscht, der erreichte prozentuale Umsatz der geradkettigen Kohlenwasserstoffe bei einem Wert gehalten werden, der sich 100 nähert, ohne daß ein unverhältnismäßig hoher Aufwand an Kontaktzeit erforderlich ist, um geringe Verbesserungen zu erzielen. Ferner kann bei einem kontinuierlichen Verfahren dieser hohe Umsatz erreicht werden, ohne die Anwendung eines langen Reaktionsweges zu Hilfe zu nehmen.

Durch Anwendung dieses Verfahrens unter Bedingungen, die die Aufspaltung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe beschränken, ist es möglich, so zu arbeiten, daß nur ein gewünschter Anteil dieser Kohlenwasserstoffe entfernt wird.

Als Einsatzmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen sich Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle. Diese Einsatzmaterialien können unraffiniert sein oder einer gewissen raffinierenden Behandlung unterworfen werden, jedoch müssen sie gewöhnlich einen Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten, um für den Zweck der Erfindung geeignet zu sein. Zweckmäßig enthält die Erdölfraktion 3 bis 45 Gewichtsprozent geradkettige Kohlenwasserstoffe.

Bevorzugte Hefen gehören zur Familie Cryptococcacae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococcoidae. Gegebenenfalls können jedoch beispielsweise ascosporegene Hefen der Unterfamilie Saccharomycelidase verwendet werden. Die bevorzugten Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoidae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida. Die bevorzugten Hefestämme sind nachstehend aufgeführt. Besonders bevorzugt werden die Stämme, deren Hinterlegungsnummer beim Centraal Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland (CBS), in der folgenden Tabelle genannt ist.

Candida lipolytica

Candida pulcherrima CBS 610

Candida utilis

Candida utilis, Variati major... CBS 841 "

Candida tropicalis CBS 2317

Torulopsis collisculosa CBS 133

Hansenula anomala CBS 110

Oidium lactis
Neurospora sitophila

Von den vorstehend genannten Stämmen wird Candida lipolytica besonders bevorzugt.

Zum Wachstum der Mikroorganismen sind zusätzlich zum Einsatzmaterial ein wäßriges Nährmedium und eine Sauerstoffquelle, vorzugsweise in Form von Luft, erforderlich.

Ein geeignetes Nährmedium für Hefe hat folgende Zusammensetzung:

Diammoniumphosphat 2 g

Kaliumchlorid 1,15 g

Magnesiumsulfatheptahydrat 0,65 g

Zinksulfat 0,17 g

Mangansulfatmonohydrat 0,045 g

Eisen(II)-sulfatheptahydrat 0,068 g

Leitungswasser 200 g

Hefeextrakt 0,025 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml)

Hefen wachsen zuweilen nur mit Schwierigkeit, wenn sie erstmals unter Verwendung von Kohlenwasserstofffraktionen als Ausgangsmaterial gezüchtet

ίο werden. Manchmal ist es erforderlich, zum Beimpfen eine Hefe zu verwenden, die vorher zum Wachstum auf der zu verwendenden Kohlenwasserstofffraktion angepaßt worden ist. Ferner ist es möglich, daß die Hefen trotz der Züchtung in Gegenwart eines wäßrigen mineralischen Mediums, das die geeigneten Nährstoffe enthält, nur mit Schwierigkeit wachsen, weil die Kohlenwasserstofffraktion nicht die Wachstumsfaktoren enthält, die in Ausgangsmaterialien auf der Basis von Kohlehydraten vorhanden sind, es sei denn, diese Wachstumsfaktoren werden zugesetzt.

Das Wachstum der verwendeten Hefen wird begünstigt, wenn man zum Nährmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextrakts (ein durch Hydrolyse von Hefe erhaltenes, an Vitaminen der Gruppe B reiches industrielles Produkt) oder ganz allgemein an Vitaminen der Gruppe B und/oder Biotin gibt. Diese Menge liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million, bezogen auf das wäßrige Gärmedium. Sie kann höher oder niedriger sein, je nach den für die Fermentation gewählten Bedingungen.

Das Wachstum der Hefen erfolgt auf Kosten der Einsatzfraktion unter Zwischenbildung von Körpern — hauptsächlich Fettsäuren — mit Säurefunktion, so daß der pH-Wert des wäßrigen mineralischen Mediums progressiv sinkt. Ohne Korrektur kommt das Wachstum ziemlich schnell zum Stillstand, und die Konzentration der Hefe im Medium bzw. die Zelldichte nimmt nicht mehr zu, so daß eine sogenannte stationäre Phase erreicht wird.

Das wäßrige Nährmedium wird daher vorzugsweise durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe eines wäßrigen Mediums von hohem pH-Wert beim gewünschten pH-Wert erhalten. Gewöhnlich wird der pH-Wert des Nährmediums bei Verwendung von Hefen, insbesondere bei Verwendung von Candida lipolytica, im Bereich von 3 bis 6, vorzugsweise im Bereich von 4 bis 5, gehalten. Als alkalische Stoffe für den Zusatz zum Nährmedium eignen sich Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak in freier Form oder in wäßriger Lösung.

Die optimale Temperatur des Zuchtmediums ist verschieden, je nach der Art der verwendeten Hefen, und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis 35°C. Bei Verwendung von Candida lipolytica wird ein Temperaturbereich von 28 bis 32° C bevorzugt.

Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum der Hefen wesentlich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Um die Wachstumsgeschwindigkeit hoch zu halten, muß die Luft, die den Sauerstoff liefert, durch Rühren in feine Blasen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingeführt werden, jedoch kann auch das als »Wirbelbelüftung« bekannte System der Belüftung angewendet werden.

Es wurde festgestellt, daß bei Verwendung von Hefe der Art Candida lipolytica bei einem Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem die Belüftung durch

»Wirbelbelüftung« erfolgt, eine höhe Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationszeit im Bereich von 2 bis 5 Stunden liegt.

Bei Chargenbetrieb wachsen die Hefen gewöhnlich zunächst mit langsamer Zunahme der Zelldichte. (Diese Wachstumsperiode wird nachstehend als »Trägheitsphase« bezeichnet.) Danach steigt die Wachstumsgeschwindigkeit auf einen höheren Wert. Die Periode mit höherer Wachstumsgeschwindigkeit wird als »Exponentialphase« bezeichnet. Anschließend wird die Zelldichte wieder konstant (die »stationäre Phase«). Eine gewisse Menge der Hefe für den Beginn der nächsten Charge wird vorzugsweise vor Beendigung der Exponentialphase abgenommen. Die Fermentation wird gewöhnlich vor der stationären Phase abgebrochen. In dieser Phase wird die Hefe gewöhnlich von der Hauptmasse des wäßrigen Nährmediums und von der Hauptmasse der nicht verbrauchten Einsatzfraktion abgetrennt.

Vor der weiteren Reinigung des Produkts kann die Hefe gegebenenfalls der Autolyse unterworfen werden.

Nach einer möglichen Aufarbeitung des Produkts wird zuerst der größere Teil der geschlossenen wäßrigen Phase abgetrennt. Vorzugsweise erfolgt dies durch Zentrifugieren oder Dekantieren. Die abgetrennte wäßrige Phase enthält gewöhnlich Ionen, die keine Nährstoffionen sind, in einer höheren Konzentration, als sie im Kreislaufstrom in Kauf genommen werden kann. In diesem Fall kann nur ein Teil der zurückgewonnenen wäßrigen Phase im Kreislauf geführt werden. Beispielsweise ist es gewöhnlich möglich, etwa 96 Gewichtsprozent der im Produkt vorhandenen wäßrigen Phase abzutrennen, wovon (auf der gleichen Basis) etwa 20 Gewichtsprozent verworfen werden. Nach Zugabe ergänzender Mengen der notwendigen Nährstoffe zum Kreislauf strom wird dieser in den Fermenter zurückgeführt. Gegebenenfalls können die ergänzenden Stoffe dem Fermenter als getrennter Strom zugesetzt werden.

Bei Züchtung einer Hefe können die folgenden

Produktabscheidungsstufen in Frage kommen. Durch Zentrifugieren des aus dem Fermenter kommenden Produkts werden drei Fraktionen gewonnen, nämlich

' (in der Reihenfolge steigender Dichte):

I. Eine Ölphase, die Hefezellen enthält,

II. eine wäßrige Phase, die Spuren von Öl und Hefe enthält, und

III. eine aus Hefe zusammen mit wäßriger Phase bestehende »Hefecreme«, an deren Zellen Öl haftet. ■·■.>

Nach Abtrennung der Fraktion II wird die Fraktion III oder ein Gemisch der Fraktionen I und III mit einer wäßrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels gemischt. Diese Behandlung hat den Zweck, von den Hefezellen das Öl abzutrennen, das anscheinend durch Adsorption an den Zellen haftet. Es kann vorteilhaft sein, ein genießbares oberflächenaktives Mittel, z. B. einen Zuckerester, zu verwenden, so daß das Ausmaß der anschließenden Wäsche, die zur Entfernung von nicht genießbaren oberflächenaktiven Mitteln von der Hefe erforderlich ist, verringert werden kann. , ^:

Die auf diese Weise gebildete Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochen. Hierbei werden drei Fraktionen erhalten:

IV. Eine Ölphase,

V. eine wäßrige Phase, die das oberflächenaktive Mittel enthält und zur Behandlung der Fraktion I und III im Kreislauf geführt wird, und

VI. eine »Hefecreme«, bestehend aus Hefe, die noch mit Öl verunreinigt ist, und einer wäßrigen oberflächenaktiven Phase.

Um den Verbrauch an oberflächenaktivem Mittel möglichst stark einzuschränken, wird die wäßrige Waschlösung, die das Mittel enthält, im Kreislauf geführt.

Die Fraktion VI kann einer aus abwechselndem Waschen mit oberflächenaktivem Mittel und Zentrifugieren bestehenden Weiterbehandlung unterworfen werden, bis der Ölgehalt der Hefe einen gewünschten niedrigen Wert erreicht hat. Die nunmehr aus Hefe und wäßrigem oberflächenaktivem Mittel bestehende Hefecreme kann mit Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert werden. Gegebenenfalls kann diese Hefecreme zweimal oder noch häufiger gewaschen werden. Eine oder mehrere dieser Wäschen (vorzugsweise jedoch nicht die letzte) mit Wasser können mit Salzwasser (z. B. Meerwasser) vorgenommen werden. Zur letzten Wäsche wird vorzugsweise enthärtetes Wasser verwendet. Um den Bedarf an Weichwasser im Verfahren möglichst niedrig zu halten, wird das gesamte von der letzten Wäsche anfallende Wasser ausgenutzt. Ein Teil dient als Ergänzungswasser für das Nährmedium, in dem die Fermentation stattfindet, ein Teil — falls erforderlich — als Ergänzungswasser für die Lösung des oberflächenaktiven Mittels, und der Rest wird dem zum Waschen verwendeten Salzwasser zugesetzt, um dessen Salzkonzentration zu verringern. Abschließend kann die Hefe unter Bedingungen getrocknet werden, die sich für ihre spätere Verwendung als Nahrungs- und Futtermittel eignen.

Die Stufen des Verfahrens können vollständig chargenweise durchgeführt werden, jedoch kann gegebenenfalls auch in einer oder mehreren Stufen

kontinuierlich gearbeitet werden. ^:

In den folgenden Beispielen ist die Zelldichte als Trockengewicht der Hefe pro Liter Kultur ausgedrückt.

Beispiell

Gasöl und das Kulturmedium wurden aus zwei Behältern mit zwei Kolbenpumpen zu den beiden Leitungen eines Injektors gepumpt. Zwischen den Pumpen und dem Injektor waren Pufferbehälter angeordnet, um den Rückdruck stetig zu halten, der auf einen Wert im Bereich von 14 bis 16 kg/cm² eingestellt wurde.

Der Injektor bestand aus einer Kapillare aus nichtrostendem Stahl (Innendurchmesser 0,5 mm), deren freies Ende zu einer Austrittsöffnung von 0,05 bis 0,08 mm verengt war. Das andere Ende der Kapillare war gabelförmig an die beiden Eintrittsleitungen für Gasöl und Nährmedium geschweißt. Die Pumpen konnten auf eine Ausströmmenge von 0,3 bis 11/Std. reguliert werden.

Das aus dem Injektor kommende Gemisch von Gasöl und Kulturmedium wurde in ein kontinuierlich arbeitendes 5-1-Gärgefäß eingeführt, das mit folgenden Einrichtungen versehen war.

209 553/11

Rührer

Drehzahl 1000

Verhältnis von Flügeldurchmesser zu

Behälterdurchmesser 1:3

Flügelzahl 8

Luftinjektoren in Form einer Ringkapillare.

Elektroden zur pH-Regelung (eingehaltener pH-Wert = 4).

Wassermantel zur Einhaltung einer konstanten Temperatur von 3O⁰C.

Leitungen zur Entnahme von Flüssigkeit mit einer Kolbenpumpe.

Zur Einführung des Gemisches aus Gasöl und Nährmedium in Form einer feinen Dispersion unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Systems kann die Kapillarspitze des Injektors entweder innerhalb der Flüssigkeit (vorzugsweise unterhalb des Rührers) oder über der Flüssigkeitsoberfläche zum Boden des Gärgefäßes zeigend angeordnet werden.

Folgende Materialien wurden gebraucht:

Hefe = Candida lipolytica

Gasöl = schweres Gasöl aus Irak-Rohöl mit

12 Gewichtsprozent n-Paraffinen,

Stockpunkt + 17° C

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

IO

Zusammensetzung des wäßrigen Nährmediums:

Diammoniumphosphat 2 g

Kaliumchlorid 1,15 g

Magnesiumsulfatheptahydrat 0,65 g

Zinksulfat 0,17 g

Mangansulfatmonohydrat 0,045 g

Ferrosulfatheptahydrat 0,068 g

Hefeextrakt 0,025 g

Leitungswasser 200 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 cm³) Luft filtriert und komprimiert

Um die Wichtigkeit der Verwendung des Druckeinspritzsystems zu veranschaulichen, wurden folgende Versuche durchgeführt:

1. Kultur unter Zuführung von Gasöl und Medium durch getrennte Leitungen ohne vorherige Zerstäubung.

2. Kultur unter Zerstäubung des Gemisches von Gasöl und Medium mit Hilfe der beschriebenen Druckeinspritzung bei eingetauchter Kapillare.

3. Wie bei 2., jedoch mit Anordnung der Kapillare as oberhalb des Flüssigkeitsspiegels (Einspritzung an der Luft).

Versuch 1	Versuch 2	Versuch 3
ECeine Zerstäubung	Zerstäubung in der	Zerstäubung in der
	Flüssigkeit	Luft
3	3	3
0,07	0,10	0,11
70	70	70
0,21	0,3	0,33
180	180	180
5	5	5,5
100	10	6
10	7	6,5
41	40	43

Flüssigkeitsvolumen im Gärgefäß, 1..

Verdünnung

Luftmenge, V/V/Std

Flüssigkeitsmenge, 1/Std

Gramm Gasöl/1 Einsatz

Zelldichte

Mittlere Größe der Gasöltröpfchen, μ

Dauer der Zellteilung, Std

Verbrauch an η-Paraffinen, °/o

Es ist festzustellen, daß durch Dispergierung mit HiKe der Kapillare die Zellteilungszeit bei gleichem Entparaffinierungsgrad erheblich verkürzt wird, d. h., die Geschwindigkeit der Bildung von Hefe und von entparaffiniertem Gasöl wird ohne Veränderung des Grades der Entparaffinierung erhöht.

Beispiel 2

55

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Ausgangsmaterials, das durch Dispergierung von festem Paraffinwachs erhalten wird.

Das feste Substrat (Hartgatsch oder festes Paraffinwachs) wurde in einem Behälter geschmolzen und an der Luft als feine Dispersion in das im Gärgefäß enthaltene Kulturmedium gespritzt, wobei ein Luftzerstäuber verwendet wurde, der aus einem in einem konzentrischen Lufteintrittsrohr angeordneten Kapillarrohr bestand. Die Einspritzung kann entweder von einem Punkt innerhalb der Flüssigkeit oder von einem Punkt oberhalb der Flüssigkeit erfolgen. Das gleiche 5-1-Gärgefäß wie im Beispiel 1 wurde verwendet.

Folgende Materialien wurden gebraucht:
Hartgatsch (Schmelzpunkt 6O⁰C)
Paraffinwachs (Schmelzpunkt 60 bis 7O⁰C)

Schweres Gasöl (Irak) (Fließpunkt +17⁰C,
n-Paraffine 12 Gewichtsprozent)

Hefe: Candida lipolytica

Das gleiche wäßrige Nährmedium wie im Beispiel 1 wurde verwendet.

Die folgenden Versuche wurden mit dem Ziel durchgeführt, ein feinteiliges festes Substrat, das an n-Paraffinen reich oder angereichert war, der Hefe verfügbar zu machen:

1. Kultur mit gewöhnlichem schwerem Gasöl ohne vorherige Zerstäubung.

2. Kultur mit Hartgatschdispersion.

3. Kultur mit schwerem Gasöl, das mit Paraffinwachs angereichert war, zerstäubt.

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Versuch 1

Gasöl,
nicht zerstäubt

Versuch 2
Gatsch, zerstäubt

Versuch 3

Gasöl + Wachs,
zerstäubt

Flüssigkeitsvolumen, 1

Verdünnung

Luftmenge, V/V/Std

Flüssigkeitsmenge, 1/Std

Gasölsubstrat, g/l Medium

Zelldichte

Größe der Substratteilchen

Verbrauch an η-Paraffinen im Ausgangsmaterial,
Gewichtsprozent

0,10
70

0,3
180

4
100

32

0,10
70
0,3
180
8,5
5

0,10
70

0,3
180

9
10

73

Die Verwendung einer mit einem Luftzerstäuber hergestellten feinen Dispersion von Gatsch oder Gasöl, das mit festem Paraffin angereichert ist, ergibt einen deutlichen Anstieg der Zelldichte bei gleicher Verdünnung. Hieraus ist ersichtlich, daß die Zugänglichkeit der η-Paraffine verbessert werden kann. Der praktische Nutzen liegt in der erhöhten stündlichen Produktion von Hefe und entparaffiniertem Gasöl ohne Veränderung der Qualität des letzteren.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendungeines Einsatzmaterials, das durch Ultraschallvibration dispergiert wird.

Das Gasöl und das Kulturmedium wurden mit einer Kreiselpumpe zu einer Vorrichtung gepumpt, die Ultraschallvibrationen erzeugt und als »Flüssigkeitsflöte« bekannt ist. Diese Vorrichtung besteht aus einem sehr feinen Stahlblech, das vor einem abgeflachten Rohr montiert ist, das eine flache Düse bildet, durch die die Flüssigkeit eintritt. Diese Vorrichtung wurde in einem zylindrischen Behälter angeordnet, der eine Resonanzkammer bildete. Es wurde eine Frequenz von 20 bis 22 kHz angewendet. Der Austritt der »Flöte« war über einen elastischen Kunststoffschlauch von 50 cm Länge mit dem Gärgefäß verbunden. Das gleiche kontinuierlich arbeitende 5-1-Gärgefäß wie im Beispiel 1 wurde verwendet.

Folgende Materialien wurden eingesetzt:

Hefe = Candida lipolytica

Gasöl = Schweres Gasöl (Irak) mit

12 Gewichtsprozent n-Paraffinen

Kulturmedium = Wäßriges Medium wie im
Beispiel 1

Luft = Filtriert und komprimiert

Die Vorteile des Ultraschallsystems ergeben sich aus folgenden Versuchen:

1. Kultur ohne vorherige Dispergierung des Gasöls.

2. Kultur mit Ultraschalldispergierung des Gasöls.

20	Versuch 1 Ohne Disper gierung	Versuch 2 Disper gierung
Flüssigkeitsvolumen, 1 25 Luftmenge, V/V/Std Gasölgehalt des Einsatzes, g/l Verdünnung Durchflußmenge der Flüssig keit, 1/Std 30 Zelldichte, g/l Größe der Gasöltröpfchen, μ Verbrauch an η-Paraffin aus dem Einsatzmaterial, Gewichtsprozent	3 70 180 0,1 0,3 4 100 32	3 70 180 0,1 0,3 9 5 74

Es ist offensichtlich, daß die Zelldichte durch das Ultraschall-Dispergierungssystem bei gegebener Verdünnung erhöht wird. Mit anderen Worten, das System verbessert die Verfügbarkeit des Gasölsubstrats für die Hefe. Es ist möglich, auf diese Weise die Hefeproduktion bei gleicher Verdünnung zu steigern oder bei stärkerer Verdünnung die gleiche Zelldichte zu erzielen. Dieses entspricht einer erheblichen Verkürzung der Zellteilungszeit.

B e i s ρ i e 1 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Stabilisierung von als Einsatzmaterial verwendeten Gasöldispersionen mit Hilfe von Hefen.

Die Dispergierung eines als kohlenstoffhaltiges Material verwendeten Gasöls in einem mineralischen Medium wurde in einer als »Seila-Microdisperser« bekannten Kolloidmühle durchgeführt, in der die Scherwirkung durch zwei Systeme erzeugt wurde, die auf der gleichen Drehachse montiert waren, nämlich durch ein Zahnrad und zwei konische Flächen. Der Austritt der Apparatur war mit einem elastischen Schlauch mit dem Gärgefäß verbunden. Zur Stabilisierung der gebildeten Emulsion wurde eine Menge der Kulturflüssigkeit, die etwa 5°/o des Volumens der Emulsion entsprach und 8 bis 9 g Hefe/1 enthielt, am Eintritt oder am Austritt der Kolloidmühle in das flüssige Material eingespritzt.

Der Rührer des Gärgefäßes, das ein Fassungsvermögen von 3 1 hatte, lief mit 1000 UpM. Das Gefäß war mit einem Abzugsystem und mit einer Pumpe versehen. Der pH-Wert wurde mit Elektroden und einem automatischen Potentiometer geregelt.

Folgende Materialien wurden eingesetzt:

Hefe = Candida lipolytica,

Gasöl = Schweres Gasöl mit 12 % n-Paraffinen,

Fließpunkt+17⁰C,
Medium = Wäßriges mineralisches Nährmedium

wie im Beispiel 1,
Luft = Filtriert und komprimiert.

Um die Vorteile der Kolloidmühle und der Stabilisierung der Dispersion mit Hefe zu veranschaulichen, wurden folgende Versuche durchgeführt:

1. Kultivierung auf Gasöl ohne vorherige Dispergierung.

2. Kultivierung auf Gasöl mit vorheriger Dispergierung mit Hilfe der Kolloidmühle, jedoch ohne Stabilisierung mit Hefe.

3. Kultivierung auf Gasöl mit Dispergierung und Stabilisierung durch Kreislaufführung eines Teils der Produkthefe zum Eintritt der Kolloidmühle.

	Versuch 1	Versuch 2	Versuch 3
Flüssigkeitsvolumen .Tv Verdünnung : Zugeführte Flüssigkeit, 1/Std	-·■ 3,.i:....;· 7"QyIO	-X-.3J 0,10.	31 0,10
Gasölgehalt, g/l Luftmenge, V/V/Std. .. Mittlere Größe der Öl- tröpfchen, μ Zelldichte Verbrauchte Paraffin menge, Gewichtspro zent	0,3. 180 70 100 4 32	k 0,3 - 180 ■ 70 10 8 65	'·■'■<&:■? 180 70 5 10 81

Es ist offensichtlich, daß durch Verwendung einer Kolloidmühle eine Emulsion erhalten wird, durch deren Dispergierungsgrad die Zelldichte erheblich gesteigert wird. Durch die Anwesenheit von Hefe in der Emulsion wird der hohe Dispergierungsgrad aufrechterhalten und das Wachstum der Hefe erheblich verstärkt.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Züchten von geradkettige Kohlenwasserstoffe verwertenden Hefen, vorzugsweise der Gattung Candida, unter üblichen Bedingungen in einem Kohlenwasserstoffe mit n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenwasserstoffe mit η-Paraffin-Kohlenwasserstoffen im Nährmedium sehr fein dispergiert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenwasserstoffe mit n-Paraffin-Kohlenwasserstoffen im Nährmedium mit einer Teilchengröße von kleiner als 30 μ, vorzugsweise kleiner 10 μ, dispergiert sind.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein festes Kohlenwasserstoffeinsatzmaterial durch Zerstäuben im geschmolzenen Zustand in ein flüssiges, unterhalb der Schmelztemperatur des festen Kohlenwasserstoffeinsatzmaterials gehaltenes Medium dispergiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dispersion des Einsatzmaterials in einem flüssigen Medium außerhalb des Fermenters gebildet wird, diese Dispersion mit dem Mikroorganismus gemischt wird und die erhaltene Mischung in den Fermenter gegeben wird.