DE60021181T2

DE60021181T2 - Pectin mit verminderter Calciumrreaktivität

Info

Publication number: DE60021181T2
Application number: DE60021181T
Authority: DE
Inventors: Meyer Karin HANSON; Flemming Moeller
Original assignee: CP Kelco ApS
Current assignee: CP Kelco ApS
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: ES2241595T3; WO2000058367A1; EP1171473B1; DE60021181D1; DK1171473T3; BR0009496A; EP1171473A1; CZ20013511A3; MXPA01009799A; KR20020001807A; KR100791157B1; AU3915000A; TW499689B; RU2001128764A; TWI252235B; JP2002540258A; ATE299152T1; CN1352653A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Pectin, das die Stabilisierung von Proteinen ohne den unerwünschten Anstieg der Viskosität ergibt. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Pectin, das durch enzymatische oder chemische Mittel und/oder Maßnahmen behandelt worden ist, um ein Pectin zu erzeugen, das eine Protein-Stabilisierung ergibt und eine relativ niedrige Empfindlichkeit gegenüber Calcium aufweist.
Hintergrund der Erfindung
Pectin ist ein gereinigtes Kohlenhydrat-Produkt, erhalten durch wässrige Extraktion eines geeigneten genießbaren pflanzlichen Materials, gewöhnlich aus Zitrusfrüchten oder Äpfeln. Beispielsweise kann Pectin kommerziell aus Zitrusschalen oder Apfeltrester unter milden sauren Bedingungen extrahiert werden. Eine typische Herstellung von Pectin umfasst 3 bis 4 Primärstufen, nämlich die Extraktion aus dem pflanzlichen Material, die Reinigung des Extrakts, die Isolierung des Pectins aus der gereinigten Lösung und gegebenenfalls eine Entesterung.
Chemisch ist Pectin der methylierte Ester von Polygalacturonsäure. Es besteht primär aus D-Galacturonsäure- und Galacturonsäuremethylester-Einheiten, die lineare Polysaccharid-Ketten bilden, wobei die D-Galacturonsäure-Einheiten durch β-1,4-glycosidische Bindungen verbunden sind. Einige Neutralzucker, wie Rhamnose und Arabinose, sind gewöhnlich ebenfalls vorhanden. Die Polygalacturonsäure ist teilweise mit Methylgruppen verestert, und die freien Säuregruppen können teilweise oder vollständig mit Natrium-, Kalium- oder Ammoniumionen neutralisiert sein. Das Verhältnis der veresterten zu den gesamten Galacturonsäure-Gruppen, das als Veresterungsgrad (DE) bezeichnet wird, beeinflusst die Eigenschaften von Pectin, insbesondere seine Löslichkeits- und Gelbildungseigenschaften.
Pectin wird im Normalfall gemäß seinem Veresterungsgrad klassifiziert und kann in diesem Zusammenhang in 2 Hauptkategorien eingeteilt werden: Hoch(methyl)ester (HM)-Pectin und Nieder(Low)(methyl)ester (LM)-Pectin. (Für die vorliegende Diskussion sind Niederester und Niedermethylester als austauschbare Begriffe verwendet, wie dies auch für die Begriffe Hochester und Hochmethylester gilt.) Die LM-Pectine sind diejenigen, in denen weniger als 50% der Carbonsäure-Einheiten als Methylester vorliegen, während die HM-Pectine diejenigen sind, in denen 50% oder mehr der Carbonsäure-Einheiten als Methylester vorliegen. Für Vorschriftzwecke ist diese Nomenklatur durch FCC-Definition in Kraft, worunter jedes Pectin von 50% DE oder mehr ein HM-Pectin, wogegen alles unter einem DE von 50% ein LM-Pectin sind.
HM-Pectine bilden höchst unmittelbar bei Vorliegen hoch löslicher Feststoffe und bei niedrigem pH-Wert Gele, während LM-Pectine in charakteristischer Weise in der Gegenwart zweiwertiger Kationen, wie von Calcium und/oder Magnesium, gelieren. Obwohl die Gelierung eine primäre Charakteristik von Pectin darstellt, kann es auch zur Verbesserung der Stabilisierung von Nahrungsmittel- und Getränkeprodukten verwendet werden. Pectin wird insbesondere zur Stabilisierung von Getränken, die Proteine, wie Milchproteine, enthalten, besonders bei niedrigem pH-Wert angewandt. Eine Kategorie solcher Getränke betrifft angesäuerte Milchgetränke, die durch Fermentation oder durch direkte Ansäuerung hergestellt werden können. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, erscheint es zutreffend, dass Pectin Proteine, wie Kasein, durch Wechselwirkung mit den an der Oberfläche solcher Proteine vorgefundenen ionischen Ladungen stabilisiert. Bei Abwesenheit einer Stabilisierung können die Proteinpartikel in einem Getränk mit einander wechselwirken, um zu agglomerieren, was zu Trübung und/oder Ausfällung führt. Pectin ist zur Stabilisierung von Proteinen durch die Wechselwirkung der negativ geladenen Säure-Regionen entlang des Pectin-Rückgrats mit den ionischen Ladungen auf der Oberfläche des Proteins befähigt. Weil Kasein amphoter ist, kann die Stabilisierung auch über Calcium-Verbrückung zwischen den negativ geladenen Säure-Regionen entlang des Pectin-Rückgrats und den negativ geladenen Regionen auf der Oberfläche von Kaseinpartikeln erfolgen. Allerdings weist bei niedrigem pH-Wert, wie unterhalb ca. pH = 4,4, Kasein hauptsächlich eine positive Ladung auf, so dass eine Verbrückung über Calcium minimal wird und die Stabilisierung mit Pectin vorrangig oder ausschließlich als Ergebnis einer elektrostatischen Wechselwirkung zwischen Pectin und Kasein erfolgt.
Nahrungsmittel- und Getränkehersteller können signifikante Abweichungen bei den Ausgangsmaterialien vorfinden, aus denen ihre Produkte hergestellt werden. Im Fall von Produkten, einschließlich Joghurt und Getränken, die Obst und/oder Milch enthalten, können diese Abweichungen signifikante Änderungen bei pH, Protein- und Calcium-Konzentration einschließen, welche aus Abweichungen der Verfahrensführung und der Rohmaterialien oder aus beiden resultieren. Die Stabilisierung solcher Produkte mit einer Pectin-Menge, die ausreicht, eine typische oder standardisierte Produktzusammensetzung zu stabilisieren, kann zu Produkten führen, die unterlegen bei der Qualität oder sogar ungeeignet sind, wenn die Zubereitung einer besonderen Produktzusammensetzung das Stabilisierungsvermögen der eingesetzten Pectin-Menge übersteigt. Dieses Risiko kann durch "Überdosierung" mit Pectin kompensiert werden, d.h. durch Zugabe einer Pectin-Menge in Überschuss zu derjenigen Menge, die theoretisch benötigt wird, eine typische oder Standard-Charge zu stabilisieren. Die Überdosierungsmenge schwankt unter den Erzeugern und der Anwendung, kann aber ziemlich groß sein, z.B. 50%, 100% oder mehr. Allerdings kann, abhängig von Faktoren wie pH, Feststoff- und Calciumgehalt besonderer Produkte oder Produkt-Chargen, das "extra"-Pectin einen signifikanten Viskositätsanstieg verursachen, der manchmal auch als Überdosierungsviskosität bezeichnet wird. Beispielsweise können Produkte, die Milchfeststoffe enthalten oder darauf beruhen, wie angesäuerte Milchgetränke, auch signifikante Konzentrationen von Calciumionen enthalten. Hier stehen die Erzeuger oder Verarbeiter von Nahrungsmitteln vor einem Dilemma, weil die Pectine, die ein besseres Stabilisiervermögen ergeben, gleichzeitig auch eine signifikante Überdosierungsviskosität verursachen können.
Verschiedene Lösungsansätze für dieses Problem sind versucht oder vorgeschlagen worden. Akahoshi et al., US 5,690,975 , diskutieren ein Verfahren zur Erzeugung von mit Calcium angereicherter fermentierter Milch oder entsprechender Milchgetränke. Das Verfahren umfasst die Zugabe von HM-Pectin und von "Calcium individuell zusammen mit Sirup" in ein Milchsäure-fermentiertes Milchgetränk sowie die Homogenisierung der entstandenen Mischung oder die Homogenisierung eines Milchsäure-fermentierten angesäuerten Milchgetränks, die Zugabe von Sirup und von HM-Pectin dazu, die Vermischung, die Zugabe von Calcium und eine erneute Vermischung. In beiden Verfahren kann ein "Pectin vom Blockweise Typ" als das HM-Pectin verwendet werden. Allerdings wäre es, aus Sicht der Hersteller von Nahrungsmitteln oder Getränken, generell vorzuziehen, Prozessänderungen zu minimieren. Es wäre daher wünschenswert, ein Pectin zu erhalten, das zusammen mit Nahrungsmitteln und Getränken, die einen relativ hohen löslichen Feststoffgehalt und einen niedrigen pH-Wert aufweisen, verwendet werden könnte und eine Stabilität ohne unerwünschte Viskositätssteigerungen, sogar unter Überdosierungsbedingungen, ergeben würde.
Details bezüglich der ΔCS (Calcium-Empfindlichkeit) von Zitruspectinen sind offenbart in C. Rolin, Gums and Stabilizers for the Food Industry, GB, IRL Press, Oxford 1994, Seiten 413–422.
WO 89/12 648 betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Gelierungseigenschaften von hoch verestertem Pectin, wobei das hoch veresterte Pectin mit Polygalacturonase behandelt wird, die auch als Pectin-Depolymerase oder Pectinase bekannt ist. Polygalacturonase wirkt auf Pectat und weitere Galacturonane durch Katalyse der Hydrolyse von 1,4-α-D-Galactosiduron-Bindungen in statistischer Weise ein.
WO 00/27 888, die einen Stand der Technik unter Art. 54 (3) EPÜ im vorliegenden Fall darstellt, offenbart Pectine zur Stabilisierung von Proteinen. Auf Seite 12, Zeilen 20–23, wird offenbart, dass die Ausgangsmischung der Pectine mit Polygalacturonase oder Pectat-Lyase oder mit weiteren chemischen oder enzymatischen Verfahrenstechniken behandelt werden kann, die selektiv das Rückgrat des Pectinmoleküls hydrolysieren. Während die katalytische Wirkung von Polygalacturonase auf Pectat und weitere Galacturonane zu einer statistischen Hydrolyse von 1,4-α-D-Galactosiduron-Bindungen führt, ist die Pectat-Lyase ein Enzym, das zu einer Beseitigungsspaltung von Pectat führt, um Oligosaccharide mit 4-Desoxy-α-D-gluc-4-enuronosylgruppen an deren nicht-reduzierenden Enden zu ergeben. Pectat-Lyase wirkt auch auf weitere Polygalacturonade ein, wogegen sie nicht auf Pectin einwirkt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von Pectin gerichtet, wobei das genannte Verfahren die Stufe umfasst, wobei ein Ausgangspectin, das einen Blockigkeitsgrad von mindestens 10%, einen Veresterungsgrad von mindestens 55% und eine ΔCS (Calcium- Empfindlichkeit) von größer als 0 cp (Centipoise) aufweist, mit einer Pectin-Lyase unter Bedingungen behandelt wird, die hinreichen, ein verarbeitetes Pectin zu erzeugen, das eine ΔCS aufweist, die niedriger als die ΔCS des genannten Ausgangspectins ist.
Vorzugsweise weist das genannte Ausgangspectin einen Blockigkeitsgrad von mindestens 15%, bevorzugter von mindestens 20%, noch mehr bevorzugt von nicht mehr als 30% und ganz besonders bevorzugt von nicht mehr als 25% auf.
Des Weiteren weist das Ausgangspectin vorzugsweise einen Veresterungsgrad von mindestens 55%, wie von mindestens 70 oder 80%, auf, und der bevorzugtere Bereich beträgt 55 bis 80% und ganz besonders bevorzugt 60 bis 72%.
Außerdem weist das Ausgangspectin vorzugsweise eine ΔCS von mindestens 20 cp, wie von mindestens 200, mindestens 300 oder von mindestens 500 cp, auf, und das verarbeitete Pectin weist vorzugsweise eine ΔCS von nicht mehr als 20 cp und bevorzugter von 0 bis 20 cp auf.
Das Ausgangspectin weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als 240.000, bevorzugter von nicht mehr als 150.000 und ganz besonders bevorzugt von mindestens 100.000 auf.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Pectin bereit, das mit dem obigen Verfahren erhältlich ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung weist dieses Pectin einen Blockigkeitsgrad von mindestens 10%, einen Veresterungsgrad von mindestens 55% und eine ΔCS von nicht mehr als 100 cp auf.
Die ΔCS des Pectins beträgt vorzugsweise nicht mehr als 30 cp, wie nicht mehr als 20, nicht mehr als 10, nicht mehr als 5 oder ca. 0 cp, und sie beträgt vorzugsweise 0 bis 20 cp und bevorzugter 0 bis 10 cp.
Vorzugsweise weist das Pectin einen Blockigkeitsgrad von mindestens 15% und bevorzugter von mindestens 20%, und vorzugsweise von nicht mehr als 30% und bevorzugter von nicht mehr als 25% auf.
Ferner weist das Pectin vorzugsweise einen Veresterungsgrad von mindestens 55%, wie von mindestens 60, 70 oder 80%, sowie bevorzugtere Bereiche von 55 bis 80% auf, wobei 60 bis 72% sogar noch bevorzugter sind.
Das mit dem vorliegenden Verfahren erhältliche Pectin weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von mindestens 40.000, bevorzugter von mindestens 50.000 und sogar noch bevorzugter von mindestens 70.000 auf, und das bevorzugte Molekulargewicht beträgt 50.000 bis 200.000, wobei 70.000 bis 90.000 ganz besonders bevorzugt sind.
In einer weiteren Ausgestaltung weist das Pectin einen Blockigkeitsgrad von 10 bis 15, einen Veresterungsgrad von 70 bis 75 und eine ΔCS von nicht mehr als 18 cp, wie von nicht mehr als 14, nicht mehr als 10, nicht mehr als 6, nicht mehr als 3, nicht mehr als 2 oder nicht mehr als 1 cp, auf.
In einer alternativen Ausgestaltung ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Pectin gerichtet, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, in denen man

(a) ein Pectin, das einen Blockigkeitsgrad von mindestens 10%, einen Veresterungsgrad von mindestens 70% und eine ΔCS von größer als 0 cp aufweist, mit Pflanzenpectin-Methylesterase unter Bedingungen behandelt, die hinreichen, um ein entestertes Pectin mit einem Blockigkeitsgrad von mindestens 10%, einem Veresterungsgrad von mindestens 55% und mit einer ΔCS von größer als 0 zu erzeugen, und man
(b) das genannte entesterte Pectin mit einer Pectin-Lyase unter Bedingungen behandelt, die hinreichen, um ein Pectin zu erzeugen, das einen Blockigkeitsgrad von mindestens 10% und eine ΔCS von nicht mehr als 20 cp aufweist.

Auch ist die vorliegende Erfindung auf ein Pectin gerichtet, das mit dem obigen alternativen Verfahren erhältlich ist.
Ferner ist die vorliegende Erfindung auf eine ess- bzw. genießbare Zusammensetzung gerichtet, die ein Pectin umfasst, das mit den vorliegenden oben definierten Verfahren erhältlich ist und einen Blockigkeitsgrad von mindestens 10%, einen Veresterungsgrad von mindestens 55% und eine ΔCS von nicht mehr als 100 Centipoise aufweist.
Die essbare Zusammensetzung kann ferner Kasein umfassen und ist vorzugsweise ein Getränk und bevorzugter ein angesäuertes Milchgetränk.
Schließlich ist die vorliegende Erfindung auch noch auf die Verwendung eines mit den vorliegenden oben definierten Verfahren erhältlichen Pectins zur Steigerung der Lagerstabilität einer ess- bzw. genießbaren Zusammensetzung gerichtet.
Das Molekulargewicht des Pectins der vorliegenden Erfindung beträgt mindestens ca. 40.000, vorzugsweise mindestens ca. 50.000 und noch bevorzugter mindestens ca. 70.000 und kann mindestens ca. 200.000 betragen. Ein bevorzugter Molekulargewichtsbereich beträgt ca. 50.000 bis ca. 200.000, wobei ein Bereich von ca. 70.000 bis ca. 90.000 besonders bevorzugt ist.
In einer weiteren Ausgestaltung kann das Pectin einen Blockigkeitsgrad von ca. 10 bis ca. 15, einen Veresterungsgrad von ca. 70 bis ca. 75 und eine ΔCS von nicht mehr als ca. 18 aufweisen. Die ΔCS kann alternativ nicht mehr als ca. 14 oder nicht mehr als ca. 10 oder nicht mehr als ca. 6 oder nicht mehr als ca. 3 oder nicht mehr als ca. 2 oder nicht mehr als ca. 1 betragen.
In noch einer weiteren Ausgestaltung ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Pectins gerichtet, welches die Stufe einschließt, worin ein Ausgangspectin, das einen Blockigkeitsgrad von mindestens ca. 10%, einen Veresterungsgrad von mindestens ca. 55% und eine ΔCS von mehr als ca. 0 Centipoise aufweist, mit einer Pectin-Lyase unter Bedingungen behandelt wird, die hinreichen, um ein verarbeitetes Pectin zu erzeugen, das eine ΔCS aufweist, die niedriger als die ΔCS des Ausgangspectins ist. Das Ausgangspectin kann einen Blockigkeitsgrad von mindestens ca. 20% aufweisen; alternativ dazu, kann das Ausgangspectin einen Blockigkeitsgrad von nicht mehr als ca. 30% aufweisen. Vorzugsweise beträgt der Blockigkeitsgrad des Ausgangspectins ca. 15 bis ca. 25%.
Der Veresterungsgrad des Ausgangspectins kann mindestens ca. 55% oder mindestens ca. 70% oder mindestens ca. 80% betragen. Der bevorzugte Bereich des Blockigkeitsgrads des Ausgangspectids beträgt ca. 55 bis ca. 80% und bevorzugter ca. 60 bis ca. 72%.
Das Ausgangspectin kann eine ΔCS von mindestens ca. 20 oder von mindestens ca. 200 oder von mindestens ca. 300 oder von mindestens ca. 500 aufweisen.
Das verarbeitete Pectin, das mit diesem Verfahren erzeugt wird, weist eine ΔCS von nicht mehr als ca. 20, vorzugsweise von nicht mehr als ca. 10, bevorzugter von nicht mehr als ca. 5 und am meisten bevorzugt von ca. 0 Centipoise auf. Der bevorzugte Bereich der ΔCS für das verarbeitete Pectin beträgt ca. 0 bis ca. 20 Centipoise, wobei der Bereich von ca. 0 bis ca. 10 Centipoise am meisten bevorzugt ist.
Das Ausgangspectin kann ein Molekulargewicht von nicht mehr als ca. 240.000 und vorzugsweise von nicht mehr als ca. 150.000 und sollte ein Molekulargewicht von mindestens ca. 100.000 aufweisen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung ist es ermöglicht, Pectine zu erhalten, die ein gutes Stabilisiervermögen für Proteine ohne wesentliche und unerwünschte Viskositätssteigerungen, sogar bei Verwendung in relativ hohen Konzentrationen, ergeben.
Früher stellten die Eigenschaftsbedingungen einer Protein-Stabilisierung sowie einer minimalen Viskositätserhöhung ganz allgemein widerstreitende Ziele für Pectin dar. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, kann dies aus einer Protein-Stabilisierung resultieren, die sich durch das Vorliegen negativer Ladungen auf dem Pectin, vorrangig in der Form von Säuregruppen, einstellt, welche auch für die Verbrückung oder Vernetzung durch zweiwertige Kationen verantwortlich sind, wodurch Viskositätssteigerungen bis hin zu einer Gelierung erzeugt werden. Daher würden erhöhte Mengen von Säuregruppen, die eine verbesserte Stabilisierung ergeben würden, auch die Tendenz des Pectins steigern, die Viskosität von Flüssigkeiten zu erhöhen, die zweiwertige Kationen, wie Calcium, enthalten. Dagegen könnten ausgewählte Pectine, die einen annähernd niedrigen Säuregehalt aufweisen, eine signifikante Viskositätssteigerung vermeiden, würden aber auch ein nur relativ geringes Stabilisiervermögen erzeugen. Theoretisch kann es zumindest möglich sein, ein Pectin auszuwählen, das einen Mittelweg zwischen diesen zwei Extremen darstellt und einiges Stabilisiervermögen ohne wesentliche Viskositätssteigerung ergibt. Allerdings wäre in der Praxis die Nützlichkeit solcher Pectine wegen der Notwendigkeit zur vorher diskutierten Überdosierung zu verneinen, weil unter Überdosierungsbedingungen dieser Kompromiss bei den Eigenschaften zusammenbricht und unerwünschte Viskositätssteigerungen auftreten.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun Pectine gefunden, die eine gute Stabilität ergeben, ohne dass, in ganz überraschender Weise, unerwünschte oder unannehmbare Viskositätssteigerungen, sogar unter Überdosierungsbedingungen, verursacht werden. Die Pectine der vorliegenden Erfindung können durch verschiedene Eigenschaften, einschließlich Veresterungsgrad oder %DE, Blockigkeitsgrad oder DB, Calcium-Empfindlichkeit oder ΔCS, Molekulargewicht, Protein-Stabilisiervermögen oder YOG und Viskosifiziervermögen oder VIS, oder durch das Verhältnis von Viskosifizier-zu-Stabilisiervermögen oder VIS/YOG gekennzeichnet werden. Diese Parameter sowie die Verfahren zu deren Messung werden nun noch weiter diskutiert und erläutert.
Veresterungsgrad (%DE): Wie vorher bereits erläutert, ist der Veresterungsgrad eines Pectins ein Maß des Prozentsatzes der Säuregruppen, die im Pectinmolekül als der Methylester vorliegen. Für HM-Pectine liegen mindestens 50% der Carbonsäure-Einheiten als der Methylester vor. Mit einem Anstieg des %DE sinkt die Calcium-Empfindlichkeit ab, und erwartungsgemäß würde dies auch für das Stabilisiervermögen gelten. Die Pectine der vorliegenden Erfindung sind durch einen %DE von mindestens ca. 55 gekennzeichnet, wobei der Bereich von ca. 60 oder 70 bis ca. 72% bevorzugt ist und der %DE so hoch wie ca. 80 sein kann. Bei diesen höheren Bereichswerten wäre insbesondere das Stabilisiervermögen als gering zu erwarten, wobei eine theoretische Grundlage für diese Erwartung darauf beruht, dass nur ungenügende negative Ladung aus den relativ wenigen zurückbleibenden Säuregruppen vorhanden ist, um Proteine wirkungsvoll zu stabilisieren. Es sollte angemerkt sein, dass, bei Erzeugung des Pectins der vorliegenden Erfindung durch Behandlung eines Pectin-Ausgangsmaterials mit Enzym, der %DE des Ausgangsmaterials im Wesentlichen unverändert bleibt.
Probenzubereitung: Es werden 2,0000 g Pectin in einen 250 mL-Glasbecher eingewogen, 100 mL saurer Alkohol (100 mL 60%iger Isopropylalkohol plus 5 mL rauchende 37%ige HCl) zugegeben und auf einem Magnetrührer 10 min lang verrührt. Die entstandene Lösung wird durch einen getrockneten, gewogenen Glasfiltertiegel filtriert. Der Becher wird vollständig mit 6 × 15 mL saurem Alkohol gespült, und die Spülung wird ebenfalls filtriert. Das Filtrat wird mit 60%igem Isopropylalkohol (IPA) gewaschen, bis das Filtrat als Chlorid-frei ermittelt ist, gemäß Bestimmung durch Überführung von ca. 10 mL Filtrat in ein Testrohr, Zugabe von ca. 3 mL 3 N HNO₃ und Zugabe einiger (wie von 2 oder 3) Tropfen AgNO₃. Dieses Filtrat kann als Chlorid-frei bewertet werden, falls die Lösung klar ist, im Gegensatz zu der Feststellung einer Ausfällung von Silberchlorid. In typischer Weise sind ca. 500 mL IPA-Wäsche hinreichend. Sobald das Filtrat als Chlorid-frei bestimmt ist, wird mit zusätzlichen 20 mL 100% IPA gewaschen und 2,5 h lang bei 105°C getrocknet. Der Tiegel wird nach Trocknung gewogen.
Messung: Es werden 2 Proben des Filtrats von jeweils 0,4000 g in getrennte 250 mL-Glasbecher eingewogen; die zweite Probe stellt die Gegenprobe der ersten dar, und die gleiche Vorgehensweise wird dann für jede Probe befolgt. Das Pectin wird mit ca. 2 mL 100% IPA benetzt, worauf ca. 100 mL entionisiertes Wasser unter Rühren auf einem Magnetmischer zugegeben werden. Die Probe ist nun fertig zur Titration. Es wird die gleiche Vorgehensweise an der zweiten Probe durchgeführt, wobei die zweite Titrationsmenge als B₁ angegeben wird.
Titration

1. Titrieren mit 0,1 N NaOH auf pH = 8,5; Angabe der Titrationsmenge als V₁-Titer.
2. Zugabe von 20,00 mL 0,5 N NaOH und unberührt Stehen lassen 15 min lang, bedeckt mit Folie.
3. Zugabe von 20,00 mL 0,5 N HCl und Rühren auf einem Magnetrührer, bis der pH-Wert konstant ist.
4. Titrieren mit 0,1 N NaOH auf pH = 8,5; Angabe des Ergebnisses als V₂-Titer.

Für den Blindtest:

1. Titrieren von 100 mL entionisiertem, Kohlendioxid-freien Wasser auf pH = 8,5 mit 0,1 N NaOH.
2. Zugabe von 20,00 mL 0,5 N NaOH und unberüht Stehen lassen für genau 15 min, bedeckt mit Folie.
3. Zugabe von 20,00 mL 0,5 N HCl und Rühren auf einem Magnetrührer, bis der pH konstant ist.
4. Titrieren mit 0,1 N NaOH auf pH = 8,5; Angabe des Ergebnisses als B₁-Titer.

Die Maximalmenge, die zur Titration in obiger Stufe 4 erlaubt ist, beträgt 1 mL der 0,1 N NaOH. Falls mehr 1 mL 0,1 N NaOH benötigt werden, wird die Vorgehensweise wiederholt, wobei die 0,5 N HCl aus Stufe 3 mit einer kleinen Menge entionisiertem Wasser verdünnt wird; ebenso werden, falls der Proben-pH nicht unter 8,5 auf Zugabe der 0,5 N HCl in obiger Stufe 3 abfällt, die 0,5 N NaOH in Stufe 2 mit einer kleinen Menge entionisiertem Wasser verdünnt. Wenn die Verdünnung notwendig ist, ist die maximal erlaubte Verdünnung so bemessen, dass die entstandene Lösung 0,52 bis 0,48 N beträgt.
Berechnung: Der Veresterungsgrad wird gemäß der folgenden Formel berechnet: Vt = V1 + (V2 – B1)
Blockigkeitsgrad (DB): Der Blockigkeitsgrad stellt ein Maß der Verteilung der Säuregruppen entlang des Pectinmoleküls dar. Blockigkeit betrifft die Eigenschaft von Säuregruppen in Blöcken zusammengemengt zu sein, im Gegensatz zu einer relativ statistischen Verteilung entlang des Polymers. Sind die Säuregruppen statistisch verteilt, sind deren individuelle negative Ladungen relativ schwach, und es stünde zu erwarten, dass sie nur einen geringen Effekt auf entweder eine Stabilisierung von Proteinen oder eine Viskositätssteigerung ausüben. Treten die Säuregruppen allerdings in Block-weiser Art auf, sind die mit den Blöcken zusammenhängenden negativen Ladungen relativ groß, und das Stabilisier- und Viskosifiziervermögen des Pectins werden erhöht. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist %DB als die Menge nicht-methylierter Galacturonsäuremoleküle (Mono-, Di- und Trimer) ausgedrückt, die durch Behandlung mit Endopolygalacturonase (PG, EC 3.2.1.15) als Prozentsatz der Gesamtzahl nicht-veresterter Galacturonsäuremoleküle pro g Pectin freigesetzt wird. Die Pectine der vorliegenden Erfindung weisen einen %DB auf, der ca. 10 bis ca. 30 beträgt. Wie beim %DE, wird bei Erzeugung des Pectins der vorliegenden Erfindung durch Behandlung eines Pectinausgangsmaterials mit Enzym der %DB des Ausgangsmaterials im Wesentlichen im Produkt beibehalten.
Prinzip und Berechnung: Von Polygalacturonase ist bekannt, dass sie das Pectinpolymer durch hydrolytische Spaltung der Galacturon-Kette aufspaltet. Sie greift nur nicht-methylierte Galacturonsäurereste an, was bedeutet, dass die Freisetzung von Mono-, Di- und Triglacturonsäure aus einem Pectinpolymer von (a) der Menge vorhandener nicht-methylierter Galacturonsäurereste und (b) der intramolekularen Verteilung der nicht-methylierten Galacturonsäurereste abhängt. Je größer die Menge der nicht-methylierten Galacturonsäurereste, die im Pectin vorhanden sind, ist, um so größer ist die Menge des Mono-, Di- und Trimers, die aus dem Pectinpolymer durch Inkubation mit PG freigesetzt wird, falls die intramolekulare Verteilung der nicht-methylierten Galacturonsäurereste konstant gehalten wird. Je vermengter oder blockiger die nicht-methylierten Galacturonsäurereste sind, um so größer ist die Menge des Mono-, Di- und Trimers, die aus dem Pectinpolymer durch Inkubation mit PG freigesetzt wird, falls die Menge nicht-methylierter Galacturonsäurereste konstant gehalten wird.
Für ein Pectin mit gegebenem %DE wurde die Blockigkeit als %DB durch quantitative Bestimmung der nicht-veresterten Mono-, Di- und Trimeren von Galacturonsäure ermittelt, die nach Behandlung mit PG freigesetzt wurde. Die quantitative Bestimmung wurde durch Hochleistungs-Anionaustauschchromatografie (HPAEC) durchgeführt, wie beschrieben von P. J. H. Daas et al., Anal. Biochem., 257 (2) S. 195–202 (1988), welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
Polygalacturonase-Zubereitung: Die hier verwendete Polygalacturonase-Zubereitung PG-1 wurde aus A. niger abgeleitet. Während die hier verwendete PG-1 durch Klonen im Zusammenhang mit dem EU-geförderten Projekt "AIR2-CT941345" erzeugt wurde, kommt das Enzym in A. niger natürlich vor und kann aus A. niger mit herkömmlichen Enzym-Isolier- und -Reinigungsverfahrenstechniken, über die früher bereits referiert wurde, isoliert werden.
Polygalacturonase-Aktivität: Die PG-Aktivität wurde wie folgt analysiert: 260 μL Polygalacturon-Lösung (Poly-D-galacturonsäure (C₆H₈O₆)_n ca. 150 USB) wurden zu 210 μL 50 mM Natriumacetat gegeben und die Temperatur der entstandenen Lösung auf 30°C eingestellt. Als Nächstes wurden 50 μL des Enzyms zugegeben, das analysiert wird. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt. Nach 0, 1, 2, 3, 4 bzw. 5 min wurde eine Probe von 50 μL entnommen. Die Reaktion wurde sofort durch Pipettieren der Probe in 1 mL Na₂CO₃ (26,5 g/L) gestoppt. Nach sorgfältigem Schütteln der Probe wurden 0,5 mL Neucoproinlösung (400 mg, Neucoproin-Hydrochlorid CR, C₁₄H₁₃ClN₂J + 200 mg CuSO₄ × 5H₂O in 1 L Ion-Austauschwasser) zugegeben. Die Probe wurde bei 65°C 15 min inkubiert und bei Raumtemperatur 15 min lang stehen gelassen. Die Zubereitung wurde dann in eine Küvette gegeben, und es wurde die Absorption bei 460 nm gegen eine bei 0 min entnommene Probe gemessen. Zur Bestimmung der Menge (μmol) reduzierender Endgruppen wurde eine Standardkurve von einer Lösung von D-Galacturonsäure (8,57 mg/mL) erstellt. Anteilsmengen von 0, 15, 30, 45 und 60 μL der Galacturonsäurelösung wurden mit 50 mM Natriumacetat auf 1 mL verdünnt. Dann wurden 50 μL jeder Probe, wie oben beschrieben, ausgehend von "Die Reaktion wurde gestoppt ...", behandelt. Eine Standardkurve wurde durch Auftragen der μmol Galacturonsäure gegen die bei 460 nm gemessene Absorption erstellt. Die Aktivität wurde ausgedrückt als 1 U (Einheit) = μmol erzeugte reduzierende Endgruppen × min–1/mL
Behandlung mit PG vor der Chromatografie-Analyse: Eine Menge von 250 mg des zu analysierenden Pectins wurde mit 40 μL Ethanol befeuchtet und in 50 mL Ion-Austauschwasser bei 70°C unter Rühren auf einem Magnetrührer aufgelöst. Die Pectinprobe wurde auf 40°C abgekühlt, und der pH-Wert wurde auf 4,2 eingestellt. Als Nächstes wurden 1,5 mL der Pectin-Zubereitung zu 3,5 Einheiten PG-1 gegeben. Die Probe wurde bei 40°C 30 min lang unter konstanter Vermischung inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 70 μL HNO₃ gestoppt, worauf 10 min lang auf 80°C erhitzt wurde.
Chromatografie-Analyse: Die nach PG-Behandlung erhaltenen Pectin-Abbauprodukte wurden, wie von P. J. H. Daas et al. beschrieben, analysiert, wobei geringfügige Modifikationen, die unten beschrieben sind, vorgenommen wurden.
Ein Dionex (Sunnyvale, CA, USA) DX-500-Hochleistungs-Flüssigchromatgrafie (HPLC)-System mit quaternärer GP40-Gradientpumpe, einem A53500-Autosampler mit einem Eluensentgas(He)-Modul wurde angewandt. Der Nachweis wurde mit einem Natriumhydroxid-Nachsäule-Abgabesystem und einem elektrochemischen Dionex ED40-Detektor mit amperometrischer Zelle durchgeführt. Der Detektor arbeitete im gepulsten amperometrischen Nachweis- (pulsed amperometric detection = PAD-) Modus und war mit einer Gold-Arbeitselektrode und einer Ag/AgCl-Bezugselektrode ausgerüstet. Das Nachsäule-Abgabesystem bestand aus einer DQP-1-Pumpe, einem Pulsdämpfersystem und einer Überwachungssäule (GM-3). Der Auslauf war an den Chromatografiesäulenauslauf mit einem T-Verbindungsstück angeschlossen und wurde in einer 1500 μL Mischspule vermischt. Nach Vermischen des Eluats mit Natriumhydroxid (2,5 M) trat die Probe in den PRD-Detektor ein. Chromatogramme wurden mit der Dionex Peak Net-Software Version 4.11 aufgenommen. Oligomere wurden an einer Dionex CarboPac PA 1-Säule mit einer CarboPac PA-1-Überwachungssäule aufgetrennt. Die Elution erfolgte mit einem Lineargradient von 0,05 bis 0,7 M Natriumacetat (pH = 5,0) 65 min lang bei 0,5 mL/min und anschließend mit einem 10 min Lineargradient von 1 M Natriumacetat und einer Waschstufe von 0,5 mL. Nach einer Äquilibrierungsstufe von 15 min mit 0,05 M Natriumacetat (pH = 5,0) wurden 80 μL Proben eingespritzt. Die Nachsäulenpumpe wurde so eingestellt, dass die endgültige Fließgeschwindigkeit in die PAD-Zelle 1,0 mL/min betrug.
Der Acetat-Puffer wurde durch Verdünnen mit Essigsäure in Wasser, Titrieren mit einer 50%igen Lösung von Natriumhydroxid auf pH = 5,0 und Einstellen des Volumens mit Wasser zubereitet, um eine Endkonzentration von 1,0 M Acetat zu ergeben. Der Gradient wurde durch Vermischen des Acetat-Puffers mit Milliporesystem-Wasser vollständig hergestellt.
Die zum amperometrischen Nachweis angewandte Dreifachpuls-Sequenz beinhaltete die folgenden Potenziale und Zeitspannen:
E₁ = 0,05 V (t₁ = 0,4 s), E₂ = 0,75 V (t₂ = 0,2 s) und E₃ = –0,15 V (t₃ = 0,4 s). Integriert wurde für 0,2 s nach einem Verzug von 0,2 s.
Zur quantitativen Bestimmung der Menge von nachgewiesenen nicht-veresterten Mono-, Di- und Trigalacturonsäuremengen mussten die PAD-Reaktionsfaktoren dieser Komponenten ermittelt werden (siehe A. T. Hotchkiss et al., Anal. Biochem. 184, 200–206 (1990)). Zuerst wurden die Peakflächen verschiedener Mengen von Di- und Trimeren (0,05 bis 2,5 μmol) erhalten und mit denjenigen identischer Mengen von Monogalacturonsäure verglichen. Die relativen Reaktionsfaktoren wurden berechnet. Während jeder Serie wurde die PAD-Reaktionsfläche einer Standardmenge von Monoglacturonsäure (0,051 μmol) bestimmt, um die genaue Berechnung der Mono-, Di- und Trigalacturonsäure-Konzentrationen in dieser Serie zu ergeben. Aus der Mono-, Di- und Trigalacturonsäuremenge wurde der Blockigkeitsgrad mit der oben für %DB angegebenen Formel berechnet.
Molekulargewicht (MG): Das (gewichtsdurchschnittliche) Molekulargewicht von Pectin kann in einen breiten Bereich fallen, der von der Quelle und dem zur Extraktion angewandten Verfahren abhängt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung weist das als Ausgangsmaterial eingesetzte Pectin im Allgemeinen ein Molekulargewicht von weniger als ca. 240.000 und vorzugsweise von ca. 100.000 bis ca. 150.000 auf. (Wenn nichts Anderes ausgesagt ist, sind die hierin genannten Molekulargewichte in Dalton angegeben.) Nach der Behandlung mit Enzym wird das Molekulargewicht des verarbeiteten Pectins natürlich niedriger als dasjenige des ausgewählten Ausgangspectins sein und beträgt im Allgemeinen ca. 40.000 bis ca. 200.000 Dalton. Es scheint, dass das Wirkvermögen des verarbeiteten Pectins unterhalb eines Molekulargewichts von ca. 40–50.000 wesentlich und im Bereich von ca. 40–50.000 bis ca. 70.000 etwas verringert, aber noch verwendbar ist. Ein bevorzugter Molekulargewichtsbereich für das Pectin der vorliegenden Erfindung beträgt ca. 70.000 bis ca. 90.000.
Pectinprobe-Zubereitung: Das Molekulargewicht von Pectin wird durch Messung der relativen Viskosität einer 0,1%igen Pectinlösung unter Verwendung von Natriumhexametaphosphat abgeschätzt. Zuerst wird eine Probe zubereitet, wie beschrieben im Abschnitt, der die Bestimmung von %DE betrifft. Eine Natriumhexametaphosphatlösung wird durch Auflösen von 20,0 g Natriumhexametaphosphat in 1800 mL Ion-ausgetauschtem, entlüfteten (zum Sieden gebrachten) Wasser, Einstellen des pH-Wertes auf 4,50 ± 0,05 mit 1 M HCl und Verdünnen auf 2000 mL mit Ion-ausgetauschtem, entlüfteten (zum Sieden gebrachten) Wasser zubereitet. Unmittelbar vor der Messung wird die notwendige Menge Hexametaphosphatlösung durch ein Glasfilter #3 filtriert. Dann werden ca. 90 g Natriumhexametaphosphatlösung in einen tarierten Becher eingewogen, zu dem ein Magnet gegeben wird.
Als Nächstes werden 0,1000 g des Säure-gewaschenen Pectins in den Becher stufenweise unter Rühren gegeben. Die Lösung wird unter Rühren auf 70°C erwärmt, und es wird weiter gerührt, bis das Pectin vollständig aufgelöst ist. Die Lösung wird dann auf 25°C abgekühlt, auf ein Gewicht von 100,0 g mit Natriumhexametaphosphatlösung gebracht und durch ein Gasfilter #3 filtriert.
Molekulargewichtsmessung: Für jede Molekulargewichtsbestimmung wird die Auslaufzeit für eine Pectin/Hexametaphosphatlösung an 2 verschiedenen Viskosimetern unter Anwendung der unten angegebenen Vorgehensweise gemessen. Das Molekulargewicht wird getrennt für jedes Viskosimeter mit der gemessenen Auslaufzeit für die Hexametaphosphatlösung auf dem entsprechenden Viskosimeter berechnet. Beträgt die Differenz zwischen den 2 berechneten Molekulargewichten weniger als 3.500, wird der Mittelwert berechnet und auf das nächste 1/1.000 abgerundet. Beträgt die Differenz zwischen den 2 berechneten Molekulargewichten 3.500 oder mehr, sollten die Viskosimeter gesäubert und eine neue Messung der Auslaufzeit für die Hexametaphosphatlösung durchgeführt werden.
Zur Messung der Auslaufzeit wird das Viskosimeter 2 Mal mit der Probe gespült. Dann werden 5,00 mL der Probe in das Viskosimeter gegossen, und das Ganze wird in ein mit einem Thermostat ausgerüstetes Wasser-Bad bei 25,0°C ± 0,3°C mindestens 15 min lang vor der Messung gegeben. Die Auslaufzeit wird an 2 Ausläufen gemessen. Beträgt die Differenz zwischen den Zeiten mehr als 0,2 s (bei Messung der Hexametaphosphatlösung) oder mehr als 0,4 s (bei Messung der Proben), werden die Messungen wiederholt, bis die Differenz weniger als den entsprechenden Wert beträgt. Die für die Molekulargewichtsbestimmung eingesetzte Auslaufzeit ist der Mittelwert der obigen identischen oder im Wesentlichen identischen Messergebnisse.
Die relative Viskosität wird wie folgt berechnet:
worin t₀ und t_h die Auslaufzeiten für eine Pectinlösung bzw. eine Hexametaphosphatlösung sind.
Der Parameter K kann mit genügender Genauigkeit bei 107 s^–2 in einem Witeg-Ostwald-Viskosimeter festgelegt werden. Ansonsten kann K wie folgt berechnet werden:
worin Q das Viskosimetervolumen in cm³, L die Kapillarrohrlänge in cm und t_v die Auslaufzeit für Wasser in s sind.
Das Molekulargewicht von Pectin wird wie folgt berechnet:
worin P bei 6 und k bei 4,7 × 10^–5 mol·g^–1 festgelegt sind; C ist der Gewichtsprozentsatz von Pectin im Probensystem. Mit den eingesetzten numerischen Werten ergibt dies: M = 1,277·106 (nt 1/6 – 1) g/mol.
Calcium-Empfindlichkeit (ΔCS): Die Calcium-Empfindlichkeit des verarbeiteten Pectins wird durch die vorliegende Erfindung wesentlich verringert, was im Hinblick auf die Tatsache besonders überraschend ist, dass der DB im Wesentlichen konstant bleibt. Wie weiter unten noch genauer erläutert, stellt die Calcium-Empfindlichkeit die Viskositätsdifferenz zwischen einer Bezugslösung, die Pectin ohne Calcium enthält, und einer Lösung dar, die Pectin mit Calcium enthält, weshalb diese Differenz als ΔCS dargestellt werden kann. Das Pectin der vorliegenden Erfindung weist eine ΔCS von weniger als ca. 100 und vorzugsweise von weniger als ca. 20, wie von ca. 5 bis ca. 10, und vorzugsweise von ca. 0 auf. Die ΔCS des Ausgangsmaterials kann einen Wert von über ca. 20 und einen sehr hohen Wert aufweisen, wie von größer als ca. 300 oder sogar größer als ca. 500.
Die Calcium-Empfindlichkeit des Pectins wird in einer Lösung von 0,5% Pectin, vorzugsweise aus reinem Pectin, gemessen. Das Calciumsalz und das Pectin werden bei niedrigem pH-Wert vermischt, um ein zu starkes Absetzen der Calciumionen und des Pectins zu vermeiden. Die Reaktion zwischen dem Pectin und den Calciumionen wird dann durch die Zugabe eines Natriumacetat/Essigsäure-Puffers gestartet. Die Viskosität der Calcium-haltigen Pectinlösung wird mit der Viskosität der gleichen Lösung ohne das Calcium verglichen, und die Differenz der Viskosität ist die Calcium-Empfindlichkeit oder ΔCS, gemessen in Centipoise.
In spezifischerer Weise wird eine Lösung von 400 g mit 2,4 g Pectin hergestellt (d.h. eine 0,6%ige Lösung). Falls reines Pectin nicht verwendet wird, sollte die Lösung um eine Pectinmenge korrigiert werden, die gemäß der Formel berechnet wird:
worin A der Pectin-Prozentsatz der Probe ist.
Die Pectinmenge, die eingesetzt wird (2,4 g bei reinem Pectin, andernfalls wie oben berechnet), wird mit einer Genauigkeit von 3 Dezimalstellen eingewogen. Das Pectin wird in 250 mL siedendem entionisierten Wasser in einem Hoch-Scher-Mischer (Waring Blender Model 34BL99, Waring Product Division Dynamic Corporation of America, New Hartford, Connecticut) bei hoher Geschwindigkeit ca. 4 min lang dispergiert. (Alles hierbei verwendete entionisierte Wasser ist Ion-Austauschwasser mit einer Leitfähigkeit unterhalb 1,0 μS/cm.) Die gescherte Pectinlösung wird in einen tarierten Becher gegossen, und es wird ein Magnet zur Vermischung auf einem JK IKA-Combimag REO-Magnetrührer (Janke & Kunkel (IKA), Staufen, Deutschland) zugegeben. Der Hoch-Scher-Mischer wird mit zusätzlichen 100 mL entionisiertem Wasser gespült, das zur Pectinlösung im Becher gegeben wird. Die Lösung wird bei 25°C ± 1° gekühlt und dann auf einen pH-Wert von 1,5 mit 1 M Salzsäure unter Vermischung eingestellt. Zusätzliches DI-Wasser wird zur Gewichtserhöhung der Lösung auf 400 g zugegeben, und es werden 145 g ± 1 g Pectinlösung in jedes von 2 50 × 100 mm Viskositätsgläsern (Holm & Halby) eingewogen. Ein Magnet wird in jedes Viskositätsglas gegeben. Eines der Viskositätsgläser erhält dann 5 mL entionisiertes Wasser, während das andere Viskositätsglas 5 mL 250 mM Ca⁺⁺-Lösung (36,7550 g/L CaCl₂ × 2H₂O) erhält, wobei beide Gläser auf einem IKA MAG EOA 9 Magnetplattenrührer bei Stufe 1 gerührt werden. Als Nächstes werden 25 mL 1 M Acetat-Puffer (68,04 g/L 500 mM CH₃COONa × 3H₂O und 28,6 mL/L 500 mM CH₃COOH, 100%ig) in jedes Viskositätsglas unter kräftigem Rühren auf einem IKA MAG RET-Magnetrührer gegeben. Es wird bei Stufe 1 2 min lang weiter gerührt, worauf die Magneten herausgenommen und die Lösungen mit einem Parafilm^®-Film abgedeckt und bei 25°C über Nacht stehen gelassen werden. Die Viskosität wird dann mit einem Brookfield LVT-Viskosimeter bei 60 U/min noch immer bei 25°C in einem thermostatisch geregelten Wasser-Bad gemessen. Die Differenz zwischen den Viskositäten der 2 Lösungen in Centipoise ist die Calcium-Empfindlichkeit oder ΔCS des einschlägigen Pectins.
Die Pectine der vorliegenden Erfindung können durch Behandlung eines Ausgangspectins, wie dieses hierin weiter beschrieben ist, mit Pectin-Lyase unter Bedingungen erzeugt werden, die hinreichen, um ein Pectin mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Das Verfahren zur Herstellung der Pectine der vorliegenden Erfindung beeinflusst den Blockigkeitsgrad oder Veresterungsgrad der Ausgangsmaterialien nicht signifikant. Weil der DB sich darauf bezieht, wie konzentriert die Säuregruppen entlang des Pectin-Rückgrats sind, und sich die Konzentration der Säuregruppen im Allgemeinen auf die Calcium-Empfindlichkeit bezieht, ist es ziemlich überraschend, dass die Calcium-Empfindlichkeit ohne Änderung beim DB abgesenkt werden kann.
Weder die besondere Pectin-Lyase, die zur Behandlung verwendet wird, noch die Quelle des als Ausgangsmaterial eingesetzten Pectins scheinen kritisch zu sein und können als Routinemaßnahme einer Verfahrensoptimierung ausgewählt oder eingestellt werden. Pectin-Lyasen sind gut bekannt, und während weitere Quellen verfügbar sind, werden sie gewöhnlich aus Aspergillus niger erhalten, worin mehrere Varianten vorkommen; siehe z.B. F. E. A. Van Houdenhoven, "Studies on Pectin Lyase", Doktorarbeit, Wageningen Agricultural University, Niederlande, 17 (1975); und M. A. Kusters-Van Someren, "Characterization of an Aspergillus niger Pectin Lyase Gene Family", Doktorarbeit, State University Utrecht, Niederlande (1991), deren Offenbarungsinhalte durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden. Das Vorliegen von Kontaminanten und besonders biologisch aktiver Kontaminanten in der Lyase-Zubereitung führt von der Durchführung des Verfahrens in der Praxis und den Erhalt der Pectine der vorliegenden Erfindung weg, und deshalb sollten nur Lyase-Zubereitungen verwendet werden, die in im Wesentlichen reiner Form erhalten werden oder auf eine wesentliche Homogenität gereinigt sind.
Wie bereits vorher ausgesagt, liegt Pectin in einem breiten Bereich pflanzlicher Quellen vor oder kann daraus extrahiert werden. Diese schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, relativ übliche kommerzielle Quellen wie Zitrone, Zitrus, Orange, Traube, Apfel und Zuckerrübe ein.
Beispiele
Enzyme: 4 unterschiedliche Enzym-Zubereitungen, enthaltend Pectin-Lyase (PL, E. C. 4.2.2.10) wurden verwendet. Zubereitung A war Pectin-Lyase A (PL A), abgeleitet aus Aspergillus niger, und Zubereitung B war Pectin-Lyase D (PL D), ebenfalls abgeleitet aus A. niger. Während die Proben von PL A und PL D, die in den folgenden Beispielen eingesetzt wurden, durch Klonen im Zusammenhang mit dem EU-geförderten Projekt "AIR2-CT941345" erzeugt wurden, kommen diese Enzyme auch in A. niger natürlich vor und können aus A. niger mit herkömmlichen Enzym-Isolierungs- und -Reinigungsverfahren wie den von Van Houdenhoven beschriebenen isoliert werden. Das Enzym sollte auf eine wesentliche Homogenität gereinigt werden, um die Aktivität zu maximieren und Kontamination und/oder unerwünschte Nebenreaktionen zu vermeiden, die aus unreinen Zubereitungen resultieren können.
Zubereitung C war eine handelsübliche fungale Enzym-Zubereitung, erhältlich als "Pectinase 444 L" von Biocatalysts, United Kingdom, während Zubereitung D eine handelsübliche Enzym-Zubereitung war, erhältlich als "Rohapect PTE", hergestellt aus genetisch modifizierten Organismen (Aspergillus species) von Röhm, Deutschland.
Enzym-Aktivität: Die Enzym-Zubereitungen A bis D wurden alle bezüglich der PL-Aktivität getestet. PL katalysiert den nicht-hydrolytischen Zusammenbruch von Pectin durch eine trans-eliminative Spaltung des Polymerrückgrats an C-4 und eliminiert gleichzeitig H von C-5, wodurch eine Doppelbindung zwischen C-4 und C-5 erzeugt wird, was einen Anstieg der Absorption bei 235 nm verursacht. Die Pectin-Lyase-Aktivität wurde demzufolge spektrofotometrisch bei 30°C durch Messung des Anstiegs der optischen Dichte bei 235 nm analysiert. Die Assaymischung enthielt 1,4 mL McIlvaine-Puffer (36,85 mM Zitronensäure, 126,3 mM NaH₂PO₄, pH, eingestellt auf 5,5 mit 0,5 N NaOH), 0,4 mL 0,0625%iges Pectin (B-rapid set mit einem DE von 72%, Copenhagen Pectin A/S, Dänemark) und 0,2 mL Enzym. Die Aktivität wurde mit dem molaren Extinktionskoeffizient Σ₂₃₅ = 5.500 berechnet. 1 Aktivitätseinheit (1 U) wurde als diejenige Enzymmenge bestimmt, die 1 μmol ungesättigtes Produkt/min erzeugt.
Beziehen sich die hierin beschriebenen Verfahren auf eine "geeignete Menge" von Pectin-Lyse (oder auf entsprechende Worte im Hinblick auf diesen Ausdruck) bedeutet dies diejenige Menge, die berechnet ist, bezogen auf das Ziel-Molekulargewicht des Lyase-behandelten Pectins und auf die spezifische Aktivität der zur Anwendung gelangen Lyase. Die Enzymmenge, die verwendet wird, ist durch die Gleichung e^(y-a/b) = x gegeben, worin y die Verringerung des Molekulargewichts (und somit ΔMG) und x die Enzymmenge (in Einheiten) pro 500 g Pectin sind. Zur Anwendung dieser Gleichung wird die Verfahrenszeit zur Enzym-Reaktion als 1 h genommen; a und b sind Enzym-spezifische Konstanten, die nach Durchlauf mehrerer Versuche mit dem entsprechenden Enzym bestimmt werden.
Enzymatische Behandlung: 3 unterschiedliche Ausgangsmaterialien wurden einer enzymatischen Behandlung von Pectin mit PL enthaltenden Zubereitungen unterzogen: Saft, abgeleitet aus getrockneter Schale durch HM-Extraktion, Saft, behandelt mit Pflanzen-Methylesterase (PME), und getrocknetes Pectinpulver.
Saft aus getrockneter Schale durch HM-Extraktion: Getrocknete Zitronenschale in einer Menge von 600 kg wurde in 1.700 L Ion-Austauschwasser gegeben. Die Zubereitung wurde auf 70°C erwärmt und 2 h lang gerührt; dann wurden 98 L 62%ige HNO₃ zugegeben, und die Extraktion wurde 1 h lang durchgeführt. Als Nächstes wurden 100 kg Papierpulpe zum extrahierten Material gegeben, um die Filtration zu erleichtern. Die Zubereitung wurde unter Vakuum mit Diatomeenerde filtriert ("blank filtriert"). Der filtrierte Saft wurde einem Ionenaustausch an einem starken Kation-Austauscher (IRC 120, Bayer Corporation) unterzogen, auf ca. 50% des Ursprungsvolumen auf eine Pectin-Konzentration von ca. 3 bis ca. 5% Gewicht/Gewicht, Trockengewichtsbasis, eingedampft und auf Raumtemperatur abgekühlt. Der pH-Wert wurde auf 5,5 durch Zugabe von NH₃ (2%ige Lösung, verdünnt mit DI-Wasser, ausgehend von 25%igem NH₃) eingestellt, und es wurde eine geeignete Menge PL zugegeben.
Die Enzymreaktion wurde durchgeführt, bis das gewünschte Molekulargewicht erreicht war. Um die Reaktion zu stoppen, wurde der pH-Wert auf 2,5 durch Zugabe von verdünnter (10% V/V) HNO₃ herabgesetzt, und die Temperatur wurde von Raumtemperatur auf 80°C in 10 min mit einem Heizmantel angehoben. Das Pectin wurde auf ein Verhältnis von 1:3 in 80%igem 2-Propanol ausgefällt. Das ausgefällte Pectin wurde abgepresst und in 60%igem 2-Propanol gewaschen. Nach dem Abpressen wurde das Pectin bei 70°C 16–20 h lang getrocknet. Die getrocknete Probe wurde gemahlen und durch ein 0,25 mm-Testsieb gesiebt.
Saft, behandelt mit PME: Getrocknete Zitronenschale in einer Menge von 1.300 kg wurde in 25.500 L Ion-Austauschwasser und 126 L 62%ige HNO₃ gegeben. Die Extraktion wurde 7 h lang durchgeführt. Papierpulpe (100 kg) wurde zum extrahierten Material gegeben, um die Filtration zu erleichtern. Die Zubereitung wurde im Vakuum filtriert, worauf eine Blank-Filtration durchgeführt wurde. Der filtrierte Saft wurde einem Ionenaustausch an dem starken Kation-Austauscher (IRC 120) unterzogen, auf ca. 50% des Ursprungsvolumens auf eine Pectin-Konzentration von ca. 3 bis ca. 5% Gew./Gew., Trockengewichtsbasis, eingedampft und auf 45°C abgekühlt, worauf der pH-Wert auf 5,5 durch Zugabe von 2%igem NH₃ eingestellt wurde.
Eine geeignete Menge Pflanzen-PME wurde zugegeben, worauf die Reaktion durchgeführt wurde, bis der gewünschte Veresterungsgrad erreicht war. Der gewünschte Veresterungsgrad wird durch die Beziehung y = 1,6x bestimmt, worin y die %DE-Änderung (und somit Δ%DE) und x g NH₃/kg Pectin sind. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch automatische Titration mit 2%igem NH₃ konstant gehalten. Die PME wurde durch Zugabe von HNO₃ auf einen pH-Wert von 2,5 und durch Erhitzen auf 80°C über 10 min inaktiviert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde der pH-Wert auf 5,5 mit einer 2% V/V-Lösung von NH₃ eingestellt, und es wurde eine geeignete Menge PL zugegeben. Man ließ die enzymatische Reaktion ablaufen, bis das gewünschte Molekulargewicht erreicht war. Um die Reaktion zu stoppen, wurden der pH-Wert auf 2,5 durch Zugabe von verdünnter HNO₃ herabgesetzt und die Temperatur auf 80°C in 10 min angehoben. Das Pectin wurde in 80%igem 2-Propanol in einem 1:3-Verhältnis von Pectin zu Propanol ausgefällt. Das ausgefällte Pectin wurde dann abgepresst und in 60%igem 2-Propanol gewaschen. Nach Abpressen wurde das Pectin bei 70°C 16 bis 20 h lang getrocknet. Die getrocknete Probe wurde gemahlen und durch ein 0,25 mm-Testsieb gesiebt.
Getrocknetes Pectinpulver: Pectin in einer Menge von 500 g wurde in 10 L Ion-Austauschwasser bei 70°C unter kräftigem Rühren aufgelöst. Die Pectinlösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf der pH-Wert auf 5,50 durch Zugabe von 2%igem NH₃ eingestellt wurde. Eine geeignete Menge PL wurde zugegeben, und man ließ die Enzym-Reaktion ablaufen, bis das gewünschte Molekulargewicht erreicht war. Um die Reaktion zu stoppen, wurden der pH-Wert auf 2,5 durch Zugabe von verdünnter HNO₃ abgesenkt und die Temperatur auf 80°C in 10 min angehoben. Das Pectin wurde in 80%igem 2-Propanol (1:3) ausgefällt. Das ausgefällte Pectin wurde abgepresst und in 60%igem 2-Propanol gewaschen. Nach Abpressen wurde das Pectin bei 70°C 16 bis 20 h lang getrocknet. Die getrocknete Probe wurde gemahlen und durch ein 0,25 mm-Testsieb gesiebt. Die Ergebnisse sind im Folgenden angegeben:
Beispiel 1 – PL D
Beispiel 2 – PL A
Beispiel 3 – 444 L
Beispiel 4 – PTE
Während diese Ergebnisse durch Anwendung einer enzymatischen Behandlung erhalten wurden, sind vergleichbare Ergebnisse mit einer chemischen Behandlung erhältlich, vorausgesetzt, dass durch die Behandlung der %DE und der %DB des Ausgangspectins nicht verändert werden. Insbesondere kann eine chemische Behandlung, die eine Spaltung der 1,4-glycosidischen Bindung über β-Eliminierung verursacht, angewandt werden, um Pectine mit Eigenschaften zu erzeugen, die vergleichbar mit dem Pectin sind, das durch die oben gekennzeichnete enzymatische Behandlung erzeugt wurde. Beispielsweise sollte eine Behandlung der Pectinlösung mit einem alkalischen Reagens, wie mit NaOH, wobei der pH-Wert der Lösung auf über 7 angehoben wird, ähnliche Ergebnisse liefern.
Die vorliegende Erfindung ist aus Gründen der Notwendigkeit hierin unter Bezug auf bestimmte spezifische Verfahren und Materialien diskutiert worden. Die Aufzählung dieser Verfahren und Materialien erfolgte lediglich zur Erläuterung und stellt in keiner Weise eine Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung dar. Es ist zu erwarten, dass die Fachleute Variationen der oder Alternativen zu den spezifischen technischen Lehren, die hierin vermittelt werden, erkennen und in die Praxis überführen, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Pectins; das Verfahren umfasst den Schritt der Behandlung eines Ausgangspectins mit einem Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10%, einem Veresterungsgrad von mindestens 55% und einem ΔCS (Calciumempfindlichkeit) von mehr als 0 cP mit einer Pectinlyase unter Bedingungen, die zur Erzeugung eines verarbeiteten Pectins mit einem ΔCS, das niedriger ist als das ΔCS des Ausgangspectins, ausreichend sind.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Ausgangspectin einen Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 20% aufweist.
Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Ausgangspectin einen Blockhaftigkeitsgrad von nicht mehr als 30% aufweist.
Verfahren gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Ausgangspectin einen Veresterungsgrad von mindestens 55% besitzt.
Verfahren gemäss Anspruch 4, worin das Ausgangspectin einen Veresterungsgrad zwischen 55 und 80% besitzt.
Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, worin das Ausgangsmaterial ein ΔCS von mindestens 20 aufweist.
Verfahren gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das verarbeitete Pectin ein ΔCS von nicht mehr als 20 cP aufweist.
Verfahren gemäss Anspruch 7, worin das verarbeitete Pectin ein ΔCS zwischen 0 und 20 cP aufweist.
Verfahren gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Ausgangspectin ein Molekulargewicht von nicht mehr als 240.000 besitzt.
Pectin, das nach einem Verfahren gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 erhältlich ist.
Pectin gemäss Anspruch 10, das einen Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10%, einen Veresterungsgrad von mindestens 55% und ein ΔCS von nicht mehr als 100 cP aufweist.
Pectin gemäss Anspruch 11, das ein ΔCS von nicht mehr als 30 cP aufweist.
Pectin gemäss Anspruch 12, das ein ΔCS zwischen 0 und 20 cP aufweist.
Pectin gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 13, das einen Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 20 besitzt.
Pectin gemäss Anspruch 14, das einen Blockhaftigkeitsgrad von nicht mehr als 30% aufweist.
Pectin gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 15, das einen Veresterungsgrad von mindestens 60% besitzt.
Pectin gemäss Anspruch 16, das einen Veresterungsgrad von bis zu 80% besitzt.
Pectin gemäss Anspruch 17, das einen Veresterungsgrad zwischen 60 und 72% besitzt.
Pectin gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 18, das ein Molekulargewicht von mindestens 40.000 besitzt.
Pectin gemäss Anspruch 19, das ein Molekulargewicht zwischen 50.000 und 200.000 besitzt.
Pectin gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 20, das einen Blockhaftigkeitsgrad zwischen 10 und 15, einen Veresterungsgrad zwischen 70 und 75 und ein ΔCS von nicht mehr als 18 aufweist.
Pectin gemäss Anspruch 21, das ein ΔCS von nicht mehr als 14 aufweist.
Verfahren zur Herstellung von Pectin, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Behandeln eines Pectins mit einem Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10%, einem Veresterungsgrad von mindestens 70% und einem ΔCS von mehr als 0 cP mit Pflanzenpectinmethylesterase unter Bedingungen, die zur Erzeugung eines entesterten Pectins mit einem Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10%, einem Veresterungsgrad von mindestens 55% und einem ΔCS von mehr als 0 ausreichend sind; und (b) Behandeln des entesterten Produkts mit einer Pectinlyase unter Bedingungen, die zur Erzeugung eines Pectins mit einem Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10% und einem ΔCS von nicht mehr als 20 cP ausreichend sind.
Pectin, das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 23 erhältlich ist.
Nahrungsmittelzusammensetzung, die ein Pectin gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 22 und 24 mit einem Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10%, einem Veresterungsgrad von mindestens 55% und einem ΔCS von nicht mehr als 100 cP umfasst.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss Anspruch 25, die ferner Casein umfasst.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss Anspruch 26, worin die Nahrungsmittelzusammensetzung ein Getränk ist.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss Anspruch 27, worin das Getränk ein angesäuertes Milchgetränk ist.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss mindestens einem der Ansprüche 25 bis 28, worin das Pectin ein ΔCS von nicht mehr als 20 cP aufweist.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss mindestens einem der Ansprüche 25 bis 29, worin das Pectin einen Blockhaftigkeitsgrad zwischen 15 und 25% aufweist.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss mindestens einem der Ansprüche 25 bis 30, worin das Pectin einen Veresterungsgrad zwischen 60 und 72% aufweist.
Nahrungsmittelzusammensetzung gemäss mindestens einem der Ansprüche 25 bis 30, worin das Pectin ein Molekulargewicht zwischen 70.000 und 90.000 aufweist.
Verwendung eines Pectins gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 22 und 24 mit einem Blockhaftigkeitsgrad von mindestens 10%, einem Veresterungsgrad von mindestens 55% und einem ΔCS von nicht mehr als 100 cP zur Erhöhung der Lagerungsstabilität einer Nahrungsmittelzusammensetzung.