DE69832060T2

DE69832060T2 - Zusammensetzung, welche pektinmethylesterase und zwei substrate beinhaltet

Info

Publication number: DE69832060T2
Application number: DE69832060T
Authority: DE
Inventors: Dina Jette KREIBERG; Martel Tove CHRISTENSEN; Susanne Hyttel
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2018-04-25
Also published as: EP0977495A1; US20020015758A1; CN1260687A; GB2339135A; GB9924715D0; DE69832060D1; CA2286479A1; JP2001519653A; DK0977495T3; US6368642B2; NZ500031A; GB2339135B; ATE307494T1; AU6932498A; GB9708278D0; WO1998047391A1; CN1126460C; EP0977495B1; BR9808974A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung als ein Nahrungsmittel oder bei der Herstellung eines Nahrungsmittels. Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung als ein Nahrungsmittel oder bei der Herstellung eines Nahrungsmittels, welches Pektin oder ein Pektinderivat enthält oder daraus hergestellt ist.
Pektin ist in der heutigen Industrie eine wichtige Konsumware. Beispielsweise kann es in der Nahrungsmittelindustrie als Verdickungs- oder Geliermittel eingesetzt werden, wie beispielsweise bei der Herstellung von Konfitüren.
Pektin ist ein strukturelles Polysaccharid, welches für gewöhnlich in der Form von Protopektin in den Zellwänden von Pflanzen zu finden ist. Das Rückgrat von Pektin umfaßt α-1–4-verknüpfte Galacturonsäurereste, die durch eine kleine Anzahl an 1,2-verknüpften α-L-Rhamnoseeinheiten unterbrochen sind. Zusätzlich umfaßt Pektin stark verzweigte Bereiche mit einer sich fast abwechselnden Rhamno-Galacturon-Kette. Diese stark verzweigten Bereiche enthalten auch andere Zuckereinheiten (wie D-Galactose, L-Arabinose und Xylose), die durch glycosidische Bindungen an das C3- oder das C4-Atom der Rhamnoseeinheiten oder das C2- oder das C3-Atom der Galacturonsäureeinheiten gebunden sind. Die langen Ketten der α-1–4-verknüpften Galacturonsäurereste werden im allgemeinen als "glatte" Bereiche bezeichnet, wohingegen die stark verzweigten Bereiche im allgemeinen als "haarige Bereiche" bezeichnet werden.
Einige der Carboxylgruppen der Galacturonsäurereste sind verestert (z.B. sind die Carboxylgruppen methyliert). Typischerweise findet die Veresterung der Carboxylgruppen nach der Polymerisation der Galacturonsäurereste statt. Es ist jedoch überaus selten, daß alle Carboxylgruppen verestert (z.B. methyliert) sind. Normalerweise variiert der Grad der Veresterung von 0–90%. Wenn 50% oder mehr der Carboxylgruppen verestert sind, wird das resultierende Pektin als ein "hochverestertes Pektin" (kurz "HE-Pektin") oder als "Pektin mit hohem Methoxylgehalt" bezeichnet. Wenn weniger als 50% der Carboxylgruppen verestert sind, wird das resultierende Pektin als ein "niederverestertes Pektin" (kurz "LE-Pektin") oder als "Pektin mit geringem Methoxylgehalt" bezeichnet. Wenn 50% der Carboxylgruppen verestert sind, wird das resultierende Pektin als "mittelverestertes Pektin" (kurz "ME-Pektin") oder "Pektin mit mittlerem Methoxylgehalt" bezeichnet. Wenn das Pektin keine – oder nur wenige – veresterte Gruppen enthält, wird es üblicherweise als Pektinsäure bezeichnet.
Die Struktur des Pektins, insbesondere der Grad der Veresterung (z.B. Methylierung), gibt viele der resultierenden physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften des Pektins vor. Beispielsweise hängt die Gelierung von Pektin von der chemischen Beschaffenheit des Pektins, insbesondere vom Grad der Veresterung, ab. Darüber hinaus hängt die Gelierung von Pektin auch von dem Gehalt an löslichen Feststoffen, dem pH-Wert und der Calciumionenkonzentration ab. Bezüglich letzterer wird angenommen, daß die Calciumionen mit freien Carboxylgruppen, insbesondere denjenigen in einem LE-Pektin, Komplexe bilden.
Pektinenzyme werden danach klassifiziert, wie sie den Galacturonteil des Pektinmoleküls angreifen. Eine Übersicht über einige Pektinenzyme wurde von Pilnik und Voragen (Food Enzymology, Hrsg.: P.F. Fox; Elsevier; (1991); S. 303–337) zusammengestellt. Insbesondere entestern Pektinmethylesterasen (EC 3.1.1.11), ansonsten auch als PME bezeichnet, HE-Pektine zu LE-Pektinen oder Pektinsäuren. Im Gegensatz dazu und beispielhaft spalten Pektindepolymerasen die glycosidischen Bindungen zwischen Galacturonosylmethylesterresten.
Genauer gesagt erzeugt die PME-Aktivität freie Carboxylgruppen und freien Methanol. Die Zunahme der freien Carboxylgruppen kann mittels automatischer Titration leicht überwacht werden. In dieser Hinsicht haben frühere Studien gezeigt, daß einige PME Pektine in zufälliger Weise entestern, und zwar in dem Sinne, daß sie irgendwelche der veresterten (z.B. methylierten) Galacturonsäurereste auf einer oder mehr als einer der Pektinketten entestern. Beispiele von PME, die in zufälliger Weise Pektine entestern, können aus Pilzquellen, wie Aspergillus aculeatus (siehe WO 94/25575) und Aspergillus japonicus (Ishii et al. 1980 J Food Sci 44 S. 611–14), erhalten werden. Baron et al. (1980 Lebensm. Wiss. M-Technol. 13 S. 330–333) haben scheinbar eine Pilz-PME aus Aspergillus niger isoliert. Es wurde berichtet, daß diese Pilz-PME ein Molekulargewicht von 39000 D, einen isoelektrischen Punkt von 3,9, einen optimalen pH-Wert von 4,5 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 3 hat.
Im Gegensatz dazu ist von einigen PME bekannt, daß sie Pektine blockweise entestern, und zwar wird angenommen, daß sie Pektine entweder an nicht reduzierenden Enden oder in der Nähe von freien Carboxylgruppen angreifen und dann mittels eines Einzelkettenmechanismus entlang der Pektinmoleküle fortfahren, wodurch sie Blöcke von nicht veresterten Galacturonsäureeinheiten erzeugen, die calciumempfindlich sein können. Beispiele solcher Enzyme, die Pektin blockweise enzymatisch entestern, sind Pflanzen-PME. Es wurde vorgeschlagen, daß bis zu 12 Isoformen von PME in Zitrusfrüchten existieren (Pilnik W. und Voragen A.G.J. (Food Enzymology (Hrsg.: P.F. Fox); Elsevier; (1991)); S. 303–337). Diese Isoformen haben verschiedene Eigenschaften.
Die zufällige oder blockweise Verteilung freier Carboxylgruppen kann mittels Hochleistungs-Ionenaustauschchromatographie (Schols et al Food Hydrocolloids 1989 6 S. 115–121) unterschieden werden. Diese Tests werden oft verwendet, um Säfte aus Zitrusfrüchten nach der Pasteurisierung auf unerwünschte Aktivität von PME-Resten zu untersuchen, da PME-Reste neben einer Ansammlung von Methanol in Orangensaft auch einen sogenannten "Trübungsverlust" hervorrufen können.
PME-Substrate, wie aus natürlichen Pflanzenquellen erhaltene Pektine, liegen allgemein in der Form eines hochveresterten Pektins mit einem DE von etwa 70% vor. Zu diese hochveresterten PME-Substrate enthaltenden Extrakten muß Zucker zugegeben werden, um eine ausreichende Menge an löslichen Feststoffen bereitzustellen, um eine Gelierung zu bewirken. Üblicherweise werden mindestens 55% an löslichen Feststoffen benötigt. Es kommt häufiger zum Auftreten von Synärese, wenn der Prozentsatz an löslichen Feststoffen weniger als 55% beträgt. Wenn Synärese auftritt, müssen teure Additive verwendet werden, um eine Gelierung herbeizuführen.
Versteeg et al. (J Food Sci 45 (1980) S 969–971 haben offenbar eine PME aus Orangen isoliert. Es wurde berichtet, daß diese Pflanzen-PME in mehreren Isoformen mit verschiedenen Eigenschaften vorkommt. Isoform I hat ein Molekulargewicht von 36000 D, einen isoelektrischen Punkt von 10,0, einen optimalen pH-Wert von 7,6 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,083. Isoform II hat ein Molekulargewicht von 36200 D, einen isoelektrischen Punkt von 11,0, einen optimalen pH-Wert von 8,8 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,0046. Isoform III (HMW-PE) hat ein Molekulargewicht von 54000 D, einen isoelektrischen Punkt von 10,2, einen optimalen pH-Wert von 8 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,041. Bis heute gibt es jedoch nur sehr wenige Sequenzdaten für solche PME.
Gemäß Pilnik und Voragen (ebenda) sind PME in einer Vielzahl anderer höherer Pflanzen zu finden, wie beispielsweise Apfel, Aprikose, Avocado, Banane, Beere, Limette, Grapefruit, Mandarine, Kirsche, Johannisbeere, Traube, Mango, Papaya, Passionsfrucht, Pfirsich, Birne, Pflaume, Bohne, Karotte, Blumenkohl, Gurke, Lauch, Zwiebel, Erbse, Kartoffel, Rettich und Tomate. Bis heute gibt es jedoch nur sehr wenige Sequenzdaten für solche PME.
In der WO-A-97/03574 (deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) wurde über eine Pflanzen-PME berichtet. Diese PME weist die folgenden Merkmale auf: ein Molekulargewicht von etwa 36 kD bis etwa 64 kD, einen optimalen pH-Wert von 7–8, wenn dieser mit 0,5% Limettenpektin in 0,15 M NaCl gemessen wird, ein Temperaturoptimum von wenigstens 50°C, eine Temperaturstabilität im Bereich von 10°C bis wenigstens 40°C, einen K_m Wert von 0,07%, eine maximale Aktivität bei Mengen von etwa 0,25 M NaCl, eine maximale Aktivität bei Mengen von etwa 0,2 M Na₂SO₄ und eine maximale Aktivität bei Mengen von etwa 0,3 M NaNO₃.
In der WO 97/31102 (deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) wurde über eine weitere PME berichtet.
PME haben in der Industrie wichtige Verwendungszwecke. Beispielsweise können sie in Sequestriermitteln oder als Sequestriermittel für Calciumionen verwendet werden. In dieser Hinsicht und gemäß Pilnik und Voragen (ebenda) kann Viehfutter hergestellt werden, indem nach der Saftgewinnung eine Aufschlämmung von Calciumhydroxid zu Zitrusschalen zugegeben wird. Nach der Zugabe aktivieren der hohe pH-Wert und die Calciumionen jegliche natürliche PME in der Schale, was zu einer raschen Entesterung des Pektins führt, und es kommt zu einer Koagulation von Calciumpektat. Gebundene Flüssigphase wird freigesetzt und kann leicht ausgepreßt werden, so daß nur ein Bruchteil des ursprünglichen Wassergehalts mittels teurer Wärmetrocknung entfernt werden muß. Die ausgepreßte Flüssigkeit wird dann als Tierfutter verwendet.
Wie oben angegeben, wurde eine PME aus Aspergillus aculeatus (WO 94/25575) erhalten. Diese PME kann anscheinend dazu verwendet werden, die Festigkeit eines Pektin enthaltenden Materials zu verbessern oder Pektin zu demethylieren oder die Viskosität eines Pektin enthaltenden Materials zu steigern.
Es wurde auch üblich, PME bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, die aus Pektin enthaltenden Frucht- oder Gemüsematerialien bestehen – wie z.B. Konfitüren oder Konservierungsstoffe –, zu verwenden. Beispielsweise berichtet die WO-A-94/25575 weiterhin über die Herstellung von Orangenmarmelade und Tomatenpaste unter Verwendung von PME, die aus Aspergillus aculeatus erhalten wurde.
Die JP-A-63/209553 offenbart Gele, die durch die Wirkung von Pektinmethylesterase in Gegenwart eines polyvalenten Metallions auf ein pektinartiges Polysaccharid, welches als Hauptbestandteil eine Poly-α-1,4-D-Galacturonidkette mit hohem Methoxylgehalt enthält, erhalten wurden, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Pilnik und Voragen (ebenda) listen Verwendungsmöglichkeiten für endogene PME auf, die deren Zugabe zu Fruchtsäften beinhalten, um die Viskosität des Safts, wenn er zuviel von den Früchten abgeleitetes Pektin enthält, zu reduzieren, deren in Form von Pektinaselösungen erfolgende Zugabe zu den Gasblasen in der Albedo von Zitrusfrüchten, die auf eine Kerntemperatur von 20°C bis 40°C erhitzt wurden, um das Entfernen der Schale und anderer Membrane von intakten Saftsegmenten zu erleichtern (US-A-4284651), und deren Verwendung zum Schutz und zur Verbesserung der Textur und Festigkeit verschiedener verarbeiteter Früchte und Gemüse, wie Äpfeln (Wiley & Lee 1970 Food Technol 24 1168–70), Dosentomaten (Hsu et al 1965 J Food Sci 30 S. 583–588) und Kartoffeln (Bartolome & Hoff 1972 J Agric Food Chem 20 S 262–266).
Glahn und Rolin (1994 Food Ingredients Europe, Conf Proceedings S. 252–256) berichten über die hypothetische Anwendung des industriellen "GENU pectin type YM-100" für die Wechselwirkung mit Sauermilchgetränken. Es werden keinerlei Einzelheiten darüber angegeben, wie GENU Pektin Typ YM-100 hergestellt wird.
Die EP-A-0664300 offenbart ein chemisches Fraktionierungsverfahren zur Herstellung von calciumempfindlichem Pektin. Dieses calciumempfindliche Pektin soll für die Nahrungsmittelindustrie vorteilhaft sein.
Die WO 94/12055 offenbart die Verwendung von Pektinesterase zur Demethoxylierung von Pektinen mit hohem Methoxylgehalt.
Die WO 93/09683 offenbart die Verwendung einer im wesentlichen von Depolymeraseaktivität freien Pektinesterase beim Aufquellen von Apfelbrei.
Somit haben neben PME auch Pektine und entesterte Pektine eine industrielle Bedeutung.
Wir haben nun herausgefunden, daß jeglicher Nutzen aus der Verwendung einer PME bei der Herstellung z.B. eines Nahrungsmittels in einigem Umfang von der Qualität und der Menge und der Art der verwendeten PME und von der Qualität und der Menge und der Art der PME-Substrate – insbesondere Pektin –, die in dem zur Herstellung des Nahrungsmittels verwendeten Material vorhanden sein können, abhängig ist. Wenn beispielsweise das Substrat ein Fruchtmaterial oder ein Gemüsematerial ist, sind die Menge und/oder die Struktur des natürlichen Pektins in diesem Substrat für verschiedene Arten von Fruchtmaterial oder Gemüsematerial unterschiedlich. Dies wird auch durch die Daten gestützt, die in der WO-A-94/25575, insbesondere 7, angegeben sind, woraus klar wird, daß ihr PME-System nicht ideal ist.
In dieser Hinsicht überwindet die Hinzufügung eines zusätzlichen PME-Substrats jegliche Probleme, die mit unterschiedlichen Mengen und Qualitäten von PME-Substraten, die in bei der Herstellung z.B. von Nahrungsmitteln verwendeten Materialien zu finden sind, einhergehen.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Gelierungszusammensetzung bereitgestellt, welche eine Pektinmethylesterase (PME), ein PME-Substrat und ein hochverestertes, mit PME behandeltes Pektin oder Derivat davon umfaßt, wobei das hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder Derivat davon gegenüber Calciumionen empfindlich ist und wobei weder das PME-Substrat noch das hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder Derivat davon in situ von dem jeweils anderen abstammen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Gelierungszusammensetzung, die ein PME-Substrat und ein calciumempfindliches, hochverestertes, mit PME behandeltes Pektin oder Derivat davon umfaßt, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln des PME-Substrats und des calciumempfindlichen, hochveresterten, mit PME behandelten Pektins oder Derivats davon mit PME vor, während und/oder nach dem Vereinigen des PME-Substrats und des calciumempfindlichen, hochveresterten, mit PME behandelten Pektins oder Derivats davon unter Bildung der Zusammensetzung umfaßt, wobei weder das PME-Substrat noch das calciumempfindliche, hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder Derivat davon in situ von dem jeweils anderen abstammen.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, welches einem ein PME-Substrat enthaltenden Reaktionsmedium Stabilität verleiht, wobei das Verfahren das Zugeben wenigstens einer PME und eines calciumempfindlichen, hochveresterten, mit PME behandelten Pektins oder Derivats davon umfaßt, wobei weder das PME-Substrat noch das calciumempfindliche, hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder Derivat davon in situ von dem jeweils anderen abstammen.
Im breitesten Sinne stellt die vorliegende Erfindung somit eine Zusammensetzung bereit, die eine PME, ein PME-Substrat und ein hochverestertes, mit PME behandeltes Pektin oder Derivat davon umfaßt, wobei das hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder Derivat davon gegenüber Calciumionen empfindlich ist, und wobei weder das PME-Substrat noch das hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder Derivat davon in situ von dem jeweils anderen abstammen.
Bei der vorliegenden Erfindung stammen weder das PME-Substrat noch das mit PME behandelte Substrat in situ von dem jeweils anderen ab. Der Begriff "weder das PME-Substrat noch das mit PME behandelte Substrat stammen in situ von dem jeweils anderen ab" bedeutet, daß das PME-Substrat nicht in situ von dem mit PME behandelten Substrat abstammt und/oder daß das mit PME behandelte Substrat nicht von dem PME-Substrat abstammt. Somit wurde bei der vorliegenden Erfindung das PME-Substrat nicht in situ von dem mit PME behandelten Substrat abgeleitet und umgekehrt. Somit enthält die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung beispielsweise keine Menge eines PME-Substrats, bei der ein Teil des PME-Substrats teilweise durch ein PME-Enzym modifiziert wurde.
In der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können verschiedene zusätzliche PME-Substrate vorhanden sein.
Die PME-Substrate in der oder für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können aus verschiedenen Quellen erhalten werden und/oder sie können verschiedene chemische Zusammensetzungen haben.
Gleichermaßen können in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verschiedene zusätzliche PME-Enzyme vorhanden sein.
Wenn mehr als eine PME vorhanden ist, können die PME-Enzyme aus verschiedenen Quellen erhalten werden und/oder sie können verschiedene Zusammensetzungen haben und/oder sie können ein unterschiedliches Reaktivitätsprofil (z.B. ein anderes pH-Wert-Optimum und/oder ein anderes Temperaturoptimum) haben.
In der vorliegenden Erfindung kann das PME-Enzym die PME-Substrate in zufälliger Weise oder blockweise entestern. Wenn mehr als eine PME vorhanden ist, wird jede PME unabhängig voneinander unter einer PME, die das (die) PME-Substrat(e) in zufälliger Weise entestern kann, oder einer PME, die das (die) PME-Substrat(e) blockweise entestern kann, ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform entestert das (oder das wenigstens eine) PME-Enzym das (die) PME-Substrat(e) blockweise.
Wenn mehr als eine PME vorhanden ist, wird jede PME unabhängig voneinander unter einem PME-Enzym, das gegenüber Natriumionen empfindlich (Na-empfindlich) ist, oder einem PME-Enzym, das gegenüber Natriumionen unempfindlich (Na-unempfindlich) ist, ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das (oder das wenigstens eine) PME-Enzym ein PME-Enzym, welches Na-empfindlich ist.
Die PME kann aus natürlichen Quellen erhältlich sein oder sie kann sogar aus natürlichen Quellen erhalten werden oder sie kann chemisch synthetisiert werden.
Beispielsweise kann die PME aus einem Pilz erhältlich sein, wie beispielsweise eine PME mit Pilzursprung (d.h. eine PME, die aus einem Pilz erhalten wurde).
Alternativ kann die PME aus einem Bakterium erhältlich sein, wie beispielsweise eine PME mit Bakterienursprung (d.h. eine PME, die aus einem Bakterium erhalten wurde).
Alternativ kann die PME aus einer Pflanze erhältlich sein, wie beispielsweise eine PME mit pflanzlichem Ursprung (d.h. eine PME, die aus einer Pflanze erhalten wurde).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die PME unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt.
Beispielsweise kann die PME eine rekombinante PME, wie sie in der WO-A-97/O3574 offenbart ist, oder die PME, die in entweder der WO-A-94/25575 oder der WO-A-97/31102 offenbart ist, sowie Varianten, Derivate oder Homologe der in diesen Patentanmeldungen offenbarten Sequenzen sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die PME die rekombinante PME aus der WO-A-97/03574 (deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) – wie z.B. die PME aus SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 (die durch die als SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 angegebenen Nukleotidsequenzen codiert sind), oder eine Variante, ein Derivat oder ein Homologes davon, und/oder die PME aus der WO-A-94/25575 (deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) oder eine Variante, ein Derivat oder ein Homologes davon.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf das rekombinante Enzym der vorliegenden Erfindung beinhalten jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Addition einer (oder mehrerer) Aminosäure(n) in oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß die resultierende Aminosäuresequenz eine PME-Aktivität, vorzugsweise dieselbe Aktivität wie ein rekombinantes Enzym, das irgendeine oder mehrere der als SEQ ID NO:1 und 2 angegebenen Sequenzen umfaßt, aufweist. Insbesondere deckt der Begriff "Homologes" Homologie bezüglich der Struktur und/oder der Funktion ab, mit der Maßgabe, daß das resultierende rekombinante Enzym PME-Aktivität aufweist. In Bezug auf die Sequenzhomologie (d.h. Ähnlichkeit) besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu den in dem anhängenden Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen. Vorzugsweise besteht wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu den in dem anhängenden Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf die Nukleotidsequenz, die das rekombinante Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, beinhalten jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Addition einer (oder mehrerer) Nukleinsäure(n) in oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein rekombinantes Enzym mit PME-Aktivität, vorzugsweise mit wenigstens derselben Aktivität wie ein rekombinantes Enzym, welches irgendeine oder mehrere der als SEQ ID NO:1 und 2 angegebenen Sequenzen umfaßt, codiert. Insbesondere deckt der Begriff "Homologes" Homologie bezüglich der Struktur und/oder der Funktion ab, mit der Maßgabe, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein rekombinantes Enzym mit PME-Aktivität codiert. Im Hinblick auf die Sequenzhomologie (d.h. Ähnlichkeit) besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie. Vorzugsweise besteht wenigstens 95%, besonders bevorzugt wenigstens 98% Homologie.
Die obigen Begriffe sind synonym zu den allelischen Variationen der Sequenzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eines der PME-Substrate Pektin oder ein Substrat, welches von Pektin ableitbar oder abgeleitet ist (z.B. ein Pektinderivat).
Der Begriff "von Pektin abgeleitet" umfaßt derivatisiertes Pektin, abgebautes (wie z.B. teilweise abgebautes) Pektin und modifiziertes Pektin. Ein Beispiel eines modifizierten Pektins ist Pektin, das zuvor mit einem Enzym, wie PME, behandelt wurde. Ein Beispiel eines Pektinderivats ist Pektin, das chemisch behandelt – z.B. amidiert – wurde.
Vorzugsweise sind sowohl das erste PME-Substrat als auch das zweite PME-Substrat unabhängig voneinander unter Pektin, einem von Pektin ableitbaren Substrat oder einem von Pektin abgeleiteten Substrat ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind sowohl das erste PME-Substrat als auch das zweite PME-Substrat Pektin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist entweder das erste PME-Substrat oder das zweite PME-Substrat ein modifiziertes Pektin – insbesondere ein enzymatisch modifiziertes Pektin, vorzugsweise ein mit PME behandeltes Pektin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite PME-Substrat ein solches modifiziertes Pektin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind sowohl das erste PME-Substrat als auch das zweite PME-Substrat ein solches modifiziertes Pektin.
Vorzugsweise ist das erste PME-Substrat in einer Pflanze oder einem Pflanzenmaterial (d.h. in situ) vorhanden. Die Pflanze kann eine transgene Pflanze sein, wie z.B. eine Pflanze, die genetisch modifiziert wurde, um verschiedene Mengen und/oder Arten von Pektin herzustellen. In gleicher Weise kann das Pflanzenmaterial von einer transgenen Pflanze, wie z.B. einer Pflanze, die genetisch modifiziert wurde, um verschiedene Mengen und/oder Arten von Pektin herzustellen, erhalten werden.
Die Pflanze oder das Pflanzenmaterial kann ein Gemüse, eine Frucht oder eine andere Art einer Pektin enthaltenden oder produzierenden Pflanze sein oder daraus abgeleitet sein.
Vorzugsweise ist das Pflanzenmaterial ein Gemüsematerial und/oder ein Fruchtmaterial.
Vorzugsweise ist das Gemüsematerial und/oder das Fruchtmaterial ein Brei.
Das erste PME-Substrat und/oder das zweite PME-Substrat kann (können) irgendeines oder mehrere von einem niederveresterten Pektin, einem mittelveresterten Pektin oder einem hochveresterten Pektin sein.
Vorzugsweise ist das zweite PME-Substrat ein niederverestertes Pektin, ein mittelverestertes Pektin oder ein hochverestertes Pektin. Ein Protokoll zur Bestimmung des Veresterungsgrades des PME-Substrats ist auf Seite 58 der WO-A-97/03574 (deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) zu finden. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird dieses Protokoll im Abschnitt Beispiele (infra) zitiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite PME-Substrat ein hochverestertes Pektin.
Für die vorliegende Erfindung werden das erste PME-Substrat und das zweite PME-Substrat unabhängig voneinander unter einem PME-Substrat, das gegenüber Calciumionen empfindlich (Ca-empfindlich) ist, oder einem PME-Substrat, das gegenüber Calciumionen unempfindlich (Ca-unempfindlich) ist, ausgewählt. Ein Protokoll zur Bestimmung der Calciumempfindlichkeit ist auf Seite 57 der WO-A-97/03574 (deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) zu finden. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird dieses Protokoll im Abschnitt Beispiele (infra) zitiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite PME-Substrat Ca-empfindlich.
Vorzugsweise wird das zweite PME-Substrat zu dem ersten PME-Substrat zugegeben. Hier beinhaltet der Begriff "zugegeben zu" das physikalische Zugeben des zweiten PME-Substrats zu dem ersten PME-Substrat und umgekehrt.
Die PME kann zur gleichen Zeit wie das zweite PME-Substrat oder vor der Zugabe des zweiten PME-Substrats oder nach der Zugabe des zweiten PME-Substrats zugegeben werden.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung wenigstens die folgenden Möglichkeiten: Zugeben von PME zu dem ersten PME-Substrat und zur gleichen Zeit wie das zweite PME-Substrat, Zugeben von PME zu dem zweiten PME-Substrat und zur gleichen Zeit wie das erste PME-Substrat, Zugeben des zweiten PME-Substrats zu PME und zur gleichen Zeit wie das erste PME-Substrat, gleichzeitiges Zugeben von PME und dem ersten PME-Substrat und dem zweiten PME-Substrat in ein Reaktionsgefäß, Inkubieren des ersten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem zweiten PME-Substrat, Inkubieren des zweiten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem ersten PME-Substrat, Inkubieren des ersten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem zweiten PME-Substrat und anschließendes Zugeben von mehr PME (welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME), Inkubieren des zweiten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem ersten PME-Substrat und anschließendes Zugeben von mehr PME (welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME), Inkubieren des ersten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem zweiten PME-Substrat und anschließendes Zugeben eines weiteren PME-Substrats (welches dasselbe sein kann wie oder ein anderes sein kann als die anderen PME-Substrate), Inkubieren des zweiten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem ersten PME-Substrat und anschließendes Zugeben eines weiteren PME-Substrats (welches dasselbe sein kann wie oder ein anderes sein kann als die anderen PME-Substrate), Zugeben des ersten PME-Substrats beim Inkubieren mit PME zu dem zweiten PME-Substrat beim Inkubieren mit PME (welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME), Zugeben des ersten PME-Substrats, nachdem es mit PME inkubiert wurde (wobei optional die Reaktion gestoppt wurde – z.B. durch Aufbringen von Hitze), zu dem zweiten PME-Substrat, nachdem es mit PME inkubiert wurde, welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME (wo bei die Reaktion optional gestoppt wurde – z.B. durch Aufbringen von Hitze), sowie irgendeine Kombination davon.
In einer Reihe von Ausführungsformen umfaßt die vorliegende Erfindung vorzugsweise irgendeines oder mehrere der folgenden: Zugeben von PME zu dem ersten PME-Substrat und zur gleichen Zeit wie das zweite PME-Substrat, Zugeben von PME zu dem zweiten PME-Substrat und zur gleichen Zeit wie das erste PME-Substrat, Zugeben des zweiten PME-Substrats zu PME und zur gleichen Zeit wie das erste PME-Substrat, gleichzeitiges Zugeben von PME und dem ersten PME-Substrat und dem zweiten PME-Substrat zu einem Reaktionsgefäß, Inkubieren des ersten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem zweiten PME-Substrat, Inkubieren des zweiten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem ersten PME-Substrat, Inkubieren des ersten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem zweiten PME-Substrat und anschließendes Zugeben von mehr PME (welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME), Inkubieren des zweiten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem ersten PME-Substrat und anschließendes Zugeben von mehr PME (welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME), Inkubieren des ersten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem zweiten PME-Substrat und anschließendes Zugeben eines weiteren PME-Substrats (welches dasselbe sein kann wie oder ein anderes sein kann als die anderen PME-Substrate), Inkubieren des zweiten PME-Substrats mit PME vor dem Zugeben zu dem ersten PME-Substrat und anschließendes Zugeben eines weiteren PME-Substrats (welches dasselbe sein kann wie oder ein anderes sein kann als die anderen PME-Substrate), Zugeben des ersten PME-Substrats beim Inkubieren mit PME zu dem zweiten PME-Substrat beim Inkubieren mit PME (welche dieselbe sein kann wie oder eine andere sein kann als die andere PME).
Somit ist es in einer Ausführungsform möglich, ein hochverestertes, mit PME vorbehandeltes zweites PME-Substrat herzustellen, welches dann zu einem ersten PME-Substrat zugegeben werden könnte. In dieser Hinsicht wäre es möglich, verschiedene PME (wie z.B. rekombinante Pflanzen-, Pilz- und Bakterien-PME) zu verwenden, um das zweite PME-Substrat im Hinblick darauf zu modifizieren, PME-Substrate mit unterschiedlicher Funktionalität in einem Kombinationssystem bereitzustellen.
Alternativ ausgedrückt stellt diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die PME, ein erstes PME-Substrat und ein zweites PME-Substrat umfaßt, wobei weder das erste PME-Substrat noch das zweite PME-Substrat in situ von dem jeweils anderen abstammen und wobei wenigstens das zweite PME-Substrat mit PME vorbehandelt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, ein PME-Substrat zu einem hochveresterten, mit PME vorbehandelten ersten PME-Substrat zuzugeben. In dieser Hinsicht wäre es möglich, verschiedene PME (z.B. rekombinante Pflanzen-, Pilz- und Bakterien-PME) zu verwenden, um das zweite PME-Substrat im Hinblick darauf zu modifizieren, PME-Substrate mit unterschiedlicher Funktionalität in einem Kombinationssystem bereitzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, ein hochverestertes, mit PME vorbehandeltes zweites PME-Substrat bereitzustellen, welches dann zu einem hochveresterten, mit PME vorbehandelten ersten PME-Substrat zugegeben werden könnte. In dieser Hinsicht wäre es möglich, verschiedene PME (wie z.B. nicht-rekombinante Pflanzen-, Pilz- und Bakterien-PME) zu verwenden, um das zweite PME-Substrat im Hinblick darauf zu modifizieren, PME-Substrate mit unterschiedlicher Funktionalität in einem Kombinationssystem bereitzustellen.
Die Zusammensetzung kann eine oder mehrere andere Komponenten, wie z.B. einen oder mehrere geeignete Nahrungsmittelbestandteile, umfassen. Typische Nahrungsmittelbestandteile umfassen irgendeine oder mehrere von einer Säure – wie Zitronensäure – oder einem Zucker – wie Saccharose, Glucose oder Invertzucker – oder Früchten – oder andere Enzyme, Konservierungsstoffe, Farbstoffe und andere geeignete Komponenten.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bei der Herstellung eines Nahrungsmittels verwendet werden. Beispielsweise kann sie ein Startreagens oder ein Zwischenprodukt bei der Herstellung eines Nahrungsmittels sein.
Alternativ kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung das Nahrungsmittel selbst sein.
Der Begriff "Nahrungsmittel" kann Nahrung für den Verzehr durch Menschen und/oder Tiere beinhalten. Typische Nahrungsmittel umfassen Konfitüren, Marmeladen, Gelees, Molkereiprodukte (wie Milch oder Käse), Fleischprodukte, Geflügelprodukte, Fischprodukte und Bäckereiprodukte. Das Nahrungsmittel kann auch ein Getränk sein. Das Getränk kann ein Trinkjoghurt, ein Fruchtsaft oder ein Molkeprotein enthaltendes Getränk sein.
Die (oder irgendeine oder mehrere der) PME kann gemeinsam mit anderen Arten von Enzymen verwendet werden.
Beispiele anderer Arten von Enzymen umfassen andere Pektinasen, Pektindepolymerasen, Polygalacturonasen, Pektatlyasen, Pektinlyasen, Rhamno-Galacturonasen, Galactanasen, Zellulasen, Hemizellulasen, Endo-β-Glucanasen, Arabinasen, Acetylesterasen oder Pektin freisetzende Enzyme oder Kombinationen davon.
Diese anderen Arten von Enzymen können zur gleichen Zeit wie die PME oder alternativ vor oder nach der Zugabe der PME zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die PME gemeinsam mit einer oder mehreren Polygalacturonasen, z.B. einer Endo-Polygalacturonase (wie z.B. die aus der WO-A-89/12648, deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) und/oder einer Exo-Polygalacturonase (wie z.B. die aus der WO-A-94/14966, deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist), verwendet. Diese bevorzugte Ausführungsform ist vorteilhaft für die Herstellung von Konfitüre und Marmelade, da die resultierenden behandelten PME-Substrate eine stärker gesteuerte Calciumempfindlichkeit erzielen können.
Wie oben angegeben, stellen die Lehren der WO-A-97/03574 einige nützliche Lehren darüber bereit, wie unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken eine geeignete PME zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann. Einige dieser Lehren werden unten zitiert.
Um eine rekombinante PME zu exprimieren, kann der Wirtsorganismus ein prokaryontischer oder ein eukaryontischer Organismus sein. Beispiele geeigneter prokaryontischer Wirte umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Lehren über die Transformation prokaryontischer Wirte sind im Stand der Technik gut dokumentiert, siehe beispielsweise Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Wenn ein prokaryontischer Wirt verwendet wird, kann es notwendig sein, das Gen vor der Transformation in geeigneter Weise zu modifizieren – wie z.B. durch Entfernen von Introns.
In einer Ausführungsform kann der Wirtsorganismus ein Organismus der Gattung Aspergillus, wie z.B. Aspergillus niger, sein. Ein transgener Aspergillus kann hergestellt werden, indem man den Lehren von Rambosek, J. und Leach, J. 1987 (Recombinant DNA in flamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 357–393), Davis, R.W. 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Herausgeber) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology Band 29. Elsevier Amsterdam 1994. S. 525–560), Ballance, D.J. 1991 (Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. In: Leong, S.A., Berka, R.M. (Herausgeber) Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc. New York 1991. S. 1–29) und Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Herausgeber) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology Band 29. Elsevier Amsterdam 1994. S. 641–666) folgt. Die folgenden Erläuterungen geben jedoch eine Zusammenfassung dieser Lehren zur Herstellung von transgenem Aspergillus.
Seit nahezu hundert Jahren werden Fadenpilze in vielen Industriezweigen weitverbreitet für die Herstellung organischer Verbindungen und Enzyme eingesetzt.
Beispielsweise haben traditionelle japanische Koji- und Sojafermentationen Aspergillus sp. verwendet. In diesem Jahrhundert wurde auch Aspergillus niger zur Herstellung organischer Säuren, insbe sondere Zitronensäure, und zur Herstellung verschiedener Enzyme für die Verwendung in der Industrie eingesetzt.
Es gibt zwei wichtige Gründe dafür, daß Fadenpilze in der Industrie so weitverbreitet verwendet werden. Erstens können Fadenpilze große Mengen an extrazellulären Produkten, wie z.B. Enzyme und organische Verbindungen, wie Antibiotika oder organische Säuren, erzeugen. Zweitens können Fadenpilze auf preisgünstigen Substraten wie Körnern, Kleie, Rübenbrei usw. wachsen. Diese Gründe haben Fadenpilze als Wirte für die heterologe Expression rekombinanter PME zu attraktiven Organismen gemacht.
Um den transgenen Aspergillus herzustellen, werden durch Einfügen einer benötigten Nukleotidsequenz in ein Konstrukt, welches für die Expression in Fadenpilzen ausgestaltet ist, Expressionskonstrukte erzeugt.
Es wurden verschiedene Arten von Konstrukten entwickelt, die für die heterologe Expression verwendet werden. Diese Konstrukte können einen in Pilzen aktiven Promotor enthalten. Beispiele von Promotoren beinhalten einen Pilzpromotor für ein hochexprimiertes extrazelluläres Enzym, wie z.B. den Glucoamylase-Promotor oder den α-Amylase-Promotor. Die Nukleotidsequenz kann mit einer Signalsequenz, die das durch die Nukleotidsequenz codierte abzusondernde Protein steuert, fusioniert werden. Für gewöhnlich wird eine aus Pilzen stammende Signalsequenz verwendet. Ein in Pilzen aktiver Terminator schließt das Expressionssystem ab.
In Pilzen wurde eine weitere Art eines Expressionssystems entwickelt, wobei die Nukleotidsequenz mit einem kleineren oder einem größeren Teil eines Pilzgens, welches ein stabiles Protein codiert, fusioniert werden kann. Dies kann das durch die Nukleotidsequenz codierte Protein stabilisieren. In einem solchen System kann eine Spaltstelle, die von einer bestimmten Protease erkannt wird, zwischen dem Pilzprotein und dem durch die Nukleotidsequenz codierten Protein eingefügt werden, so daß das erzeugte Fusionsprotein an dieser Position durch die spezifische Protease gespalten werden kann, wodurch das durch die Nukleotidsequenz codierte Protein freigesetzt wird. Beispielsweise kann man eine Stelle einfügen, die von einer KEX-2-artigen Peptidase, die in wenigstens einigen Aspergilli vorhanden ist, erkannt wird. Eine solche Fusion führt zu einer Spaltung in vivo, was zu einem Schutz des exprimierten Produkts und nicht zu einem größeren Fusionsprotein führt.
Heterologe Expression in Aspergillus wurde für verschiedene Gene, die Bakterien-, Pilz-, Wirbeltier- und Pflanzenproteine codieren, berichtet. Die Proteine können intrazellulär gelagert werden, wenn die Nukleotidsequenz nicht mit einer Signalsequenz fusioniert wird. Solche Proteine sammeln sich im Zytoplasma an und werden üblicherweise nicht glycosyliert, was für einige Bakterienproteine vorteilhaft sein kann. Wenn die Nukleotidsequenz mit einer Signalsequenz versehen ist, sammelt sich das Protein extrazellulär an.
Im Hinblick auf die Produktstabilität und Modifikationen des Wirtsstamms sind einige heterologe Proteine nicht sehr stabil, wenn sie in die Pilz-Kulturflüssigkeit abgesondert werden. Die meisten Pilze produzieren verschiedene extrazelluläre Proteasen, die heterologe Proteine abbauen. Um dieses Problem zu umgehen, wurden für die heterologe Herstellung spezielle Pilzstämme mit reduzierter Proteaseproduktion als Wirte verwendet.
Für die Transformation von Fadenpilzen wurden verschiedene Transformationsprotokolle für viele Fadenpilze entwickelt (Ballance 1991, ebenda). Viele von ihnen basieren auf der Herstellung von Protoplasten und der Einbringung von DNA in die Protoplasten unter Verwendung von PEG und Ca²⁺-Ionen. Die transformierten Protoplasten regenerieren sich dann, und die transformierten Pilze werden unter Verwendung verschiedener selektiver Marker ausgewählt. Unter den für die Transformation verwendeten Markern befinden sich eine Reihe auxotropher Marker, wie argB, trpC, niaD und pyrG, Antibiotikaresistenzmarker, wie Benomylresistenz, Hygromycinresistenz und Phleomycinresistenz. Ein allgemein verwendeter Transformationsmarker ist das amdS-Gen von A. nidulans, das es dem Pilz bei großer Kopienzahl erlaubt, mit Acrylamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen.
In einer anderen Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In dieser Hinsicht wurden Hefen weitverbreitet auch als ein Vehikel für heterologe Genexpression verwendet. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae wird seit langer Zeit industriell verwendet, einschließlich einer Verwendung für die heterologe Genexpression. Die Expression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al., Hrsg., S. 401–429, Allen und Unwin, London) und von King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton und G.T. Yarronton, Hrsg., S. 107–133, Blackie, Glasgow) untersucht.
Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen für die heterologe Genexpression gut geeignet. Erstens ist sie für Menschen nicht pathogen und sie ist auch nicht in der Lage, bestimmte Endotoxine zu produzieren. Zweitens hat sie nach jahrhundertelanger kommerzieller Nutzung für verschiedene Zwecke eine lange Geschichte der sicheren Verwendung. Dies hat zu einer breiten Akzeptanz in der Öffentlichkeit geführt. Drittens haben die extensive kommerzielle Verwendung und die dem Organismus gewidmete Forschung zu einer Fülle an Wissen über die Genetik und die Physiologie sowie zu umfangreichen Fermentationscharakteristika von Saccharomyces cerevisiae geführt.
Eine Übersicht über die Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion von Genprodukten wird von E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony H. Rose und J. Stuart Harrison, Hrsg., 2. Aufl., Academic Press Ltd.) gegeben.
Es sind verschiedene Arten von Hefevektoren, einschließlich integrativer Vektoren, die für ihre Erhaltung eine Rekombination mit dem Wirtsgenom erforderlich machen, und autonom replizierender Plasmidvektoren, verfügbar.
Um die transgene Saccharomyces herzustellen, werden durch Einfügen der Nukleotidsequenz in ein Konstrukt, das für die Expression in Hefe ausgestaltet ist, Expressionskonstrukte hergestellt. Es wurden verschiedene Arten von Konstrukten für die heterologe Expression entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen Promotor, der in Hefe aktiv und mit der Nukleotidsequenz fusioniert ist; für gewöhnlich wird ein Promotor mit Hefeursprung, wie z.B. der GAL1-Promotor, verwendet. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Hefeursprung, wie z.B. die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator schließt das Expressionssystem ab.
Für die Transformation von Hefe wurden verschiedene Transformationsprotokolle entwickelt. Beispielsweise kann unter Befolgung der Lehren von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929), Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275, 104) und Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163–168) eine transgene Saccharomyces hergestellt werden.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener selektiver Marker selektiert. Unter den für die Transformation verwendeten Markern befinden sich eine Reihe auxotropher Marker, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und dominanter Antibiotikaresistenzmarker, wie Aminoglycosid-Antibiotikamarker, z.B. G418.
Ein weiterer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. In dieser Hinsicht sind im Stand der Technik reichlich Quellen für die Herstellung transgener Pflanzen vorhanden. Zwei Dokumente, die einen Hintergrundkommentar über die Arten der Techniken geben, die für die Herstellung transgener Pflanzen verwendet werden können, sind die EP-B-0470145 und die CA-A-2006454 – einige dieser Informationen werden unten wiedergegeben.
Das Grundprinzip bei der Herstellung genetisch modifizierter Pflanzen besteht darin, genetische Informationen so in das Pflanzengenom einzufügen, daß eine stabile Erhaltung des eingefügten genetischen Materials erreicht wird.
Es existieren verschiedene Techniken zum Einfügen der genetischen Informationen; die beiden Hauptprinzipien sind dabei die direkte Einbringung der genetischen Information und die indirekte Einbringung der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems. Eine Übersicht über die allgemeinen Techniken ist in Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27) zu finden.
Ein geeignetes Transformationssystem für eine Pflanze kann einen Vektor umfassen, doch es kann auch zwei Vektoren umfassen. Im Falle zweier Vektoren wird das Vektorsystem normalerweise als ein binäres Vektorsystem bezeichnet. Binäre Vektorsysteme sind in Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1–19, ausführlicher beschrieben.
Ein extensiv eingesetztes System für die Transformation von Pflanzenzellen mit einem gegebenen Promotor oder einer Nukleotidsequenz oder einem Konstrukt basiert auf der Verwendung eines Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium rhizogenes, wie es in An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301–305, und Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Hrsg.: D.S. Ingrams und J.P. Helgeson, 203–208, beschrieben ist.
Es wurden mehrere verschiedene Ti- und Ri-Plasmide hergestellt, die für die Herstellung der Pflanzen- oder der Pflanzenzellkonstrukte, wie oben beschrieben, geeignet sind. Ein nicht beschränkendes Beispiel eines solchen Ti-Plasmids ist pGV3850.
Die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt sollte vorzugsweise zwischen den terminalen Sequenzen der T-DNA oder benachbart zu einer T-DNA-Sequenz in das Ti-Plasmid eingefügt werden, um so eine Unterbrechung der die T-DNA-Grenzen unmittelbar umgebenden Sequenzen zu vermeiden, da zumindest einer dieser Bereiche für die Einfügung modifizierter T-DNA in das Pflanzengenom wesentlich zu sein scheint.
Wie es sich aus der obigen Erklärung ergibt, ist das Vektorsystem, wenn der Organismus eine Pflanze ist, vorzugsweise eines, das die Sequenzen enthält, die notwendig sind, um die Pflanze (z.B. die vir-Region) und wenigstens einen Grenzbereich einer T-DNA-Sequenz zu infizieren, wobei der Grenzbereich auf demselben Vektor liegt wie das genetische Konstrukt. Vorzugsweise ist das Vektorsystem ein Agrobacterium tumefaciens-Ti-Plasmid oder ein Agrobacterium rhizogenes-Ri-Plasmid oder ein Derivat davon; da diese Plasmide gut bekannt sind und bei der Herstellung transgener Pflanzen weitverbreitet eingesetzt werden, existieren viele Vektorsysteme, die auf diesen Plasmiden oder Derivaten davon basieren.
Bei der Herstellung einer transgenen Pflanze kann die Nukleotidsequenz zuerst in einem Mikroorganismus, in dem sich der Vektor replizieren kann und welcher vor der Einfügung in die Pflanze leicht zu manipulieren ist, hergestellt werden. Ein Beispiel eines nützlichen Mikroorganismus ist E. coli, aber es können auch andere Mikroorganismen, die die obigen Eigenschaften besitzen, verwendet werden. Wenn ein Vektor eines Vektorsystems, wie es oben definiert wurde, in E. coli hergestellt wurde, wird er, falls notwendig, in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z.B. Agrobacterium tumefaciens, überführt. Das die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt beherbergende Ti-Plasmid wird somit vorzugsweise in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z.B. A. tumefaciens, überführt, um so eine Agrobacterium-Zelle zu erhalten, die die Nukleotidsequenz beherbergt, deren DNA nachfolgend in die zu modifizierende Pflanzenzelle übertragen wird.
Wie in der CA-A-2006454 berichtet wird, ist eine große Menge an Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, enthalten. Die Vektoren umfassen beispielsweise pBR 322, die pUC-Serie, die M13 mp-Serie, pACYC 184 usw.
Auf diese Weise kann die Nukleotidsequenz an eine geeignete Restriktionsposition in dem Vektor eingebracht werden. Das enthaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium kultiviert und dann geerntet und lysiert. Dann wird das Plasmid wiedergewonnen. Als Analyseverfahren werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektroforese und weitere biochemische/molekularbiologische Verfahren verwendet. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz verdaut und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Sequenz kann in demselben oder einem anderen Plasmid kloniert werden.
Nach jedem Verfahren zum Einbringen des gewünschten Promotors oder Konstrukts oder der gewünschten Nukleotidsequenz in die Pflanzen kann das Vorhandensein und/oder die Einfügung weiterer DNA-Sequenzen notwendig sein. Wenn beispielsweise für die Transformation das Ti- oder Ri-Plasmid der Pflanzenzellen verwendet wird, können wenigstens die rechte Grenze, oft jedoch auch die rechte und die linke Grenze der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Bereiche der eingebrachten Gene verbunden werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv untersucht und ist in der EP-A-120516, Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Kapitel V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46, und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277–284, beschrieben.
Die direkte Infizierung von Pflanzengeweben mit Agrobacterium ist eine einfache Technik, die weitverbreitet angewendet wird und die in Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Hrsg.: D.S. Ingrams und J.P. Helgeson, 203–208, beschrieben wird. Für weitere Lehren zu diesem Thema siehe Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27). Mit dieser Technik kann die Infizierung einer Pflanze auf einem bestimmten Teil oder Gewebe der Pflanze, d.h. auf einem Teil eines Blattes, einer Wurzel, eines Stengels oder eines anderen Teils der Pflanze, durchgeführt werden.
Bei der direkten Infizierung von Pflanzengeweben mit Agrobacterium, welches den Promotor und/oder das GOI trägt, wird eine zu infizierende Pflanze typischerweise verletzt, z.B. durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge oder durch Punktieren der Pflanze mit einer Nadel oder durch Reiben der Pflanze mit einem Schleifmittel. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium inokuliert.
Die inokulierte Pflanze oder der inokulierte Pflanzenteil wird dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und sich zu ausgewachsenen Pflanzen entwickeln gelassen.
Wenn Pflanzenzellen hergestellt werden, können diese Zellen gemäß gut bekannter Gewebekultivierungsverfahren gezüchtet und erhalten werden, wie z.B. durch Kultivieren der Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, welches mit den notwendigen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Aminosäuren, Pflanzenhormonen, Vitaminen usw., versehen ist. Die Regeneration der transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann unter Verwendung bekannter Verfahren für die Regeneration von Pflanzen aus Zell- oder Gewebekulturen, beispielsweise durch Auswählen transformierter Triebe unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Subkultivieren der Triebe auf einem Medium, welches die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone usw. enthält, erzielt werden.
Weitere Lehren über die Transformation von Pflanzen sind in der EP-A-0449375 zu finden.
Zusammenfassend wird eine Zusammensetzung beschrieben, die für die Verwendung als Nahrungsmittel oder bei der Herstellung eines Nahrungsmittels geeignet ist. Die Zusammensetzung umfaßt eine PME, ein erstes PME-Substrat und ein zweites PME-Substrat, wobei weder das erste PME-Substrat noch das zweite PME-Substrat in situ von dem jeweils anderen abstammen.
Wie oben angegeben, liegen PME-Substrate, wie aus natürlichen Pflanzenquellen erhaltene Pektine, im allgemeinen in Form eines hochveresterten Pektins mit einem DE von etwa 70% vor. Zu diese hochveresterten PME-Substrate enthaltenden Extrakten muß Zucker zugegeben werden, um eine ausreichende Menge an löslichen Feststoffen bereitzustellen und eine Gelierung zu induzieren. Üblicherweise werden mindestens 55% an löslichen Feststoffen benötigt. Synärese tritt häufiger auf, wenn der Prozentsatz an löslichen Feststoffen weniger als 55% beträgt. Wenn Synärese auftritt, müssen teure Additive verwendet werden, um ein Gelieren zu induzieren.
Mit der vorliegenden Erfindung haben wir überraschend herausgefunden, daß es möglich ist, die Gelierung eines Extrakts, der ein hochverestertes PME-Substrat enthält, durch Zugeben eines zweiten hochveresterten PME-Substrats zu induzieren. Die gesteigerte Gelierfähigkeit dieser vereinigten hochveresterten PME-Substrate bei Mengen von weniger als 50% an löslichen Feststoffen ist völlig unerwartet. Im Stand der Technik wurde immer gelehrt, daß hochveresterte Pektine typischerweise mindestens einen Gehalt von 55% an löslichen Feststoffen erfordern, ehe eine Gelierung stattfinden kann.
Gemäß dem breitesten Aspekt dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen wir somit ein wäßriges System in einem verfestigten bzw. erstarrten Gelzustand bereit, welches einen Gehalt von weniger als 50% w/w an löslichen Feststoffen aufweist, wobei die Gelierung unter Verwendung eines hochveresterten PME-Substrats stattgefunden hat. In diesem Aspekt kann der verfestigte Gelzustand durch das in dem Abschnitt Beispiele (infra) genannte Verfahren bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von den Lehren der WO-A-94/25575, da diese Patentanmeldung keine Zusammensetzung, die eine PME, ein erstes PME-Substrat und ein zweites PME-Substrat umfaßt, ganz zu schweigen von einer Zusammensetzung, in der weder das erste PME-Substrat noch das zweite PME-Substrat jeweils in situ von dem jeweils anderen abstammen, offenbart oder auch nur vorschlägt. Gleiches gilt für die Lehren der JP-A-63/209533.
Es sei auch angemerkt, daß die Lehren auf Seite 12 (Zeilen 6–14) der WO-A-94/25575 sogar von der vorliegenden Erfindung weg gehen. In dieser Hinsicht offenbart der Begriff "Produkte auf Gemüse- oder Fruchtbasis", wie er in den Zeilen 7 und 8 der WO-A-94/25575 verwendet wird, nicht explizit ein PME-Substrat. Darüber hinaus weist der nachfolgende Satz "Alternativ (was wir unterstreichen) kann der natürliche Gehalt an Pektin unter Verwendung des Enzyms demethyliert werden ..." in den Zeilen 12 bis 14 der WO-A-94/25575 klar darauf hin, daß das von der WO-A-94/25575 ins Auge gefaßte Reaktionsmedium nur ein PME-Substrat und nicht wenigstens zwei PME-Substrate, wie es in der vorliegenden Erfindung der Fall ist, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird nun lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben:
1 ist ein Säulendiagramm (welches die Wirkung von PPME-Modifikation, zugegebenem Pektin und +/– Calcium zeigt).
2 ist ein Säulendiagramm (welches die Wirkung der PPME-Behandlung von Frucht und Pektin (P66) zeigt).
PROTOKOLLE
PROTOKOLL I
CALCIUMEMPFINDLICHKEITSINDEX (CF)
Die Calciumempfindlichkeit wird als die Viskosität eines in einer Lösung mit 57,6 mg Calcium/g Pektin gelösten Pektins, geteilt durch die Viskosität genau derselben Menge an Pektin in Lösung, jedoch ohne Zugabe von Calcium, gemessen. Ein gegenüber Calcium unempfindliches Pektin hat einen CF-Wert von 1.
4,2 g Pektinprobe werden unter gründlichem Rühren in 550 ml heißem Wasser gelöst. Die Lösung wird auf etwa 20°C abgekühlt und der pH-Wert wird mit 1N HCl auf 1,5 eingestellt. Die Pektinlösung wird mit Wasser auf 700 ml eingestellt und gerührt. 145 g dieser Lösung werden jeweils getrennt in vier Viskositätsmeßgläsern gemessen. Zu zweien der Gläser (doppelte Bestimmung) werden 10 ml Wasser zugegeben und zu den anderen beiden Gläsern werden 10 ml einer 250 mM CaCl₂-Lösung unter Rühren zugegeben.
50 ml eines Acetatpuffers (0,5 M, pH-Wert etwa 4,6) werden unter gründlichem Magnetrühren zu allen vier Viskositätsmeßgläsern zugegeben, wodurch der pH-Wert der Pektinlösung auf einen pH-Wert von mehr als 4,0 erhöht wird. Die Magnete werden entfernt, und die Gläser werden über Nacht bei 20°C stehen gelassen. Die Viskositäten werden am nächsten Tag unter Verwendung eines Brookfield-Viskosimeters gemessen. Der Calciumempfindlichkeitsindex wird wie folgt berechnet.
PROTOKOLL II
GRAD DER VERESTERUNG (%DE)
Zu 50 ml einer Lösung aus 60% Isopropanol und 5% HCl werden 2,5 g Pektinprobe zugegeben und für 10 Min. gerührt. Die Pektinlösung wird durch einen Glasfilter filtriert und mit 15 ml 60% Isopropanol/5% HCl-Lösung 6-mal gewaschen, gefolgt von weiteren Waschungen mit 60% Isopropanol, bis das Filtrat frei von Chloriden ist. Das Filtrat wird über Nacht bei 80°C getrocknet.
20,0 ml 0,5 N NaOH und 20,0 ml 0,5 N HCl werden in einem Erlenmeyerkolben vereinigt, und es werden 2 Tropfen Phenolphthalein zugegeben. Dies wird mit 0,1 N NaOH titriert, bis ein dauerhafter Farbwechsel erhalten wird. Die 0,5 N HCl sollten etwas stärker sein als die 0,5 N NaOH. Das zugegebene Volumen an 0,1 N NaOH wird als V₀ notiert.
0,5 g der getrockneten Pektinprobe (das Filtrat) werden in einen Erlenmeyerkolben eingewogen, und die Probe wird mit 96% Ethanol befeuchtet. 100 ml kürzlich gekochtes und abgekühltes destilliertes Wasser werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird gerührt, bis das Pektin vollständig gelöst ist. Dann werden 5 Tropfen Phenolphthalein zugegeben, und die Lösung wird mit 0,1 N NaOH titriert (bis ein Farbwechsel stattfindet und der pH-Wert 8,5 beträgt). Die hier verwendete Menge an 0,1 N NaOH wird als V₁ notiert. 20,0 ml 0,5 N NaOH werden zugegeben, und der Kolben wird kräftig geschüttelt und anschließend für 15 Min. stehen gelassen. 20,0 ml 0,5 N HCl werden zugegeben, und der Kolben wird geschüttelt, bis die Rosafärbung verschwindet. Dann werden 3 Tropfen Phenolphthalein zugegeben, und die resultierende Lösung wird mit 0,1 N NaOH titriert. Das Volumen an 0,1 N NaOH wird als V₂ notiert.
Der Grad der Veresterung (% DE: % der gesamten Carboxylgruppen) wird wie folgt berechnet:
NAHRUNGSMITTELHERSTELLUNG
Einführung
Zur Einführung, Nahrungsmittelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere andere Komponenten umfassen, wie z.B. eine oder mehrere Nahrungsmittelzutaten. Typische Nahrungsmittelzutaten beinhalten irgendeine oder mehrere von einer Säure – wie Zitronensäure – oder einem Zucker – wie Saccharose, Glucose oder Invertzucker – oder Früchte oder Enzyme.
Beispielsweise verleihen Früchte dem Gel nicht nur Geschmack, Farbe und Struktur, sondern auch Pektin, Säure und eine geringe Menge an Feststoffen. In Abhängigkeit von der in der Frucht vorhandenen Menge an natürlichen Geschmacks- und Farbstoffen macht die Fruchtmenge normalerweise 25% bis 60% der Konfitüre aus. Der Feststoffgehalt gewöhnlicher Früchte beträgt etwa 10% Brix, doch es kann auch Fruchtkonzentrat verwendet werden, welches typischerweise einen Brixwert von 65–70% hat. Der pH-Wert von Früchten variiert in Abhängigkeit von der betreffenden Frucht sehr stark, doch haben die meisten Früchte einen pH-Wert zwischen 3,0 und 3,5 Auch der Pektingehalt variiert in Abhängigkeit von der betreffenden Frucht. Beispielsweise haben rote Johannisbeeren, schwarze Johannisbeeren und Orangen einen hohen Pektingehalt, und es können zufriedenstellende Gele aus diesen Früchten erhalten werden, indem nur eine kleine Menge an zusätzlichem Pektin zugegeben wird. Die Auswahl des GRINDSTED^TM-Pektins ist abhängig von der Art der betreffenden Konfitüre. Beispielsweise wird GRINDSTED^TM-Pektin SS 200 in Konfitüren, die keine Fruchtstücke enthalten, oder in Konfitüren, die nur sehr kleine Fruchtstücke enthalten, verwendet. Das Zerfallen der Früchte stellt in solchen Konfitüren kein Problem dar, und so können ein langsam abbindendes Pektin und eine niedrigere Befüllungstemperatur verwendet werden. GRINDSTED^TM-Pektin RS 400 wird in Konfitüren, die große Fruchtstücke oder ganze Früchte, beispielsweise Kirschen oder Erdbeeren, enthalten, verwendet. In Konfitüren, die ganze Früchte enthalten, kann es schwierig sein, ein Zerfallen der Früchte zu verhindern, und es ist daher notwendig, ein schnell abbindendes Pektin, wie GRINDSTED^TM-Pektin RS 400, zu verwenden.
Die Auswahl des Pektintyps kann auch von der Größe des jeweiligen Behälters abhängen. Wenn Standardgläser verwendet werden, ist die Befüllungstemperatur im Hinblick auf die Stabilität des Pektins weniger kritisch, da die Gläser nach dem Befüllen relativ schnell abkühlen und das Pektin sich nicht zersetzt. Wenn jedoch die Konfitüre in große Behälter, z.B. von 500 oder 1.000 kg, gefüllt wird, wird die Kühlzeit sehr lang. Besonders in der Mitte eines solchen Behälters unterliegt das Pektin einer Zersetzung, und das Gel wird in der Mitte weniger fest sein als an den Seiten. Folglich wird für große Behälter im allgemeinen ein langsamer abbindendes Pektin verwendet, welches eine Befüllung bei niedrigeren Temperaturen erlaubt und somit eine Zersetzung des Pektins verhindert.
Zucker wird aus verschiedenen Gründen zu Konfitüren zugegeben, wie beispielsweise:

1. Um lösliche Feststoffe bereitzustellen – HE-Pektine können einen Gehalt an löslichen Feststoffen von mindestens 55% erfordern, ehe sie gelieren.
2. Um Süße bereitzustellen.
3. Um eine größere physikalische, chemische und mikrobiologische Stabilität bereitzustellen.
4. Um ein verbessertes Mundgefühl bereitzustellen.
5. Um eine verbesserte Farbe und einen verbesserten Glanz bereitzustellen.

Der normalerweise verwendete Zucker ist Saccharose, doch können in Abhängigkeit von dem gewünschten Geschmack, der gewünschten Süßungswirkung, der gewünschten Kristallisation oder der gewünschten Struktur auch andere Zucker verwendet werden. Auch der Preis kann einen Einfluß darauf haben, welche Art von Zucker verwendet wird.
Invertzucker hat dieselbe Süßungswirkung wie Saccharose, wohingegen Glucosesirup, Glucose und Sorbitol eine verminderte Süßungswirkung haben. Maissirup mit hohem Fructosegehalt und Fructose haben eine stärkere Süßungswirkung als Saccharose.
Die Struktur und die Festigkeit des Gels sowie die Gelierungstemperatur werden in gewissem Umfang durch Veränderungen in der Zuckerzusammensetzung beeinflußt.
Säure wird aus zwei Gründen zugegeben: 1) teilweise, um den pH-Wert auf 3,0–3,2 zu reduzieren, um mit dem Pektin ein zufriedenstellendes Gel zu erhalten, und 2) teilweise, um den Geschmack der Frucht zu verstärken. Der optimale pH-Wert für eine Gelierung unter Verwendung der HE-Pektine ist von der Art des jeweiligen Pektins und dem Feststoffgehalt abhängig.
Wenn GRINDSTED^TM-Pektin SS 200 in Konfitüre mit 65–68% Brix verwendet wird, beträgt der optimale pH-Wert 3,0–3,2.
Wenn der Feststoffgehalt höher ist, beträgt der optimale pH-Wert 3,1–3,3.
Wenn dagegen der Feststoffgehalt niedriger ist, beträgt der optimale pH-Wert 2,8–3,0.
Wenn GRINDSTED^TM-Pektin RS 400 verwendet wird, liegt der optimale pH-Wert etwa um 0,2 Einheiten höher als der für GRINDSTED^TM-Pektin SS 200.
Die am häufigsten verwendete Säure ist Zitronensäure-Monohydrat in einer Lösung von 50% w/w.
Andere Säuren (wie Äpfelsäure, Weinsäure oder Phosphorsäure) können verwendet werden, müssen jedoch immer in Lösung vorliegen.
Die Auswahl der Säure ist abhängig von der Gesetzgebung, dem Preis und der Sauerheit der Süße, die in dem Endprodukt vorhanden sein soll.
Zitronensäure verleiht dem Endprodukt einen relativ stark sauren Geschmack, wohingegen Äpfelsäure einen milderen, jedoch länger anhaltenden Geschmack erzeugt.
Weinsäure kann zu einem leicht bitteren Geschmack führen und Phosphorsäure erzeugt einen süßeren Geschmack.
Enzymatisch behandeltes Pektin kann Synärese, die bei der Herstellung von Marmeladen und Konfitüren mit einem geringen Gehalt an löslichen Feststoffen häufig auftreten kann, verhindern.
KONFITÜRE MIT WENIG ZUCKER UND MARMELADE MIT 25% SS Formulierung

* Typische Früchte beinhalten Erdbeere, Apfel, Zitrusfrüchte und schwarze Johannisbeere
^** Oder irgendeine andere Nahrungsmittelsäure
¹ Das mit Enzym modifizierte Pektin kann dasjenige aus der WO-A-97/03574 sein
² Das PME kann diejenige aus der WO-A-97/03574 sein

Verfahren
Herstellung der Pektinlösung:

1. Trockenmischen von mit Enzym modifiziertem Pektin und Zucker
2. Lösen des Pektin-Zucker-Gemischs in heißem Wasser (80°C) unter gründlichem Schütteln

Konfitüre:

1. Frucht, Zucker und Wasser werden gemischt.
2. Das Fruchtgemisch wird kurz aufgekocht und auf 40°C gekühlt.
3. Nach Kühlen auf 40°C wird PME-Lösung zugegeben.
4. Die Reaktionszeit für das Fruchtgemisch beträgt eine Stunde.
5. Das Fruchtgemisch wird für einige Minuten auf 85°C erhitzt, und die Konfitüre wird auf den gewünschten SS-Gehalt eingedampft.
6. Die Pektinlösung wird zugegeben.
7. Konservierungsstoffe werden zugegeben und der pH-Wert wird eingestellt.
8. Die Konfitüre wird auf Befüllungstemperatur gekühlt, abgefüllt und auf Raumtemperatur gekühlt.

Dieses Beispiel kann durch Zugabe von oder Substitution mit wenigstens einem anderen geeigneten Nahrungsmittelbestandteil und/oder durch Zugabe eines anderen geeigneten Enzyms (wie z.B. einer Glucanase) modifiziert werden.
KONFITÜRE MIT WENIG ZUCKER UND MARMELADE MIT 50%SS Formulierung

^* Typische Früchte beinhalten Erdbeere, Apfel, Kirsche, Zitrusfrüchte und schwarze Johannisbeere
^** Oder irgendeine andere Nahrungsmittelsäure
¹ Das mit Enzym modifizierte Pektin kann dasjenige aus der WO-A-97/03574 sein
² Die PME kann diejenige aus der WO-A-97/03574 sein

Verfahren
Herstellung der Pektinlösung:

Konfitüre:

1. Frucht, Zucker und Wasser werden gemischt.
2. Das Fruchtgemisch wird kurz aufgekocht und auf 40°C gekühlt.
3. Nach Kühlen auf 40°C wird PME-Lösung zugegeben.
4. Die Reaktionszeit für das Fruchtgemisch beträgt eine Stunde.
5. Das Fruchtgemisch wird für einige Minuten auf 85°C erhitzt.
6. Der restliche Zucker und die Pektinlösung werden zugegeben, und die Konfitüre wird auf den gewünschten SS-Gehalt eingedampft.
7. Die Konfitüre wird auf Befüllungstemperatur gekühlt, abgefüllt und auf Raumtemperatur gekühlt.

Dieses Beispiel kann durch Zugabe von oder Substitution mit wenigstens einem anderen geeigneten Nahrungsmittelbestandteil und/oder durch Zugabe eines anderen geeigneten Enzyms (wie z.B. einer Glucanase) modifiziert werden.
Für Fachleute auf dem Gebiet liegen Modifikationen der vorliegenden Erfindung auf der Hand. Beispielsweise, und wie es in den obigen Beispielen angegeben ist, würden zusätzliche Beispiele die Anwendung von sowohl PME als auch Glucanase beinhalten, um ein Pektin mit einem geringeren Veresterungsgrad (z.B. ein langsam abbindendes Pektin) zu erhalten.
HERSTELLUNG VON MIT PFLANZEN-PME MODIFIZIERTEM ORANGENBREI
Stufe I
Orangenstücke wurden in einem Mischer homogenisiert und für 15 Minuten gekocht, um jegliche endogenen Enzyme zu inaktivieren. Nach Einfrieren/Auftauen wurden 20% (w/w) Zucker zugegeben, und der Orangenbrei wurde mit vorgeheiztem (95–100°C) entionisiertem Wasser 1:1 verdünnt. Der Brei wurde in Glaskolben überführt, und der pH-Wert und die Temperatur wurden auf 7,0 (unter Verwendung von 10% NaOH) bzw. 40°C eingestellt.
Gereinigte Pflanzen-PME (300 μmol/min/ml) in einer Konzentration von 113 μl/200 g Orangenbrei wurde mit dem Brei bei 40°C für 15 Minuten inkubiert, und anschließend wurde der pH-Wert unter Verwendung von Zitronensäure (50% w/v) auf 3,2 (+/– 0,6) eingestellt. Um die zugegebene Pflanzen-PME zu inaktivieren, wurde der Brei bei 85°C für 3 Minuten hitzebehandelt. Während die Aktivität von Pflanzen-PME für ihre Aktivität typischerweise die Zugabe von NaCl erfordert, erforderte diese Zubereitung von enzymatisch modifiziertem Orangenbrei kein exogen zugegebenes NaCl, da endogenes NaCl in ausreichender Menge (24 ppm) vorhanden war, um PME-Aktivität sicherzustellen.
Der mit Pflanzen-PME behandelte Brei (etwa 90 g) wurde in Kristallisationsschalen (Durchmesser: 60 mm, Höhe: 35 mm) bei 5°C gelagert. Alle Pektingelierungsmessungen wurden innerhalb von drei Tagen nach der Verarbeitung durchgeführt und lieferten reproduzierbare Ergebnisse.
Stufe II – Auswahl, Herstellung und Zugabe von Pektinsubstraten
Auswahl: Es wurden drei Pektinsubstrate zur Verwendung ausgewählt. Alle drei Substrate, GRIND-STED^TM-Pektin SS200-, P66- und P60-Substrat, wiesen einen hohen Veresterungsgrad (%DE) auf.
Dieser betrug 65%, 66% bzw. 60%. Sowohl P60 als auch P66 wurden durch Vorbehandlung von GRINDSTED^TM Ultra Rapid Set (URS)-Pektin mit Pflanzen-PME hergestellt, wohingegen GRIND-STED^TM-Pektin SS200 unbehandelt blieb. Zwei der drei Substrate, P60 und P66, waren calciumempfindlich, wohingegen GRINDSTED^TM-Pektin SS200 calciumunempfindlich war. Nur eines der drei Substrate, GRINDSTED^TM-Pektin SS200, war kommerziell erhältlich.
Herstellung: P66 und P60 wurden durch Vorbehandlung von GRINDSTED^TM URS-Pektin mit Pflanzen-PME unter Verwendung des folgenden Verfahrens hergestellt: GRINDSTED^TM URS-Pektin wurde in 0,15 M NaCl solubilisiert und für mehrere Stunden bei 40°C und einem pH-Wert von 7,0 mit Pflanzen-PME behandelt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 3,0 wurde das solubilisierte Pektin für 5–10 Minuten auf 100°C erhitzt, um jegliche vorhandene PME zu inaktivieren, und anschließend wurde es mit Isopropanol präzipitiert und vor der Verwendung getrocknet. Alle drei Pektinsubstrate wurden als eine 8%-ige Lösung hergestellt und unter Verwendung eines Magnetrührers in vorgeheiztem (80°C) entionisiertem Wasser vollständig gelöst.
Zugabe: Die Zugabe jedes Pektinsubstrats zu dem mit Pflanzen-PME enzymatisch modifizierten Brei wurde unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Magnetrührers durchgeführt, um eine homogene Lösung sicherzustellen.
Stufe III – Herstellung und Zugabe von Calciumcitrat
Pektingelierung kann durch eine Zugabe von Calcium, entweder in Form einer Aufschlämmung oder als ein Hydrat, bei hohen Temperaturen induziert werden. Ca-Citrat (C₁₂H₁₀Ca₃O₁₄ 4H₂O) wurde in einer Endkonzentration von 5 mM zu dem Gemisch zugegeben.
Stufe IV – Messung der Gelfestigkeit
Der Grad der Pektingelierung/Gelfestigkeit wurde durch Druckversuche unter Verwendung eines Texturanalysators bestimmt. Das Verfahren ist in "The Chemistry and Technology of Pectin", Hrsg. Reginald H. Walker, Academic Press, (1991) S. 240 (deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) beschrieben.
Durch Druck induzierte Viskositätsmessungen wurden auf einem SMS TA-XT2-Texturanalysator (Reciproter) unter Verwendung einer kühl gelagerten (5°C) Sonde (P 25/L) bei einer Geschwindigkeit von 2,0 mm/Sek. und einer Eindringtiefe von 30% durchgeführt. Die Probentemperatur betrug 5°C. Die Spitzenkraft in der Druckkurve gibt die Gelfestigkeit in Newton-Einheiten (N) an.
Stufe V – Tests auf Synärese und Verfestigung
Synärese wird definiert als die Unfähigkeit eines Pektingels, einen Feststoff zu bilden. Es wurde angenommen, daß ein Gel Synärese zeigte, wenn es nach Umdrehen eines das Gel enthaltenden Reaktionsgefäßes nicht intakt blieb. Es wurde angenommen, daß ein Gel Verfestigung zeigte, wenn es nach Umdrehen eines das Gel enthaltenden Reaktionsgefäßes intakt blieb. Ein intaktes Gel zeigte eine im Vergleich zu einem nicht intakten Gel sehr ebene Oberfläche.
ERGEBNISSE
Charakterisierung von mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei
Die Behandlung von Orangenbrei mit Pflanzen-PME resultierte in einem hochveresterten Pektin mit einem durchschnittlichen Veresterungsgrad (%DE) von 55,2% (%DE wurde gemäß Protokoll II bestimmt).
Tabelle I. Auswirkung von Calcium (0,096/g Ca-Citrat/100 g Orangenbrei) und/oder Behandlung mit Pflanzen-PME auf die Gelfestigkeit von Orangenbrei.
Die Gelfestigkeit des extrahierten Orangenbreis wurde entweder durch Behandlung mit Pflanzen-PME oder durch die Zugabe von Calcium leicht modifiziert (Tabelle I). Die sequentielle Behandlung von Orangenbrei mit Pflanzen-PME, gefolgt von der Zugabe von Calcium, hatte jedoch keinerlei synergistische Wirkung auf die erreichte Gelfestigkeit. Die visuelle Überprüfung der Gele deutete darauf hin, daß sie alle in flüssiger Form vorlagen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß, obwohl eine Behandlung von Orangenbrei mit Pflanzen-PME zu einem bezüglich seines Veresterungsgrads (%DE von 55,2%) und seines Ansprechens auf geringe Mengen an endogenem Calcium homogeneren Produkt führte, der enzymatisch modifizierte Brei im Hinblick auf Calciumgelierung oder erhöhte Gelfestigkeit nicht auf exogen zugegebenes Calcium reagierte.
Diese Ergebnisse zeigen auch, daß die Reaktion von mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei mit entweder endogen oder exogen zugegebenen Calciumionen nicht ausreichend ist, um eine zufriedenstellende Erhöhung der Gelfestigkeit zu bewirken.
Die Zugabe eines zweiten Pektinsubstrats, wie P66 oder P60, zu dem mit Pflanzen-PME modifizierten Brei entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Calcium induzierte eine wesentliche Erhöhung der Gelfestigkeit im Vergleich zu der unbehandelten Orangenbrei-Kontrolle (Tabelle II; 1). Insbesondere induzierten nach Zugabe jedes Substrats zu dem mit Pflanzen-PME modifizierten Orangenbrei in Gegenwart von Calcium sowohl das P66- als auch das P60-Pektinsubstrat eine 3-fache bzw. 5-fache Erhöhung der Gelfestigkeit. Der Erhöhungsfaktor der Gelfestigkeit ist bei Abwesenheit von Calcium in dem Reaktionsgemisch für beide Pektinsubstrate etwas geringer.
Die Zugabe des GRINDSTED^TM-Pektin SS200-Substrats zu dem mit Pflanzen-PME modifizierten Brei induzierte keine mehrfache Erhöhung der Gelfestigkeit, da das GRINDSTED^TM-Pektin S200-Substrat nicht mit PME vorbehandelt worden war und sich somit eine Gelierung der vereinigten Substrate als unmöglich erwies.
Tabelle II. Wirkung von vereinigten Pektinsubstraten und Calcium auf die erzielte Gelfestigkeit
Ein verfestigtes Gel wurde nach Vereinigen des P66-Pektinsubstrats mit mit Pflanzen-PME modifiziertem Orangenbrei in Gegenwart, jedoch nicht in Abwesenheit von Calcium erhalten. Im Gegenteil, nach Vereinigen des P60-Pektinsubstrats mit dem mit Pflanzen-PME modifizierten Orangenbrei entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Calcium wurden verfestigte Gele erzeugt.
Die zusätzliche Wirkung von sowohl PME-Behandlung als auch der Gegenwart von Calcium auf die Pektingelierung ist in 2 veranschaulicht. Diese Figur zeigt die relative Erhöhung der Gelfestigkeit (oder Härte), die zu beobachten ist, wenn ein P66-Pektinsubstrat in Gegenwart und in Abwesenheit von Calcium entweder zu unbehandeltem oder zu mit PME behandeltem Orangenbrei zugegeben wird, in Prozent an. Die tatsächlichen Werte für die Gelfestigkeit (N) sind neben jeder Säule angegeben, und der Prozentsatz der relativen Erhöhung der Gelfestigkeit ist oberhalb jeder Säule angegeben. Liest man die Figur von links nach rechts, so gibt Säule eins an, daß der unbehandelte Orangenbrei eine geringe Gelfestigkeit aufweist, was bei visueller Überprüfung ergibt, daß er flüssig ist. Wenn ein zweites Pektinsubstrat, wie P66, in Abwesenheit von Calcium zu dem unbehandelten Orangenbrei zugegeben wird, hat dies keine Auswirkung auf die erzielte Gelfestigkeit (Säule 2). Wenn jedoch P66 zu mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei zugegeben wird, ist eine Erhöhung der Gelviskosität zu beobachten (Säule 3). Eine ähnliche Erhöhung der Gelviskosität ist zu beobachten, wenn man P66 in Gegenwart von Calcium mit dem unbehandelten Orangenbrei vereinigt (Säule 4). Wenn schließlich P66 in Gegenwart von Calcium zu mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei zugegeben wird, erhält man ein verfestigtes Gel (Säule 5). Diese Ergebnisse werden ungeachtet der Reihenfolge, in welcher die Vereinigung und PME-Behandlung der Substrate stattfindet, erzielt. So wird ein verfestigtes Gel erhalten, wenn in Gegenwart von Calcium ein GRIND-STED^TM URS-Pektinsubstrat und eine Orangenbreizubereitung vereinigt und mit PME behandelt werden, oder wenn ein GRINDSTED^TM URS-Pektinsubstrat und eine Orangenbreizubereitung separat mit PME vorbehandelt werden, ehe sie in Gegenwart von Calcium vereinigt werden.
Die in den 1 und 2 beschriebenen Experimente wurden wiederholt, und die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben. Eine visuelle Überprüfung der bei diesen Experimenten erzeugten Gele bestätigte frühere Feststellungen:

(i) Orangenbrei alleine oder nach Behandlung mit Pflanzen-PME und Calcium, entweder allein oder in Kombination, induziert keine Erhöhung der Gelfestigkeit.
(ii) Die Zugabe von Calcium alleine zu GRINDSTED^TM URS-Pektin verändert nicht die Funktionalität des Pektins. Gleichermaßen wird, wenn GRINDSTED^TM URS-Pektin nicht mit Pflanzen-PME behandelt wird, eine Zunahme der Viskosität, jedoch keine Verfestigung beobachtet, wenn es entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Calcium mit mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei vereinigt wird.
(iii) Die Behandlung von GRINDSTED^TM URS-Pektin mit Pflanzen-PME erzeugt P66, welches das Pektin leistungsfähiger macht, wenn es in Gegenwart von Calcium mit mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei vereinigt wird. Diese erhöhte Funktionalität bzw. Leistungsfähigkeit wird durch die Induzierung der Verfestigung in der Gelprobe angezeigt.
(iv) Die Behandlung zweier Pektinsubstrate, wie Orangenbrei und GRINDSTED^TM URS-Pektin, mit Pflanzen-PME führt zu leistungsfähigeren hochveresterten Pektinen, die in Gegenwart von Calcium in der Lage sind, eine Verfestigung von Konfitüre mit einem geringen Gehalt an Feststoffen zu induzieren.

Tabelle III. Auswirkung von vereinigten Pektinsubstraten und Calcium auf die beobachtete Gelfestigkeit

^* GRINDSTED^T ^M URS-Pektin

DISKUSSION
Wenn eine Konfitüre mit einem geringen Gehalt an löslichen Feststoffen aus einem Orangenbreihomogenisat hergestellt wird, wird selbst nach Behandlung mit Pflanzen-PME oder nach der Zugabe von exogenem Calcium keine Gelierung beobachtet. Gleichermaßen wird, wenn ein zweites hochverestertes Pektinsubstrat, wie P66, zu einer unbehandelten Orangenbreizubereitung zugegeben wird, dies keine Auswirkung auf deren Gelierfähigkeit haben, selbst wenn das zweite Pektinsubstrat durch Vorbehandeln mit einem Pflanzen-PME-Enzym leistungsfähiger gemacht wird. Eine Erhöhung der Gelviskosität wird jedoch beobachtet, wenn ein zweites hochverestertes Pektinsubstrat, wie P66, in Gegenwart von Calcium mit unbehandeltem Orangenbrei vereinigt wird. Eine ähnliche Wirkung im Hinblick auf eine Erhöhung der Gelviskosität wird beobachtet, wenn dasselbe hochveresterte Pektinsubstrat (P66) in Abwesenheit von Calcium mit mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei vereinigt wird.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß Erhöhungen der Gelviskosität entweder durch eine vor der Vereinigung mit einem hochveresterten Pektinsubstrat, wie P66, erfolgende Behandlung von Orangenbrei mit Pflanzen-PME oder durch Vereinigen von unbehandeltem Orangenbrei mit P66 in Gegenwart von Calcium induziert werden können. Die Ergebnisse zeigen auch an, daß die Vereinigung von mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei mit P66 in Gegenwart von Calcium zu einem verfestigten Gel führt. Diese Wirkung wird ungeachtet der Reihenfolge, in der die Vereinigung und PME- Behandlung der Substrate stattfindet, erzielt. Somit wird entweder durch Vorbehandeln der Pektinsubstrate mit PME vor der Vereinigung oder durch Behandeln der vereinigten Substrate mit PME in Gegenwart von Calcium eine Verfestigung des Gels beobachtet.
ZUSAMMENFASSUNG
Wenn eine Konfitüre mit einem geringen Gehalt an löslichen Feststoffen aus Orangenbrei hergestellt wird, wird selbst nach der Behandlung des Orangenbreis mit Pflanzen-PME oder nach der Zugabe von exogenem Calcium keine Gelierung beobachtet.
Wenn ein zweites hochverestertes Pektinsubstrat zu einem unbehandelten Orangenbrei zugegeben wird, hat dies keinerlei Auswirkung auf dessen Gelierfähigkeit, selbst wenn das zweite Substrat vor der Zugabe durch Vorbehandeln mit einem Pflanzen-PME-Enzym leistungsfähiger gemacht wird.
Die Vereinigung von mit Pflanzen-PME behandeltem Orangenbrei und mit PME vorbehandelten hochveresterten Pektinsubstraten entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Calcium erzeugt Gele mit wesentlich größerer Gelfestigkeit und verbesserter Funktionalität. Somit verbessert eine Behandlung von Pektinsubstraten mit PME entweder alleine oder in Kombination deren Gelierfähigkeit, indem die Pektinsubstrate als hochveresterte Substrate in Gegenwart von Calcium leistungsfähiger gemacht werden.
SEQUENZEN

Claims

Erstarrende Zusammensetzung, welche eine Pektinmethylesterase (PME), ein PME-Substrat und ein hochverestertes, mit PME behandeltes Pektin oder ein Derivat davon enthält, wobei das hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder das Derivat davon empfindlich gegenüber Calciumionen ist und wobei weder das PME-Substrat noch das hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder das Derivat davon in situ von dem anderen stammt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die PME rekombinant ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das PME-Substrat Pektin oder ein Derivat davon ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das PME-Substrat in einer Pflanze und/oder einem Pflanzenmaterial vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Pflanze oder das Pflanzenmaterial eine/eines oder mehrere unter einem Gemüse, einem Gemüsematerial, einer Frucht oder einem Fruchtmaterial ist/sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Gemüsematerial und/oder das Fruchtmaterial ein Brei ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das PME-Substrat ein hochverestertes Pektin ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welche in einem verfestigten Gelzustand vorliegt und einen Gehalt an löslichen Feststoffen von weniger als 50 Gew.-% aufweist, wobei das Erstarren unter Verwendung eines hochveresterten PME-Substrats stattgefunden hat.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ein Nahrungsmittel ist oder bei der Herstellung eines Nahrungsmittels verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung einer erstarrenden Zusammensetzung, welche ein PME-Substrat und ein calciumempfindliches, hochverestertes, mit PME behandeltes Pektin oder ein Derivat davon enthält, wobei das Verfahren umfaßt, daß man das PME-Substrat und das calciumempfindliche, hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder das Derivat davon mit PME behandelt, bevor, während und/oder nachdem man das PME-Substrat und das calciumempfindliche, hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder das Derivat davon unter Ausbildung der Zusammensetzung vereinigt, wobei weder das PME-Substrat noch das calciumempfindliche, hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder das Derivat davon in situ von dem anderen stammt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die PME rekombinant ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei das PME-Substrat wie in einem der Ansprüche 3 bis 10 definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Verfahren für die Herstellung eines Nahrungsmittels eingesetzt wird.
Verfahren zum Verleihen von Stabilität an ein Reaktionsmedium, welches ein PME-Substrat enthält, wobei das Verfahren umfaßt, daß man wenigstens eine PME und ein calciumempfindliches, hochverestertes, mit PME behandeltes Pektin oder ein Derivat davon hinzufügt, wobei weder das PME-Substrat noch das calciumempfindliche, hochveresterte, mit PME behandelte Pektin oder das Derivat davon in situ von dem anderen stammt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Reaktionsmedium ein Nahrungsmittel ist oder für die Herstellung eines Nahrungsmittels vorgesehen ist.
Zusammensetzung, erhältlich nach dem Verfahren eines der Ansprüche 10 bis 15.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, welche in einem Gelzustand verfestigt ist und einen Gehalt an löslichen Feststoffen von weniger als 50 Gew.-% aufweist, wobei das Erstarren unter Verwendung eines hochveresterten PME-Substrates stattgefunden hat.