DE19921676A1 - Aminosäuresequenz - Google Patents

Abstract

Eine Aminosäuresequenz wird beschrieben, die PME-Aktivität beeinflußt. Die Aminosäuresequenz besitzt die Formel (I): DOLLAR A A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20- DOLLAR A A21-A22

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Aminosäurese­ quenz. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nucleo­ tidsequenz, die diese codiert.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Aminosäuresequenz, die eine enzymatische Aktivität beein­ flussen kann. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nucleotidsequenz, die diese codiert.

Pectin ist ein wichtiges Erzeugnis in der heutigen In­ dustrie. Beispielsweise kann es in der Lebensmittelindustrie als Verdickungs- oder Geliermittel, wie bei der Herstellung von Marmeladen, verwendet werden.

Pectin ist ein Strukturpolysaccharid, das üblicherweise in Form von Protopectin in Pflanzenzellwänden aufgefunden wird. Das Grundgerüst von Pectin umfaßt α-1,4-verknüpfte Galacturonsäurereste, die durch eine kleine Anzahl von 1,2-verknüpften α-L-Rhamnoseeinheiten unterbrochen sind. Zusätzlich umfaßt Pectin stark verzweigte Regionen mit einer fast alternierenden Rhamnogalacturonankette. Diese stark verzweigten Regionen enthalten auch andere Zuckereinheiten (wie D-Galactose, L-Arabinose und Xylose), die durch Glyco­ sidbindungen an die C3- oder C4-Atome der Rhamnoseeinheiten oder die C2- oder C3-Atome der Galacturonsäureeinheiten ge­ bunden sind. Die langen Ketten der α-1,4-verknüpften Galac­ turonsäurereste werden üblicherweise als "glatte" Regionen bezeichnet, wohingegen die verzweigten Regionen üblicher­ weise als "haarige Regionen" bezeichnet werden.

Einige der Carboxylgruppen der Galacturonsäurereste sind verestert (z. B. sind die Carboxylgruppen methyliert). Typischerweise tritt die Veresterung der Carboxylgruppen nach Polymerisation der Galacturonsäurereste ein. Jedoch ist es extrem selten, daß alle Carboxylgruppen verestert (z. B. methyliert) sind. Üblicherweise variiert der Grad der Ver­ esterung von 0 bis 90%. Wenn 50% oder mehr der Carboxyl­ gruppen verestert sind, wird das resultierende Pectin als "stark verestertes Pectin" (abgekürzt "HE-Pectin") oder als "stark methoxyliertes Pectin" bezeichnet. Wenn weniger als 50% der Carboxylgruppen verestert sind, dann wird das re­ sultierende Pectin als "niedrig verestertes Pectin" (abge­ kürzt "LE-Pectin") oder "niedrig methoxyliertes Pectin" be­ zeichnet. Wenn 50% der Carboxylgruppen verestert sind, dann wird das resultierende Pectin als "mittelgradig verestertes Pectin" (abgekürzt "ME-Pectin") oder als "mittelgradig meth­ oxyliertes Pectin" bezeichnet. Wenn das Pectin keine - oder nur ein paar - veresterte Gruppen enthält, wird es üblicher­ weise als Pectinsäure bezeichnet.

Die Struktur des Pectins, insbesondere der Vereste­ rungsgrad (z. B. Methylierung), diktiert viele der daraus re­ sultierenden physikalischen und/oder chemischen Eigenschaf­ ten des Pectins. Beispielsweise hängt die Pectingelierung von der chemischen Natur des Pectins, insbesondere dem Ver­ esterungsgrad, ab. Zusätzlich hängt die Pectingelierung je­ doch auch von dem Gehalt an löslichen Feststoffen, dem pH-Wert und der Calciumionenkonzentration ab. Bezüglich des zu­ letzt genannten Parameters wird angenommen, daß die Calcium­ ionen Komplexe mit freien Carboxylgruppen, insbesondere den­ jenigen auf einem LE-Pectin, bilden.

Pectinenzyme werden gemäß ihrer Art des Angriffs auf den Galacturonan-Teil des Pectinmoleküls klassifiziert. Eine Übersicht über einige pectloytische Enzyme wurde von Pilnik und Voragen (Food Enzymology, Hrsg.: P.F. Fox; Elsevier; (1991); S. 303-337) zusammengestellt. Insbesondere entestern Pectinmethylesterasen (EC 3.1.1.11), die ansonsten als PMEs bezeichnet werden, HE-Pectine in die LE-Pectine oder Pectin­ säuren. Im Gegensatz dazu spalten beispielsweise Pectin­ depolymerasen die Glycosidbindungen zwischen den Galactu­ ronosylmethylesterresten.

Ausführlicher ausgeführt erzeugt die PME-Aktivität freie Carboxylgruppen und freies Methanol. Die Zunahme der freien Carboxylgruppen kann leicht durch automatische Titra­ tion überwacht werden. In dieser Hinsicht zeigten frühere Untersuchungen, daß einige PMEs Pectine zufallsweise ent­ estern, in dem Sinne, daß sie jeden der veresterten (z. B. methylierten) Galacturonsäurereste auf einer oder mehr als einer Pectinkette entestern. Beispiele für die PMEs, die zufallsweise Pectine entestern, können aus Pilzquellen, wie Aspergillus aculeatus (vgl. WO 94/25575) und Aspergillus japonicus (Ishii et al., 1980 J Food Sci 44, S 611-14) er­ halten werden. Baron et al. (1980 Lebensm. Wiss. M-Technol 13, S. 330-333) isolierten offenbar eine Pilz-PME aus Aspergillus niger. Es wird beschrieben, daß diese Pilz-PME ein Molekulargewicht von 39 000 Da, einen isoelektrischen Punkt von 3,9, ein pH-Optimum von 4,5 und einem K_m-Wert (mg/ml) von 3 besitzt.

Im Gegensatz dazu entestern einige PMEs bekanntlich Pectine blockweise so, daß angenommen wird, daß sie Pectine entweder an den nichtreduzierten Enden oder in der Nähe von freien Carboxylgruppen angreifen und dann entlang der Pectinmoleküle nach einem einkettigen Mechanismus fortschreiten, wobei Blöcke von nichtveresterten Galacturon­ säureeinheiten erzeugt werden, die calciumempfindlich sein können. Beispiele für solche Enzyme, die blockweise enzy­ matisch Pectin entestern, sind Pflanzen-PMEs. Es wurde die Existenz von bis zu 12 Isoformen von PME in Citrusfrüchten vorgeschlagen (Pilnik W. und Voragen A.G.J. (Food Enzymology (Hrsg.: P.F. Fox); Elsevier; (1991); S. 303-337). Diese Iso­ formen besitzen unterschiedliche Eigenschaften.

Eine zufallsweise oder blockweise Verteilung der freien Carboxylgruppen kann durch eine Hochleistungs-Ionenaus­ tauschchromatographie (Schols et al. Food Hydrocolloids, 1989 6, S. 115-121) unterschieden werden. Diese Tests werden oft verwendet, um unerwünschte PME-Restaktivität in Citrus­ früchten nach Pasteurisation zu überprüfen, weil ver­ bleibende PME den sog. "Trübungsverlust" in Orangensaft zu­ sätzlich zu einer Anreicherung von Methanol im Saft bewirken kann.

Versteeg et al. (J Food Sci 45 (1980), S. 969-971) iso­ lierten offenbar eine PME aus Orange. Diese Pflanzen-PME soll in multiplen Isoformen mit unterschiedlichen Eigen­ schaften vorkommen. Die Isoform I besitzt ein Molekularge­ wicht von 36 000 Da, einen isoelektrischen Punkt von 10,0, ein pH-Optimum von 7,6 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,083. Die Isoform II besitzt ein Molekulargewicht von 36 200 Da, einen isoelektrischen Punkt von 11,0, ein pH-Optimum von 8,8 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,0046. Die Isoform III (HMW-PE) besitzt ein Molekulargewicht von 54 000 Da, einen isoelektrischen Punkt von 10,2, ein pH-Optimum von 8 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,041. Jedoch gab es bis heute nur sehr begrenzte Sequenzdaten für solche PMEs.

Gemäß Pilnik und Voragen (a.a.O.) können PMEs in einer Anzahl von anderen höheren Pflanzen, wie Apfel, Aprikose, Avocado, Banane, Beerenfrüchten, Limone, Grapefruit, Mandarine, Kirschen, schwarzen Johannisbeeren, Weintrauben, Mango, Papaya, Passionsfrucht, Pfirsich, Birne, Pflaumen, Bohnen, Karotten, Blumenkohl, Gurke, Lauch, Zwiebeln, Erbse, Kartoffel, Rettich und Tomate, gefunden werden. Jedoch gibt es in ähnlicher Weise bis heute nur sehr begrenzte Se­ quenzdaten für derartige PMEs.

Eine Pflanzen-PME wurde in der WO-A-97/03574 beschrie­ ben. Diese PME besitzt die folgenden Eigenschaften: Moleku­ largewicht von etwa 36 kDa bis etwa 64 kDa; pH-Optimum von pH 7 bis 8 bei Messung mit 0,5% Limonenpectin in 0,15 M NaCl; Temperaturoptimum von mindestens 50°C; Temperatursta­ bilität im Bereich von 10° bis mindestens 40°C; K_m-Wert von 0,07%; ein Aktivitätsmaximum bei Gehalten von etwa 0,25 M NaCl; ein Aktivitätsmaximum bei Gehalten von etwa 0,2 M Na₂SO₄; ein Aktivitätsmaximum bei Gehalten von etwa 0,3 M NaNO₃.

Eine weitere PME wurde in der WO 97/31102 beschrieben.

Die PMEs besitzen wichtige Anwendungen in der Indu­ strie. Beispielsweise können sie in oder als Sequestiermit­ tel(n) für Calciumionen verwendet werden. In dieser Hinsicht kann nach Pilnik und Voragen (a.a.O.) Viehfutter durch Zu­ gabe einer Aufschlämmung von Calciumhydroxid zu Citrusscha­ len nach Saftextraktion hergestellt werden. Nach der Zugabe aktivieren der hohe pH-Wert und die Calciumionen jede native PME in der Schale, was eine rasche Entesterung des Pectins und ein Eintreten der Calciumpectatkoagulation verursacht. Die gebundene flüssige Phase wird freigesetzt und wird leicht ausgepreßt, so daß nur eine Fraktion des ursprüngli­ chen Wassergehalts durch teures thermisches Trocken entfernt werden muß. Der Preßsaft wird dann als Tierfutter verwendet.

Wie vorstehend angegeben, wurde eine PME aus Aspergil­ lus aculeatus (WO 94/25575) erhalten. Offensichtlich kann diese PME verwendet werden, um die Festigkeit eines pectin­ haltigen Materials zu verbessern oder um Pectin zu demethy­ lieren oder um die Viskosität eines pectinhaltigen Materials zu erhöhen.

Es war auch üblich, PME zur Herstellung von Lebensmit­ teln, die aus pectinhaltigen Frucht- oder Gemüsematerialien hergestellt wurden, wie Marmeladen oder Konserven, zu verwenden. Beispielsweise beschreibt die WO-A-94/25575 wei­ ter die Herstellung von Orangenmarmelade und Tomatenpaste unter Verwendung von aus Aspergillus aculeatus erhaltener PME.

Die JP-A-63/209553 beschreibt Gele, die durch die Ein­ wirkung von Pectinmethylesterase - in Gegenwart eines mehr­ wertigen Metallions - auf ein Pectinpolysaccharid, das als Hauptkomponente eine stark methoxylierte Poly-α-1,4-D-galac­ turonidkette enthält, erhalten wurden, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Pilnik und Voragen (a.a.O.) führen die Verwendungen endogener PMEs auf, die ihre Zugabe zu Fruchtsäften zur Ver­ ringerung der Viskosität des Safts, wenn er zuviel Frucht­ pectin enthält, ihre Zugabe als Pectinaselösungen zu den Gasblasen in der Albedo von Citrusfrüchten, die auf eine Kerntemperatur von 20°C bis 40°C erhitzt wurden, um das Entfernen der Schale und sonstiger Zwischenwände von intak­ ten Saftsegmenten zu erleichtern (US-A-4284651), und ihre Verwendung zum Schutz und zur Verbesserung der Textur und Festigkeit mehrerer verarbeiteter Früchte und Gemüse, wie Äpfel (Wiley & Lee, 1970, Food Technol 24, 1168-70), eingedoste Tomaten (Hsu et al., 1965, J Food Sci, 30, S. 583-588) und Kartoffeln (Bartolome & Hoff, 1972, J Agric Food Chem 20, S. 262-266), umfassen.

Glahn und Rolin (1994 Food Ingredients Europe, Conf Proceedings, S. 252-256) beschreiben die hypothetische An­ wendung des industriellen "GENU-Pectintyps YM-100" zur Wech­ selwirkung mit Sauermilchgetränken. Es werden überhaupt kei­ ne Einzelheiten angegeben, wie GENU-Pectintyp YM-100 herge­ stellt wird.

Die EP-A-0664300 beschreibt ein chemisches Fraktionie­ rungsverfahren zur Herstellung von calciumempfindlichem Pectin. Dieses calciumempfindliche Pectin soll in der Le­ bensmittelindustrie vorteilhaft sein.

So besitzen Pectine und entesterte Pectine zusätzlich zu den PMEs eine industrielle Bedeutung.

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die enzyma­ tische Aktivität einer PME dadurch zu beeinflussen, daß man in eine PME eine ziemlich kurze Aminosäuresequenz inser­ tiert, daraus deletiert oder darin umwandelt. In dieser Hin­ sicht kann die enzymatische Aktivität einer PME durch Inser­ tieren oder Deletieren einer spezifischen Aminosäuresequenz oder Umwandlung einer Sequenz in diese verändert werden. Je­ doch kann wichtigerweise die so erhaltene PME immer noch als PME wirken.

Erfindungsgemäß wird eine Aminosäuresequenz der Formel (I):

bereitgestellt, worin
A1 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A2 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A3 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A4 eine polare Aminosäure ist,
A5 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A6 eine polare Aminosäure ist,
A7 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A8 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A9 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A10 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A11 eine geladene Aminosäure ist,
A12 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A13 eine hydrophobe oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A14 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine gela­ dene oder neutrale Aminosäure ist,
A15 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A16 eine polare oder hydrophobe oder geladene Aminosäure oder neutrale Aminosäure ist,
A17 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A18 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A19 eine polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A20 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A21 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A22 eine polare oder hydrophobe Aminosäure ist.

Wie angegeben, wurde gefunden, daß die Aminosäurese­ quenz der Formel (I) die PME-Aktivität beeinflußt.

Insbesondere wurde gefunden, daß die Aminosäuresequenz der Formel (I) eine Rolle darin spielt, ob eine PME block­ weise oder zufallsweise ein PME-Substrat entestern kann.

Genauer wurde gefunden, daß die Anwesenheit der Amino­ säuresequenz der Formel (I) in einer PME bedeutet, daß die PME blockweise ein PME-Substrat entestern kann. Andererseits bedeutet das Fehlen eines Anteils oder der Gesamtheit der Aminosäuresequenz der Formel (I) in einer PME, daß die PME ein PME-Substrat zufallsweise entestern kann.

Diese Ergebnisse sind dahingehend überraschend, daß eine relativ kurze Aminosäuresequenz bis zu mindestens einem gewissen Ausmaß den Aktivitätstyp eines Enzyms, insbesondere einer PME, steuern kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Aminosäuresequenz der Formel (I) zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivität.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein modifizier­ tes Enzym, das die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Lebensmit­ tel, das durch die Verwendung der Aminosäuresequenz der For­ mel (I) hergestellt wurde.

Bevorzugt ist das Lebensmittel ein Pectin.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine modifizierte PME, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Entmethylierung von Pectin, wobei man Pectin mit einer modifizierten PME, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, in Kontakt bringt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, das die Verwendung eines demethylierten Pectins umfaßt, wobei das demethylierte Pectin durch Inkontaktbringen von Pectin mit einer modifi­ zierten PME, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) um faßt, hergestellt wird.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch ein PME-Enzym, das die Aminosäuresequenz der Formel (I) um­ faßt. Jedoch umfaßt bei dieser Ausführungsform die vorlie­ gende Erfindung nicht eine native PME, wenn diese in ihrer natürlichen Umgebung vorkommt und wenn sie durch ihre native Nucleotidcodierungssequenz, die auch in ihrer natürlichen Umgebung vorkommt, exprimiert wurde, und wenn diese Nucleo­ tidsequenz unter der Kontrolle des nativen Promotors steht, der auch in seiner natürlichen Umgebung vorkommt. Der Ein­ fachheit halber wird diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als "nichtnative PME" bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nucleotidse­ quenzen, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codieren.

So betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Nucleo­ tidsequenz, die ein PME-Enzym codiert, das die Aminosäurese­ quenz der Formel (I) umfaßt. Jedoch umfaßt in dieser Aus­ führungsform die vorliegende Erfindung nicht ein Gen, das eine native PME codiert, wenn es in seiner natürlichen Um­ gebung vorkommt, und wenn das Gen unter der Kontrolle seines nativen Promotors steht, der auch in seiner natürlichen Um­ gebung vorkommt. Der Einfachheit halber wird diese Ausfüh­ rungsform der vorliegenden Erfindung als "Gen, das nicht­ native PME codiert" bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Konstrukte, Vek­ toren, Plasmide, Zellen, Gewebe, Organe und Organismen, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfassen oder expri­ mieren können, - wobei diese(s) Teil einer größeren Amino­ säuresequenz (z. B. als ein PME-Enzym) sein kann - und/oder die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz.

Weitere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung um­ fassen Verfahren zur Expression oder Bewirkung der Expres­ sion oder Transformation eines der Nucleotidsequenz, des Konstrukts, des Plasmids, des Vektors, der Zelle, des Ge­ webes, des Organs oder des Organismus sowie der Produkte davon.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Aminosäurese­ quenzen, die zu mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Aminosäuresequenzen, die zu mindestens 85% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Aminosäuresequenzen, die zu min­ destens 90% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) ho­ molog sind, bevorzugt Aminosäuresequenzen, die zu mindestens 95% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Aminosäuresequenzen, die zu mindestens 98% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind. In einer stark bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz die gleiche wie die Aminosäuresequenz der Formel (I).

Insbesondere kann der hier verwendete Ausdruck "Homolo­ gie" mit dem Ausdruck "Identität" gleich gesetzt werden. Hier kann die Sequenzhomologie, bezogen auf die erfindungs­ gemäße Nucleotidsequenz, durch einen einfachen "Augenver­ gleich" (d. h. einen strengen Vergleich) einer oder mehrerer der Sequenzen mit einer anderen Sequenz bestimmt werden, um zu sehen, ob die andere Sequenz mindestens 75% Identität mit der/den Sequenz(en) besitzt. Eine relative Sequenz­ homologie (d. h. Sequenzidentität) kann auch durch im Handel erhältliche Computerprogramme bestimmt werden, die die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen können. Ein typisches Beispiel für ein solches Computerprogramm ist CLUSTAL.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nucleotidse­ quenzen, die Aminosäuresequenzen codieren, die zu mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Aminosäuresequenzen, die zu mindestens 85% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Aminosäuresequenzen, die zu mindestens 90% mit der Amino­ säuresequenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Amino­ säuresequenzen, die zu mindestens 95% mit der Aminosäurese­ quenz der Formel (I) homolog sind, bevorzugt Aminosäurese­ quenzen, die zu mindestens 98% mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) homolog sind. In einer stark bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz die gleiche wie die Aminosäuresequenz der Formel (I).

In ähnlicher Weise kann hier der hier verwendete Aus­ druck "Homologie" mit dem Ausdruck "Identität" gleich ge­ setzt werden. Hier kann die Sequenzhomologie, bezogen auf die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz, durch einen einfa­ chen "Augenvergleich" (d. h. einen strengen Vergleich) einer oder mehrerer der Sequenzen mit einer anderen Sequenz be­ stimmt werden, um zu sehen, ob die andere Sequenz eine min­ destens 75%ige Identität mit der/den Sequenz(en) besitzt. Eine relative Sequenzhomologie (d. h. Sequenzidentität) kann auch durch im Handel erhältliche Computerprogramme bestimmt werden, die die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen können. Ein typisches Beispiel für ein solches Computerprogramm ist CLUSTAL.

Der Ausdruck "Vektor" umfaßt Expressionsvektoren und Transformationsvektoren.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezeichnet ein Kon­ strukt, das zur in vivo und in vitro Expression befähigt ist.

Der Ausdruck "Transformationsvektor" bezeichnet ein Konstrukt, das von einer Art in die andere überführt werden kann, wie von einem E. coli in einen Fadenpilz (z. B. Aspergillus) oder in einen Nicht-Fadenpilz (z. B. Pichia). Er kann sogar ein Konstrukt sein, das von einem E. coli in ein Agrobacterium in eine Pflanze überführt werden kann.

Der Ausdruck "Gewebe" umfaßt isoliertes Gewebe und Ge­ webe in einem Organ. Das Gewebe kann ein Pflanzengewebe sein.

Der Ausdruck "Organismus" umfaßt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jeden Organismus (einschließlich Mikroorganismen und einzellige Organismen), der die erfin­ dungsgemäße Nucleotidsequenz umfassen kann, und/oder daraus erhaltene Produkte, in denen die erfindungsgemäße Nucleotid­ sequenz bei Vorhandensein in einen Organismus exprimiert werden kann. Ein bevorzugter Organismus ist ein Mikroorga­ nismus, wie ein Pilz, wie Aspergillus oder Hefe. Der Orga­ nismus kann auch eine Pflanze sein.

Die transformierte Zelle oder der transformierte Orga­ nismus kann akzeptable Mengen der gewünschten PME produ­ zieren, die leicht aus der Zelle oder dem Organismus iso­ lierbar sind.

Bevorzugt umfaßt das erfindungsgemäße Konstrukt die er­ findungsgemäße Nucleotidsequenz und einen Promotor.

Der Ausdruck "Promotor" wird im normalen Sinne auf dem Fachgebiet verwendet, z. B. eine RNA-Polymerasebindungsstelle in der Jacob-Monod-Theorie der Genexpression.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt kann der erfindungs­ gemäße Promotor die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz expri­ mieren.

Gemäß einem Gesichtspunkt kann die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz (wie beispielsweise diejenige, die eine er­ findungsgemäße PME codiert) unter der Kontrolle eines Pro­ motors stehen, der ein zell- oder gewebsspezifischer Pro­ motor sein kann. Wenn beispielsweise der Organismus eine Pflanze ist, dann kann der Promotor einer sein, der die Ex­ pression der Nucleotidsequenz in einem oder mehreren von Frucht-, Samen-, Stamm-, Sproß-, Wurzel- und Blattgeweben be­ einflußt. Der Promotor kann zusätzlich Merkmale umfassen, um die Expression in einem geeigneten Wirt zu gewährleisten oder zu erhöhen. Beispielsweise können diese Merkmale kon­ servierte Regionen, wie eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box, sein.

Das erfindungsgemäße Konstrukt kann auch noch andere Sequenzen enthalten, die die Expressionshöhen der erfin­ dungsgemäßen Nucleotidsequenz beeinflussen (wie Erhalten, Erhöhen, Erniedrigen). Beispielsweise umfassen geeignete andere Sequenzen das ShI-Intron oder ein ADH-Intron. Andere Sequenzen umfassen induzierbare Elemente, wie durch Tempe­ ratur, eine Chemikalie, Licht oder Streß induzierbare Ele­ mente. Auch können geeignete Elemente zur Erhöhung der Transkription oder Translation vorhanden sein. Ein Beispiel für das zuletzt genannte Element ist die 5'-Signalsequenz von TMV (vgl. Sleat Gene 217 [1987] 217-225; und Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Kombinationen von Promotoren und/oder Nucleotidsequenzen, die Proteine oder rekombinante Enzyme und/oder Elemente codieren.

Die Aminosäuresequenz der Formel (I) kann auch zum Durchmustern auf PME-Enzyme verwendet werden, die eine blockweise Entesterung eines PME-Substrats bewirken können. Beispielsweise kann das Durchmustern in einer Computer- Datenbank durchgeführt werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Aminosäuresequenz der Formel (I) verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die eine nachweisbare Immunant­ wort/Reaktion mit Sequenzen, die die gleichen wie die Amino­ säuresequenz der Formel (I) sind, hervorrufen können. Diese Antikörper können dann zum Durchmustern auf PME-Enzyme, die eine blockweise Entesterung eines PME-Substrats bewirken können, verwendet werden.

So betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwen­ dung der Aminosäuresequenz der Formel (I) oder eines Anti­ körpers dagegen, um auf ein PME-Enzym durchzumustern, das eine blockweise Entesterung eines PME-Substrats bewirken kann.

Antikörper können gegen das erfindungsgemäße Enzym durch Injizieren eines gereinigten Enzyms in Kaninchen und Isolieren der Immunglobuline aus dem Antiserum gemäß nach von N. Harboe und A. Ingild ("Immunization, Isolation of Immunoglobulins, Estimation of Antibody Titre" In a Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications, N.H. Axelsen et al. (Hrsg.), Universitets­ forlaget, Oslo, 1973) und von T.G. Cooper ("The Tools of Biochemistry", John Wiley & Sons, New York (1977) be­ schriebenen Verfahren erzeugt werden. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz der Formel (I) an einen Diphtherie­ toxoidträger vernetzt werden. Antikörper werden dann gegen das Konjugat erzeugt. Das Durchmustern nach PMEs, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfassen, kann unter Ver­ wendung u. a. der Antikörper und der SDS-PAGE dann durchge­ führt werden (vgl. Marcussen und Poulsen, 1991, Analytical Biochem 198: 318-323).

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein mit einem solchen Durchmustern identifiziertes PME-Enzym.

Die Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, oder auch eine Sequenz, die damit hybri­ disieren kann (bevorzugt unter stringenten Bedingungen, z. B. 65°C und 0,1 SSC {1x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-citrat, pH 7,0}, kann ebenfalls verwendet werden, um nach Genen zu suchen, die PME-Enzyme codieren, die eine blockweise Entesterung eines PME-Substrats bewirken können. Beispielsweise kann das Durchmustern in einer Bank von Clonen oder auch in einer Computer-Datenbank durchgeführt werden.

So betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwen­ dung der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, oder einer Sequenz, die damit hybridi­ sieren kann, um nach einem Gen durchzumustern, das ein PME-Enzym codiert, das eine blockweise Entesterung eines PME-Substrats bewirken kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Gen, das ein durch ein solches Durchmustern identifiziertes PME-Enzym codiert.

Die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz kann auch verwen­ det werden, um Antisense-Sequenzen zu entwickeln, die das Gen, das PME codiert und das eine Region umfaßt, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, ausschalten können. So können die Antisense-Nucleotidsequenzen in der Lage sein, selektiv eine PME abzuschalten.

Die vorliegende Erfindung ist dahingehend vorteilhaft, daß sie ein Mittel bereitstellt, um die PME-Aktivität durch Verwendung einer relativ kurzen Aminosäuresequenz und/oder einer Nucleotidsequenz, die diese codiert, zu beeinflussen.

Die Aminosäuresequenz der Formel (I) kann in eine vor­ handene PME unter Verwendung geeigneter chemischer oder bio­ logischer Techniken eingeschleust werden. Wo immer geeignet, kann die Aminosäuresequenz der Formel (I) teilweise, in ihrer Gesamtheit oder auch als Teil eines größeren Fragments eingeschleust werden. Bevorzugt ist die so erhaltene Amino­ säuresequenz der Formel (I) in der Nähe des C-terminalen Teils der aktiven Stelle der PME positioniert.

In dieser Hinsicht wird angenommen, daß die aktive Stelle der PME (die als die katalytische Stelle bezeichnet werden kann) typischerweise durch die Aminosäuresequenz der Formel (II) charakterisiert sein kann:

worin:
H unabhängig eine hydrophobe Aminosäure bezeichnet,
C unabhangig eine geladene Aminosäure bezeichnet,
P unabhängig eine polare Aminosäure bezeichnet,
G Glycin bezeichnet,
N unabhängig Glycin oder eine hydrophobe oder geladene oder polare Aminosäure bezeichnet.

Für die Aminosäuresequenz der Formel (II) umfassen Bei­ spiele für hydrophobe Aminosäuren: Ala (A), Val (V), Phe (F), Pro (P), Met (M), Ile (I), Leu (L); Beispiele für gela­ dene Aminosäuren umfassen: Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R); und Beispiele für polare Aminosäuren umfassen: Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), His (H), Cys (C), Asn (N), Gln (Q), Trp (W).

Es wird angenommen, daß die Aminosäuresequenz der For­ mel (II) für die Definition der aktiven Stelle wichtig ist, da frühere Studien gezeigt haben, daß für die Aspergillus- PME die Aminosäure 14 an der aktiven Stelle beteiligt ist, da die Veränderung eines Histidins in Alanin einen Verlust der PME-Aktivität verursachte (Duwe und Khanh (1996) Biotechn Letters, Bd. 18: 621-626).

Alternativ kann es möglich sein, eine vorhandene Amino­ säuresequenz, die in einer PME enthalten ist, beispielsweise dadurch zu verändern, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Verwendung ortsspezifischer chemischer Veränderungen polarer gemacht werden und dadurch die Aminosäuresequenz in eine Sequenz der Formel (I) umgewandelt wird und so die PME in eine PME umgewandelt wird, die blockweise ein PME-Sub­ strat entestern kann.

Alternativ kann die codierende Sequenz für eine PME durch Insertion oder Deletion oder Substitution einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, verändert werden. Sofern geeignet, kann die Nucleo­ tidsequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) co­ diert, als Teil, in ihrer Gesamtheit oder sogar als Teil eines größeren Fragments eingeschleust werden. Die Insertion mittels eines größeren Fragments kann beispielsweise geeignet sein, wenn zwei geeignete Restriktionsspaltstellen nicht in der genauen benötigten Lokalisierung vorhanden sind. In dieser Hinsicht kann es notwendig sein, ein größeres Fragment aus dem ursprünglichen Gen zu entfernen und es dann durch ein zweites Fragment zu ersetzen, das die Nucleotidsequenz umfaßt, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, und worin diese Nucleotidsequenz an einer oder beiden Seiten durch eine Sequenz flankiert sein kann, die mindestens zu mindestens einem Teil des Nucleotid­ sequenzfragments, das entfernt wurde, im wesentlichen ähnlich ist. Bevorzugt wird die so erhaltene Nucleotidse­ quenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, in der Nähe des 3'-Endes der aktiven Stelle der PME positioniert.

Wenn erwünscht ist, ein PME-Enzym, das normalerweise die Eigenschaften der blockweisen Entesterung zeigt, anzupassen, dann ist es möglich, ein oder mehrere der Codons der Nucleotid-Codierungssequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, zu entfernen oder zu substituieren oder auch ein oder mehrere weitere Codons an die Nucleotid­ sequenz anzufügen und dadurch die Nucleotidsequenz von einer, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, in eine, die nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umzuwandeln und so die Aktivität der PME zu verändern, so daß sie die Eigenschaften einer zufallsweisen Entesterung zeigen kann.

Wenn nun erwünscht ist, ein PME-Enzym, das normaler­ weise die Eigenschaften der zufallsweisen Entesterung zeigt, anzupassen, dann ist es möglich, ein oder mehrere der Codons einer Nucleotid-Codierungssequenz, die innerhalb der PME-Codierungssequenz enthalten ist (aber nicht die aktive Stelle davon) zu entfernen oder zu substituieren oder sogar ein oder mehrere weitere Codons an die Nucleotidsequenz hinzuzufügen und dadurch einen Teil der Nucleotidsequenz von einer, die nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, in eine umzuwandeln, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert und so die Aktivität der PME zu verändern, so daß sie die Eigenschaften der blockweisen Entesterung zeigen kann.

Beispielsweise ist es möglich, einen Abschnitt eines Gens, das PME codiert, aus beispielsweise Aspergillus herauszuspleißen und diesen Abschnitt durch eine Nucleotid­ sequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, zu ersetzen. Die so erhaltene modifizierte Aspergillus-PME kann dann die Eigenschaften der blockweisen Entesterung gegenüber PME-Substraten zeigen.

So umfaßt die vorliegende Erfindung eine modifizierte PME, bei der die modifizierte PME dadurch erhältlich ist, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, und die erste PME so modifiziert wird, daß sie eine Aminosäuresequenz der For­ mel (I) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine modifizierte PME, in der die modifizierte PME dadurch erhältlich ist, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die eine Aminosäurese­ quenz der Formel (I) umfaßt, und die erste PME so modifi­ ziert wird, daß sie nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine modifizierte PME, bei der die modifizierte PME dadurch erhältlich ist, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, und die erste PME so modifiziert wird, daß sie eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine modifizierte PME, wobei die modifizierte PME dadurch erhalten wird, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die eine Aminosäurese­ quenz der Formel (I) umfaßt, und die erste PME so modifi­ ziert wird, daß sie nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfah­ ren zur Modifizierung einer PME, umfassend die Stufen Be­ reitstellung einer ersten PME, die nicht eine Aminosäurese­ quenz der Formel (I) umfaßt, und Modifizieren der ersten PME, so daß sie eine Aminosäuresequenz der Formel (I) um­ faßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Modifikation einer PME, umfassend die Stufen der Bereitstel­ lung einer ersten PME, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt; und Modifizieren der ersten PME, so daß sie nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine modifizierte PME, wobei die modifizierte PME dadurch erhältlich ist, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die eine erste Aminosäu­ resequenz der Formel (I) umfaßt; und die erste PME so modi­ fiziert wird, daß sie eine modifizierte Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz der Formel (I) sich von der modifizierten Aminosäuresequenz der Formel (I) unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine modifizierte PME, wobei die modifizierte PME dadurch erhalten wird, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die eine erste Aminosäu­ resequenz der Formel (I) umfaßt; und die erste PME so modi­ fiziert wird, daß sie eine modifizierte Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz der Formel (I) sich von der modifizierten Aminosäuresequenz der Formel (I) unterscheidet.

Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfah­ ren zur Modifikation einer PME, umfassend die Stufen der Be­ reitstellung einer ersten PME, die eine erste Aminosäurese­ quenz der Formel (I) umfaßt; und Modifizieren der ersten PME, so daß sie eine modifizierte Aminosäuresequenz der For­ mel (I) umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz der Formel (I) sich von der modifizierten Aminosäuresequenz der Formel (I) unterscheidet.

Diese letzten drei Gesichtspunkte können von Bedeutung sein, wenn es erwünscht ist, eine andere Aktivität der blockweisen Entesterung einzuschleusen.

Erfindungsgemäß ist es möglich, die Gesamtheit oder einen Teil (wie eine oder mehrere Aminosäuresequenz(en) der Formel (I)) der Aminosäuresequenz der Formel (I) in eine PME zu insertieren, so daß die so erhaltene modifizierte PME die gesamte Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt. Der Modifi­ kationsgesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfaßt auch die Modifikation bestehender Aminosäurereste in einer PME, so daß die so erhaltene PME die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Wie angegeben, kann die Modifikationsstufe einen oder mehrere der Schritte Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n) umfassen.

Um das korrekte Faltungsmuster des modifizierten Enzyms zu gewährleisten, kann es notwendig sein, einen oder mehrere Aminosäurerest(e) zu entfernen. Wenn es notwendig ist, einen oder mehrere Aminosäurereste zu entfernen, dann wird/werden üblicherweise der/die Rest(e) am Punkt der Insertion der Gesamtheit oder eines Teils der Aminosäuresequenz der Formel (I) entfernt. Wenn beispielsweise die Aminosäuresequenz der Formel (I) in voller Länge in eine Sequenz insertiert wird, um ein modifiziertes Enzym zu bilden, dann kann es notwendig sein, einen 22 Aminosäuren langen Anteil von dem Enzym zu entfernen. Natürlicherweise kann die Entfernungsstufe vor, während oder nach der Insertionsstufe stattfinden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizier­ te PME codiert, dadurch erhältlich ist, daß ein erstes Gen, das eine PME codiert, das nicht eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, bereit­ gestellt wird, und das erste Gen, das die PME codiert, so modifiziert, daß es eine Nucleotidsequenz, die eine Amino­ säuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifi­ zierte PME codiert, dadurch erhältlich ist, daß ein erstes Gen bereitgestellt wird, das eine PME codiert, das eine Se­ quenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und das erste Gen, das die PME codiert, so modifi­ ziert wird, daß es nicht eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizier­ te PME codiert, dadurch erhalten wird, daß ein erstes Gen bereitgestellt wird, das eine PME codiert, das nicht eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und das erste Gen, das die PME codiert, so modifi­ ziert wird, daß es eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizier­ te PME codiert, dadurch erhalten wird, daß ein erstes Gen bereitgestellt wird, das eine PME codiert, das eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt; und das erste Gen, das die PME codiert, so modifiziert wird, daß es nicht eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Amino­ säuresequenz der Formel (I) codiert.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Gens, das eine modifizierte PME codiert, umfassend die Stufen Bereitstellung eines ersten Gens, das eine PME codiert, das nicht eine Sequenz, die eine Aminosäu­ resequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und Modifikation des ersten Gens, das die PME codiert, so daß es eine Nucleo­ tidsequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Gens, das eine modifizierte PME codiert, umfassend die Stufen Bereitstellung eines ersten Gens, das eine PME codiert, das eine Sequenz, die eine Aminosäurese­ quenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und Modifikation des ersten Gens, das die PME codiert, so daß es nicht eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizier­ te PME codiert, dadurch erhältlich ist, daß ein erstes Gen bereitgestellt wird, das eine PME codiert, das eine Sequenz umfaßt, die eine erste Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert; und das erste Gen, das die PME codiert, so modifiziert wird, daß es eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine modifizierte Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, und wobei die erste Aminosäuresequenz der Formel (I) sich von der modifizierten Aminosäuresequenz der Formel (I) unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizier­ te PME codiert, dadurch erhalten wird, daß ein erstes Gen, das eine PME codiert, bereitgestellt wird, das eine Sequenz, die eine erste Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, um­ faßt; und das erste Gen, das die PME codiert, so modifiziert wird, daß es eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine modifi­ zierte Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, und wobei die erste Aminosäuresequenz der Formel (I) sich von der mo­ difizierten Aminosäuresequenz der Formel (I) unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Gen, das eine modifizierte PME codiert, umfassend die Stufen Bereitstellung eines ersten Gens, das eine PME codiert, das eine Sequenz, die eine erste Aminosäu­ resequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und Modifikation des ersten Gens, das die PME codiert, so daß es eine Nucleo­ tidsequenz, die eine modifizierte Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und wobei die erste Aminosäure­ sequenz der Formel (I) sich von der modifizierten Aminosäu­ resequenz der Formel (I) unterscheidet.

Diese letzten drei Gesichtspunkte können von Bedeutung sein, wenn es erwünscht ist, eine andere Aktivität der blockweisen Entesterung einzuschleusen.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Gesamtheit oder einen Teil (wie eine oder mehrere Nucleotidsequenz(en), die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert/codieren) einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, in ein Gen einzuschleusen, das eine PME codiert, so daß das so erhaltene Gen eine modifizierte PME codiert, die die Gesamtheit der Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt.

Wie angegeben, kann die Modifikationsstufe einen oder mehrere Schritte der Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Nucleotide umfassen.

Um das korrekte Faltungsmuster des so erhaltenen expri­ mierten modifizierten Enzyms zu gewährleisten, kann es not­ wendig sein, ein oder mehrere Nucleotid(e) zu entfernen. Wenn es notwendig ist, ein oder mehrere Nucleotid(e) zu ent­ fernen, dann wird/werden üblicherweise die Nucleotide/das Nucleotid an dem Punkt der Insertion der Gesamtheit oder eines Teils der Nucleotidsequenz entfernt, die die Aminosäu­ resequenz der Formel (I) codiert. Wenn beispielsweise die Nucleotidsequenz in voller Länge, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, in eine Sequenz insertiert wird, um ein modifiziertes Enzym zu bilden, dann kann es notwendig sein, einen 66 Nucleotide langen Anteil von der das Enzym codierenden Sequenz zu entfernen. Natürlicherweise kann die Entfernungsstufe vor, während oder nach der Insertionsstufe stattfinden.

Die erfindungsgemäße PME kann durch die Modifikation einer PME aus natürlichen Quellen erhalten werden oder kann auch aus natürlichen Quellen erhalten werden oder sie kann chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise kann die PME zur Modifikation aus einem Pilz erhältlich sein, wie bei­ spielsweise eine PME fungalen Ursprungs (d. h. eine PME, die aus einem Pilz erhalten wurde). Alternativ kann die PME zur Modifikation aus einem Bakterium erhältlich sein, wie bei­ spielsweise eine PME bakteriellen Ursprungs (d. h. eine PME, die aus einem Bakterium erhalten wurde). Alternativ kann die PME zur Modifikation aus einer Pflanze erhältlich sein, wie beispielsweise eine PME pflanzlichen Ursprungs (d. h. eine PME, die aus einer Pflanze erhalten wurde). Gemäß einer be­ vorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße PME un­ ter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt.

In ähnlicher Weise kann das Gen, das die erfindungsge­ mäße PME codiert, durch die Modifikation eines Gens, das eine PME aus natürlichen Quellen codiert, erhalten werden oder auch aus natürlichen Quellen erhalten werden oder es kann chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise kann das Gen, das eine PME zur Modifikation codiert, von einem Pilz erhalten werden, beispielsweise ein Gen, das eine PME funga­ len Ursprungs codiert (d. h. ein Gen, das eine PME codiert, das aus einem Pilz erhalten wurde). Alternativ kann das Gen, das eine PME zur Modifikation codiert, aus einem Bakterium erhältlich sein, wie beispielsweise ein Gen, das eine PME bakteriellen Ursprungs codiert (d. h. ein Gen, das eine PME codiert, das aus einem Bakterium erhalten wurde). Alternativ kann das Gen, das eine PME zur Modifikation codiert, von einer Pflanze erhältlich sein, wie beispielsweise ein Gen, das eine PME pflanzlichen Ursprungs codiert (d. h. ein Gen, das eine PME codiert, das aus einer Pflanze erhalten wurde). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gen, das eine erfindungsgemäße PME codiert, durch Verwendung rekombi­ nanter DNA-Techniken hergestellt.

So betrifft ein Schlüsselelement der vorliegenden Er­ findung die Aminosäuresequenz der Formel (I) sowie eine Nucleotidsequenz, die diese codiert.

Bevorzugt ist A1 eine hydrophobe Aminosäure.

Bevorzugt ist A5 eine polare Aminosäure.

Bevorzugt ist A7 eine polare Aminosäure.

Bevorzugt ist A9 eine hydrophobe Aminosäure.

Bevorzugt ist A10 eine hydrophobe Aminosäure.

Bevorzugt ist A12 eine geladene Aminosäure.

Bevorzugt ist A13 eine hydrophobe Aminosäure.

Bevorzugt ist A14 eine hydrophobe Aminosäure.

Bevorzugt ist A15 eine geladene Aminosäure.

Bevorzugt ist A16 eine polare Aminosäure.

Bevorzugt ist A17 eine polare Aminosäure.

Bevorzugt ist A18 eine polare Aminosäure.

Bevorzugt ist A20 eine hydrophobe Aminosäure.

Bevorzugt ist A22 eine polare Aminosäure.

Wie angegeben, umfaßt die Aminosäuresequenz der Formel (I) eine Gruppierung aus einer oder mehreren hydrophoben Aminosäure, polaren Aminosäure, geladenen Aminosäure und neutralen Aminosäure. Jede beliebige oder mehrere der hydro­ phoben Aminosäuren, polaren Aminosäuren, geladenen Aminosäu­ ren oder neutralen Aminosäuren können eine nichtnatürliche Aminosäure sein. In dieser Hinsicht kann es beispielsweise möglich sein, eine nichtpolare, natürlich vorkommende Amino­ säure so zu derivatisieren, daß sie zu einer polaren Amino­ säure wird. Lehren über nichtnatürliche Aminosäure können in Creighton (1984 Proteins: Structures and Molecula Principles. W.H. Freeman and Company, New York, USA) gefun­ den werden. Diese Literaturstelle bietet auch eine gewisse allgemeine Anleitung zur Modifikation von Aminosäureresten, wie Glycosylierung, Phosphorylierung und Acetylierung.

Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt sind jedoch die hydrophoben Aminosäuren, polaren Aminosäuren, geladenen Aminosäuren, neutralen Aminosäuren natürlich vorkommende Aminosäuren.

Für die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfassen be­ vorzugte Beispiele für hydrophobe Aminosäuren: Ala (A), Val (V), Phe (F), Pro (P), Met (M), Ile (I), Leu (L).

Für die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfassen be­ vorzugte Beispiele für geladene Aminosäuren: Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R).

Für die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfassen be­ vorzugte Beispiele für polare Aminosäuren: Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), His (H), Cys (C), Asn (N), Gln (Q), Trp (W).

Für die Aminosäuresequenz der Formel (I) ist ein be­ vorzugtes Beispiel für eine neutrale Aminosäure Glycin (G).

Bevorzugt ist A1 A, V, G oder T.

Bevorzugt ist A2 V oder L.

Bevorzugt ist A3 L, F oder I.

Bevorzugt ist A4 Q.

Bevorzugt ist A5 N, D, K, G oder S.

Bevorzugt ist A6 C oder S.

Bevorzugt ist A7 D, Q, K, E, Y oder L.

Bevorzugt ist A8 I, L oder F.

Bevorzugt ist A9 H, N, V, M oder L.

Bevorzugt ist A10 A, C, I, P, L, C oder S.

Bevorzugt ist A11 R.

Bevorzugt ist A12 K, R, L, Q oder Y.

Bevorzugt ist A13 P, G oder R.

Bevorzugt ist A14 N, G, M, A, L, R oder S.

Bevorzugt ist A15 S, K, E, P oder D.

Bevorzugt ist A16 G, Y, H, N, K oder V.

Bevorzugt ist A17 Q, G oder K.

Bevorzugt ist A18 K, Q, F, Y, T oder S.

Bevorzugt ist A19 N, C oder G.

Bevorzugt ist A20 M, L, I, T, V, H oder N.

Bevorzugt ist A21 V oder I.

Bevorzugt ist A22 T, L oder S.

Sobald die modifizierte PME erfindungsgemäß hergestellt wurde oder Mengen an PME, die unter Verwendung des erfin­ dungsgemäßen Durchmusterungsverfahrens identifiziert wurde, hergestellt wurden, kann die erfindungsgemäße PME einem oder mehreren PME-Substrat(en) zugesetzt werden. Das PME-Substrat kann aus verschiedenen Quellen erhalten werden und/oder kann eine andere chemische Zusammensetzung besitzen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eines der PME-Substrate Pectin oder ist ein Substrat, das von Pectin ableitbar ist oder abgeleitet ist (z. B. ein Pec­ tinderivat).

Der Ausdruck "abgeleitet von Pectin" umfaßt derivati­ siertes Pectin, abgebautes (wie beispielsweise teilabge­ bautes) Pectin und modifiziertes Pectin. Ein Beispiel für ein modifiziertes Pectin ist Pectin, das zuvor mit einem Enzym, wie einer PME, behandelt wurde. Ein Beispiel für ein Pectinderivat ist ein Pectin, das chemisch behandelt wurde, beispielsweise amidiert wurde.

Zusätzlich kann die erfindungsgemäße PME zusammen mit zusätzlichen und fakultativen anderen PME(s) verwendet wer­ den.

Wenn mehr als eine PME vorhanden ist, dann können die PMEs aus verschiedenen Quellen erhältlich sein und/oder kön­ nen eine unterschiedliche Zusammensetzung besitzen und/oder können ein unterschiedliches Reaktivitätsprofil besitzen (z. B. verschiedenes pH-Optimum und/oder verschiedenes Tem­ peraturoptimum).

Erfindungsgemäß kann das erfindungsgemäße PME-Enzym die PME-Substrate zufallsweise oder blockweise entestern. Wenn daher mehr als eine PME vorliegt, dann wird jede PME unab­ hängig von einer PME, die das/die PME-Substrat(e) zufallsweise entestern kann, oder einer PME, die das/die PME-Substrat(e) blockweise entestern kann, ausgewählt.

In einer bevorzugten Ausführungsform entestert das (oder mindestens ein) modifiziertes PME-Enzym gemäß der Er­ findung das/die PME-Substrat(e) blockweise.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße modifizierte PME-Enzym ein niedriges pH-Optimum (wie beispielsweise von pH 2 bis 5, bevorzugt von pH 2,5 bis 4,5) und eine hohe Affinität für Pectin (wie < 1 mg/ml) und die Fähigkeit, Pectin blockweise zu demethylie­ ren.

Wenn mehr als eine PME vorhanden ist, dann wird jede PME unabhängig voneinander von einem PME-Enzym, das gegenüber Natriumionen empfindlich ist (Na-sensitiv), oder einem PME-Enzym, das gegenüber Natriumionen unempfindlich ist (Na-insensitiv), ausgewählt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das (oder mindestens ein) PME-Enzym ein PME-Enzym, das Na-sensitiv ist.

Die zusätzliche PME kann aus natürlichen Quellen er­ hältlich sein oder kann auch aus natürlichen Quellen erhal­ ten werden oder kann chemisch synthetisiert werden. Bei­ spielsweise kann die zusätzliche PME aus einem Pilz erhält­ lich sein, wie beispielsweise eine PME fungalen Ursprungs (d. h. eine PME, die aus einem Pilz erhalten wurde). Alter­ nativ kann die zusätzliche PME aus einem Bakterium erhält­ lich sein, wie beispielsweise eine PME bakteriellen Ur­ sprungs (d. h. eine PME, die aus einem Bakterium erhalten wurde). Alternativ kann die zusätzliche PME von einer Pflan­ ze erhältlich sein, wie beispielsweise eine PME pflanzlichen Ursprungs (d. h. eine PME, die aus einer Pflanze erhalten wurde). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu­ sätzliche PME durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt. Beispielsweise kann die zusätzliche PME eine rekombinante PME, wie in der WO-A-97/03574 offenbart, oder die in entweder der WO-A-94/25575 oder WO-A-97/31102 offen­ barte PME sein, sowie Varianten, Derivate oder Homologe der in diesen Patentanmeldungen offenbarten Sequenzen sein. Ge­ mäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche PME die rekombinante PME der WO-A-97/03574 (auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird) und/oder die PME der WO-A-94/25575 (auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird) oder eine Variante, Derivat oder Homologes davon.

Es wird angenommen, daß durch die modifizierte PME ent­ estertes Pectin eine andere Struktur besitzt als das durch die nichtmodifizierte PME entesterte Pectin. In dieser Hin­ sicht kann dann, wenn die nichtmodifizierte PME nicht die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, wohingegen die modifizierte PME diese umfaßt, das durch die modifizierte PME behandelte Pectin zumindest teilweise blockweise entestert werden, im Gegensatz zu einer zufallsweisen Entesterung mit der nichtmodifizierten PME. Zusätzlich wird angenommen, daß Gesichtspunkte, wie die Calciumsensitivität des mit der PME behandelten Pectins, sich auch in Abhängigkeit davon verändern werden, ob die modifizierte PME die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt oder nicht. Es wird angenommen, daß, wenn die modifizierte PME die Amino­ säuresequenz der Formel (I) umfaßt, dann das mit der PME behandelte Pectin eine höhere Calciumsensitivität hat als das mit der nichtmodifizierten PME behandelte Pectin.

Es wird auch angenommen, daß die Gesamtaffinität der PME für Pectin sich nach Modifikation verändern kann.

Es wird auch angenommen, daß es eine Veränderung im pH-Optimum für die PME nach Modifikation geben kann.

Dies bedeutet, daß es möglich sein kann, eine modifi­ zierte PME so maßzuschneidern, daß sie individuellen Er­ fordernissen entspricht, wie optimalen Reaktionsbeding­ ungen. So kann es möglich sein, eine Pflanzen-PME, die ein hohes pH-Optimum und die Fähigkeit, Pectin blockweise zu entestern, besitzt, in eine modifizierte PME, die immer noch ein hohes pH-Optimum besitzt, aber bei der die PME nun die Fähigkeit besitzt, Pectin zufallsweise zu entestern, einfach durch Entfernen, Verändern oder Ausschalten (beispielsweise durch selektive Antisense-Technologie) der Aminosäuresequenz der Formel (I) oder der diese codierenden Sequenz umzuwandeln. Auf ähnliche Weise kann es möglich sein, eine fungale PME oder eine bakterielle PME, die ein niedriges pH-Optimum und die Fähigkeit, Pectin zufallsweise zu entestern, in eine modifizierte PME, die immer noch ein niedriges pH-Optimum besitzt, aber bei der die PME nun die Fähigkeit besitzt, Pectin mindestens teilweise blockweise zu entestern, einfach durch Einschleusen einer Aminosäurese­ quenz der Formel (I) oder Umwandlung eines bestehenden Se­ quenzabschnitts in diesen und/oder Verändern der codierenden Sequenz, so daß sie diese codiert, zu modifizieren.

Die erfindungsgemäße PME kann zur Herstellung von Le­ bensmittel verwendet werden.

Der Ausdruck "Lebensmittel" kann Nahrungsmittel für den menschlichen und/oder tierischen Verzehr umfassen. Typische Nahrungsmittel umfassen Marmeladen und Konfitüren, Gelees, Molkereiprodukte (wie Milch oder Käse), Fleischprodukte, Ge­ flügelprodukte, Fischprodukte und Bäckereiprodukte. Das Le­ bensmittel kann sogar auch ein Getränk sein. Das Getränk kann ein Trinkjoghurt, ein Fruchtsaft oder ein ein Molkepro­ tein umfassendes Getränk sein.

Die erfindungsgemäße PME kann zusammen mit anderen En­ zymtypen verwendet werden.

Beispiele für die anderen Enzymtypen umfassen andere Pectinasen, Peatindepolymerasen, Polygalacturonasen, Pectat­ lyasen, Pectinlyasen, Rhamnogalacturonasen, Galactanasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Endo-β-glucanasen, Arabinasen, Acetylesterasen oder pectinfreisetzende Enzyme oder Kombi­ nationen davon.

Beispiele für die Aminosäuresequenzen der Formel (I) können umfassen:

Wie vorstehend angegeben, umfaßt die vorliegende Erfin­ dung Nucleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz der For­ mel (I) codieren. Natürlicherweise kann der Fachmann die ge­ eignete Sammlung von Codons auswählen, die schließlich eine Nucleotidsequenz ergeben, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codieren kann. Als nichtbeschränkendes Beispiel ist ein Beispiel für eine geeignete Aminosäuresequenz der Formel (I):

und eine geeignete Nucleotid-Codierungssequenz:

angegeben. Erfindungsgemäß ist es möglich, transformierte Zellen, transformierte Organe oder transformierte Organismen herzustellen, worin die endogene PME-Produktion gestoppt oder unterdrückt oder entfernt wurde und worin die exogene, erfindungsgemäße, modifizierte PME statt dessen exprimiert wird. Die Zelle kann eine Pflanzenzelle sein. Das Organ kann ein Pflanzenorgan sein. Bevorzugt ist der Organismus ein Pilz (wie Aspergillus oder Hefe). Der Organismus kann sogar eine Pflanze sein. Dieser Gesichtspunkt der vorliegenden Er­ findung besitzt den Vorteil, daß beispielsweise erfindungs­ gemäße transformierte Pflanzen bei Reifung eine oder mehrere verschiedene Typen von Pectinen produzieren als die nichtmo­ difizierten Pflanzenzellen produzieren würden.

Obwohl die WO-A-97/03574 nicht einmal die erfindungsge­ mäße PME nahelegt, ganz abgesehen von der Aminosäuresequenz der Formel (I), enthält dessen Lehre, eine gewisse nützliche Information darüber, wie eine erfindungsgemäße PME durch Verwendung eines modifizierten Gens, das eine PME codiert (wie durch eine der vorstehend dargelegten Modifikationen), hergestellt wird. Zusätzlich enthält dessen Offenbarung auch einen guten Hintergrund, wie transformierte Zellen, transformierte Organe und transformierte Organismen die Aminosäuresequenz der Formel (I) allein und als Teil einer größeren Komponente (wie beispielsweise als Teil einer er­ findungsgemäßen PME) exprimieren können. Einige dieser Aus­ führungen sind nachstehend zitiert.

Um eine rekombinante PME zu exprimieren, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryotische Wir­ te umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Informationen über die Transformation von prokaryotischen Wirten sind im stand der Technik gut dokumentiert, vgl. beispielsweise sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Wenn ein prokaryotischer Wirt verwendet wird, dann kann es erforder­ lich sein, daß das Gen in geeigneter Weise vor der Transfor­ mation modifiziert wird, wie durch Entfernung von Introns.

Gemäß einer Ausführungsform kann der Wirtsorganismus der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger, angehören. Ein transgener Aspergillus kann gemäß den Lehren von Rambosek, J. und Leach, J., 1987 (Recominant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev.

Biotechnol. 6: 357-393), Davis R.W., 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Hrsg.) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, Bd. 29. Elsevier Amsterdam 1994, S. 525-560, Ballance, D.J. 1991 (Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. In: Leong, S.A., Berka R.M. (Hrsg.) Molecular Industrial Mycology. Systems and Application for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc., New York, 1991, S. 1-29) und Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Hrsg.) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, Bd. 29. Elsevier Amsterdam 1994, S. 641-666) hergestellt werden. Jedoch bietet der folgende Kommentar eine Zusammenfassung dieser Informationen zur Produktion von transgenem Aspergillus.

Seit fast einem Jahrhundert werden Fadenpilze vielfach in vielen verschiedenen Industriezweigen zur Produktion von organischen Verbindungen und Enzymen verwendet. Beispiels­ weise verwendeten die traditionellen japanischen Koji- und Sojafermentationen Aspergillus sp. Auch in diesem Jahrhundert wurde Aspergillus niger zur Produktion von organischen Säuren, insbesondere Citronensäure, und zur Produktion verschiedener Enzyme zur industriellen Verwendung verwendet.

Es gibt zwei Hauptgründe, weshalb Fadenpilze in der In­ dustrie so vielfach verwendet wurden. Erstens können Faden­ pilze große Mengen extrazellulärer Produkte produzieren, beispielsweise Enzyme und organische Verbindungen, wie Anti­ biotika oder organische Säuren. Zweitens können Fadenpilze auf billigen Substraten, wie Getreidekörnern, Kleie, Rüben­ pulpe etc., wachsen. Die gleichen Gründe machten die Faden­ pilze zu attraktiven Organismen als Wirte für die heterologe Expression von rekombinanter PME.

Um den transgenen Aspergillus herzustellen, werden Ex­ pressionskonstrukte durch Insertieren einer benötigten Nucleotidsequenz in ein zur Expression in Fadenpilzen ent­ wickeltes Konstrukt hergestellt.

Mehrere Typen von Konstrukten, die für die heterologe Expression verwendet werden, wurden entwickelt. Diese Kon­ strukte können einen Promotor, der in Pilzen aktiv ist, ent­ halten. Beispiele für Promotoren umfassen einen Pilzpromotor für ein stark exprimiertes extrazelluläres Enzym, wie den Glucoamylasepromotor oder den α-Amylasepromotor. Die Nucleo­ tidsequenz kann an eine Signalsequenz fusioniert sein, die die Sekretion des von der Nucleotidsequenz codierten Pro­ teins steuert. Üblicherweise wird eine Signalsequenz funga­ len Ursprungs verwendet. Ein in Pilzen aktiver Terminator beendet das Expressionssystem.

Ein weiterer Typ von Expressionssystem wurde in Pilzen entwickelt, bei dem die Nucleotidsequenz an einen kleineren oder größeren Teil eines Pilzgens, das ein stabiles Protein codiert, fusioniert werden kann. Dies kann das von der Nucleotidsequenz codierte Protein stabilisieren. In einem solchen System kann eine Spaltstelle, die von einer spezifi­ schen Protease erkannt wird, zwischen das Pilzprotein und das von der Nucleotidsequenz codierte Protein eingeschleust werden, so daß das produzierte Fusionsprotein an dieser Po­ sition durch die spezifische Protease gespalten werden kann, wodurch das von der Nucleotidsequenz codierte Protein frei­ gesetzt wird. Als Beispiel kann man eine Stelle einführen, die von einer KEX-2-artigen Peptidase, die in mindestens einem Aspergillus vorkommt, erkannt wird. Eine solche Fusion führt zu einer in vivo Spaltung, was zum Schutz des exprimierten Produkts und nicht zu einem größeren Fusionsprotein führt.

Die heterologe Expression in Aspergillus wurde für meh­ rere Gene, die bakterielle, fungale, Vertebraten- und Pflan­ zenproteine codieren, berichtet. Diese Proteine können intrazellulär abgelagert werden, wenn die Nucleotidsequenz nicht an eine Signalsequenz fusioniert ist. Solche Proteine reichern sich im Cytoplasma an und werden üblicherweise nicht glycosyliert, was für einige bakterielle Proteine ein Vorteil sein kann. Wenn die Nucleotidsequenz mit einer Sig­ nalsequenz ausgestattet ist, reichert sich das Protein extrazellulär an.

Im Hinblick auf die Produktstabilität und Modifikatio­ nen des Wirtsstamms sind einige heterologe Proteine nicht sehr stabil, wenn sie in die Kulturflüssigkeit von Pilzen sezerniert werden. Die meisten Pilze produzieren mehrere extrazelluläre Proteasen, die heterologe Proteine abbauen. Um dieses Problem zu vermeiden, wurden spezielle Pilzstämme mit reduzierter Proteaseproduktion als Wirt für die hetero­ loge Produktion verwendet.

Für die Transformation von Fadenpilzen wurden mehrere Transformationsprotokolle für viele Fadenpilze entwickelt (Ballance 1991, a.a.O.). Viele davon basieren auf der Her­ stellung von Protoplasten und der Einschleusung von DNA in die Protoplasten unter Verwendung von PEG und Ca²⁺-Ionen. Die transformierten Protoplasten regenerieren sich dann, und die transformierten Pilze werden unter Verwendung verschie­ dener Selektionsmarker selektiert. Unter den für die Trans­ formation verwendeten Markern sind eine Reihe von auxotro­ phen Markern, wie argB, trpC, niaD und pyrG, Antibiotikare­ sistenzmarkern, wie Benomylresistenz, Hygromycinresistenz und Phleomycinresistenz. Ein üblicherweise verwendeter Transformationsmarker ist das amdS-Gen von A. nidulans, das in einer hohen Kopienzahl dem Pilz das Wachstum mit Acryl­ amid als einziger Stickstoffquelle erlaubt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In dieser Hinsicht wurden Hefen auch vielfach als Vehikel für die heterologe Genexpression verwendet. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae besitzt eine lange Geschichte industrieller Verwendung einschließlich ihrer Verwendung für die heterologe Genexpression. Die Ex­ pression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al., Hrsg., S. 401-429, Allen und Unwin, London) und von King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton und G.T. Yarronton, Hrsg., S. 107-133, Blackie, Glasgow) übersichtsartig zusammengestellt.

Aus mehreren Gründen eignet sich Saccharomyces cerevisiae gut für die heterologe Genexpression. Erstens ist er für Menschen nicht pathogen und kann bestimmte Endotoxine nicht produzieren. Zweitens besitzt er eine lange Geschichte sicherer Verwendung nach Jahrhunderten kommerzieller Ausnutzung für verschiedene Zwecke. Dies führte zu einer weiten öffentlichen Akzeptanz. Drittens führte die ausge­ dehnte kommerzielle Verwendung und Forschung, die mit dem Organismus erfolgte, zu einem breiten Wissen über die Gene­ tik und Physiologie sowie über die Fermentationseigenschaf­ ten von Saccharomyces cerevisiae in großem Maßstab.

Eine Übersicht über die Prinzipien der heterologen Gen­ expression in Saccharomyces cerevisiae und Sekretion von Genprodukten wird von E. Hinchcliffe E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Bd. 5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, Hrsg., 2. Aufl., Academic Press Ltd.) gegeben.

Mehrere Typen von Hefevektoren sind verfügbar ein­ schließlich integrativer Vektoren, die eine Rekombination mit dem Wirtsgenom zu ihrer Aufrechterhaltung benötigen, und autonom replizierender Plasmidvektoren.

Um den transgenen Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte durch Insertieren der Nucleotidsequenz in ein Konstrukt, das zur Expression in Hefe entwickelt ist, her-gestellt. Mehrere Typen von Konstrukten, die für die he­ terologe Expression verwendet werden, wurden entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor in Fu­ sion an die Nucleotidsequenz; üblicherweise wird ein Promo­ tor mit Ursprung in Hefe, wie der GAL1-Promotor, verwendet. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Ursprung in Hefe, wie die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid codiert, verwen­ det. Ein Terminator, der in Hefe aktiv ist, beendet das Ex­ pressionssystem.

Für die Transformation von Hefe wurden mehrere Trans­ formationsprotokolle entwickelt. Beispielsweise kann ein transgener Saccharomyces nach der Lehre von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168) hergestellt werden.

Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den zur Transformation verwendeten Markern finden sich eine Reihe von auxotrophen Markern, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und domi­ nante Antibiotika-Resistenzmarker, wie Aminoglycosid-Anti­ biotikamarker, z. B. G418.

Ein anderer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. In dieser Hinsicht ist der Stand der Technik voll mit Referenzen zur Herstellung transgener Pflanzen. Zwei Dokumente, die einen gewissen Hintergrundkommentar über die Typen von Techniken, die verwendet werden können, um transgene Pflanzen herzu­ stellen, bieten, sind die EP-B-0 470 145 und die CA-A-2 006 454, von denen nachstehend ein Teil kommentierend zusammengefaßt ist.

Das Grundprinzip bei der Konstruktion genetisch modifi­ zierter Pflanzen ist die Insertion genetischer Information in das Pflanzengenom, um eine stabile Aufrechterhaltung des insertierten genetischen Materials zu erhalten.

Es gibt mehrere Techniken zur Insertion der genetischen Information, wobei die zwei Hauptprinzipien die direkte Ein­ schleusung der genetischen Information und die indirekte Einschleusung der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems sind. Eine Übersicht über die allgemei­ nen Techniken findet sich in Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994, 17-27).

Ein geeignetes Transformationssystem für Pflanzen kann einen Vektor umfassen, aber es kann auch zwei Vektoren um­ fassen. Im Falle von zwei Vektoren wird das Vektorsystem normalerweise als binäres Vektorsystem bezeichnet. Binäre Vektorsysteme sind ausführlicher in Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19 beschrieben.

Ein extensiv zur Transformation von Pflanzenzellen mit einem gegebenen Promotor oder einer Nucleotidsequenz oder einem Konstrukt verwendetes System beruht auf der Verwendung eines Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium rhizogenes, wie in An et al. (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 und Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Hrsg.; D.S. Ingrams und J.P. Helgeson, 203-208 beschrieben.

Mehrere verschiedene Ti- und Ri-Plasmide wurden kon­ struiert, die für die Konstruktion der Pflanze oder Pflan­ zenzellkonstrukte, wie vorstehend beschrieben, geeignet sind. Ein nichtbeschränkendes Beispiel eines solchen Ti-Plasmids ist pGV3850.

Die Nucleotidsequenz oder das Konstrukt sollten bevor­ zugt in das Ti-Plasmid zwischen den terminalen Sequenzen der T-DNA oder benachbart zu einer T-DNA-Sequenz insertiert wer­ den, um eine Unterbrechung der Sequenzen, die unmittelbar die T-DNA-Grenzen umgeben, zu vermeiden, da mindestens eine dieser Regionen für die Insertion der modifizierten T-DNA in das Pflanzengenom essentiell zu sein scheint.

Wie aus der vorstehenden Erklärung hervorgeht, ist, wenn der Organismus eine Pflanze ist, dann das Vektorsystem bevorzugt eines, das die Sequenzen, die notwendig sind, die Pflanze zu infizieren (z. B. die vir-Region), und mindestens einen Grenzteil einer T-DNA-Sequenz enthält, wobei der Grenzteil auf dem gleichen Vektor wie das genetische Kon­ strukt lokalisiert ist. Bevorzugt ist das Vektorsystem ein Agrobacterium tumefaciens-Ti-Plasmid oder ein Agrobacterium rhizogenes-Ri-Plasmid oder ein Derivat davon, da diese Plas­ mide gut bekannt sind und bei der Konstruktion transgener Pflanzen vielfach verwendet werden; es gibt viele Vektor­ systeme, die auf diesen Plasmiden oder Derivaten davon be­ ruhen.

Bei der Konstruktion einer transgenen Pflanze kann die Nucleotidsequenz zuerst in einen Mikroorganismus konstruiert werden, in dem der Vektor sich replizieren kann und der leicht zu manipulieren ist, bevor sie in die Pflanze inser­ tiert wird. Ein Beispiel für einen nützlichen Mikroorga­ nismus ist E. coli, aber andere Mikroorganismen mit den vor­ stehenden Eigenschaften können verwendet werden. Wenn ein Vektor eines Vektorsystems, wie vorstehend definiert, in E. coli konstruiert wurde, wird er ggf. in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z. B. Agrobacterium tumefaciens, über­ führt. Das Ti-Plasmid, das die Nucleotidsequenz oder das Konstrukt beherbergt, wird so bevorzugt in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z. B. A. tumefaciens, überführt, um eine Agrobacterium-Zelle zu erhalten, die die Nucleotidsequenz beherbergt, wobei die DNA anschließend in die zu modifizie­ rende Pflanzenzelle überführt wird.

Wie in CA-A-2 006 454 beschrieben, ist eine große Menge von Clonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssy­ stem in E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, enthalten. Die Vektoren ent­ halten beispielsweise pBR 322, die pUC-Reihe, die M13-mp-Reihe, pACYC 184 etc.

So kann die Nucleotidsequenz in eine geeignete Restrik­ tionsposition in dem Vektor eingeschleust werden. Das er­ haltene Plasmid wird zur Transformation in E. coli verwen­ det. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährme­ dium gezüchtet und dann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird dann isoliert. Als Verfahren zur Analyse werden im all­ gemeinen die Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektro­ phorese und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden verwendet. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz restriktionsgespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verknüpft werden. Jede Sequenz kann in das gleiche oder ein anderes Plasmid cloniert werden.

Nach jedem Einschleusungsverfahren des gewünschten Pro­ motors oder des Konstrukts oder der Nucleotidsequenz in die Pflanzen kann die Anwesenheit und/oder Insertion weiterer DNA-Sequenzen notwendig sein. Wenn beispielsweise für die Transformation das Ti- oder Ri-Plasmid der Pflanzenzellen verwendet wird, können mindestens die rechte Grenze und oft jedoch die rechte und linke Grenze der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Bereiche der eingeschleusten Gene verknüpft werden. Die Verwendung der T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv studiert und ist in der EP-A-120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46; und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277-284, beschrieben.

Die direkte Infektion von Pflanzengeweben durch Agro­ bacterium ist eine einfache Technik, die vielfach verwendet wurde und die in Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Hrsg.: D.S. Ingrams und J.P. Helgeson, 203-208 beschrieben ist. Bezüglich weiterer Informationen zu diesem Thema wird auf Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994, 17-27) verwiesen. Mit dieser Technik kann die Infektion einer Pflanze an einem bestimmten Teil oder Gewebe der Pflanze, d. h. an einem Teil eines Blattes, einer Wurzel, eines Stammes oder an einem anderen Teil der Pflanze, durchgeführt werden.

Typischerweise wird bei der direkten Infektion von Pflanzengeweben durch Agrobacterium, das den Promotor und die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz trägt, eine zu infi­ zierende Pflanze verwundet, z. B. durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge oder Punktieren der Pflanze mit einer Nadel oder Reiben der Pflanze mit einem Abrasivum. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium inokuliert. Die inokulierte Pflanze oder der inokulierte Pflanzenteil wird dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und sich zu reifen Pflanzen entwickeln gelassen.

Wenn Pflanzenzellen konstruiert werden, können diese Zellen gemäß gut bekannten Gewebskulturmethoden, wie durch Züchten der Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, das mit den notwendigen Wachstumsfaktoren, wie Aminosäure, Pflanzen­ hormonen, Vitaminen etc., supplementiert ist, gezüchtet und erhalten werden. Die Regeneration der transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann unter Verwendung bekannter Verfahren zur Regeneration von Pflanzen aus Zellen oder Gewebskulturen, beispielsweise durch Selektion trans­ formierter Schößlinge, unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Subkultivieren der Schößlinge auf einem Medium, das die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone etc., ent­ hält, durchgeführt werden.

Eine weitere Technik zur Transformation von Pflanzen ist die ballistische Transformation. Ursprünglich entwickelt zur Produktion stabiler Transformanten von Pflanzenarten, die gegenüber der Transformation mit Agrobacterium tume­ faciens beständig waren, fand die ballistische Transforma­ tion von Pflanzengewebe, die DNA in die Zellen auf der Ober­ fläche von Metallteilchen einschleust, eine Nützlichkeit bei Tests zur Leistungsfähigkeit genetischer Konstrukte während vorübergehender Expression. So kann die Genexpression in vorübergehend transformierten Zellen untersucht werden, ohne das interessierende Gen stabil zu integrieren und dadurch ohne zeitaufwendige Erzeugung von stabilen Transformanten.

Ausführlicher wurde die ballistische Transformations­ technik (anderweitig als Teilchenbeschußtechnik) zuerst von Klein et al. [1987], Sanford et al. [1987] und Klein et al. [1988] beschrieben und verbreitete sich infolge der leichten Handhabung und des Fehlens einer Vorbehandlung der inter­ essierenden Zellen oder Gewebe.

Das Prinzip der Teilchenbeschußtechnik ist die direkte Abgabe DNA-beschichteter Mikroprojektile in intakte Pflan­ zenzellen durch eine antreibende Kraft (z. B. elektrische Entladung oder komprimierte Luft). Die Mikroprojektile durchdringen die Zellwand und -membran unter nur geringfügi­ ger Beschädigung, und die transformierten Zellen exprimieren dann die Promotorkonstrukte.

Eine Teilchenbeschußtechnik, die durchgeführt werden kann, verwendet die Particle-Inflow-Gun (PIG), die von Finer et al. [1992] und Vain et al. [1993] entwickelt und be­ schrieben wurde. Die PIG beschleunigt die Mikroprojektile in einem Strom fließenden Heliums durch ein Teilvakuum in die Pflanzenzellen.

Einer der Vorteile der PIG ist, daß die Beschleunigung der Mikroprojektile durch ein Timer-Relay-Solenoid und durch Regulierung des angelegten Heliumdrucks kontrolliert werden kann. Die Verwendung von Heliumdruckgas als antreibende Kraft hat den Vorteil, daß es inert ist, keine Rückstände hinterläßt und eine reproduzierbare Beschleunigung ergibt. Das Vakuum verringert den Strömungswiderstand auf die Teil­ chen und vermindert Gewebsbeschädigung durch Dispersion des Heliumgases vor dem Aufprall [Finer et al., 1992].

Andere Techniken zur Transformation von Pflanzen um­ fassen die Silicon-Whisker-Technik und virale Transforma­ tionstechniken.

Weitere Informationen über die Pflanzentransformation können in EP-A-0 449 375, US-A-5 387 757, US-A-5 569 831, US-A-5 107 065, EP-A-0 341 885, EP-A-0 271 988, EP-A-0 416 572, EP-A-0 240 208, EP-A-0 458 367, WO-A-97/37023, WO-A-94/21803, WO-A-93/23551, WO-A-95/23227 gefunden werden.

Obwohl die Aminosäuresequenz der Formel (I) vermutlich eine wichtige Rolle bei den Eigenschaften der blockweisen Entesterung einer PME spielt, wird angenommen, daß die Se­ quenz auch die enzymatische Aktivität anderer Enzyme beeinflußt, wenn sie in der Sequenz für diese anderen Enzyme vorhanden ist. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz der Formel (I) in Enzyme, wie Pectinacetylesterase oder Rhamnogalacturonanacetylesterase, eingeschleust werden. In dieser Hinsicht kann die Anwesenheit der Aminosäuresequenz der Formel (I) eine Acetylesterase ergeben, die blockweise deacetylieren kann (z. B. das Zuckerrübenpectin bzw. die "Haarregion" mehrerer Pectine). Die Aminosäuresequenz der Formel (I) kann sogar in Enzyme, wie Xylanacetylesterase, eingeschleust werden. In dieser Hinsicht kann die Anwesenheit der Aminosäuresequenz der Formel (I) eine Acetylesterase ergeben, die Xylan blockweise deacetylieren kann. Daher kann jede der vorstehend genannten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die sich auf eine modifizierte PME bezieht, auch auf ein modifiziertes Enzym in allgemeiner Hinsicht anwendbar sein.

Wie vorstehend angegeben, umfaßt die vorliegende Erfin­ dung auch Homologe der angegebenen Sequenzen. Wie ebenfalls angegeben, kann der Homologiegrad (oder Identitätsgrad) durch einen einfachen Augenvergleich (d. h. einen strengen Vergleich) einer oder mehrerer Sequenzen mit einer anderen Sequenz oder durch Verwendung im Handel erhältlicher Computerprogramme, die die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen können, bestimmt wer­ den.

Wenn ein kommerzielles Programm verwendet wird, kann die Sequenzhomologie (oder -identität) unter Verwendung je­ des geeigneten Homologiealgorithmus bestimmt werden, wobei beispielsweise Default-Parameter verwendet werden. Vorteil­ hafterweise wird der BLAST-Algorithmus verwendet, wobei Pa­ rameter auf Default-Werte eingestellt werden. Der BLAST-Algorithmus ist ausführlich in http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html beschrieben, worauf hiermit Bezug ge­ nommen wird. Die Suchparameter sind wie folgt definiert und werden vorteilhafterweise zur Definition der Default-Para­ meter eingestellt.

Vorteilhafterweise gilt "wesentliche Homologie" bei Be­ wertung mittels BLAST für Sequenzen, die mit einem EXPECT-Wert von mindestens etwa 7, bevorzugt mindestens etwa 9 und bevorzugter 10 oder mehr, übereinstimmen. Die Default- Schwelle für EXPECT bei einer BLAST-Suche ist üblicherweise 10.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ist der heu­ ristische Suchalgorithmus, der von den Programmen blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx verwendet wird; diese Programme schreiben die Signifikanz ihren Befunden zu, wobei die statische Methoden von Karlin und Altschul (vgl. http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) mit ein paar Verstärkungen verwendet werden. Die BLAST-Programme wurden für die Suche nach Sequenzähnlichkeiten maßgeschneidert, beispielsweise um Homologien in einer infragekommenden Se­ quenz zu identifizieren. Die Programme sind nicht allgemein für Motif-Style-Recherche nützlich. Bzgl. einer Diskussion der Grundlagen bezüglich der Ähnlichkeitssuche von Sequenz- Datenbanken vgl. Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6: 119-129.

Die fünf BLAST-Programme, die bei http://www.ncbi.nlm.nih.gov verfügbar sind, führen die folgenden Aufgaben aus:
blastp vergleicht die angefragte Aminosäuresequenz mit einer Proteinsequenz-Datenbank;
blastn vergleicht die angefragte Nucleotidsequenz mit einer Nucleotidsequenz-Datenbank;
blastx vergleicht die konzeptuellen Translationsproduk­ te in einem Sechserrahmen einer angefragten Nucleotidsequenz (beide Stränge) gegen eine Proteinsequenz-Datenbank;
tblastn vergleicht die angefragte Proteinsequenz gegen eine Nucleotidsequenz-Datenbank, die dynamisch in alle sechs Leseraster (beide Stränge) translatiert wird;
tblastx vergleicht Translationen einer angefragten Nucleotidsequenz in einem Sechserrahmen gegen Translationen einer Nucleotidsequenz-Datenbank.

BLAST verwendet die folgenden Suchparameter:
HISTOGRAM zeigt ein Histogramm von Treffern für jede Suche; der Default ist ja. (Vgl. Parameter H in dem BLAST- Handbuch).

DESCRIPTIONS beschränkt die Anzahl der kurzen Beschrei­ bungen passender Sequenzen, die in der spezifizierten Anzahl angegeben sind; die Default-Grenze ist 100 Beschreibungen. (Vgl. Parameter V auf der Seite des Handbuchs). Vgl. auch EXPECT und CUTOFF.

ALIGNMENTS beschränkt die Datenbanksequenzen auf die spezifizierte Anzahl, für die Segmentpaare mit hohen Tref­ ferquoten (HSPs) berichtet werden; die Default-Grenze ist 50. Wenn mehr Datenbanken als diese zufällig die statistische Signifikanzschwelle für einen Bericht erfüllen (vgl. EXPECT und CUTOFF nachstehend), werden nur die Treffer mit der größten statistischen Signifikanz berichtet. (Vgl. Parameter B in dem BLAST-Handbuch).

EXPECT Die statistische Signifikanzschwelle für den Be­ richt von Treffern gegen Datenbanksequenzen; der Default- Wert ist 10, so daß 10 Treffer nur durch Zufall gemäß dem stochastischen Modell von Karlin und Altschul (1990) gefun­ den werden. Wenn die einer Paarung zugeschriebene statisti­ sche Signifikanz größer als die EXPECT-Schwelle ist, wird der Treffer nicht berichtet. Niedrigere EXPECT-Schwellen sind stringenter, die dazu führen, daß weniger Zufalls­ treffer berichtet werden. Fraktionale Werte sind akzeptabel. (vgl. Parameter E in dem BLAST-Handbuch).

CUTOFF Cutoff-Bewertung zum Bericht von Segmentpaaren mit hohen Treffern. Der Default-Wert wird aus dem EXPECT- Wert (siehe vorstehend) berechnet. HSPs werden für eine Da­ tenbanksequenz nur berichtet, wenn die ihnen zugeordnete statistische Signifikanz mindestens so hoch ist, wie sie einem einzelnen HSP mit einer Bewertung, die gleich dem CUTOFF-Wert ist, zugeschrieben werden würde. Höhere CUTOFF-Werte sind stringenter, was zur Berichtung weniger Zufalls­ treffer führt. (Vgl. Parameter S in dem BLAST-Handbuch). Ty­ pischerweise können Signifikanzschwellen zutreffender unter Verwendung von EXPECT gehandhabt werden.

MATRIX spezifiziert eine alternative Bewertungsmatrix für BLASTP, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX. Die Default-Matrix ist BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992). Die gültigen Al­ ternativwahlen umfassen: PAM40, PAM120, PAM250 und IDENTITY. Keine Alternativbewertungsmatrices sind für BLASTN verfüg­ bar; Spezifikation der MATRIX-Direktive in BLASTN-Anfragen führt zu einer Error-Antwort.

STRAND beschränkt eine TBLASTN-Suche nur auf den oberen oder unteren Strang der Datenbanksequenzen; oder beschränkt eine BLASTN-, BLASTX- oder TBLASTX-Suche nur auf die Lese­ raster im oberen oder unteren Strang der angefragten Se­ quenz.

FILTER maskiert Segmente der angefragten Sequenz, die eine niedrige zusammengesetzte Komplexizität besitzen, wie durch das SEG-Programm von Wootton & Federhen (1993), Computers and Chemistry 17: 149-163, bestimmt, oder Segmen­ te, die aus internen Repeats mit kurzer Periodenlänge bestehen, wie durch das XNU-Programm von Claverie & States (1993) Computer and Chemistry 17 : 191-201 bestimmt oder für BLASTN durch das DUST-Programm von Tatusov und Lipman (vgl. http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bestimmt. Die Filterung kann statistisch signifikant, aber biologisch nicht interessierende Berichte aus dem Blast-Output (beispielsweise Treffer gegen gemeinsame säuren-, basen- oder prolinreiche Regionen) eliminieren, wodurch die biologisch interessanten Regionen der angefragten Sequenz für eine spezifische Paarung gegen Datenbasensequenzen verfügbar sind.

Eine Sequenz mit niedriger Komplexizität, die durch ein Filterprogramm aufgefunden wird, wird unter Verwendung des Buchstaben "N" in der Nucleotidsequenz (z. B. "NNNNNNNNNNNNN") und des Buchstaben "X" in Proteinsequenzen (z. B. "XXXXXXXXX") substituiert.

Die Filterung wird nur auf die angefragte Sequenz (oder deren Translationsprodukte), nicht auf Datenbanksequenzen angewendet. Die Default-Filterung ist DUST für BLASTN, SEG für andere Programme.

Es ist nicht unüblich, daß überhaupt nichts durch SEG, XNU oder beides bei Anwendung auf Sequenzen in SWISS-PROT maskiert wird; so sollte nicht erwartet werden, daß die Fil­ terung immer eine Wirkung hat. Ferner werden in einigen Fäl­ len Sequenzen völlig maskiert, was anzeigt, daß die stati­ stische Signifikanz gegenüber berichteten Paarungen gegen nichtgefilterte angefragte Sequenzen verdächtig sein sollte.

NCBI-gi bewirkt, das NCBI-gi-Identifikatoren im Output zusätzlich zu den Zugangs- und/oder Ortsnamen angezeigt wer­ den.

Am meisten bevorzugt werden Sequenzvergleiche unter Verwendung des einfachen BLAST-Suchalgorithmus, der unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST zur Verfügung gestellt wird, durchgeführt.

Andere Verfahren auf der Basis von Computerprogrammen zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen umfassen ohne Beschränkung das GCG-Pro­ grammpaket (Devereux et al. 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) und FASTA (Altschul et al., 1990, J Molec Biol 403-410).

Wenn Gap-Penalties bei der Bestimmung der Sequenziden­ tität verwendet werden, dann werden bevorzugt die folgenden Parameter verwendet:

Die hier verwendeten Ausdrücke "Variante", "Homologes", "Fragment" und "Derivat" umfassen allelische Variationen der Sequenzen.

Der Ausdruck "Variante" umfaßt auch Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die mit den hier dargebotenen Nucleotidsequenzen hybridisieren können.

In einigen Fällen ist es erwünscht, ein Tryptophan zwischen A2 und A3 in Formel (I) zu positionieren. In dieser Ausführungsform würde das Tryptophan in der Tat Position Nr. 3 werden. Jedoch bleibt die Anordnung der folgenden Amino­ säuren die gleiche. Der Einfachheit halber wird diese Modi­ fikation der Formel (I) als Formel (IA) bezeichnet.

So umfaßt gemäß einem Gesichtspunkt die vorliegende Er­ findung auch eine Aminosäuresequenz der Formel (IA):

worin
W Tryptophan bezeichnet,
A1 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A2 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A3 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A4 eine polare Aminosäure ist,
A5 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A6 eine polare Aminosäure ist,
A7 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist
A8 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A9 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A10 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A11 eine geladene Aminosäure ist,
A12 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A13 eine hydrophobe oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A14 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine gelade­ ne oder neutrale Aminosäure ist,
A15 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A16 eine polare oder hydrophobe oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A17 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A18 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A19 eine polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A20 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A21 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A22 eine polare oder hydrophobe Aminosäure ist.

In dieser Hinsicht gelten alle Offenbarungen im Zusam­ menhang mit der Formel (I) und deren bevorzugte Ausführungs­ formen in gleicher Weise für die Formel (IA).

Beispielsweise umfassen N-terminale Sequenzen von Bei­ spielen, die durch die Formel (IA) umfaßt werden:

Zusätzlich oder alternativ können A9 und/oder A10 und/oder A22 weggelassen werden. Der Einfachheit halber wird diese Modifikation der Formel (I) und/oder Formel (IA) als Formel (IB) bezeichnet.

So umfaßt gemäß einem Gesichtspunkt die vorliegende Er­ findung auch eine Aminosäuresequenz der Formel (IB):

worin
W ein fakultatives Tryptophan bezeichnet,
A1 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A2 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A3 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A4 eine polare Aminosäure ist,
A5 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A6 eine polare Aminosäure ist,
A7 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A8 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A9 eine gegebenenfalls hydrophobe oder eine gegebenenfalls polare Aminosäure ist,
A10 eine gegebenenfalls hydrophobe oder eine gegebenenfalls polare Aminosäure ist,
A11 eine geladene Aminosäure ist,
A12 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A13 eine hydrophobe oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A14 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine gelade­ ne oder neutrale Aminosäure ist,
A15 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A16 eine polare oder hydrophobe oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A17 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A18 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A19 eine polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A20 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A21 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A22 eine gegebenenfalls polare Aminosäure oder eine gegebenenfalls hydrophobe Aminosäure ist.

In dieser Hinsicht gelten alle Offenbarungen im Zusam­ menhang mit der Formel (I) und deren bevorzugte Gesichts­ punkte in gleicher Weise für die Formel (IB).

Beispielsweise umfassen Beispiele für Sequenzen, die von Formel (IB) umfaßt werden, fol 24639 00070 552 001000280000000200012000285912452800040 0002019921676 00004 24520gende:

Die vorliegende Erfindung wird nun nur anhand von Bei­ spielen beschrieben.

Beispiel 1

Die Nucleotidsequenz für die Aminosäuresequenz der For­ mel (I) - wie nachstehend angegeben - wird in ein Gen, das eine PME codiert, die keine Eigenschaften der blockweisen Entesterung besitzt, wie die PME von Aspergillus niger, eingeschleust.

Sequenz zur Insertion:

Diese Sequenz kann eine synthetische Sequenz sein oder kann durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken produziert werden.

Die Positionierung der Sequenz ist in der Nähe des 3'-Endes des Genteils, der die aktive Stelle von PME codiert.

Eine 66 Nucleotide lange Sequenz wird im Anschluß an die Insertionsstelle entfernt.

Die so erhaltene modifizierte PME aus Aspergillus niger wird dann beispielsweise durch Transformation von Aspergillus durch geeignete Anpassung der vorstehenden Aus­ führungen und Referenzen zur Transformation von Aspergillus produziert. Die modifizierte PME wird dann zur Modifikation eines Pectins verwendet, indem das Pectin in Kontakt mit der modifizierten PME in einer geeigneten Reaktionsumgebung ge­ bracht wird. Die modifizierte PME-Probe kann eine isolierte und/oder reine Probe sein oder sie kann ein Rohextrakt sein.

Die PME mit den Eigenschaften der blockweisen Enteste­ rung und die Eigenschaften eines von dieser behandelten Pec­ tins können durch die nachstehend genannten Protokolle be­ stimmt werden.

Überraschenderweise zeigt die exprimierte modifizierte PME ein anderes PME-Profil, insbesondere zeigt sie zumindest einige Eigenschaften der blockweisen Entesterung (d. h. mindestens eine Eigenschaft der teilweisen blockweisen Entesterung).

Beispiel 2

Die Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, wird von einem Gen entfernt, das eine PME codiert, die Eigenschaften der blockweisen Entesterung zeigt, wie die PME aus Orangen.

Die zu entfernende Sequenz lautet:

Eine 66 Nucleotdie lange Sequenz wird dann in die Ent­ fernungsstelle insertiert. Diese 66 Nucleotid lange Sequenz codiert keine Aminosäuresequenz der Formel (I).

Die so erhaltene modifizierte PME aus Orangen wird dann beispielsweise durch Transformieren einer geeigneten Wirts­ zelle, wie einer Pflanzenzelle, durch geeignetes Anpassen der vorstehenden Ausführungen und Referenzen zur Pflanzen­ transformation produziert. Die modifizierte PME wird dann zur Modifikation eines Pectins verwendet, indem das Pectin in Kontakt mit der modifizierten PME in einer geeigneten Reaktionsumgebung gebracht wird. Die modifizierte PME-Probe kann eine isolierte und/oder eine reine Probe sein oder sie kann ein Rohextrakt sein.

Die Eigenschaften der zufallsweisen Entesterung der PME und die Eigenschaften eines damit behandelten Pectins können durch die nachstehend genannten Protokolle bestimmt werden.

Überraschenderweise zeigt die exprimierte modifizierte PME ein anderes PME-Profil, insbesondere zeigt sie Eigenschaften der zufallsweisen Entesterung.

Beispiel 3

Die Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, wird von einem Gen entfernt, das eine PME codiert, die Eigenschaften der blockweisen Entesterung zeigt, wie die PME aus Tomaten.

Die zu entfernende Sequenz lautet:

Eine 66 Nucleotide lange Sequenz wird dann in die Ent­ fernungsstelle insertiert. Diese 66 Nucleotide lange Sequenz codiert keine Aminosäuresequenz der Formel (I).

Das so erhaltene modifizierte PME aus Tomaten wird dann beispielsweise durch Transformieren einer geeigneten Wirts­ zelle, wie einer Pflanzenzelle, durch geeignetes Anpassen der vorstehenden Ausführungen und Referenzen für die Pflanzentransformation produziert. Die modifizierte PME wird dann zur Modifikation eines Pectins verwendet, indem das Pectin in Kontakt mit der modifizierten PME in einer geeignete Reaktionsumgebung gebracht wird. Die modifizierte PME-Probe kann eine isolierte und/oder reine Probe sein oder sie kann ein Rohextrakt sein.

Die Eigenschaften der zufallsweisen Entesterung der PME und die Eigenschaften eines mit dieser behandelten Pectins können durch die nachstehend angegebenen Protokolle bestimmt werden.

Überraschenderweise zeigt die modifizierte PME ein an­ deres PME-Profil, insbesondere zeigt sie Eigenschaften der zufallsweisen Entesterung.

In diesem Beispiel wird die Expression der modifizier­ ten PME durch Verwendung des 35S-Promotors des Blumenkohl­ mosaikvirus (CaMV) in verschiedenen Pflanzentypen, wie To­ matengenotypen, erzielt. Dieser stark exprimierte konstitu­ tive Promotor ist weit verfügbar. Andere Promotoren können auch verwendet werden. Der konstitutive CaMV 35S-Promotor wird zuerst für die vorgeschlagenen Experimente verwendet, weil gezeigt wurde, daß dieser Promotor hohe Gehalte an Pro­ teinproduktion in den meisten Pflanzenorganen einschließlich Tomatenfrüchten fördert.

Zuerst wird eine DNA-Konstruktion erzeugt, die die Nucleotidsequenz umfaßt, die eine modifizierte PME codiert. Im Minimum enthält diese DNA-Konstruktion einen Promotor, der effektiv ist, die Transkription in Tomatenpflanzen zu fördern, einen cDNA-Clon, der die modifizierte PME codiert und eine Sequenz, die effektiv die Transkription beendet. Unter Verwendung molekularbiologischer Standardmethoden wird die CaMV35S-Promotorsequenz an die codierende Sequenz ange­ fügt. Eine geeignete Terminationssequenz, wie der Nopalin-Syn­ thase-3'-Terminator, wird stromabwärts der cDNA-Insertion plaziert. Die DNA-Konstruktion wird in einen geeigneten Vek­ tor zur Pflanzentransformation gegeben. Für die durch Agro­ bacterium vermittelte Transformation wird die Pro­ motor/cDNA/Terminator-Konstruktion bevorzugt in ein Plasmid auf Ti-Basis, wie pBI121, einen binären Standardvektor, gegeben. Im allgemeinen wird die Transformation bevorzugt mit zwei binären Agrobacterium-Standardvektoren durchgeführt: PBI121 (verkauft von Clontech Laboratories, Palo Alto Calif.) und pGA643 (entwickelt von G. An in Washington State University). pBI121 enthält einen CAMV-Promotor und ein GUS- Reportergen. Die GUS-codierende Sequenz wird durch Spaltung mit SstI und SmaI (glatte Enden) entfernt. Die Sequenz, die die modifizierte PME codiert, die verwendet werden soll, könnte durch Spalten mit geeigneten Restriktionsenzymen pro­ duziert werden. Die klebrigen/glatten Enden erlauben die ge­ richtete Clonierung in pBI121. Standardverfahren zur Spal­ tung, Ligierung und E. coli-Transformation werden verwendet.

Für die Pflanzentransformation ist es möglich, im all­ gemeinen die Verfahren von McCormick (1986, Plant Cell Reporter 5: 81-84) und Plant Tissue Culture Manual B6: 1-9 (1991) Kluwer Academic Publishers, zu befolgen. Diese zu­ letzt genannte Literaturstelle faßt verschiedene Verfahren zur Agrobacterium-vermittelten Transformation von Tomaten zusammen und vergleicht sie.

Protokolle Protokoll I Calciumsensitivitätsindex (CF)

Die Calciumsensitivität wird als die Viskosität eines Pectins, das in einer Lösung mit 57,6 mg Calcium/g Pectin aufgelöst ist, geteilt durch die Viskosität genau der glei­ chen Menge Pectin in Lösung, aber ohne Calciumzusatz, ge­ messen. Ein calciuminsensitives Pectin besitzt einen CF-Wert von 1.

4,2 g Pectinprobe werden in 550 ml heißem Wasser unter effizientem Rühren aufgelöst. Die Lösung wird auf etwa 20°C abgekühlt, und der pH-Wert wird mit 1 N HCl auf 1,5 einge­ stellt. Die Pectinlösung wird auf etwa 700 ml mit Wasser eingestellt und gerührt. 145 g dieser Lösung werden einzeln in 4 Viskositätsgläsern gemessen. 10 ml Wasser werden zwei der Gläser zugesetzt (doppelte Bestimmung), und 10 ml einer 250 mM CaCl₂-Lösung werden den anderen zwei Gläsern unter Rühren zugesetzt.

50 ml eines Acetatpuffers (0,5 M, pH etwa 4,6) werden allen vier Viskositätsgläsern unter effizientem Magnetrühren zugesetzt, wodurch der pH-Wert der Pectinlösung auf über pH 4,0 gebracht wird. Die Magnete werden entfernt, und die Gläser werden über Nacht bei 20°C gelassen. Die Viskositäten werden am nächsten Tag mit einem Brookfield-Viskometer ge­ messen. Der Calciumsensitivitätsindex wird wie folgt berech­ net:

Protokoll II Veresterungsgrad (% DE)

50 ml einer Lösung aus 60% Isopropanol und 5% HCl werden mit 2,5 g Pectinprobe versetzt und 10 min gerührt. Die Pectinlösung wird durch einen Glasfilter filtriert und mit 10 ml einer Lösung aus 60% Isopropanol/5% HCl sechsmal gewaschen und dann weiter mit 60% Isopropanol gewaschen, bis das Filtrat chloridfrei ist. Das Filtrat wird über Nacht bei 80°C getrocknet.

20,0 ml 0,5 N NaOH und 20,0 ml 0,5 N HCl werden in einem konischen Kolben vereinigt und zwei Tropfen Phenol­ phthalein werden zugesetzt. Dies wird mit 0,1 N NaOH titriert, bis eine permanente Farbänderung erhalten wird. Die 0,5 N HCl-Lösung sollte geringfügig stärker als die 0,5 N NaOH sein. Das zugesetzte Volumen von 0,1 N NaOH wird als V₀ notiert.

0,5 g der getrockneten Pectinprobe (das Filtrat) werden in einen konischen Kolben abgemessen, und die Probe wird mit 96% Ethanol angefeuchtet. 100 ml frisch gekochtes und ab­ gekühltes destilliertes Wasser werden zugesetzt, und die so erhaltene Lösung wird gerührt, bis das Pectin vollständig aufgelöst ist. Dann werden fünf Tropfen Phenolphthalein zu­ gesetzt und die Lösung mit 0,1 N NaOH titriert (bis eine Farbveränderung auftritt und der pH-Wert 8,5 beträgt). Die Menge an hier verwendeter 0,1 N NaOH wird als V₁ notiert. 20,0 ml 0,5 N NaOH werden zugesetzt, und der Kolben wird heftig geschüttelt und dann 15 min stehengelassen. 20,0 ml 0,5 N HCl werden zugesetzt, und der Kolben wird geschüttelt, bis die Farbe Pink verschwindet. Drei Tropfen Phenolphtha­ lein werden zugesetzt, und dann wird die so erhaltene Lösung mit 0,1 N NaOH titriert. Das Volumen an verwendeter 0,1 N NaOH wird als V₂ notiert.

Der Veresterungsgrad (% DE: % der gesamten Carboxy­ gruppen) wird wie folgt berechnet:

Protokoll III Trinktest

Verfahren in kleinem Maßstab zum Screening auf Pectine in einem gesäuerten Milchgetränksystem.

I. Einleitung

Gesäuerte Milchgetränke mit einer langen Lagerzeit sind sehr populär, insbesondere im Fernen Osten. Eine Wärmebe­ handlung ist notwendig, um eine lange Lagerzeit zu erhalten, und um eine Sedimentation der Proteine während und nach der Erhitzung zu vermeiden, wird Pectin als Stabilisator zuge­ setzt. Da die Qualität gesäuerter Milchgetränke stark von den Eigenschaften und der Konzentration des verwendeten Pectins abhängt, wurde die Wirkung einer Pectinstabilisie­ rung in verschiedenen Modellsystemen untersucht.

Kravtchenko et al. (1) verwendete einen kommerziellen Joghurt als Basis. Der Joghurt wurde homogenisiert, und eine Pectinlösung wurde zugesetzt, wobei keine Wärmebehandlung erfolgte. Glahn (2) säuerte rekonstituiertes Magermilchpul­ ver mit Glucono-δ-lacton (GDL) an. Nach der Zugabe von in Zucker dispergiertem Pectin wurde das Gemisch homogenisiert, wärmebehandelt und ein zweites Mal homogenisiert. Fast das gleiche Verfahren wurde von Foley und Mulcahy (3) angewendet, obwohl sie die letzte Homogenisierung wegließen. Amice-Quemeneur et al. (4) verwendeten auch rekonstituiertes Magermilchpulver, das mit entweder GDL oder Joghurtkultur angesäuert war. Die Joghurtbasis wurde mit einer Lösung aus Pectin in Wasser versetzt und mit einem Ultra-Turrax homo­ genisiert, während keine Wärmebehandlung angewendet wurde. Pedersen und Jorgensen (5) verwendeten ein wäßriges Gemisch aus Pectin und Casein ohne irgendeine Homogenisierung und Wärmebehandlung.

Die meisten der in diesen Studien verwendeten Systeme benötigen relativ große Mengen an Pectin. Eine weitere Be­ schränkung ist, daß in den meisten Fällen nur ein Typ von Pectin verwendet wurde. Da die stabilisierende Kraft von Pectin sehr von der chemischen Struktur und den funktionel­ len Eigenschaften abhängt, kann der gleiche Test, der mit anderen Pectintypen durchgeführt wird, zu anderen Schlußfol­ gerungen hinsichtlich der an der Stabilisierung von Milch­ proteinen beteiligten Mechanismen führen. Es ist daher wert­ voll, ein System einzurichten, das die Testung vieler Pec­ tinproben (z. B. experimentelle Laborproben) erlaubt. Da die laboratoriumsmäßige Produktion von Pectinen normalerweise sehr geringe Probenmengen ergibt, ist es wichtig, daß ein solches Modellsystem nur eine kleine Menge an Pectin benötigt.

Im folgenden ist ein Protokoll beschrieben, bei dem nur etwa 1,7 g Pectin bis zu einer möglichst geringen Menge verwendet werden. Die zur Bewertung der Leistungsfähigkeit des Systems verwendeten Methoden waren Viskometrie, zentrifugale Sedimentation und Teilchengrößenbestimmung.

2. Material und Methoden 2.1 Materialien

Magermilchpulver mit etwa 36% Protein wurde von Mejeriernes Falles Indkob (Kolding, Dänemark) erhalten. Pec­ tine zum Testen wurden durch Behandlung eines Pectins mit einer erfindungsgemäßen modifizierten PME erhalten. Diese Pectine können verschiedene Eigenschaften, wie Veresterungs­ grad und Molekulargewicht, in Abhängigkeit von dem Typ des verwendeten modifizierten PME besitzen.

2.2 Herstellung eines Milchgetränks

Die Milchgetränke wurden durch Vermischen einer gesäu­ erten Milchlösung und einer Pectinlösung, gefolgt von einer weiteren Bearbeitung, hergestellt.

Eine Milchlösung wurde durch Auflösen von 17% (Gew./Gew.) Magermilchpulver in destilliertem Wasser bei 68°C und 30minütiges Rühren hergestellt. Die Milchlösung wurde dann auf pH 4,1 bei 30°C durch Zugabe von 3% (Ge­ wicht/Gewicht) Glucono-δ-lacton (GDL) angesäuert.

Die Pectinlösung wurde in mehreren Stufen hergestellt. Zuerst wurde Pectin trocken mit Dextrose in einem 3 : 2-Ge­ wichtsverhältnis vermischt, und dann wurde eine 1,11%ige (Gewicht/Gewicht) Lösung dieses Gemisches in destilliertem Wasser hergestellt. Die letzte Stufe bei der Herstellung der Pectinlösung war die Zugabe von Saccharose bis zu einer End­ konzentration von 17,8% (Gewicht/Gewicht).

Milchgetränke wurden dann durch Vermischen von 1 Teil Milchlösung mit 1,13 Teilen (Gewicht/Gewicht) Pectinlösung, gefolgt von einer Wärmebehandlung (siehe Abschnitt 3.2) und Homogenisierung bei 20 bis 22 MPa und 20°C unter Verwendung eines Mini-Jet-Homogenisators (Burgaud et al., 1990) herge­ stellt. Gemäß diesem Verfahren betrug die Endkonzentration an Pectin in dem Milchgetränk 0,3% (Gewicht/Gewicht). Alle Proben wurden doppelt angesetzt, bei 5°C gelagert und am folgenden Tag auf Viskosität, Teilchengröße und Sedimentation getestet.

2. 3 Viskositätsmessung

Die Viskosität wurde unter Verwendung eines Bohlin-VOR-Rheo­ meter-Systems (Bohlin Instruments, Metric Group Ltd., Gloucestershire, Großbritannien) gemessen. Die Thermostati­ sierung wurde durch eine Bohlin-Lower-Plate-Temperature- Kontrolleinheit erzielt. Die Viskosität wurde bei einer Scherrate von 91,9 s^-1 gemessen. Die Meßtemperatur betrug 20°C, und die Proben wurde etwa für 1 h vor der Messung bei 20°C gehalten. Das verwendete Meßsystem war C14 (ein koaxiales zylindrisches System). Das verwendete Drehmoment betrug 0,25 gcm. Die Integrationszeit betrug 5 s, das Meßintervall betrug 30 s, und kein Autozero wurde verwendet. Die instrumentelle Kontrolle und die primäre Datenverarbeitung wurden auf einem PC mit der Bohlin- Rheometer-Software-Version 4.05 durchgeführt.

2.4 Messung der Teilchengröße

Der mittlere Teilchendurchmesser D[4.3] wurde mit einem Malvern-Mastersizer-Micro-Puls (Malvern Instruments Limited, Worcestershire, UK) gemessen. Die instrumentellen Angaben waren: Präsentations-Code: 5NBD und Analysenmodell: Poly­ dispers. Die instrumentelle Kontrolle und die primäre Daten­ verarbeitung wurde auf einem PC mit Mastersize-Microplus für Windows, Version 2,15, durchgeführt.

Das Ultrafiltrationspermeat, das von einer Charge des gesäuerten Milchgetränks, das mit Pectin Nr. 4 hergestellt worden war, erhalten wurde, wurde zur Verdünnung verwendet. Die Ultrafiltration wurde unter Verwendung eines DDS-UF-Lab 20-0,36-Moduls, das mit GR61PP-Membranen versehen war, mit einem Molekulargewichtsausschluß von 20 000 Da durchgeführt.

2.5 Sedimentation

Sedimentationsmessungen wurden durch Zentrifugation der Proben unter Verwendung einer IEC-Centra-8R-Zentrifuge (International Equipment, Needham Hts, MA, USA) durchge­ führt. 2,5 g gesäuertes Milchgetränk wurden 25 min bei 20°C und 2400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Röhrchen wurden umgedreht 15 min lang stehengelassen, und das Gewicht des Sediments wurde bestimmt und als Pro­ zentsatz (der Menge des verwendeten Milchgetränks) ausge­ drückt. Doppelte Messungen wurden von jeder Probe vorgenom­ men.

3. Ergebnisse und Diskussion 3.1 Größe des Testsystems

Dieses neue System ist, verglichen mit früheren Test­ systemen, klein, aber es enthält immer noch die gleichen Eigenschaften wie bestehende Testsysteme auf der Basis von 550 g angesäuertem Milchgetränk. Der leichteste Weg, ein Modellsystem zum Testen von Pectinen in gesäuerten Milchge­ tränken herzustellen, ist einfach gerührten Joghurt mit einer Pectinlösung zu vermischen und die Messungen an diesem Gemisch vorzunehmen. Dies besitzt auch den Vorteil, daß es wirklich in jedem Maßstab durchgeführt werden kann. Jedoch zeigten Glahn und Rolin (6), daß eine Homogenisierung die Menge des Pectins, die zur Stabilisierung benötigt wird, verringert und daß sowohl die Homogenisierung als auch die Wärmebehandlung sehr beträchtliche Wirkung auf die Stabili­ tät besitzen. Da sowohl die Homogenisierung als auch die Wärmebehandlung in das bestehende System in einem Maßstab von 550 g aufgenommen wurden, wie sie in industriellen Pro­ zessen vorhanden sind, müssen beide Behandlungen auch in dem System im kleinen Maßstab vorhanden sein. In der Industrie wird sowohl eine stromaufwärtige (vor dem Erhitzen) als auch stromabwärtige (nach dem Erhitzen) Homogenisierung verwen­ det. In diesem Modellsystem wurde gewählt, die Homogenisie­ rung nach der Hitzebehandlung durchzuführen, weil dies eine homogenere Probe ergibt und dadurch den Erhalt reproduzier­ barer Messungen, beispielsweise der Viskosität, erleichtert.

Um eine reproduzierbare Homogenisierung mit dem Mini- Jet-Homogenisator zu erhalten und um die verschiedenen Ver­ luste während des Probentransfers zu kompensieren, war es erwünscht, mit 40 ml Probe in der Homogenisierungsstufe zu arbeiten. Da nur 8 bis 9 ml für die Tests benötigt wurden (2,5 ml für die Viskometrie, 5 ml für die Sedimentation und 0,5 bis 1 ml für die Bestimmung der Teilchengröße), war die Stufe, die die größte Menge an Probe benötigte, die Homoge­ nisierung, und das Ergebnis war daher, daß das existierende Testsystem von einem Maßstab von 550 g auf 40 g Milchgetränk herabskaliert wurde.

3.2 Wärmebehandlung

Um mit dem herabskalierten System das bestehende Testsystem so nah wie möglich nachzuahmen, war es erwünscht, Modifikationen an der Wärmebehandlungsstufe vorzunehmen. Mit dem bestehenden 550 g System fand die Erhitzung in einer 600 ml Flasche mit blauer Kappe für 30 min in einem Wasser­ bad von 75°C mit Rühren alle 5 min statt.

Mit dem neuen 40 g System wurde die Wärmebehandlung in einem 50 ml Kunststoffzentrifugenröhrchen, das in das Innere einer 600 ml Flasche mit blauer Kappe, die mit Wasser ge­ füllt war, gegeben wurde, durchgeführt. Hier ergaben 75°C in dem Wasserbad eine zu starke Erhitzung, wahrscheinlich weil die thermische Leitfähigkeit von Wasser größer ist als die von koagulierter Milch. Verschiedene Temperaturen zwischen 70 und 75°C wurden daher getestet, und es wurde gefunden, daß 72°C für 30 min ohne Rühren eine gute Annäherung an das Temperaturprofil in dem großen System ergaben.

3.3 Testen des Systems in kleinem Maßstab

Wenn ein mit Pectin, das mit einer erfindungsgemäßen modifizierten PME behandelt wurde, stabilisiertes Milchge­ tränk eine geringe Sedimentation und kleine Teilchen zeigte, dann zeigt dies an, daß dieses Pectin gut zu verwenden ist und zeigt ferner an, daß das erfindungsgemäße modifizierte PME für eine solche Verwendung geeignet ist.

4. Schlußfolgerung

Ein System zum Testen der stabilisierenden Kraft von Pectinen in gesäuerten Milchgetränken wurde erfolgreich von 550 g auf 40 g Milchgetränk herabskaliert, was bedeutet, daß die benötigte Menge an Pectin von ca. 1,7 g auf ca. 0,15 g verringert wurde. Dies ist wenig genug, um ein Screening von experimentellen Pectinproben, die mit erfindungsgemäßen modifizierten Pectinen behandelt wurden, zu erlauben. Eine hohe Korrelation der Ergebnisse, die für die Teilchengröße, Viskosität und Sedimentation erhalten wurden, zwischen den beiden Methoden wurden nachgewiesen. Das Verfahren zur Verkleinerung ist relativ einfach, obwohl es immer noch sowohl Erhitzung als auch Homogenisierung enthält, was für die industrielle Relevanz als wichtig gilt.

Der Einfachheit halber wird nun eine Tabelle angegeben, die die für die Aminosäuren verwendete Codes angibt.

Auf alle in dem vorstehenden Beschreibung genannten Publikationen wird hiermit Bezug genommen. Verschiedene Modifikationen und Variationen der beschriebenen Verfahren und des erfindungsgemäßen Systems sind für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich, ohne vom Umfang und Gehalt der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Obwohl die vorlie­ gende Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist zu verstehen, daß die beanspruchte Erfindung nicht unzulässigerweise auf sol­ che spezifische Ausführungsformen beschränkt werden sollte. In der Tat sollen verschiedene Modifikationen der beschrie­ benen Ausführungsformen der Erfindung, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Biochemie und Biotechnologie oder auf verwandten Gebieten offensichtlich sind, unter den Umfang der folgenden Patentansprüche fallen.

Literaturstellen

(1) Kravtchenko, T.P., Parker, A., Trespoey, A.: In Food Macromolecules and Colloids (Hrsg. E. Dickinson und D. Lorient). The Royal Society of Chemistry, Cambridge (1995)
(2) Glahn, P.-E.: Progress in Food Nutrient Science 6, 171-177 (1982)
(3) Foley, J., Mulcahy, A.J.: Irish Journal of Food Science and Technology, 13, 43-50 (1989)
(4) Amice-Quemeneur, N., Haluk, J.-P., Hardy, J.: Journal of Dairy Science, 78, (12), 2683-2690 (1995)
(5) Ambjerg Pedersen, H.C., Jorgensen, B.B.; Food Hydrocolloids, 5(4), 323-328 (1997)
(6) Glahn, P.E., Rolin, C.: Food Ingredients Europe, Conf. Proc. 252-256 (1994)
(7) Burgaud, I., Dickinson, E., Nelson, E.: International Journal of Food Science and Technology, 25, 39-46 (1990)
Finer JJ, Vain P, Jones MW & McMullen MD (1992) Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells, Plant cell Reports 11: 323-328
Klein TM, Wolf ED, Wu R & Sanford JC (1987) High-velocity micropojectiles for delivery nucleic acids into living cells, Nature 327: 70-73
Sanford JC, Klein TM, Wolf ED & Allen N (1987) Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process, Particulate Science and Technology, 5: 27-37
Vain P, Keen N, Murillo J, Rathus C, Nemes C & Finer JJ (1993), Development of the Particle Inflow Gun, Plant cell, Tissue and Organ Culture 33: 237-246

Claims (19)

1. Aminosäuresequenz der Formel (I):
worin
A1 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A2 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A3 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A4 eine polare Aminosäure ist,
A5 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A6 eine polare Aminosäure ist,
A7 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A8 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A9 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A10 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A1l eine geladene Aminosäure ist,
A12 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A13 eine hydrophobe oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A14 eine hydrophobe oder polare Aminosäure oder eine gela­ dene oder neutrale Aminosäure ist,
A15 eine geladene oder polare oder hydrophobe Aminosäure ist,
A16 eine polare oder hydrophobe oder geladene Aminosäure oder neutrale Aminosäure ist,
A17 eine polare oder geladene Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A18 eine polare oder geladene oder hydrophobe Aminosäure ist,
A19 eine polare Aminosäure oder eine neutrale Aminosäure ist,
A20 eine hydrophobe oder polare Aminosäure ist,
A21 eine hydrophobe Aminosäure ist,
A22 eine polare oder hydrophobe Aminosäure ist.

2. Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) nach Anspruch 1 codiert.

3. Modifizierte PME, wobei die modifizierte PME dadurch er­ hältlich ist, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, und daß die erste PME so modifiziert wird, daß sie eine Aminosäure­ sequenz der Formel (I) nach Anspruch 1 umfaßt.

4. Modifizierte PME, wobei die modifizierte PME dadurch er­ hältlich ist, daß eine erste PME bereitgestellt wird, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, und daß die erste PME so modifiziert wird, daß sie nicht eine Aminosäu­ resequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, um­ faßt.

5. Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizierte PME codiert, dadurch erhältlich ist, daß ein erstes Gen bereitgestellt wird, das eine PME co­ diert, das keine Sequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert; und das erste Gen, das die PME codiert, so modifiziert, daß es eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, codiert.

6. Gen, das eine modifizierte PME codiert, wobei das Gen, das die modifizierte PME codiert, dadurch erhältlich ist, daß ein erstes Gen bereitgestellt wird, das eine PME co­ diert, das eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz der For­ mel (I) codiert, umfaßt, und das erste Gen, das die PME codiert, so modifiziert wird, daß es nicht eine Nucleotidse­ quenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, codiert, umfaßt.

7. Verfahren zur Modifikation einer PME, umfassend die Stu­ fen Bereitstellung einer ersten PME, die nicht eine Amino­ säuresequenz der Formel (I) umfaßt, und Modifizieren der ersten PME, so daß sie eine Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt.

8. Verfahren zur Modifikation einer PME, umfassend die Stu­ fen Bereitstellung einer ersten PME, die eine Aminosäurese­ quenz der Formel (I) umfaßt, und Modifizieren der ersten PME, so daß sie nicht eine Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt.

9. Verfahren zur Herstellung eines Gens, das eine modifi­ zierte PME codiert, umfassend die Stufen der Bereitstellung eines ersten Gens, das eine PME codiert, das nicht eine Se­ quenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und Modifizieren des ersten Gens, das die PME co­ diert, so daß es eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäure­ sequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, co­ diert, umfaßt.

10. Verfahren zur Herstellung eines Gens, das eine modifi­ zierte PME codiert, umfassend die Stufen der Bereitstellung eines ersten Gens, das eine PME codiert, das eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz der Formel (I) codiert, umfaßt, und Modifizieren des ersten Gens, das die PME codiert, so daß es nicht eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäurese­ quenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, codiert, umfaßt.

11. Verwendung einer Aminosäuresequenz der Formel (I) zur Beeinflussung einer PME-Aktivität.

12. Verwendung einer Aminosäuresequenz der Formel (I) zur Beeinflussung einer enzymatischen Aktivität.

13. Modifiziertes Enzym, umfassend die Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert.

14. Lebensmittel, hergestellt unter Verwendung der Aminosäu­ resequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert.

15. Lebensmittel nach Anspruch 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Lebensmittel ein Pectin ist.

16. Modifizierte PME, umfassend die Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert.

17. Verfahren zur Demethylierung von Pectin, umfassend das Inkontaktbringen des Pectins mit einer modifizierten PME, die die Aminosäuresequenz der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt.

18. Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, umfassend die Verwendung eines demethylierten Pectins, wobei das de­ methylierte Pectin durch Inkontaktbringen des Pectins mit einer modifizierten PME, die die Aminosäuresequenz der For­ mel (I), wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt, hergestellt wurde.

19. Aminosäuresequenz im wesentlichen wie hier beschrieben.