JP2000004887A

JP2000004887A - アミノ酸配列

Info

Publication number: JP2000004887A
Application number: JP11130681A
Authority: JP
Inventors: Janne Brunstedt; ブランステッドジェーン; Tove Martel Ida E Christensen; マルテルアイダエルスクリステンセントブ
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2000-01-11
Also published as: GB2338710B; CA2270425A1; NL1012028C2; FR2778667B1; AU759012C; GB2338710A; ES2160491A1; AU2809299A; ES2160491B1; FR2778667A1; GB9810159D0; IE990378A1; AU759012B2; NL1012028A1; DE19921676A1; US20030186417A1; US20020168744A1; GB9910935D0

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）のアミノ酸配列：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ
９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５
−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−
Ａ２２（Ｉ）

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アミノ酸配列に関する。本発明はまた、この
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。

【０００１】特に、本発明は、酵素活性に影響を与え得
るアミノ酸配列に関する。本発明はまた、このアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列に関する。

【０００２】ペクチンは、今日の産業において重要な商
品である。例えば、これは、濃化剤またはゲル化剤とし
て、ジャムの調製におけるような、食品産業で使用され
得る。

【０００３】ペクチンは、通常、植物細胞壁にプロトペ
クチンの形態で見いだされる構造多糖類である。ペクチ
ンの骨格は、少数の１，２結合したα−Ｌ−ラムノース
単位で断続されるα−１’４結合したガラクツロン酸残
基を含む。さらに、ペクチンは、ほとんど交互になって
いるラムノ−ガラクツロナン鎖とともに高度に分枝した
領域を含む。これらの高度に分枝した領域はまた、ラム
ノース単位のＣ３またはＣ４原子、あるいはガラクツロ
ン酸単位のＣ２またはＣ３原子へのグリコシド結合によ
って結合される他の糖単位（例えば、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｌ−アラビノース、およびキシロース）を含む。α
−１’４結合したガラクツロン酸残基の長鎖は、通常
「平滑」領域と呼ばれるが、一方、高度に分枝した領域
は、通常「毛状領域」と呼ばれる。

【０００４】ガラクツロン残基のカルボキシル基のいく
つかはエステル化される（例えば、カルボキシル基はメ
チル化される）。代表的には、カルボキシル基のエステ
ル化は、ガラクツロン酸残基の重合化後に生じる。しか
し、すべてのカルボキシル基がエステル化（例えば、メ
チル化）されることは非常にまれである。通常、エステ
ル化の程度は０〜９０％で変化する。５０％以上のカル
ボキシル基がエステル化されると、得られるペクチン
は、「高エステルペクチン」（略して「ＨＥペクチ
ン」）または「高メトキシルペクチン」と呼ばれる。５
０％未満のカルボキシル基がエステル化されると、得ら
れるペクチンは「低エステルペクチン」（略して「ＬＥ
ペクチン」）または「低メトキシルペクチン」と呼ばれ
る。５０％のカルボキシル基がエステル化されると、得
られるペクチンは「中エステルペクチン」（略して「Ｍ
Ｅペクチン」）または「中メトキシルペクチン」と呼ば
れる。ペクチンが全くまたは２、３しかエステル化した
基を含まなければ、通常、ペクチン酸と呼ばれる。

【０００５】ペクチンの構造、特にエステル化（例え
ば、メチル化）の程度は、ペクチンの多くの結果として
もたらされる物理学的および／または化学的特性を指示
する。例えば、ペクチンのゲル化は、ペクチンの化学的
性質、特にエステル化の程度に依存する。しかし、さら
に、ペクチンのゲル化はまた、可溶性固体含量、ｐＨ、
および遊離のカルシウムイオン濃度に依存する。後者に
関しては、カルシウムイオンが、カルボキシル基、特に
ＬＥペクチン上の遊離のカルボキシル基と複合体を形成
すると考えられる。

【０００６】ペクチン酵素は、ペクチン分子のガラクツ
ロナン部分への攻撃の様式に従って分類される。いくつ
かのペクチン酵素の総説は、ＰｉｌｎｉｋおよびＶｏｒ
ａｇｅｎ（ＦｏｏｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｐ．
Ｆ．Ｆｏｘ編；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；（１９９１）；
３０３−３３７頁）によって作成されている。特に、
ペクチンメチルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１
１）（他にＰＭＥと呼ばれる）は、ＨＥペクチンをＬＥ
ペクチンまたはペクチン酸に脱エステル化する。対照的
に、および例として、ペクチンデポリメラーゼは、ガラ
クツロノシルメチルエステル残基間のグリコシル結合を
分裂させる。

【０００７】より詳細には、ＰＭＥ活性は、遊離のカル
ボキシル基および遊離のメタノールを生成する。遊離の
カルボキシル基の増加は、自動滴定によって容易にモニ
ターされ得る。これに関して、初期の研究は、いくつか
のＰＭＥが、１つより多くのペクチン鎖上のエステル化
した（例えば、メチル化した）ガラクツロン酸残基のい
ずれかを脱エステル化するという意味で、ランダムな様
式でペクチンを脱エステル化することを示している。ペ
クチンをランダムに脱エステル化するＰＭＥの例は、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ（ＷＯ９
４／２５５７５を参照のこと）およびＡｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｉｓｈｉｉら１９８０
ＪＦｏｏｄＳｃｉ４４６１１−１４頁）のよ
うな真菌供給源から得られ得る。Ｂａｒｏｎら（１９８
０Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｗｉｓｓ．Ｍ−Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ１３３３０−３３３頁）は明らかに、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒから真菌ＰＭＥを単離してい
る。この真菌ＰＭＥは、３９０００Ｄの分子量、３．９
の等電点、４．５の至適ｐＨ、および３のＫ_m値（ｍｇ
／ｍｌ）を有することが報告されている。

【０００８】対照的に、いくつかのＰＭＥは、それら
が、非還元末端または遊離カルボキシル基の隣のいずれ
かでペクチンを攻撃し、次いで一本鎖機構によって、ペ
クチン分子に沿って進行し、それにより、カルシウム感
受性であり得る非エステル化ガラクツロン酸単位のブロ
ックを作製すると考えられるという意味で、ブロック様
式（Ｂｌｏｃｋ−ｗｉｓｅ）における脱エステル化ペク
チンとして公知である。ブロック様式の酵素学的にペク
チンを脱エステル化するような酵素の例は、植物ＰＭＥ
である。１２までのＰＭＥのイソ型は、柑橘類に存在す
ることが示唆されている（ＰｉｌｎｉｋＷ．およびＶ
ｏｒａｇｅｎＡ．Ｇ．Ｊ．（ＦｏｏｄＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ（Ｐ．Ｆ．Ｆｏｘ編）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；（１
９９１）；３０３−３３７頁）。これらのイソ型は、異
なる特徴を有する。

【０００９】遊離カルボキシル基のランダムまたはブロ
ック様式分布は、高速イオン交換クロマトグラフィーに
よって区別され得る（ＳｃｈｏｌｓらＦｏｏｄＨｙ
ｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ１９８９６１１５−１２
１頁）。これらの試験は、しばしば、低温殺菌後の柑橘
類ジュースにおける、所望でない残留ＰＭＥ活性を調べ
るために使用される。なぜなら、残留ＰＭＥは、オレン
ジジュース中で、ジュース中のメタノールを蓄積するの
に加えて、いわゆる「濁り損失（Ｃｌｏｕｄｌｏｓ
ｓ）」を引き起こし得るからである。

【００１０】Ｖｅｒｓｔｅｅｇら（ＪＦｏｏｄＳｃ
ｉ４５（１９８０）９６９−９７１頁）は明らかに、
オレンジからＰＭＥを単離した。この植物ＰＭＥは、種
々の特性の複数のイソ型を生じることが報告される。イ
ソ型Ｉは、３６０００Ｄの分子量、１０．０の等電点、
７．６の至適ｐＨ、および０．０８３のＫ_m値（ｍｇ／
ｍｌ）を有する。イソ型ＩＩは、３６２００Ｄの分子
量、１１．０の等電点、８．８の至適ｐＨ、および０．
００４６のＫ_m値（ｍｇ／ｍｌ）を有する。イソ型ＩＩ
Ｉ（ＨＭＷ−ＰＥ）は、５４０００Ｄの分子量、１０．
２の等電点、８の至適ｐＨ、および０．０４１のＫ_m値
（ｍｇ／ｍｌ）を有する。しかし、今日までの、このよ
うなＰＭＥについての配列データは、非常に限定されて
いる。

【００１１】ＰｉｌｎｉｋおよびＶｏｒａｇｅｎ（同
書）によれば、ＰＭＥは、多数の他の高等植物（例え
ば、リンゴ、アプリコット、アボカド、バナナ、ベリ
ー、ライム、グレープフルーツ、マンダリン、チェリ
ー、干しぶどう、ブドウ、マンゴ、パパイヤ、パッショ
ンフルーツ、モモ、西洋ナシ、プラム、マメ、ニンジ
ン、カリフラワー、キュウリ、ニラ、タマネギ、エンド
ウマメ、ジャガイモ、ラディッシュ、およびトマト）に
見いだされ得る。しかし、同様に、今日までの、このよ
うなＰＭＥについてのデータは、非常に限定されてい
る。

【００１２】植物ＰＭＥは、ＷＯ−Ａ−９７／０３５７
４に報告されている。このＰＭＥは、以下の特徴を有す
る：約３６ｋＤ〜約６４ｋＤの分子量；０．１５ＭＮ
ａＣｌ中０．５％のライムペクチンで測定した場合、７
〜８の至適ｐＨ；少なくとも５０℃の至適温度；１０゜
〜少なくとも４０℃の範囲での温度安定性；０．０７％
のＫ_m値；約０．２５ＭＮａＣｌのレベルでの最大活
性；約０．２ＭＮａ₂ＳＯ₄のレベルでの最大活性；お
よび約０．３ＭＮａＮＯ₃のレベルでの最大活性。

【００１３】別のＰＭＥは、ＷＯ９７／３１１０２に
報告されている。

【００１４】ＰＭＥは、産業における重要な用途を有す
る。例えば、ＰＭＥは、カルシウムイオンを隔離する試
薬において、またはそのような試薬として使用され得
る。これに関して、およびＰｉｌｎｉｋおよびＶｏｒａ
ｇｅｎ（同書）によれば、給餌が、水酸化カルシウムの
スラリーを、果汁濃縮後の柑橘類の皮に添加することに
よって調製され得る。添加後、高いｐＨおよびカルシウ
ムイオンは、皮中の任意のネガティブＰＭＥを活性化し
て、ペクチンの迅速な脱エステル化を引き起こし、そし
てペクチン酸カルシウムの凝集を生じる。あわされた液
体相は放出され、そして容易に絞り出され、その結果、
最初の水分含量の画分のみが、高価な熱乾燥によって除
去される必要がある。次いで、圧縮液は、動物食餌とし
て使用される。

【００１５】上記のように、ＰＭＥは、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓから得られている（ＷＯ
９４／２５５７５）。明らかに、このＰＭＥは、ペク
チン含有物質の堅固を改良するため、またはペクチンを
脱メチル化するため、またはペクチン含有物質の粘度を
増加するために使用され得る。

【００１６】ペクチンを含む果実または野菜材料から調
製された食品（例えば、ジャムまたは保存剤）の調製に
おいて、ＰＭＥが使用することが一般的になった。例え
ば、ＷＯ−Ａ−９４／２５５７５は、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓから得られたＰＭＥを用い
て、オレンジマーマレードおよびトマトペーストの調製
をさらに報告する。

【００１７】ＪＰ−Ａ−６３／２０９５５３は、ペクチ
ンメチルエステラーゼの作用によって、多価金属イオン
の存在下で、高メトキシポリα１，４−Ｄ−ガラクツロ
ニド（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｄｅ）鎖を主要な成分と
して含むペクチンポリサッカライドにおいて得られるゲ
ル、およびそれらの産生のためのプロセスを開示する。

【００１８】ＰｉｌｎｉｋおよびＶｏｒａｇｅｎ（同
書）は、内因性ＰＭＥの用途を列挙する。これは、果実
に由来するペクチンを多く含みすぎる場合、ジュースの
粘性を減少するために果汁へのＰＭＥの添加、無処置の
果汁断片からの皮および他の膜の除去を容易にするため
に、２０℃〜４０℃のコア温度に加熱されている柑橘類
果実の反射率における気体気泡へのペクチナーゼ溶液と
してのＰＭＥの添加（ＵＳ−Ａ−４２８４６５１）、お
よびリンゴ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｌｅｅ１９７０Ｆｏｏ
ｄＴｅｃｈｎｏｌ２４１１６８−７０）、缶詰の
トマト（Ｈｓｕら１９６５ＪＦｏｏｄＳｃｉ
３０５８３−５８８頁）、およびジャガイモ（Ｂａｒ
ｔｏｌｏｍｅ＆Ｈｏｆｆ１９７２ＪＡｇｒｉ
ｃＦｏｏｄＣｈｅｍ２０２６２−２６６頁）の
ような、いくつかの加工された果実および野菜の触感お
よび堅固さを保護および改良することにおけるＰＭＥの
使用を含む。

【００１９】ＧｌａｈｎおよびＲｏｌｉｎ（１９９４
ＦｏｏｄＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓＥｕｒｏｐｅ，Ｃ
ｏｎｆＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ２５２−２５６頁）
は、乳酸飲料との相互作用のための、産業用「ＧＥＮＵ
ペクチンＹＭ−１００型」の仮の適用を報告する。どの
ようにＧＥＮＵペクチンＹＭ−１００型が調製されるか
についての詳細は全く示されていない。

【００２０】ＥＰ−Ａ−０６６４３００は、カルシウム
感受性ペクチンを調製するための化学分画法を開示す
る。このカルシウム感受性ペクチンは、食品産業に有利
であるといわれる。

【００２１】従って、ペクチンおよび脱エステル化ペク
チンは、ＰＭＥに加えて、産業的重要性を有する。

【００２２】本発明は以下を提供する：１．式（Ｉ）のアミノ酸配列：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ
９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５
−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−
Ａ２２（Ｉ）であって、ここで、Ａ１は、疎水性もしくは極性アミノ酸または中性アミノ
酸Ａ２は、疎水性アミノ酸Ａ３は、疎水性アミノ酸Ａ４は、極性アミノ酸Ａ５は、極性もしくは荷電アミノ
酸または中性アミノ酸Ａ６は、極性アミノ酸Ａ７は、極性または荷電または疎水性アミノ酸Ａ８は、疎水性アミノ酸Ａ９は、疎水性または極性アミノ酸Ａ１０は、疎水性または極性アミノ酸Ａ１１は、荷電アミノ酸Ａ１２は、荷電または極性または疎水性アミノ酸Ａ１３は、疎水性もしくは荷電アミノ酸または中性アミ
ノ酸Ａ１４は、疎水性もしくは極性アミノ酸または荷電もし
くは中性アミノ酸Ａ１５は、荷電または極性または疎水性アミノ酸Ａ１６は、極性もしくは疎水性もしくは荷電アミノ酸ま
たは中性アミノ酸Ａ１７は、極性または荷電アミノ酸または中性アミノ酸Ａ１８は、極性または荷電または疎水性アミノ酸Ａ１９は、極性アミノ酸または中性アミノ酸Ａ２０は、疎水性または極性アミノ酸Ａ２１は、疎水性アミノ酸Ａ２２は、極性または疎水性アミノ酸である、アミノ酸配列。

【００２３】２．項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ
酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。

【００２４】３．改変されたＰＭＥであって、ここで、
該改変されたＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含ま
ない最初のＰＭＥを提供すること；および改変されたＰ
ＭＥが、項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列を
含むように該最初のＰＭＥを改変することによって入手
可能である。

【００２５】４．改変されたＰＭＥであって、ここで、
該改変されたＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む
最初のＰＭＥを提供すること；および改変されたＰＭＥ
が、項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列を含ま
ないように該最初のＰＭＥを改変することによって入手
可能である。

【００２６】５．改変されたＰＭＥをコードする遺伝子
であって、ここで、該改変されたＰＭＥをコードする遺
伝子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含
まないＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供するこ
と；および項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を含むようにＰＭＥをコ
ードする該最初の遺伝子を改変することによって入手可
能である。

【００２７】６．改変されたＰＭＥをコードする遺伝子
であって、ここで、該改変されたＰＭＥをコードする遺
伝子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含
むＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供すること；お
よび項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を含まないようにＰＭＥをコー
ドする該最初の遺伝子を改変することによって入手可能
である。

【００２８】７．ＰＭＥを改変するプロセスであって、
式（Ｉ）のアミノ酸配列を含まない最初のＰＭＥを提供
する工程；および項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ
酸配列を含むように該最初のＰＭＥを改変する工程を包
含する、プロセス。

【００２９】８．ＰＭＥを改変するプロセスであって、
式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む最初のＰＭＥを提供する
工程；および項目１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配
列を含まないように該最初のＰＭＥを改変する工程を包
含する、プロセス。

【００３０】９．改変されたＰＭＥをコードする遺伝子
を調製する方法であって、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ
ードする配列を含まないＰＭＥをコードする最初の遺伝
子を提供する工程；および項目１に規定される式（Ｉ）
のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むよ
うにＰＭＥをコードする該最初の遺伝子を改変する工程
を包含する、プロセス。

【００３１】１０．改変されたＰＭＥをコードする遺伝
子を調製する方法であって、式（Ｉ）のアミノ酸配列を
コードする配列を含むＰＭＥをコードする最初の遺伝子
を提供する工程；および項目１に規定される式（Ｉ）の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含まない
ようにＰＭＥをコードする該最初の遺伝子を改変する工
程を包含する、プロセス。

【００３２】１１．ＰＭＥ活性に影響を及ぼすための、
式（Ｉ）のアミノ酸配列の使用。

【００３３】１２．酵素活性に影響を及ぼすための、式
（Ｉ）のアミノ酸配列の使用。

【００３４】１３．項目１に規定される式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列を含む、改変された酵素。

【００３５】１４．項目１に規定される式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列の使用によって調製される、食品。

【００３６】１５．前記食品がペクチンである、項目１
４に記載の食品。

【００３７】１６．項目１に規定される式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列を含む、改変されたＰＭＥ。

【００３８】１７．ペクチンを脱メチル化するプロセス
であって、ペクチンを、項目１に規定される式（Ｉ）の
アミノ酸配列を含む改変されたＰＭＥと接触させる工程
を包含する、プロセス。

【００３９】１８．食品を調製するプロセスであって、
脱メチル化ペクチンを用いる工程を包含し、ここで、該
脱メチル化ペクチンが、ペクチンを、項目１に規定され
る式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む改変されたＰＭＥと接
触させる工程によって調製される、プロセス。

【００４０】１９．実質的に本明細書中に記載されるア
ミノ酸配列。

【００４１】本発明者らは、現在、かなり短いアミノ酸
配列への挿入、かなり短いアミノ酸からの欠失、かなり
短いアミノ酸をＰＭＥ内で変換することによって、ＰＭ
Ｅの酵素活性に影響し得ることを見いだした。これに関
して、ＰＭＥの酵素活性は、特定のアミノ酸を挿入また
は欠失することによって、あるいは配列を特定のアミノ
酸配列に変換することによって改変され得る。しかし、
重要なことに、得られるＰＭＥは、ＰＭＥとして作用し
得るままである。

【００４２】本発明に従って、式（Ｉ）の改良されたア
ミノ酸配列：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ
９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５
−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−
Ａ２２（Ｉ）であり、ここで、Ａ１は、疎水性もしくは極性アミノ酸または中性アミノ
酸Ａ２は、疎水性アミノ酸Ａ３は、疎水性アミノ酸Ａ４は、極性アミノ酸Ａ５は、極性もしくは荷電アミノ酸または中性アミノ酸Ａ６は、極性アミノ酸Ａ７は、極性または荷電または疎水性アミノ酸Ａ８は、疎水性アミノ酸Ａ９は、疎水性または極性アミノ酸Ａ１０は、疎水性または極性アミノ酸Ａ１１は、荷電アミノ酸Ａ１２は、荷電または極性または疎水性アミノ酸Ａ１３は、疎水性もしくは荷電アミノ酸または中性アミ
ノ酸Ａ１４は、疎水性もしくは極性アミノ酸または荷電もし
くは中性アミノ酸Ａ１５は、荷電または極性または疎水性アミノ酸Ａ１６は、極性もしくは疎水性もしくは荷電アミノ酸ま
たは中性アミノ酸Ａ１７は、極性または荷電アミノ酸または中性アミノ酸Ａ１８は、極性または荷電または疎水性アミノ酸Ａ１９は、極性アミノ酸または中性アミノ酸Ａ２０は、疎水性または極性アミノ酸Ａ２１は、疎水性アミノ酸Ａ２２は、極性または疎水性アミノ酸である。

【００４３】示されるように、本発明者らは、式（Ｉ）
のアミノ酸配列が、ＰＭＥ活性に影響することを見いだ
した。

【００４４】特に、本発明者らは、ＰＭＥが、ＰＭＥ基
質をブロック様式脱エステル化し得るか、またはＰＭＥ
基質をランダムに脱エステル化し得るかどうかにおい
て、式（Ｉ）のアミノ酸配列が役割を果たすことを見い
だした。

【００４５】より詳細には、本発明者らは、ＰＭＥ中の
式（Ｉ）のアミノ酸配列の存在が、ＰＭＥは、ＰＭＥ基
質をブロック様式脱エステル化し得ることを意味するこ
とを見いだした。一方、ＰＭＥ中の式（Ｉ）のアミノ酸
配列のいくつかまたは全ての非存在は、ＰＭＥが、ＰＭ
Ｅ基質をランダムに脱エステル化し得ることを意味す
る。

【００４６】比較的短いアミノ酸配列が、酵素（特にＰ
ＭＥ）の活性の型の少なくともいくらかの伸長を支配し
得る点において、これらの結果は驚きである。

【００４７】本発明はまた、酵素活性に影響を及ぼすた
めの、式（Ｉ）のアミノ酸配列の使用を包含する。

【００４８】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列を
含む改変された酵素を包含する。

【００４９】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列の
使用によって調製された食品を包含する。

【００５０】好ましくは、食品はペクチンである。

【００５１】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列を
含む改変ＰＭＥを包含する。

【００５２】本発明はまた、ペクチンを、式（Ｉ）のア
ミノ酸配列を含む改変ＰＭＥと接触させる工程を含む脱
メチル化されたペクチンのプロセスを包含する。

【００５３】本発明はまた、脱メチル化ペクチンを用い
る工程を含む食品を調製するプロセスを包含し、ここで
脱メチル化ペクチンは、ペクチンを、式（Ｉ）のアミノ
酸配列を含む改変ＰＭＥと接触させる工程によって調製
される。

【００５４】特に、本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸
配列を含むＰＭＥ酵素を包含する。しかし、この実施態
様において、本発明は、天然のＰＭＥがその天然の環境
に存在する場合、およびその天然の環境にもまた存在す
るその天然のヌクレオチドコード配列によって発現され
ている場合、およびそのヌクレオチドが、その天然の環
境にもまた存在するその天然のプロモーターの制御下に
ある場合、天然のＰＭＥを包含しない。簡単には、本発
明のこの実施態様は「非天然ＰＭＥ」と称される。

【００５５】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列を包含する。

【００５６】従って、本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ
酸配列を含むＰＭＥ酵素をコードするヌクレオチド配列
を包含する。しかし、この実施態様において、本発明
は、天然のＰＭＥコード遺伝子がその天然の環境に存在
する場合、およびその遺伝子が、その天然の環境にもま
た存在するその天然のプロモーターの制御下にある場
合、天然のＰＭＥコード遺伝子を包含しない。簡単に
は、本発明のこの実施態様は、「非天然ＰＭＥコード遺
伝子」と称される。

【００５７】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列−
大きなアミノ酸配列の部分であることを含む（例えば、
ＰＭＥ酵素）−および／または本発明のヌクレオチド配
列を含むかまたは発現し得る、構築物、ベクター、プラ
スミド、細胞、組織、器官、および生物を包含する。

【００５８】本発明の他の局面は、ヌクレオチド配列、
構築物、プラスミド、ベクター、細胞、組織、器官また
は生物、ならびにそれらの産物のいずれか１つを発現す
るか、または発現を可能にするか、または形質転換する
方法を包含する。

【００５９】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列と
少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、好ましく
は、式（Ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％相同で
あるアミノ酸配列、好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸配
列と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、好まし
くは、式（Ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％相同
であるアミノ酸配列、好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸
配列と少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列を包含
する。高度に好ましい実施態様において、アミノ酸配列
は、式（Ｉ）のアミノ酸配列と同一である。

【００６０】特に、本明細書中で用いられる用語「相
同」は、用語「同一」と同等であり得る。ここで、本発
明のヌクレオチド配列に関する配列相同性は、任意の１
つ以上の配列を別の配列と簡単に「眼球（ｅｙｅｂａｌ
ｌ）」比較（すなわち、厳密な比較）して、他の配列
が、配列（単数または複数）に少なくとも７５％同一で
あるかどうかを見ることによって決定され得る。相対配
列相同性（すなわち、配列同一性）もまた、２つ以上の
配列間の％相同性を計算し得る市販のコンピュータープ
ログラムによって決定され得る。このようなコンピュー
タープログラムの代表的な例は、ＣＬＵＳＴＡＬであ
る。

【００６１】本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列と
少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、好ましく
は、式（Ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％相同で
あるアミノ酸配列、好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸配
列と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、好まし
くは、式（Ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％相同
であるアミノ酸配列、好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸
配列と少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を包含する。高度に好ましい実
施態様において、アミノ酸配列は、式（Ｉ）のアミノ酸
配列と同一である。

【００６２】同様に、ここで、本明細書中で用いられる
用語「相同」は、用語「同一」と同等であり得る。ここ
で、本発明のヌクレオチド配列に関する配列相同性は、
任意の１つ以上の配列を別の配列と簡単に「眼球」比較
（すなわち、厳密な比較）して、他の配列が、配列（単
数または複数）に少なくとも７５％同一であるかどうか
を見ることによって決定され得る。相対配列相同性（す
なわち、配列同一性）もまた、２つ以上の配列間の％相
同性を計算し得る市販のコンピュータープログラムによ
って決定され得る。このようなコンピュータープログラ
ムの代表的な例は、ＣＬＵＳＴＡＬである。

【００６３】用語「ベクター」は、発現ベクターおよび
形質転換ベクターを含む。

【００６４】用語「発現ベクター」は、インビボまたは
インビトロで発現が可能である構築物を意味する。用語
「形質転換ベクター」は、１つの種から別の種へ−例え
ば、Ｅ．ｃｏｌｉから糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）または非糸状菌（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）へ
−移入され得る構築物を意味する。これは、さらに、
Ｅ．ｃｏｌｉからＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまで、植
物への移入され得る構築物であり得る。

【００６５】用語「組織」は、単離された組織および器
官内の組織を含む。組織は、植物組織であり得る。

【００６６】本発明に関する用語「生物」は、本発明の
ヌクレオチド配列を含み得る任意の生物（微生物および
単細胞生物を含む）および／またはそれらから得られる
産物を含み、ここで本発明のヌクレオチド配列は、生物
に存在する場合に発現され得る。好ましい生物は、Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたは酵母のような微生物−例え
ば、真菌−である。生物はまた、植物であり得る。

【００６７】形質転換細胞または生物は、細胞または生
物から容易に取り戻せる所望のＰＭＥの受容可能な量を
調製し得る。

【００６８】好ましくは、本発明の構築物は、本発明の
ヌクレオチド配列、およびプロモーターを含む。

【００６９】用語「プロモーター」は、当該分野の通常
の意味（例えば、遺伝子発現のＪａｃｏｂ−Ｍｏｎｏｄ
理論におけるＲＮＡポリメラーゼ結合部位）において使
用される。

【００７０】１つの局面において、本発明のプロモータ
ーは、本発明のヌクレオチド配列を発現し得る。

【００７１】１つの局面において、本発明のヌクレオチ
ド配列（例えば、本発明のＰＭＥをコードするもの）
は、細胞または組織特異的プロモーターであり得るプロ
モーターの制御下にあり得る。例えば、生物が植物であ
る場合、プロモーターは、任意の１つ以上の果実、種
子、幹、芽、根、および葉の組織におけるヌクレオチド
配列の発現に影響するものであり得る。プロモーターは
さらに、適切な宿主における発現を確実にするかまたは
増加するという特徴を含む。例えば、この特徴は、Ｐｒ
ｉｂｎｏｗＢｏｘまたはＴＡＴＡボックスのような保
存された領域であり得る。

【００７２】本発明の構築物は、本発明のヌクレオチド
配列の発現のレベルに影響する（例えば、維持、増強、
減少）他の配列さえ含み得る。例えば、適切な他の配列
は、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンを含
む。他の配列は、誘導性エレメント（例えば、温度、化
学物質、光、またはストレス誘導性エレメント）を含
む。また、転写または翻訳を増強するのに適切なエレメ
ントを存在させ得る。後者のエレメントの例は、ＴＭＶ
５'シグナル配列である（ＳｌｅａｔＧｅｎｅ２１
７［１９８７］２１７−２２５；およびＤａｗｓｏｎ
ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３［１９９３］９
７を参照のこと）。

【００７３】本発明はまた、タンパク質または組換え酵
素および／もしくはエレメントをコードするプロモータ
ーおよび／またはヌクレオチド配列の組合せを包含す
る。

【００７４】式（Ｉ）のアミノ酸配列は、ＰＭＥ基質の
ブロック様式の脱エステル化を示すことが可能であり得
るＰＭＥ酵素についてスクリーニングするのにさえ使用
され得る。例えば、スクリーニングは、コンピューター
データベースにおいて実行され得る。あるいは、または
さらに、式（Ｉ）のアミノ酸配列は、式（Ｉ）のアミノ
酸配列と同じである配列との、検出可能な免疫応答／反
応を誘発し得る抗体を作製するのに使用され得る。次い
で、これらの抗体は、ＰＭＥ基質のブロック様式脱エス
テル化を示すことが可能であり得るＰＭＥ酵素について
のスクリーニングに使用され得る。

【００７５】従って、本発明はまた、式（Ｉ）のアミノ
酸配列またはＰＭＥ基質のブロック様式脱エステル化を
示すことが可能であり得るＰＭＥ酵素についてのスクリ
ーニングするための、式（Ｉ）のアミノ酸またはそれに
対する抗体の使用を包含する。

【００７６】抗体は、ＮＨａｒｂｏｅおよびＡＩｎ
ｇｌｉｄ（「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，
ＥｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＴｉ
ｔｒｅ」、ＡＭａｎｕａｌｏｆＱｕａｎｔｉｔａｔ
ｉｖｅＩｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ，ＮＨＡｘｅｌｓｅｎら（編）、Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｅｔｓｆｏｒｌａｇｅｔ，Ｏｓｌｏ，１９
７３）およびＴＧＣｏｏｐｅｒ（「ＴｈｅＴｏｏ
ｌｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７
７）に記載の手順に従って、精製酵素をウサギに注射
し、そして抗血清からイムノグロブリンを単離すること
によって、本発明の酵素に対して産生させ得る。例示の
目的で、式（Ｉ）のアミノ酸配列は、ジフテリアトキソ
イドキャリアに架橋され得る。次いで、抗体は、結合体
に対して産生され得る。次いで、式（Ｉ）のアミノ酸配
列を含むＰＭＥについてのスクリーニングは、特に、抗
体およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行われ得る（Ｍａｒ
ｃｕｓｓｅｎおよびＰｏｕｌｓｅｎ、１９９１Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ１９８：３１８−３
２３）。

【００７７】本発明はまた、このようなスクリーニング
によって同定されるＰＭＥ酵素を包含する。

【００７８】式（Ｉ）のアミノ酸配列、またはさらにそ
れとハイブリダイズし得る配列（好ましくは、ストリン
ジェントな条件下で（例えば、６５℃および０．１×Ｓ
ＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５
クエン酸Ｎａ₃ｐＨ７．０））をコードするヌクレオ
チド配列もまた、ＰＭＥ基質のブロック様式脱エステル
化を示すことが可能であり得るＰＭＥ酵素をコードする
遺伝子をスクリーニングするのに使用され得る。例え
ば、スクリーニングは、クローンのライブラリーにおい
て、またはコンピューターデータベースにおいてさえも
実行され得る。

【００７９】従って、本発明はまた、ＰＭＥ基質のブロ
ック様式脱エステル化を示すことが可能であり得るＰＭ
Ｅ酵素をコードする遺伝子をスクリーニングするため
の、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列、またはそれとハイブリダイズし得る配列の使用を
包含する。

【００８０】本発明はまた、このようなスクリーニング
によって同定されたＰＭＥ酵素をコードする遺伝子を包
含する。

【００８１】本発明のヌクレオチド配列はまた、式
（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする領域を含むＰＭＥコ
ード遺伝子を沈黙させることが可能であるアンチセンス
配列を考案するために使用され得る。従って、アンチセ
ンスヌクレオチド配列は、ＰＭＥを選択的にスイッチオ
フすることが可能であり得る。

【００８２】本発明は、比較的短いアミノ酸配列および
／またはこれをコードするヌクレオチド配列の使用によ
って、ＰＭＥ活性に影響する手段を提供する点で有利で
ある。

【００８３】式（Ｉ）のアミノ酸配列は、適切な化学物
質または生物学的技術の使用によって、存在するＰＭＥ
に導入され得る。適切なら何処でも、式（Ｉ）のアミノ
酸配列は、部分的、全体的、または巨大なフラグメント
の一部としてさえ導入され得る。好ましくは、得られる
式（Ｉ）のアミノ酸配列は、ＰＭＥ活性部位のＣ末端部
分の付近に配置される。

【００８４】この点に関して、本発明者らは、ＰＭＥ活
性部位（これは、触媒部位と称され得る）は、代表的に
は、式（ＩＩ）：Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｈ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｈ−Ｎ
−Ｎ−Ｎ−Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｈ−Ｎ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｃ−
Ｎ−Ｈ−Ｈ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（ＩＩ）のアミノ酸配列
によって特徴づけられ得ると考え、ここで、Ｈは、独立
して、疎水性アミノ酸を表し、Ｃは、独立して、荷電ア
ミノ酸を表し、Ｐは、独立して、極性アミノ酸を表し、
Ｇは、グリシンを表し、Ｎは、独立して、グリシン、疎
水性アミノ酸、荷電アミノ酸、または極性アミノ酸を表
す。

【００８５】式（ＩＩ）のアミノ酸配列について：疎水
性アミノ酸の例としては：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ
（Ｖ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、
Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）が挙げられる；荷電のアミ
ノ酸の例としては、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｙ
ｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる；そして極性アミ
ノ酸の例としては：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｙ
ｒ（Ｙ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｎ
（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。

【００８６】本発明者らは、式（ＩＩ）のアミノ酸配列
は、活性部位を規定するために重要であると考える。な
ぜなら、以前の研究によって、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ＰＭＥアミノ酸１４が、ヒスチジンのアラニンへの変
化がＰＭＥ活性の損失を引き起こしたので、活性部位に
関与することが示されているからである（Ｄｕｗｅおよ
びＫｈａｎｈ（１９９６）ＢｉｏｔｅｃｈｎＬｅｔｔ
ｅｒｓ第１８巻：６２１−６２６）。

【００８７】あるいは、例えば、部位特異的化学改変の
使用によって１つ以上のアミノ酸をより極性にすること
によって、ＰＭＥ内に含まれる実存のアミノ酸配列を改
変し、そしてそうすることにより、アミノ酸配列を、式
（Ｉ）を有する配列に変換し、従って、ＰＭＥ基質をブ
ロック様式脱エステル化し得るＰＭＥに、ＰＭＥを変換
することが可能である。

【００８８】あるいは、ＰＭＥのコード配列は、式
（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の
挿入または欠失または置換によって改変され得る。適切
なら何処でも、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列は、部分的、全体的、または巨大なフラ
グメントの部分としてさえも導入され得る。巨大なフラ
グメントの手段による挿入は、例えば、２つの適切な制
限部位が、正確な要求位置に存在しない場合、適切であ
り得る。この点に関して、最初の遺伝子から巨大なフラ
グメントを除去し、次いで式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を含む第２のフラグメントと
置換することが必要であり得、そしてここで、ヌクレオ
チド配列は、除去されているヌクレオチド配列フラグメ
ントの少なくとも一部に少なくとも実質的に類似の配列
によって、１つまたは両方の側に隣接され得る。好まし
くは、式（Ｉ）のアミノ酸をコードする、得られるヌク
レオチド配列は、ＰＭＥ活性部位の３'末端付近に位置
する。

【００８９】この点に関して、ブロック様式脱エステル
化特性を通常示すＰＭＥ酵素に適応させることが所望さ
れる場合、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチドコード配列の１つ以上のコドンを除去または置換
することが（または、このヌクレオチド配列に１つ以上
のさらなるコドンを添加することさえ）可能であり、そ
してそうすることにおいて、ヌクレオチド配列を、式
（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするものから、式（Ｉ）
のアミノ酸をコードしないものに変換し、従って、ＰＭ
Ｅの活性を変化させ、その結果、ランダムな脱エステル
化特性を示し得る。

【００９０】この点に関して、ランダムな脱エステル化
特性を通常示すＰＭＥ酵素に適応させることが所望され
る場合、次いで、ＰＭＥコード配列（その活性部位では
ない）内に含まれるヌクレオチドコード配列の１つ以上
のコドン−を除去または置換することが（または、この
ヌクレオチド配列に１つ以上のさらなるコドンを添加す
ることさえ）可能であり、そしてそうすることにおい
て、ヌクレオチド配列を、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ
ードしないものから、式（Ｉ）のアミノ酸をコードする
ものに変換し、従って、ＰＭＥの活性を変化させ、その
結果、ブロック様式脱エステル化特性を示し得る。

【００９１】例示の目的で、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓからのＰＭＥコード遺伝子の一部分をスプライシ
ングし、次いでその部分を、式（Ｉ）のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列と置換することが可能であ
る。次いで、得られる改変ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＰ
ＭＥは、ＰＭＥ基質においてブロック様式脱エステル化
特性を示し得る。

【００９２】従って、本発明は改変ＰＭＥを包含し、こ
こで、この改変ＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含
まない最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭ
Ｅを改変し、その結果、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む
ようにする工程から入手可能である。

【００９３】本発明はまた、改変ＰＭＥを包含し、ここ
で、この改変ＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む
最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥを改
変し、その結果、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含まないよ
うにする工程から入手可能である。

【００９４】本発明はまた、改変ＰＭＥを包含し、ここ
で、この改変ＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含ま
ない最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥ
を改変し、その結果、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むよ
うにする工程から得られる。

【００９５】本発明はまた、改変ＰＭＥを包含し、ここ
で、この改変ＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む
最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥを改
変し、その結果、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含まないよ
うにする工程から得られる。

【００９６】さらに、本発明は、ＰＭＥを改変するプロ
セスを包含し、これは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含ま
ない最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥ
を改変し、その結果、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むよ
うにする工程を包含する。

【００９７】本発明はまた、ＰＭＥを改変するプロセス
を包含し、これは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む最初
のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥを改変
し、その結果、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含まないよう
にする工程を包含する。

【００９８】本発明はまた、改変ＰＭＥを包含し、ここ
でこの改変ＰＭＥは、式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列を
含む最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥ
を改変し、その結果、それが式（Ｉ）の改変アミノ酸配
列を含む工程から入手可能であり、ここで、式（Ｉ）の
最初のアミノ酸配列は、式（Ｉ）の改変アミノ酸配列と
は異なる。

【００９９】本発明はまた、改変ＰＭＥを包含し、ここ
でこの改変ＰＭＥは、式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列を
含む最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭＥ
を改変し、その結果、それが式（Ｉ）の改変アミノ酸配
列を含む工程から得られ、ここで、式（Ｉ）の最初のア
ミノ酸配列は、式（Ｉ）の改変アミノ酸配列とは異な
る。

【０１００】さらに、本発明は、ＰＭＥを改変するプロ
セスを包含し、これは、式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列
を含む最初のＰＭＥを提供する工程；および最初のＰＭ
Ｅを改変し、その結果、それが式（Ｉ）の改変アミノ酸
配列を含み、ここで、式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列
は、式（Ｉ）の改変アミノ酸配列とは異なる、工程を含
む。

【０１０１】これらの最後の３つの局面は、異なるブロ
ック様式脱エステル化活性を導入することが所望される
場合、重要であり得る。

【０１０２】本発明に従って、式（Ｉ）のアミノ酸配列
の全てまたは部分（例えば、式（Ｉ）の１つ以上のアミ
ノ酸配列）を、ＰＭＥに挿入することが可能であり、そ
の結果、得られる改変ＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配
列の全てを含む。本発明の改変局面はまた、ＰＭＥに存
在するアミノ酸残基を改変し、その結果、得られるＰＭ
Ｅが、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む、工程を含む。

【０１０３】示されるように、改変工程は、１つ以上の
アミノ酸のいずれか１つ以上の付加、置換、または欠失
を含み得る。

【０１０４】改変酵素の正確な折り畳みパターンを確実
にするために、１つ以上のアミノ酸残基を除去すること
が必要であり得る。１つ以上のアミノ酸残基を除去する
ことが必要である場合、次いで、通常これらの残基（単
数または複数）は、式（Ｉ）のアミノ酸配列の全てまた
は部分の挿入の時点で除去される。例示の目的で、式
（Ｉ）の全長アミノ酸配列が、配列に挿入されて、改変
酵素が形成される場合、酵素から２２アミノ酸部分を除
去することが必要であり得る。当然、除去工程は、挿入
工程の前、間、または後に行われ得る。

【０１０５】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を包含し、ここでこの改変ＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含ま
ないＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供する工程；
およびＰＭＥをコードする最初の遺伝子を改変して、そ
の結果、それが式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を含む工程から入手可能である。

【０１０６】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を包含し、ここでこの改変ＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含む
ＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供する工程；およ
びＰＭＥをコードする最初の遺伝子を改変して、その結
果、それが式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列を含まない工程から入手可能である。

【０１０７】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を包含し、ここでこの改変ＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含ま
ないＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供する工程；
およびＰＭＥをコードする最初の遺伝子を改変して、そ
の結果、それが式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を含む工程から入手可能である。

【０１０８】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を包含し、ここでこの改変ＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含む
ＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供する工程；およ
びＰＭＥをコードする最初の遺伝子を改変して、その結
果、それが式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列を含まない工程から得られる。

【０１０９】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を調製する方法を包含し、これは、式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列をコードする配列を含まないＰＭＥをコードす
る最初の遺伝子を提供する工程；およびＰＭＥをコード
する最初の遺伝子を改変して、その結果、それが式
（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
含む工程を含む。

【０１１０】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を調製する方法を包含し、これは、式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列をコードする配列を含むＰＭＥをコードする最
初の遺伝子を提供する工程；およびＰＭＥをコードする
最初の遺伝子を改変して、その結果、それが式（Ｉ）の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含まない
工程を含む。

【０１１１】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を包含し、ここでこの改変ＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列をコードする配列
を含むＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供する工
程；およびＰＭＥをコードする最初の遺伝子を改変し
て、その結果、それが式（Ｉ）の改変アミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を含み、ここで式（Ｉ）の最
初のアミノ酸配列が、式（Ｉ）の改変アミノ酸配列とは
異なる工程から入手可能である。

【０１１２】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を包含し、ここで改変ＰＭＥをコードする遺伝子
は、式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列をコードする配列を
含むＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供する工程；
およびＰＭＥをコードする最初の遺伝子を改変して、そ
の結果、それが式（Ｉ）の改変アミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を含み、ここで式（Ｉ）の最初のア
ミノ酸配列が、式（Ｉ）の改変アミノ酸配列とは異なる
工程から得られる。

【０１１３】本発明はまた、改変ＰＭＥをコードする遺
伝子を調製する方法を包含し、これは、式（Ｉ）の最初
のアミノ酸配列をコードする配列を含むＰＭＥをコード
する最初の遺伝子を提供する工程；およびＰＭＥをコー
ドする最初の遺伝子を改変して、その結果、それが式
（Ｉ）の改変アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ここで式（Ｉ）の最初のアミノ酸配列が、式
（Ｉ）の改変アミノ酸配列とは異なる工程を含む。

【０１１４】これらの最後の３つの局面は、異なるブロ
ック様式脱エステル化活性を導入することが所望される
場合、重要であり得る。

【０１１５】本発明に従って、式（Ｉ）のアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部（例え
ば、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする１つ以上のヌ
クレオチド配列）を、ＰＭＥをコードする遺伝子に挿入
して、その結果、得られる遺伝子は、式（Ｉ）のアミノ
酸配列の全てを含む改変ＰＭＥをコードすることもまた
可能である。

【０１１６】示されるように、改変工程は、１つ以上の
アミノ酸のいずれか１つ以上の付加、置換、または欠失
を含み得る。

【０１１７】得られた発現改変酵素の正確な折り畳みパ
ターンを確実にするために、１つ以上のアミノ酸残基を
除去することが必要であり得る。１つ以上のアミノ酸残
基を除去することが必要である場合、通常これらの残基
（単数または複数）は、式（Ｉ）のアミノ酸配列の全て
または部分の挿入の時点で除去される。例示の目的で、
式（Ｉ）の全長アミノ酸配列が、配列に挿入されて、改
変酵素が形成される場合、次いで、酵素から２２アミノ
酸部分を除去することが必要であり得る。当然、除去工
程は、挿入工程の前、間、または後に行われ得る。

【０１１８】本発明のＰＭＥはまた、天然供給源からの
ＰＭＥを改変する工程から得られ得るか、または天然の
供給源から得られ得るか、または化学的に合成され得
る。例えば、改変のためのＰＭＥは、真菌から入手可能
であり得る（例えば、例示の目的で、真菌起源のＰＭＥ
（すなわち、真菌から得られたＰＭＥ））。あるいは、
改変のためのＰＭＥは、細菌から入手可能であり得る
（例えば、例示の目的で、細菌起源のＰＭＥ（すなわ
ち、細菌から得られたＰＭＥ））。あるいは、改変のた
めのＰＭＥは、植物から入手可能である（例えば、例示
の目的で、植物起源のＰＭＥ（すなわち、植物から得ら
れたＰＭＥ）。１つの好ましい実施態様において、本発
明のＰＭＥは、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製さ
れる。

【０１１９】同様に、本発明のＰＭＥをコードする遺伝
子は、天然供給源からのＰＭＥを改変する工程から得ら
れ得るか、または天然の供給源から得られ得るか、また
は化学的に合成され得る。例えば、改変のためのＰＭＥ
をコードする遺伝子は、真菌から入手可能であり得る
（例えば、例示の目的で、真菌起源のＰＭＥをコードす
る遺伝子（すなわち、真菌から得られたＰＭＥをコード
する遺伝子））。あるいは、改変のためのＰＭＥをコー
ドする遺伝子は、細菌から入手可能であり得る（例え
ば、例示の目的で、細菌起源のＰＭＥをコードする遺伝
子（すなわち、細菌から得られたＰＭＥをコードする遺
伝子））。あるいは、改変のためのＰＭＥをコードする
遺伝子は、植物から入手可能である（例えば、例示の目
的で、植物起源のＰＭＥをコードする遺伝子（すなわ
ち、植物から得られたＰＭＥをコードする遺伝子）。１
つの好ましい実施態様において、本発明のＰＭＥは、組
換えＤＮＡ技術の使用によって調製される。

【０１２０】従って、本発明の鍵となる要素は、式
（Ｉ）のアミノ酸配列、ならびにこれをコードするヌク
レオチド配列に関する。

【０１２１】好ましくは、Ａ１は疎水性アミノ酸であ
る。

【０１２２】好ましくは、Ａ５は極性アミノ酸である。

【０１２３】好ましくは、Ａ７は極性アミノ酸である。

【０１２４】好ましくは、Ａ９は疎水性アミノ酸であ
る。

【０１２５】好ましくは、Ａ１０は疎水性アミノ酸であ
る。

【０１２６】好ましくは、Ａ１２は荷電アミノ酸であ
る。

【０１２７】好ましくは、Ａ１３は疎水性アミノ酸であ
る。

【０１２８】好ましくは、Ａ１４は疎水性アミノ酸であ
る。

【０１２９】好ましくは、Ａ１５は荷電アミノ酸であ
る。

【０１３０】好ましくは、Ａ１６は極性アミノ酸であ
る。

【０１３１】好ましくは、Ａ１７は極性アミノ酸であ
る。

【０１３２】好ましくは、Ａ１８は極性アミノ酸であ
る。

【０１３３】好ましくは、Ａ２０は疎水性アミノ酸であ
る。

【０１３４】好ましくは、Ａ２２は極性アミノ酸であ
る。

【０１３５】示されるように、式（Ｉ）のアミノ酸配列
は、１つ以上の疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、荷電ア
ミノ酸、および中性アミノ酸の群を含む。任意の１つ以
上の疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、荷電アミノ酸、ま
たは中性アミノ酸は、非天然のアミノ酸であり得る。こ
の点に関して、例えば、極性アミノ酸になるように、非
極性の天然に存在するアミノ酸を誘導体化することが可
能であり得る。非天然アミノ酸に関する教示は、Ｃｒｅ
ｉｇｈｔｏｎ（１９８４Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａＰｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ．Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍ
ｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ）に見い出さ
れ得る。この参考文献はまた、アミノ酸残基の改変（例
えば、グリコシル化、リン酸化、およびアセチル化）に
関するいくつかの一般的な教示を提供する。

【０１３６】しかし、１つの好ましい局面において、疎
水性アミノ酸、極性アミノ酸、荷電アミノ酸、および中
性アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。

【０１３７】式（Ｉ）のアミノ酸配列について、疎水性
アミノ酸の好ましい例としては：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ
（Ｖ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、
Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）が挙げられる。

【０１３８】式（Ｉ）のアミノ酸配列について、荷電の
アミノ酸の好ましい例としては：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ
（Ｅ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。

【０１３９】式（Ｉ）のアミノ酸配列について、極性ア
ミノ酸の好ましい例としては：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ
（Ｔ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、
Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられ
る。

【０１４０】式（Ｉ）のアミノ酸配列について、中性ア
ミノ酸の好ましい例としては、グリシン（Ｇ）が挙げら
れる。

【０１４１】好ましくは、Ａ１は、Ａ、Ｖ、Ｇ、または
Ｔである。

【０１４２】好ましくは、Ａ２は、ＶまたはＬである。

【０１４３】好ましくは、Ａ３は、Ｌ、Ｆ、またはＩで
ある。

【０１４４】好ましくは、Ａ４は、Ｑである。

【０１４５】好ましくは、Ａ５は、Ｎ、Ｄ、Ｋ、Ｇ、ま
たはＳである。

【０１４６】好ましくは、Ａ６は、ＣまたはＳである。

【０１４７】好ましくは、Ａ７は、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、
Ｙ、またはＬである。

【０１４８】好ましくは、Ａ８は、Ｉ、Ｌ、またはＦで
ある。

【０１４９】好ましくは、Ａ９は、Ｈ、Ｎ、Ｖ、Ｍ、ま
たはＬである。

【０１５０】好ましくは、Ａ１０は、Ａ、Ｃ、Ｉ、Ｐ、
Ｌ、Ｃ、またはＳである。

【０１５１】好ましくは、Ａ１１は、Ｒである。

【０１５２】好ましくは、Ａ１２は、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｑ、
またはＹである。

【０１５３】好ましくは、Ａ１３は、Ｐ、Ｇ、またはＲ
である。

【０１５４】好ましくは、Ａ１４は、Ｎ、Ｇ、Ｍ、Ａ、
Ｌ、Ｒ、またはＳである。

【０１５５】好ましくは、Ａ１５は、Ｓ、Ｋ、Ｅ、Ｐ、
またはＤである。

【０１５６】好ましくは、Ａ１６は、Ｇ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、
Ｋ、またはＶである。

【０１５７】好ましくは、Ａ１７は、Ｑ、Ｇ、またはＫ
である。

【０１５８】好ましくは、Ａ１８は、Ｋ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、
Ｔ、またはＳである。

【０１５９】好ましくは、Ａ１９は、Ｎ、Ｃ、またはＧ
である。

【０１６０】好ましくは、Ａ２０は、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、
Ｖ、Ｈ、またはＮである。

【０１６１】好ましくは、Ａ２１は、ＶまたはＩであ
る。

【０１６２】好ましくは、Ａ２２は、Ｔ、Ｌ、またはＳ
である。

【０１６３】一旦、改変ＰＭＥが本発明に従って調製さ
れているか、または本発明のスクリーニングを用いて同
定されているＰＭＥの量が調製されていると、次いで、
本発明のＰＭＥは、１つ以上のＰＭＥ基質に添加され得
る。ＰＭＥ基質は、異なる供給源から入手可能であり
得、そして／または異なる化学組成物であり得る。

【０１６４】好ましい実施態様において、少なくとも１
つのＰＭＥ基質はペクチンであるか、またはペクチンか
ら誘導され得るものであるか、もしくはペクチンに由来
する基質（例えば、ペクチン誘導体）である。

【０１６５】用語「ペクチンに由来する」は、誘導体化
ペクチン、分解（例えば、部分分解）ペクチン、および
改変ペクチンを含む。改変ペクチンの例は、ＰＭＥのよ
うな酵素で事前に処理されているペクチンである。ペク
チン誘導体の例は、化学処理−例えば、アミド化−され
ているペクチンである。

【０１６６】さらに、本発明のＰＭＥは、さらなる（お
よび必要に応じて異なる）ＰＭＥ（単数または複数）と
組み合わせて使用され得る。

【０１６７】１つより多いＰＭＥが存在する場合、次い
で、ＰＭＥは、異なる供給源から入手可能であり得、そ
して／または異なる組成物であり得、そして／または異
なる反応性プロフィール（例えば、異なるｐＨ至適およ
び／または異なる温度至適）を有し得る。

【０１６８】本発明を用いて、本発明のＰＭＥ酵素は、
ランダムな様式またはブロック（ｂｌｏｃｋ−ｗｉｓ
ｅ）様式において、ＰＭＥ基質を脱エステル化し得る。
１つより多いＰＭＥが存在する場合、次いで、各ＰＭＥ
は、ランダムな様式においてＰＭＥ基質（単数または複
数）を脱エステル化し得るＰＭＥ、またはブロック−ワ
イズ様式においてＰＭＥ基質（単数または複数）を脱エ
ステル化し得るＰＭＥから独立して選択される。

【０１６９】１つの好ましい実施態様において、本発明
の（または少なくとも１つの）改変ＰＭＥ酵素は、ブロ
ック様式においてＰＭＥ基質（単数または複数）を脱エ
ステル化する。

【０１７０】さらに好ましい実施態様において、本発明
の改変ＰＭＥ酵素は、低いｐＨ至適（例えば、ｐＨ２〜
５、好ましくはｐＨ２．５〜４．５）、およびペクチン
に対する高い親和性（例えば、＜１ｍｇ／ｍｌ）、およ
びブロック様式においてペクチンを脱エステル化する能
力を有する。

【０１７１】１つより多いＰＭＥが存在する場合、各Ｐ
ＭＥは、ナトリウムイオンに対して感受性（Ｎａ−感受
性）であるＰＭＥ酵素、またはナトリウムイオンに対し
て非感受性（Ｎａ−非感受性）であるＰＭＥ酵素から独
立して選択される。１つの好ましい実施態様において、
本発明の（または少なくとも１つの）ＰＭＥ酵素は、Ｎ
ａ−感受性であるＰＭＥ酵素である。

【０１７２】さらなるＰＭＥは、天然の供給源から入手
可能であり得るか、または天然の供給源から入手される
か、または化学的に合成され得る。例えば、さらなるＰ
ＭＥは、真菌から入手可能であり得る（例えば、例示の
目的で、真菌起源のＰＭＥ（すなわち、真菌から得られ
ているＰＭＥ））。あるいは、さらなるＰＭＥは、細菌
から入手可能であり得る（例えば、例示の目的で、細菌
起源のＰＭＥ（すなわち、細菌から得られているＰＭ
Ｅ））。あるいは、さらなるＰＭＥは、植物から入手可
能である（例えば、例示の目的で、植物起源のＰＭＥ
（すなわち、植物から得られているＰＭＥ））。１つの
好ましい実施態様において、さらなるＰＭＥは、組換え
ＤＮＡ技術の使用によって調製される。例えば、さらな
るＰＭＥは、ＷＯ−Ａ−９７／０３５７４に開示される
組換えＰＭＥ、または、ＷＯ−Ａ−９４／２５５７５ま
たはＷＯ−Ａ−９７／３１１０２のいずれかに開示され
るＰＭＥ、ならびにこれらの特許出願に開示される配列
の改変体、誘導体、またはホモログであり得る。１つの
好ましい実施態様において、さらなるＰＭＥは、ＷＯ−
Ａ−９７／０３５７４（その内容を、本明細書中で参考
として援用する）の組換えＰＭＥおよび／またはＷＯ−
Ａ−９４／２５５７５（その内容を、本明細書中で参考
として援用する）のＰＭＥ、またはその改変体、誘導
体、もしくはホモログである。

【０１７３】改変ＰＭＥによって脱エステル化されたペ
クチンは、非改変ＰＭＥによって脱エステル化されたも
のとは異なる構造を有し得ると考えられる。この点に関
して、非改変ＰＭＥは式（Ｉ）のアミノ酸配列を含まな
いが、改変ＰＭＥは含む場合、次いで、改変ＰＭＥによ
って処理されたペクチンは、非改変ＰＭＥとのランダム
な様式とは反対に、ブロック様式において、少なくとも
部分的に脱エステル化され得る。さらに、ＰＭＥ処理ペ
クチンのカルシウム感受性のような局面はまた、改変Ｐ
ＭＥが、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むか否かに依存し
て変化し得る。改変ＰＭＥが、式（Ｉ）のアミノ酸配列
を含む場合、次いで、ＰＭＥ処理ペクチンは、未改変Ｐ
ＭＥによって処理したペクチンのものより高いカルシウ
ム感受性を有し得ると考えられる。

【０１７４】ＰＭＥのペクチンに対する全体的な親和性
は、改変に基づいて変更し得るとも考えられる。

【０１７５】改変に基づくＰＭＥのｐＨ至適における変
化が存在し得るとも考えられる。

【０１７６】このことは、改変ＰＭＥを個々の要求（例
えば、至適反応条件）に適するように変更することが可
能であり得ることを意味する。従って、高いｐＨ至適お
よびブロック様式においてペクチンを脱エステル化する
能力を有する植物ＰＭＥを、高いｐＨ至適を有したまま
の改変ＰＭＥに改変することが可能であり得るが、ここ
で、このＰＭＥは、ランダムな様式において、単に式
（Ｉ）のアミノ酸配列またはこれをコードする配列を除
去、改変、またはサイレンシングする（例えば、選択的
アンチセンス技術によって）ことによって、ペクチンを
脱エステル化する能力を有する。同様に、低いｐＨ至
適、およびランダムな様式においてペクチン脱エステル
化する能力を有する真菌ＰＭＥまたは細菌ＰＭＥを、低
いｐＨ至適を有したままの改変ＰＭＥに改変することが
可能であり得るが、ここで、このＰＭＥは、少なくとも
部分的なブロック様式において、単に式（Ｉ）のアミノ
酸配列を導入するか、またはこのアミノ酸に対する配列
の存在する切片を変換し、そして／またはこのアミノ酸
をコードするコード配列を改変することによって、ペク
チンを脱エステル化する能力を有する。

【０１７７】本発明のＰＭＥは、食品を調製するのに使
用され得る。

【０１７８】用語「食品」は、ヒトおよび／または動物
消費のための食物を含み得る。代表的な食品としては、
ジャム、マーマレード、ゼリー、乳製品（例えば、牛乳
またはチーズ）、肉製品、鳥肉製品、魚製品、およびパ
ン製品が挙げられる。食品は、飲料でさえあり得る。飲
料は、飲用ヨーグルト、フルーツジュース、または乳漿
タンパク質を含む飲料であり得る。

【０１７９】本発明のＰＭＥは、他の型の酵素と組み合
わせて使用され得る。

【０１８０】他の型の酵素の例としては、他のペクチナ
ーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ポリガラクツロナー
ゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ラムノ−
ガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ（ｇａｌａｃｔａｎ
ａｓｅ）、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンド−β−
グルカナーゼ、アラビナーゼ（ａｒａｂｉｎａｓｅ）、
アセチルエステラーゼ、またはペクチン放出酵素、ある
いはそれらの組み合わせが挙げられる。

【０１８１】式（Ｉ）のアミノ酸配列の例は以下を含
む：ＡＶＬＱＮＣＤＩＨＡＲＫＰＮＳＧＱＫＮＭＶＴＡＶＬＱＤＣＤＩＮＡＲＲＰＮＳＧＱＫＮＭＶＴＶＶＦＱＫＣＱＬＶＡＲＫＰＧＫＹＱＱＮＭＶＴＶＶＦＱＫＣＱＬＶＡＲＫＰＧＫＹＱＱＮＭＶＴＶＶＦＱＫＳＱＬＶＡＲＫＰＭＳＮＱＫＮＭＶＴＧＶＦＱＮＣＫＬＶＣＲＬＰＡＫＧＱＱＣＬＶＴＡＶＦＱＮＣＥＦＶＩＲＲＰＭＥＨＱＱＣＩＶＴＶＶＦＱＧＣＫＩＭＰＲＱＰＬＳＮＱＦＮＴＩＴＦＦＶＱＳＣＫＩＭＰＲＱＰＬＰＮＱＦＮＴＩＴＡＶＦＱＮＣＹＬＶＬＲＬＰＲＫＫＧＹＮＶＩＬＴＶＩＱＮＳＬＩＬＣＲＫＧＳＰＧＱＴＮＨＶＴ。

【０１８２】上記のように、本発明は、式（Ｉ）アミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。当然
のことながら、当業者は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ
ードし得るヌクレオチド配列を最終的に生じるコドンの
適切な収集物を選択し得る。非限定的な例示の目的で、
式（Ｉ）の適切なアミノ酸配列の例は以下であり：ＡＶＬＱＮＣＤＩＨＡＲＫＰＮＳＧＱＫＮＭＶＴそして、適切なヌクレオチドコード配列は以下である：ＧＣＣＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＡ。

【０１８３】本発明に従って、形質転換細胞、形質転換
器官、または形質転換生物を調製することが可能であ
り、ここで、内因性ＰＭＥ産生は、停止、または抑制、
または除去されており、そしてここで、本発明による外
因性改変ＰＭＥが、その代わりに発現される。細胞は、
植物細胞であり得る。器官は、植物器官であり得る。好
ましくは、生物は、真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓまたは酵母）である。生物は、植物でさえあり得
る。本発明のこの局面は、例えば、本発明にしたがって
形質転換された細胞が、成熟において、非改変植物細胞
とは１つ以上異なる型のペクチンを産生する点におい
て、利点を有する。

【０１８４】ＷＯ−Ａ−９７／０３５７４は、式（Ｉ）
のアミノ酸配列はいうまでもなく、本発明のＰＭＥを示
唆さえしないとしても、その教示は、本発明によるＰＭ
Ｅを、ＰＭＥをコードする改変遺伝子の使用（例えば、
上記の概要の改変の１つの目的で）によってどのように
調製するかにおいて、いくつかの有用な教示を提供す
る。さらに、これらの教示はまた、式（Ｉ）のアミノ酸
配列単独および大きな成分の部分（例えば、本発明のＰ
ＭＥの部分）を発現し得る、形質転換細胞、形質転換器
官、および形質転換生物をどのように調製するかにおい
て、良好な背景を提供する。これらの教示のいくつか
は、以下に引用される。

【０１８５】組換えＰＭＥを発現するために、宿主生物
は、原核生物または真核生物であり得る。適切な原核生
物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。原核生物宿主の形
質転換の教示は、当該分野において良好に考証される。
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，第２版、１９８９，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）。次
いで、原核生物宿主が使用される場合、遺伝子は、形質
転換される前に、適切に（例えば、イントロンの除去に
よって）改変される必要があり得る。

【０１８６】１つの実施態様において、宿主生物は、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ）であり得る。トランスジェニックＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓは、以下の教示によって調製され
得る：Ｒａｍｂｏｓｅｋ，ＪおよびＬｅａｃｈ，Ｊ．１
９８７（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｉｎｆｉ
ｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ａｎｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓ．ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：３５７−３９
３）、ＤａｖｉｓＲ．Ｗ．１９９４（Ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ
Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ｊ．Ｒ．（編）Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ｙｅａｒｓｏｎ．Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ第２９巻．ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔ
ｅｒｄａｍ１９９４．５２５−５６０頁）、Ｂａｌｌ
ａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．１９９１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒＦｉｌａｍｅｎｔｏ
ｕｓＦｕｎｇｉａｎｄａｎＯｖｅｒｖｉｅｗ
ｏｆＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．
Ｉｎ：Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，ＢｅｒｋａＲ．Ｍ．
（編）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭ
ｙｃｏｌｏｇｙ．ＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＡｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
Ｆｕｎｇｉ．ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ．
ＮｅｗＹｏｒｋ１９９１．１−２９頁）、および
ＴｕｒｎｅｒＧ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒ
ｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉ
ｎ：ＭａｒｔｉｎｅｌｌｉＳ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏ
ｒｎ，Ｊ．Ｒ．（編）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ｙ
ｅａｒｓｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第２９巻．
ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒｄａｍ１９９４．６
４１−６６６頁）。しかし、以下の注釈は、トランスジ
ェニックＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを産生するためのこれ
らの教示の要旨を提供する。

【０１８７】ほとんど一世紀の間、糸状菌は、有機化合
物および酵素の産生のために、多くの型の産業で幅広く
使用されてきた。例えば、伝統的な日本の麹および大豆
発酵は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐを使用してい
る。また、今世紀において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒは、有機酸（特にクエン酸）の産生のため、
および産業における使用のための種々の酵素の産生のた
めに使用されている。

【０１８８】糸状菌が、産業において、非常に幅広く使
用されてきた２つの主な理由が存在する。第１に、糸状
菌は、高量の細胞外産物（例えば、酵素、および抗生物
質または有機酸のような有機化合物）を産生し得る。第
２に、糸状菌は、低コストの基質（例えば、穎果、糠、
ビートの髄など）で増殖し得る。同じ理由が、糸状菌
を、組換えＰＭＥを異種発現するための宿主として魅力
的な生物にしている。

【０１８９】トランスジェニックＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓを調製するために、発現構築物は、必要なヌクレオチ
ド配列を、糸状菌において発現されるように設計された
構築物に挿入することによって調製される。

【０１９０】異種発現のために使用されるいくつかの型
の構築物が開発されている。これらの構築物は、真菌に
おいて活性であるプロモーターを含み得る。プロモータ
ーの例としては、高度に発現された細胞外酵素のための
真菌プロモーター（例えば、グルコアミラーゼプロモー
ターまたはα−アミラーゼプロモーター）が挙げられ
る。ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によってコ
ードされるタンパク質を指向するシグナル配列に融合さ
れて、分泌され得る。通常、真菌起源のシグナル配列が
使用される。真菌において活性なターミネーターは、発
現系を終了する。

【０１９１】別の型の発現系は、ヌクレオチド配列が、
安定なタンパク質をコードする真菌遺伝子のより小さな
またはより大きな部分に融合され得る真菌において開発
されている。このことは、ヌクレオチド配列によってコ
ードされるタンパク質を安定化し得る。このような系に
おいて、切断部位（特定のプロテアーゼによって認識さ
れる）は、真菌タンパク質と、ヌクレオチド配列によっ
てコードされるタンパク質との間に導入され得、そし
て、産生された融合タンパク質は、この位置で、特定の
プロテアーゼによって切断され得、従ってヌクレオチド
配列によってコードされるタンパク質を遊離させる。例
示の目的で、あるものは、少なくともいくつかのＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｉに見いだされるＫＥＸ−２様ペプチダー
ゼによって認識される部位を導入し得る。このような融
合は、インビボでの切断を導き、発現された産物の保護
を生じるが、より大きな融合タンパク質ではない。

【０１９２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおける異種発現
は、細菌、真菌、脊椎動物、および植物タンパク質をコ
ードするいくつかの遺伝子について報告されている。タ
ンパク質は、ヌクレオチド配列が、シグナル配列に融合
されない場合、細胞内に沈着され得る。このようなタン
パク質は、細胞質において蓄積し、そして通常グリコシ
ル化されず、このことは、いくつかの細菌タンパク質に
ついての利点であり得る。ヌクレオチド配列が、シグナ
ル配列に装着される場合、タンパク質は細胞外に蓄積す
る。

【０１９３】産物安定性および宿主株改変に関して、い
くつかの異種タンパク質は、真菌の培養液に分泌される
場合、あまり安定ではない。ほとんどの真菌は、異種タ
ンパク質を分解するいくつかの細胞外プロテアーゼを産
生する。この問題を回避するために、減少したプロテア
ーゼ産生を伴う特別の真菌株が、異種産生のための宿主
として使用されている。

【０１９４】糸状菌の形質転換のために、いくつかの形
質転換プロトコルが、多くの糸状菌のために開発されて
いる（Ｂａｌｌａｎｃｅ１９９１、同書）。それらの
多くは、ＰＥＧおよびＣａ²⁺イオンを用いる、プロトプ
ラストの調製、およびＤＮＡのプロトプラストへの導入
に基づく。次いで、形質転換プロトプラストは再生し、
そして形質転換真菌は、種々の選択マーカーを用いて選
択される。形質転換のために使用されるマーカーには、
多数の栄養要求性マーカー（例えば、ａｒｇＢ、ｔｒｐ
Ｃ、ｎｉａＤ、およびｐｙｒＧ）、抗生物質耐性マーカ
ー（例えば、ベノミル耐性、ハイグロマイシン耐性、お
よびフェレオマイシン（ｐｈｅｌｅｏｍｙｃｉｎ）耐
性）がある。一般的に使用される形質転換マーカーは、
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子であり、これは
高コピー数において、真菌を、唯一の窒素源としてのア
クリルアミドで増殖するようにする。

【０１９５】別の実施態様において、トランスジェニッ
ク生物は、酵母であり得る。この点に関して、酵母はま
た、異種遺伝子発現のビヒクルとして、幅広く使用され
ている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ種は、産業用途の長い歴史を有し、これは、異種
遺伝子発現のためのその使用を含む。Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種遺伝子
の発現は、Ｇｏｏｄｅｙら（１９８７，Ｙｅａｓｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＲＢｅｒｒｙら
編、４０１−４２９頁、ＡｌｌｅｎａｎｄＵｎｗｉ
ｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）およびＫｉｎｇら（１９８９，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆＹｅａｓｔｓ，ＥＦＷａｌｔｏｎおよび
ＧＴＹａｒｒｏｎｔｏｎ編、１０７−１３３頁、Ｂｌ
ａｃｋｉｅ，Ｇｌａｓｇｏｗ）によって概説されてい
る。

【０１９６】いくつかの理由のために、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、異種発現に十
分適している。第１に、ヒトに対して非病原性であり、
そして特定の内毒素を産生し得ない。第２に、種々の目
的のための商業活用の世紀後の安全な使用の長い歴史を
有する。このことは、幅広い公共的な受容性を導く。第
３に、生物に費やされた広範な商業用途および探索は、
豊富な遺伝学および生理機能についての知識、ならびに
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
大規模発酵特徴を生じる。

【０１９７】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅにおける異種遺伝子発現および遺伝子産物の
分泌の理論の概説は、ＥＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅＥ
Ｋｅｎｎｙ（１９９３，「Ｙｅａｓｔａｓａｖｉ
ｈｉｃｌｅｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏ
ｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓ」、Ｙｅａ
ｓｔｓ，第５巻、ＡｎｔｈｏｎｙＨＲｏｓｅおよび
ＪＳｔｕａｒｔＨａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｔｄ．）によって与えられ
る。

【０１９８】いくつかの型の酵母ベクターが入手可能で
あり、これは、組み込みベクター（これは、それらの維
持のために、宿主ゲノムとの組換えを必要とする）およ
び自己複製プラスミドベクターを含む。

【０１９９】トランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓを調製するために、発現構築物は、ヌクレオチド
配列を、酵母における発現のために設計された構築物に
挿入することによって調製される。異種発現のために使
用されるいくつかの型の構築物が開発されている。構築
物は、ヌクレオチド配列に融合する酵母において活性な
プロモーターを含み、通常は酵母起源のプロモーター
（例えば、ＧＡＬ１プロモーター）が使用される。通常
は、酵母起源のシグナル配列（例えば、ＳＵＣ２シグナ
ルペプチドをコードする配列）が使用される。酵母にお
いて活性なターミネーターは、発現系を終了させる。

【０２００】酵母の形質転換のために、いくつかの形質
転換プロトコルが開発されている。例えば、トランスジ
ェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｈｉｎｎｅｎ
らの教示にしたがって、調製され得る（１９７８，Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈ
ｅＵＳＡ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，ＪＤ
（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７
５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈら（１９８３，Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１５３，１６３−１６
８）。

【０２０１】形質転換酵母細胞は、種々の選択マーカー
を用いて選択される。形質転換のために使用されるマー
カーには、多数の栄養要求性マーカー（例えば、ＬＥＵ
２、ＨＩＳ４、およびＴＲＰ１）および優性抗生物質耐
性マーカー（例えば、アミノグリコシド抗生物質マーカ
ー（例えば、Ｇ４１８））がある。

【０２０２】別の宿主生物は植物である。この点に関し
て、当該分野は、トランスジェニック植物を調製するた
めの参考文献を十分備えている。トランスジェニック植
物を調製するのに使用され得る技術の型に関するいくつ
かの背景注釈を提供する２つの文章は、ＥＰ−Ｂ−０４
７０１４５およびＣＡ−Ａ−２００６４５４であり、こ
の注釈のいくつかは以下に示される。

【０２０３】遺伝的改変植物の構築における基本的な理
論は、挿入される遺伝物質の安定な維持を得るように、
植物ゲノムにおける遺伝情報を挿入する。

【０２０４】遺伝情報を挿入することについていくつか
の技術が存在し、２つの主な理論は、遺伝情報の直接的
導入、およびベクター系の使用による遺伝情報の間接的
導入である。一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ
（ＡｎｎｕＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＰ
ｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ［１９９１］４２：２
０５−２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆ
ｏｏｄ−ＩｎｄｕｓｔｒｙＨｉ−ＴｅｃｈＭａｒｃ
ｈ／Ａｐｒｉｌ１９９４１７−２７）による文献に
見いだされ得る。

【０２０５】植物に適切な形質転換系は、１つのベクタ
ーを含み得るが、２つのベクターを含み得る。２つのベ
クターの場合、ベクター系は、通常、バイナリーベクタ
ー系といわれる。バイナリーベクター系は、Ｇｙｎｈｅ
ｕｎｇＡｎら、（１９８０），ＢｉｎａｒｙＶｅ
ｃｔｏｒｓ，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌＡ３，１−１９において
さらに詳細に記載される。

【０２０６】所定のプロモーターまたはヌクレオチドの
配列または構築物を用いる、１つの広範に使用される植
物細胞形質転換系は、Ａｎら（１９８６）、Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１，３０１−３０５およびＢｕ
ｔｃｈｅｒＤ．Ｎ．ら（１９８０）、Ｔｉｓｓｕｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｌａｎｔ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｄ．Ｓ．Ｉｎｇｒａｍ
ｓおよびＪ．Ｐ．Ｈｅｌｇｅｓｏｎ編，２０３−２０
８に記載されるような、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのＴｉプラスミドまたはＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓから
のＲｉプラスミドの使用に基づく。

【０２０７】いくつかの異なるＴｉプラスミドおよびＲ
ｉプラスミドが構築されており、これらは、上記の植物
または植物細胞構築物の構築に適切である。このような
Ｔｉプラスミドの非限定例は、ｐＧＶ３８５０である。

【０２０８】ヌクレオチド配列または構築物は、好まし
くは、Ｔ−ＤＮＡの末端配列の間に、またはＴ−ＤＮＡ
配列に隣接して、Ｔｉプラスミドに挿入され、その結
果、Ｔ−ＤＮＡボーダーを直接取り囲む配列の破壊を回
避するべきである。なぜなら、これらの領域の少なくと
も１つは、改変Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの挿入のため
に必須であるようだからである。

【０２０９】上記の説明から理解されるように、生物が
植物である場合、ベクター系は、好ましくは、植物に感
染するのに必要な配列（例えば、ｖｉｒ領域）および少
なくとも１つのＴ−ＤＮＡ配列のボーダー部分を含むベ
クター系であり、ボーダー部分は、遺伝構築物と同じベ
クターに位置する。好ましくは、ベクター系は、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｉ
プラスミドもしくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈ
ｉｚｏｇｅｎｅｓＲｉプラスミドまたはそれらの改変
体である。なぜなら、これらのプラスミドは周知であ
り、トランスジェニック植物の構築に幅広く使用され、
これらのプラスミドまたはその誘導体に基づく多くのベ
クター系が存在するからである。

【０２１０】トランスジェニック植物の構築において、
ヌクレオチド配列は、微生物において最初に構築され得
る。この微生物においてベクターは複製され得、そして
この微生物は植物への挿入前に操作するのが容易であ
る。有用な微生物の１例はＥ．ｃｏｌｉであるが、上記
の特性を有する他の微生物が使用され得る。上記で定義
したようなベクター系のベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉにお
いて構築されている場合、必要ならば、このベクター
は、適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（例えば、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
に移入される。従って、ヌクレオチド配列または構築物
を保有するＴｉプラスミドは、好ましくは、適切なＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（例えば、Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）に移入され、その結果、ヌクレオチド配列
を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を得て、こ
のＤＮＡは続いて、植物細胞に移入されて改変される。

【０２１１】ＣＡ−Ａ−２００６４５４に報告されるよ
うに、大量のクローニングベクターが入手可能であり、
これらは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製系および形質転換
細胞の選択を可能にするマーカーを含む。ベクターは、
例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍ
ｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。

【０２１２】このようにして、ヌクレオチド配列は、ベ
クターの適切な制限位置に導入され得る。含まれるプラ
スミドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換のために使用
される。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、適切な栄養培地で培養さ
れ、次いで採集され、そして溶解される。次いで、プラ
スミドが回収される。分析の方法としては、一般的に使
用される配列分析、制限分析、電気泳動、およびさらな
る生化学的−分子生物学的方法がある。各操作の後、使
用されるＤＮＡ配列は制限処理され得、そして次のＤＮ
Ａ配列と接続され得る。各配列は、同じかまたは異なる
プラスミドにおいてクローン化され得る。

【０２１３】所望のプロモーターまたは構築物またはヌ
クレオチド配列の植物における各導入方法の後、さらな
るＤＮＡ配列の存在および／または挿入が必要であり得
る。例えば、形質転換のために植物細胞のＴｉプラスミ
ドまたはＲｉプラスミドが使用される場合、Ｔｉおよび
ＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側の境界、し
かししばしば右および左の境界（導入した遺伝子の隣接
領域として）が接続され得る。植物細胞の形質転換のた
めのＴ−ＤＮＡの使用は、集中的に研究されており、そ
して以下に記載される：ＥＰ−Ａ−１２０５１６；Ｈｏ
ｅｋｅｍａ，ＴｈｅＢｉｎａｒｙＰｌａｎｔＶｅ
ｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍＯｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅ
ｒｉｊＫａｎｔｅｒｓＢ．Ｂ．，Ａｌｂｌａｓｓ
ｅｒｄａｍ，１９８５，第Ｖ章；Ｆｒａｌｅｙら、Ｃ
ｒｉｔ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＳｃｉ．，４：１−４
６；およびＡｎら、ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：２
７７−２８４。

【０２１４】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる植物組
織の直接感染は簡単な技術であり、この技術は幅広く使
用されており、そしてＢｕｔｃｈｅｒＤ．Ｎ．ら（１
９８０）、ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏ
ｄｓｆｏｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，
Ｄ，Ｓ，ＩｎｇｒａｍｓおよびＪ．Ｐ．Ｈｅｌｇｅｓｏ
ｎ編，２０３−２０８に記載される。この話題のさら
なる教示については、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（ＡｎｎｕＲ
ｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔＭｏ
ｌＢｉｏｌ［１９９１］４２：２０５−２２５）お
よびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｙＨｉ−Ｔｅｃｈ１９９４年３月／４月１
７−２７）を参照のこと。この技術を用いて、植物の感
染は、植物の特定の部分または組織（すなわち、葉、
根、茎の部分、または植物の別の部分）でなされ得る。

【０２１５】代表的には、本発明のプロモーターおよび
ヌクレオチド配列を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍによる植物組織の直接感染を用いて、感染される植物
は、例えば、かみそりで植物を切断することによって、
または針で植物を穿刺することによって、または研磨剤
で植物を擦ることによって傷付けられる。次いで、損傷
に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが接種される。次い
で、接種された植物または植物部分を適切な培養培地で
増殖させ、そして成熟植物に発達させる。

【０２１６】植物細胞が構築される場合、これらの細胞
は、周知の組織培養法に従って（例えば、アミノ酸、植
物ホルモン、ビタミンなどの必要な増殖因子を補充した
適切な培養培地で細胞を培養することによって）、増殖
および維持され得る。形質転換細胞の一般的な改変植物
への再生は、細胞または組織培養物からの植物の再生の
ための公知の方法を用いて、例えば、形質転換シュート
を抗生物質を用いて選択し、そして適切な栄養素、植物
ホルモンなどを含む培地でシュートを継代培養すること
によって達成され得る。

【０２１７】植物を形質転換するための別の技術は、バ
リスティック形質転換である。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる形質転換に不応性
である植物種の安定な形質転換体を作製するために当初
は開発された、植物組織のバリスティック形質転換（こ
れは、金属粒子の表面上で細胞にＤＮＡを導入する）
は、一過性発現の間の遺伝構築物の性能を試験すること
における有用性を見いだしている。このようにして、遺
伝子発現は、一過性形質転換細胞において、目的の遺伝
子の安定な取り込みを伴わずに、そしてそれにより、安
定な形質転換体の作製に時間をかけずに研究され得る。

【０２１８】より詳細には、バリスティック形質転換技
術（他には、パーティクルボンバードメント技術として
公知）は、Ｋｌｅｉｎら（１９８７）、Ｓａｎｆｏｒｄ
ら（１９８７）、およびＫｌｅｉｎら（１９８８）によ
って最初に記載され、そして、操作が容易なこと、およ
び目的の細胞または組織の前処理が不要なことに起因し
て普及した。

【０２１９】パーティクルボンバードメント技術の原理
は、駆動力（例えば、放電または圧縮空気）による、Ｄ
ＮＡコート微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）
のインタクトな植物細胞への直接送達である。微粒子
は、わずかな損傷しか伴わずに、細胞壁および膜を貫通
し、次いで、形質転換された細胞は、プロモーター構築
物を発現する。

【０２２０】行われ得る１つのパーティクルボンバード
メント技術は、粒子流入銃（ＰａｒｔｉｃｌｅＩｎｆ
ｌｏｗＧｕｎ：ＰＩＧ）を使用し、この粒子流入銃
は、Ｆｉｎｅｒら（１９９２）およびＶａｉｎら（１９
９３）によって開発および記載された。ＰＩＧは、流動
ヘリウムの流れの中の微粒子を、部分的減圧を介して、
植物細胞へ加速する。

【０２２１】ＰＩＧの利点の１つは、微粒子の加速が、
タイマー中継ソレノイドによって、および提供されたヘ
リウム圧を調節することによって制御され得ることであ
る。駆動力としての加圧ヘリウムの使用は、不活性であ
ること、残留物を残さないこと、および再現性のある加
速を与えることという利点を有する。減圧は、粒子の抵
抗を減少させ、そして衝突前のヘリウムガスの分散によ
る組織損傷を低減する（Ｆｉｎｅｒら、１９９２）。

【０２２２】植物を形質転換するための他の技術として
は、シリコンホイスカー技術およびウイルス形質転換技
術が挙げられる。

【０２２３】植物形質転換についてのさらなる教示は、
ＥＰ−Ａ−０４４９３７５、ＵＳ−Ａ−５３８７７５
７、ＵＳ−Ａ−５５６９８３１、ＵＳ−Ａ−５１０７０
６５、ＥＰ−Ａ−０３４１８８５、ＥＰ−Ａ−０２７１
９８８、ＥＰ−Ａ−０４１６５７２、ＥＰ−Ａ−０２４
０２０８、ＥＰ−Ａ−０４５８３６７、ＷＯ−Ａ−９７
／３７０２３、ＷＯ−Ａ−９４／２１８０３、ＷＯ−Ａ
−９３／２３５５１、ＷＯ−Ａ−９５／２３２２７に見
いだされ得る。

【０２２４】式（Ｉ）のアミノ酸配列が、ＰＭＥのブロ
ック様式の脱エステル化特性において重要な役割を果た
すと考えられるとしても、本発明者らはまた、この配列
が、他の酵素についての配列に存在する場合、これらの
他の酵素の酵素活性にも影響し得ると考える。例えば、
式（Ｉ）のアミノ酸配列は、ペクチンアセチルエステラ
ーゼまたはラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ
のような酵素に導入され得る。このことに関して、式
（Ｉ）のアミノ酸配列の存在は、ブロック様式で（例え
ば、それぞれ、テンサイペクチンまたはいくつかのペク
チンにおける「毛状領域」）を脱アセチル化し得る、ア
セチルエステラーゼを生じ得る。式（Ｉ）のアミノ酸配
列は、キシランアセチルエステラーゼのような酵素にさ
え導入され得る。このことに関して、式（Ｉ）のアミノ
酸配列の存在は、ブロック様式においてキシランを脱ア
セチル化し得るアセチルエステラーゼを生じ得る。それ
ゆえ、改変ＰＭＥに関する本発明の上記の実施態様の各
々はまた、一般的な意味における改変酵素に適用可能で
あり得る。

【０２２５】上記のように、本発明はまた、本発明の配
列のホモログを包含する。また示されるように、相同性
（または同一性）の程度は、任意の１つ以上の配列と、
別の配列との単純な「眼球」比較（すなわち、精密比
較）によって、または２つ以上の配列間の相同性％を計
算し得る、市販のコンピュータープログラムを用いるこ
とによって決定され得る。

【０２２６】市販のプログラムが使用される場合、配列
相同性（または同一性）は、任意の適切な相同性アルゴ
リズムを用いて、例えば、デフォルトパラメーターを用
いて決定され得る。都合良く、ＢＬＡＳＴアルゴリズム
が用いられ、パラメーターとともにデフォルト値を設定
する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓ
ｔｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで詳細に記載され、これは、本
明細書中で参考として援用される。検索パラメーター
は、以下のように規定され、そして規定されたデフォル
トパラメーターに都合良く設定される。

【０２２７】都合良く、「実質的相同性」は、ＢＬＡＳ
Ｔによって評価する場合、少なくとも約７、好ましくは
少なくとも約９、および最も好ましくは１０以上の推定
値と一致する配列に等しい。ＢＬＡＳＴ検索における推
定値についてのデフォルト閾値は、通常１０である。

【０２２８】ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡ
ｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）は、プログ
ラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂ
ｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに使用される帰納的
検索アルゴリズムである；これらのプログラムは、いく
つかの補強を有するＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕ
ｌの統計的方法を用いて、有意性をそれらの発見に割り
当てる（ａｓｃｒｉｂｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔｈ
ｅｌｐ．ｈｔｍｌを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラ
ムは、配列類似性検索にあわせて、例えば、問い合わせ
配列に対するホモログを同定するために調整された。こ
のプログラムは、モチーフ様式検索に一般的に有用であ
るわけではない。配列データベースの類似性検索におけ
る基本的な論点の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら
（１９９４）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ６：１
１９−１２９を参照のこと。

【０２２９】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能な５つのＢＬＡＳＴプロ
グラムは、以下のタスクを実行する：ｂｌａｓｔｐは、
タンパク質配列データベースに対して、アミノ酸問い合
わせ配列を比較する；ｂｌａｓｔｎは、ヌクレオチド配
列データベースに対して、ヌクレオチド問い合わせ配列
を比較する；ｂｌａｓｔｘは、タンパク質配列データベ
ースに対して、ヌクレオチド問い合わせ配列（両鎖）の
６フレームの概念的翻訳産物を比較する；ｔｂｌａｓｔ
ｎは、全ての６つのリーディングフレーム（両鎖）にお
いて動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに
対して、タンパク質問い合わせ配列を比較する；ｔｂｌ
ａｓｔｘは、ヌクレオチド配列データベースの６フレー
ム翻訳物に対して、ヌクレオチド問い合わせ配列の６フ
レーム翻訳物を比較する。

【０２３０】ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメーターを
使用する：ヒストグラム（ＨＩＳＴＧＲＡＭ）。各検索
のスコアのヒストグラムを表示する；デフォルトはｙｅ
ｓである。（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌにおけるパラメ
ーターＨを参照のこと）。

【０２３１】記載（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ）。報告
される一致配列の短い記載の数を、特定された数に制限
する；デフォルトの制限記載は１００である。（マニュ
アルの頁におけるパラメーターＶを参照のこと）。期待
値およびカットオフもまた参照のこと。

【０２３２】アラインメント（ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ
Ｓ）。データーベース配列を、高スコアのセグメント対
（ＨＳＰ）が報告される数に特定された数に制限する；
デフォルト制限は５０である。これ以上のデータベース
配列が、報告のための統計的有意性閾値をたまたま満た
した場合（以下の期待値およびカットオフを参照のこ
と）、最大の統計的な有意性が報告される一致のみが割
り当てられる。（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌにおけるパラ
メーターＢを参照のこと）。

【０２３３】期待値（ＥＸＰＥＣＴ）。データベース配
列に対する一致を報告するための統計的有意性閾値；デ
フォルト値は１０であり、その結果１０個の一致は、偶
然によって、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１
９９０）の確率モデルにしたがって、見いだされること
が予測される。一致に割り当てられた統計的有意性が、
期待値閾値より大きい場合、一致は報告されない。より
低い期待値閾値は、より厳密であり、一致が報告される
機会をより少なくする。分数の値は基準を満たす。（Ｂ
ＬＡＳＴＭａｎｕａｌにおけるパラメーターＥを参照
のこと）。

【０２３４】カットオフ（ＣＵＴＯＦＦ）。高スコアセ
グメント対を報告するためにスコアを切り捨てる。デフ
ォルト値は、期待値（上記を参照のこと）から計算され
る。ＨＳＰは、それらに割り当てられた統計的有意性
が、少なくともカットオフ値に等しいスコアを有する孤
立ＨＳＰに割り当てられるものと同様に高い場合にの
み、データベース配列について報告される。より高いカ
ットオフ値は、より厳密であり、一致が報告される機会
をより少なくする。（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌにおけ
るパラメーターＳを参照のこと）。代表的には、有意性
閾値は、期待値を用いて、より直観的に処理され得る。

【０２３５】マトリクス（ＭＡＴＲＩＸ）。ＢＬＡＳＴ
Ｐ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＴＢＬＡＳ
ＴＸについての別のスコアマトリクスを特定する。デフ
ォルトマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎ
ｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２）。確実
な別の選択は以下を含む：ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、
ＰＡＭ２５０、およびＩＤＥＮＴＩＴＹ。別のスコアマ
トリクスは、ＢＬＡＳＴＮについては利用可能ではな
い；ＢＬＡＳＴＮ要求に指向的なマトリクスを特定する
と、誤応答を返す。

【０２３６】鎖（ＳＴＲＡＮＤ）。ＴＢＬＡＳＴＮ検索
を、データベース配列の正しい頂部鎖または底部鎖へと
制限するか；または、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ま
たはＴＢＬＡＳＴＸ検索を、問い合わせ配列の頂部鎖ま
たは底部鎖上の正しいリーディングフレームへと制限す
る。

【０２３７】フィルタ（ＦＩＬＴＥＲ）。Ｗｏｏｔｔｏ
ｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒｓａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：１４９−１
６３のＳＥＧプログラムによって決定されるような、組
成の複雑さが低い問い合わせ配列のセグメント、または
ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒｓａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：
１９１−２０１のＸＮＵプログラムによって、もしくは
ＢＬＡＳＴＮについては、ＴａｔｕｓｏｖおよびＬｉｐ
ｍａｎのＤＵＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）によ
って決定されたような、短周期性内部反復からなるセグ
メントを遮断する（ｍａｓｋｏｆｆ）。フィルタリン
グは、ｂｌａｓｔアウトプットからの、統計的に有意で
あるが生物学的に興味深くない報告（例えば、共通の酸
性、塩基性、またはプロリンリッチ領域に対するヒッ
ト）を排除し得、データベース配列に対する特異的一致
に利用可能である問い合わせ配列の、より生物学的に興
味深い領域を残す。

【０２３８】フィルタプログラムによって見いだされる
複雑度が低い配列は、ヌクレオチド配列における文字
「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）お
よびタンパク質配列における文字「Ｘ」（例えば、「Ｘ
ＸＸＸＸＸＸＸＸ」）を用いて置換される。

【０２３９】フィルタリングは、問い合わせ配列（また
はその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列に
は適用されない。デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡ
ＳＴＮについてはＤＵＳＴ、他のプログラムについては
ＳＥＧである。

【０２４０】ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに配列が適用された
場合は、ＳＥＧ、ＸＮＵ、またはその両方によって遮断
されるものが全く何もないことは普通であり、そのた
め、フィルタリングがいつも効果を生じると期待すべき
ではない。さらに、いくつかの場合において、配列は、
その全体が遮断される。このことは、フィルタリングし
ていない問い合わせ配列に対して報告される任意の一致
の統計的有意性が、疑わしいことを示している。

【０２４１】ＮＣＢＩ−ｇｉ。登録名および／または遺
伝子座名（ｌｏｃｕｓｎａｍｅ）に加えて、アウトプ
ットに示されるためのＮＣＢＩｇｉ識別名を生じる。

【０２４２】最も好ましくは、配列比較は、ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬ
ＡＳＴで提供される、単純なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズ
ムを用いて行われる。

【０２４３】２つの配列の間の同一性および類似性を決
定するための他のコンピュータープログラム法として
は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ
ら、１９８４ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ１２：３８７）およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃ
ｈｕｌら、１９９０ＪＭｏｌｅｃＢｉｏｌ４０
３−４１０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０２４４】配列同一性を決定する場合には、ギャップ
ペナルティ（ＧａｐＰｅｎａｌｔｉｅｓ）が使用され
るべきであり、次いで、好ましくは、以下のパラメータ
ーが使用される：ＢＬＡＳＴについてギャップオープン（ＧＡＰＯＰＥＮ）０ギャップ長さ（ＧＡＰＥＸＴＥＮＳＩＯＮ）０ＣＬＵＳＴＡＬについてＤＮＡワードサイズ（ＷＡＲＤＳＩＺＥ）２ギャップペナルティ１０ギャップ長さ０．１本明細書中で使用されるように、用語「改変体」、「ホ
モログ」、「フラグメント」、および「誘導体」は、配
列の対立遺伝子改変体を包含する。

【０２４５】用語「改変体」もまた、本明細書中に示さ
れるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相
補的な配列を包含する。

【０２４６】いくつかの例において、式（Ｉ）のＡ２と
Ａ３との間にトリプトファンを配置することが所望され
る。この実施態様において、トリプトファンは、実際に
第３位となる。しかし、重大なアミノ酸の順番は同じま
まである。便宜上、本発明者らは、この式（Ｉ）の改変
物を、式（ＩＡ）と称する。

【０２４７】従って、１つの局面において、本発明はま
た、式（ＩＡ）のアミノ酸配列を包含する：Ａ１−Ａ２−Ｗ−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８
−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ
１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２
１−Ａ２２（ＩＡ）ここでＷは、トリプトファンを示し、Ａ１は、疎水性も
しくは極性のアミノ酸または中性アミノ酸であり、Ａ２
は、疎水性アミノ酸であり、Ａ３は、疎水性アミノ酸で
あり、Ａ４は、極性アミノ酸であり、Ａ５は、極性もし
くは荷電アミノ酸または中性アミノ酸であり、Ａ６は、
極性アミノ酸であり、Ａ７は、極性または荷電または疎
水性のアミノ酸であり、Ａ８は、疎水性アミノ酸であ
り、Ａ９は、疎水性または極性のアミノ酸であり、Ａ１
０は、疎水性または極性のアミノ酸であり、Ａ１１は、
荷電アミノ酸であり、Ａ１２は、荷電または極性または
疎水性のアミノ酸であり、Ａ１３は、疎水性もしくは荷
電アミノ酸または中性アミノ酸であり、Ａ１４は、疎水
性もしくは極性のアミノ酸または荷電もしくは中性のア
ミノ酸であり、Ａ１５は、荷電または極性または疎水性
のアミノ酸であり、Ａ１６は、極性もしくは疎水性もし
くは荷電のアミノ酸または中性アミノ酸であり、Ａ１７
は、極性または荷電アミノ酸または中性アミノ酸であ
り、Ａ１８は、極性または荷電または疎水性のアミノ酸
であり、Ａ１９は、極性アミノ酸または中性アミノ酸で
あり、Ａ２０は、疎水性または極性のアミノ酸であり、
Ａ２１は、疎水性アミノ酸であり、Ａ２２は、極性また
は疎水性のアミノ酸である。

【０２４８】この局面において、式（Ｉ）に関する全て
の教示およびその好ましい局面は、式（ＩＡ）に等しく
適用可能である。

【０２４９】例示の目的で、式（ＩＡ）によって包含さ
れる例のＮ末端配列は、以下を含む：ＲＡＷＦＨＥＣＤＩ．．．．ＡＶＷＦＱＮＣＤＩ．．．．ＡＶＷＦＱＮＣＤＩ．．．．。

【０２５０】さらに、または別の面では、Ａ９および／
またはＡ１０および／またはＡ２２は削除され得る。便
宜上、本発明者らは、この式（Ｉ）および／または式
（ＩＡ）の改変を、式（ＩＢ）と称する。

【０２５１】従って、１つの局面において、本発明はま
た、式（ＩＢ）のアミノ酸配列を包含する：Ａ１−Ａ２−Ｗ−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８
−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ
１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２
１−Ａ２２（ＩＢ）ここでＷは、必要に応じてトリプトファンを示し、Ａ１
は、疎水性もしくは極性のアミノ酸または中性アミノ酸
であり、Ａ２は、疎水性アミノ酸であり、Ａ３は、疎水
性アミノ酸であり、Ａ４は、極性アミノ酸であり、Ａ５
は、極性もしくは荷電アミノ酸または中性アミノ酸であ
り、Ａ６は、極性アミノ酸であり、Ａ７は、極性または
荷電または疎水性のアミノ酸であり、Ａ８は、疎水性ア
ミノ酸であり、Ａ９は、必要に応じて疎水性または必要
に応じて極性のアミノ酸であり、Ａ１０は、必要に応じ
て疎水性または必要に応じて極性のアミノ酸であり、Ａ
１１は、荷電アミノ酸であり、Ａ１２は、荷電または極
性または疎水性のアミノ酸であり、Ａ１３は、疎水性も
しくは荷電アミノ酸または中性アミノ酸であり、Ａ１４
は、疎水性もしくは極性のアミノ酸または荷電もしくは
中性のアミノ酸であり、Ａ１５は、荷電または極性また
は疎水性のアミノ酸であり、Ａ１６は、極性もしくは疎
水性もしくは荷電のアミノ酸または中性アミノ酸であ
り、Ａ１７は、極性もしくは荷電アミノ酸または中性ア
ミノ酸であり、Ａ１８は、極性または荷電または疎水性
のアミノ酸であり、Ａ１９は、極性アミノ酸または中性
アミノ酸であり、Ａ２０は、疎水性または極性のアミノ
酸であり、Ａ２１は、疎水性アミノ酸であり、Ａ２２
は、必要に応じて極性のアミノ酸または必要に応じて疎
水性のアミノ酸である。

【０２５２】この局面において、式（Ｉ）に関する教示
の全ておよびその好ましい局面は、式（ＩＢ）に等しく
適用可能である。

【０２５３】例示の目的で、式（ＩＢ）によって包含さ
れる配列の例は、以下を含む：ＡＶ−ＦＱＮＣＤＩＨＡＲＫＰＮＤＧＱＫＮＭＶＡＶＷＦＱＮＣＤＩＨＡＲＫＰＮＤＧＱＫＮＭＶＡＶＷＦＱＮＣＤＩ−−ＲＫＰＮＤＧＱＫＮＭＶＡＶ−ＦＱＮＣＤＩＨＡＲＫＰＮＤＧＱＫＮＭＶ。

【０２５４】本発明は、ここで例示の目的のためにのみ
記載される。

【０２５５】実施例１式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（例えば、以下に示されるもの）を、ブロック様式脱エ
ステル化特性を示さないＰＭＥ（例えば、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒからのＰＭＥ）をコードする遺
伝子に導入する。

【０２５６】挿入のための配列：ＧＣＣＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＡこの配列は、合成配列であり得るか、組換えＤＮＡ技術
の使用によって産生され得る。

【０２５７】この配列の配置は、ＰＭＥ活性部位をコー
ドする遺伝子部分の３'末端付近である。

【０２５８】挿入部位の直ぐ隣の６６ヌクレオチド配列
を除去する。

【０２５９】次いで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇ
ｅｒから得られる改変ＰＭＥを、例えば、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ形質転換についての上記の教示および参考文
献を適切に適応させることによってＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓを形質転換することにより産生する。次いで、適切
な反応環境においてペクチンを改変ＰＭＥと接触させる
ことによって、改変ＰＭＥを使用してペクチンを改変す
る。改変ＰＭＥサンプルは、単離されたサンプルおよび
／または純粋なサンプルであり得るか、または粗抽出物
であり得る。

【０２６０】ブロック様式脱エステル化特性ＰＭＥおよ
びそのＰＭＥによって処理したペクチンの特性を、以下
に示すプロトコルによって決定し得る。

【０２６１】驚くべきことに、発現した改変ＰＭＥは、
異なるＰＭＥプロフィールを示し、特に、少なくともい
くらかのブロック様式脱エステル化特徴（すなわち、少
なくとも部分的なブロック様式脱エステル化特徴）を示
す。

【０２６２】実施例２式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を、ブロック様式脱エステル化特徴を示すＰＭＥ−例え
ば、オレンジからのＰＭＥ−をコードする遺伝子から除
去する。

【０２６３】除去される配列は以下の通りである：ＧＣＣＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＡ。

【０２６４】次いで、６６ヌクレオチド配列を、除去部
位に挿入する。この６６ヌクレオチド配列は、式（Ｉ）
のアミノ酸配列をコードしない。

【０２６５】次いで、オレンジから得られた改変ＰＭＥ
を、例えば、適切な宿主細胞−例えば、植物細胞−を植
物形質転換についての上記の教示および参考文献に適切
に順応させることによって形質転換することによって、
産生する。次いで、改変ＰＭＥを使用して、適切な反応
環境において、ペクチンを改変ＰＭＥと接触するように
導くことによって、ペクチンを改変する。改変ＰＭＥサ
ンプルは、単離されたサンプルおよび／または純粋なサ
ンプルであり得るか、または粗抽出物であり得る。

【０２６６】ＰＭＥのランダム脱エステル化特徴および
そのＰＭＥによって処理したペクチンの特徴を、以下に
示すプロトコルによって決定し得る。

【０２６７】驚くべきことに、発現した改変ＰＭＥは、
異なるＰＭＥプロフィールを示し、特に、ランダム脱エ
ステル化特徴を示す。

【０２６８】実施例３式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を、ブロック様式脱エステル化特徴を示すＰＭＥ−例え
ば、トマトからのＰＭＥ−をコードする遺伝子から除去
する。

【０２６９】除去される配列は以下の通りである：ＧＣＣＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＡ。

【０２７０】次いで、６６ヌクレオチド配列を、除去部
位に挿入する。この６６ヌクレオチド配列は、式（Ｉ）
のアミノ酸配列をコードしない。

【０２７１】次いで、トマトから得られた改変ＰＭＥ
を、例えば、適切な宿主細胞−例えば、植物細胞−を植
物形質転換についての上記の教示および参考文献に適切
に順応させることによって形質転換することによって、
産生する。次いで、改変ＰＭＥを使用して、適切な反応
環境において、ペクチンを改変ＰＭＥと接触するように
導くことによって、ペクチンを改変する。改変ＰＭＥサ
ンプルは、単離されたサンプルおよび／または純粋なサ
ンプルであり得るか、または粗抽出物であり得る。

【０２７２】ＰＭＥのランダム脱エステル化特徴および
そのＰＭＥによって処理したペクチンの特徴を、以下に
示すプロトコルによって決定し得る。

【０２７３】驚くべきことに、発現した改変ＰＭＥは、
異なるＰＭＥプロフィールを示し、特に、ランダム脱エ
ステル化特徴を示す。

【０２７４】この実施例において、改変ＰＭＥの発現
を、種々の植物型（例えば、トマト遺伝子型）に、カリ
フラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモー
ターを利用することによって達成する。この高度に発現
した構成プロモーターは、幅広く利用可能である、他の
プロモーターもまた、利用され得る。構成ＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターを、提案した実験のために最初に使用
する。なぜなら、このプロモーターは、ほとんどの植物
生物（トマト果実を含む）において、高レベルのタンパ
ク質産生を促進することが示されているからである。

【０２７５】最初に、ＤＮＡ構築物を作製する。これ
は、改変ＰＭＥをコードするヌクレオチド配列を包含す
る。最小限に、このＤＮＡ構築物は、トマト植物におい
て転写を促進するのに有効なプロモーター、改変ＰＭＥ
をコードするｃＤＮＡクローン、および転写を終結する
ために有効な配列を含む。標準的な分子生物学的方法を
用いて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列を、コードす
る配列に結合させる。適切な終結配列（例えば、ノパリ
ンシンターゼ３'ターミネーター）を、ｃＤＮＡインサ
ートから下流に配置する。ＤＮＡ構築物を、植物形質転
換に適切なベクターに配置する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介性形質転換のために、プロモーター／ｃＤＮ
Ａ／ターミネーター構築物を、好ましくは、Ｔｉベース
のプラスミド（例えば、ｐＢＩ１２１、標準的なバイナ
リーベクター）に配置する。一般的には、形質転換を、
好ましくは、２つの標準的Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
バイナリーベクター：ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰａｌｏＡｌｔｏ
Ｃａｌｉｆ．によって販売される）およびｐＧＡ６４３
（ワシントン州立大学でＧ．Ａｎによって開発された）
を用いて行う。ｐＢＩ１２１は、ＣＡＭＶプロモーター
およびＧＵＳレポーター遺伝子を含む。ＧＵＳコード配
列を、ＳｓｔＩおよびＳｍａＩで消化することによって
除去する（平滑末端）。使用する改変ＰＭＥコード配列
を、適切な制限酵素での消化によって産生し得る。粘着
／平滑末端は、ｐＢＩ１２１への指向性クローニングを
可能にする。切断、連結、およびＥ．ｃｏｌｉ形質転換
のための標準的な方法を使用する。

【０２７６】植物形質転換のために、一般的に、ＭｃＣ
ｏｒｍｉｃｋ（１９８６，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅ
ｐｏｒｔｅｒ５：８１−８４）およびＰｌａｎｔＴ
ｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭａｎｕａｌＢ６：１
−９（１９９１）ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓの方法に従うことが可能である。こ
の後者の参考文献は、トマトのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ媒介性形質転換のための種々の手順を編集する／比
較する。

【０２７７】プロトコルプロトコルＩカルシウム感受性指数（ＣＦ）カルシウム感受性を、５７．６ｍｇカルシウム／ｇペク
チンで溶液に溶解したペクチンの粘度を、溶液中（しか
し、カルシウムを添加しない）の正確に同じ量のペクチ
ンの粘度で割ったものとして測定する。カルシウム非感
受性ペクチンは、１のＣＦ値を有する。

【０２７８】４．２ｇのペクチンサンプルを、５５０ｍ
ｌの熱水に、効率的に撹拌しながら溶解する。溶液を約
２０℃まで冷却し、そしてｐＨを１ＮＨＣｌで１．５
に調整する。ペクチン溶液を、水で７００ｍｌに調整
し、そして撹拌する。この溶液の１４５ｇを、４つの粘
度グラス中にて個々に測定する。１０ｍｌの水を２つの
グラス（二重測定）に添加し、そして１０ｍｌの２５０
ｍＭＣａＣｌ₂溶液を、他の２つのグラスに撹拌しな
がら添加する。

【０２７９】５０ｍｌの酢酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ約
４．６）を、効率的に磁気撹拌しながら４つ全ての粘度
グラスに添加し、それによりペクチン溶液のｐＨをｐＨ
４．０より高くする。磁石を除去し、そしてグラスを２
０℃にて一晩放置する。粘度を、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ
粘度計で、翌日測定する。カルシウム感受性指数を、以
下のように計算する：ＣＦ＝（５７．６ｍｇＣａ²⁺／ｇペクチンを含む溶液の
粘度）／（０．０ｍｇＣａ²⁺／ｇペクチンを含む溶液の
粘度）。

【０２８０】プロトコルＩＩエステル化の程度（％ＤＥ）５０ｍｌの６０％イソプロパノールおよび５％ＨＣｌ溶
液に、２．５ｇのペクチンサンプルを添加し、そして１
０分間撹拌する。ペクチン溶液を、ガラスフィルターを
通して濾過し、そして１５ｍｌの６０％イソプロパノー
ル／５％ＨＣｌ溶液で６回洗浄し、続いて６０％イソプ
ロパノールで、濾液が塩化物を含まなくなるまでさらに
洗浄する。濾液を８０℃にて一晩乾燥させる。

【０２８１】２０．０ｍｌの０．５ＮＮａＯＨおよび
２０．０ｍｌの０．５ＮＨＣｌをコニカルフラスコで
組み合わせ、そして２滴のフェノールフェタレインを添
加する。これを、０．１ＮＮａＯＨで、恒久的な色変
化を得るまで適定する。０．５ＮＨＣｌは、０．５Ｎ
ＮａＯＨよりわずかに強いはずである。０．１ＮＮａ
ＯＨの添加容量を、Ｖ₀として示す。

【０２８２】０．５ｇの乾燥ペクチンサンプル（濾液）
を、コニカルフラスコに計り取り、そしてこのサンプル
を、９６％エタノールで湿らせる。１００ｍｌの煮沸お
よび冷却したばかりの蒸留水を添加し、そして得られる
溶液を、ペクチンが完全に溶解するまで撹拌する。次い
で、５滴のフェノールフェタレインを添加し、そしてこ
の溶液を、０．１ＮＮａＯＨで適定する（色の変化お
よびｐＨが８．５になるまで）。本明細書中で使用した
０．１ＮＮａＯＨの量を、Ｖ₁として記す。２０．０
ｍｌの０．５ＮＮａＯＨを添加し、そしてフラスコを
激しく振盪し、次いで、１５分間静置する。２０．０ｍ
ｌの０．５ＮＨＣｌを添加し、そしてフラスコを、ピ
ンク色がなくなるまで振盪する。次いで、３滴のフェノ
ールフェタレインを添加し、次いで得られる溶液を、
０．１ＮＮａＯＨで適定する。使用した０．１ＮＮ
ａＯＨの容量をＶ₂として記す。

【０２８３】エステル化の程度（％ＤＥ：全カルボキシ
ル基の％）を、以下のように計算する：％ＤＥ＝（Ｖ₂−Ｖ₀）／｛Ｖ₁＋（Ｖ₂−Ｖ₀）｝。

【０２８４】プロトコルＩＩＩ試飲酸性化乳飲料系においてペクチンをスクリーニングする
ための小規模方法１．序文長い賞味期限を有する酸性化乳飲料は、特に極東で、非
常に普及している。長い賞味期限を得るために、加熱処
理が必要であり、そして加熱の間および後のタンパク質
の沈殿を回避するために、ペクチンを安定剤として添加
する。酸性化乳飲料の品質は、使用したペクチンの特性
および濃度に強く依存するので、ペクチン安定化の効果
は、異なるモデル系において調査されている。

【０２８５】ＫＲＡＶＴＣＨＥＮＫＯら（１）は、ベー
スとして市販のヨーグルトを使用した。ヨーグルトを均
質化し、そしてその後加熱処理を全くせずに、ペクチン
溶液を添加した。ＧＬＡＨＮ（２）は、再生したスキム
ミルク粉末を、グルコノ−ｄ−ラクトン（ＧＤＬ）で酸
性化した。砂糖に分散したペクチンの添加の後、混合物
を均質化し、熱処理し、そして２回目の均質化をした。
ＦＯＬＥＹおよびＭＵＬＣＡＨＹ（３）は、最後の均質
化を省いたが、ほとんど同じ手順を使用した。ＡＭＩＣ
ＥＱＵＥＭＥＮＥＵＲら（４）も、ＧＤＬまたはヨーグ
ルト培養物のいずれかで酸性化した再生スキムミルク粉
末を使用した。ヨーグルトベースを、ペクチン水溶液に
添加し、そしてＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘで均質化した
が、加熱処理は適用しなかった。ＰＥＤＥＲＳＥＮおよ
びＪＯＲＧＥＮＳＥＮ（５）は、ペクチンとカゼインの
水性混合物を、均質化および加熱処理をせずに使用し
た。

【０２８６】これらの研究において使用した系のほとん
どは、かなり大量のペクチンを必要とする。別の制限
は、ほとんどの場合において、１つの型のペクチンのみ
を使用したことである。ペクチンの安定化粉末は、化学
構造および機能特性に非常に依存するので、他の型のペ
クチンでなされた同じ試験は、牛乳タンパク質の安定化
に関与する機構に関する異なる結論を導く。それゆえ、
ペクチンの多くのサンプル（例えば、実験用研究室サン
プル）の試験を可能にする系を確立することは価値があ
る。ペクチンの研究室産生は、通常、非常に少量のサン
プルしか得られないので、このようなモデル系が、少量
のペクチンのみを必要とすることは重要である。

【０２８７】以下は、可能な限り少量の約１．７ｇのペ
クチンを使用するのみのプロトコルを記載する。この系
の効率を評価するのに使用した方法は、粘度測定、遠心
分離沈殿、および粒子サイズ決定であった。

【０２８８】２．材料および方法２．１材料約３６％のタンパク質を有するスキムミルク粉末を、Ｍ
ｅｊｅｒｉｅｒｎｅｓＦａｅｌｌｅｓＩｎｄｋｏｂ
（Ｋｏｌｄｉｎｇ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から得た。試験の
ためのペクチンを、本発明の改変ＰＭＥでのペクチンの
処理によって得た。これらのペクチンは、使用した改変
ＰＭＥの型に依存して、エステル化の程度および分子量
のような異なる特性を有し得る。

【０２８９】２．２乳飲料の調製乳飲料を、酸性化乳溶液およびペクチン溶液を混合する
ことによって作製し、続いてさらに処理した。

【０２９０】乳溶液を、６８℃にて蒸留水に１７％（ｗ
／ｗ）スキムミルク粉末を溶解させ、そして３０分間撹
拌することによって作製した。次いで、乳溶液を、３％
（ｗ／ｗ）グルコノ−ｄ−ラクトン（ＧＤＬ）の添加に
よって、３０℃にてｐＨ４．１に酸性化した。

【０２９１】ペクチン溶液を、いくつかの工程において
作製した。最初のペクチンを、３：２の重量比で、デキ
ストロースと乾燥混合し、次いでこの混合物の１．１１
％（ｗ／ｗ）溶液を蒸留水中で作製した。ペクチン溶液
の調製における最後の工程は、１７．８％（ｗ／ｗ）の
最終濃度までスクロースを添加することであった。

【０２９２】次いで、乳飲料を、１部の乳溶液を１．１
３部（ｗ／ｗ）のペクチン溶液と混合し、続いて、加熱
処理し（３．２節を参照のこと）、そしてＭｉｎｉＪ
ｅｔＨｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ（Ｂｕｒｇａｕｄら、１９
９０）を用いて２０−２２ＭＰａおよび２０℃にて均質
化することによって調製した。この手順に続いて、乳飲
料におけるペクチンの最終濃度を、０．３％（ｗ／ｗ）
にした。全てのサンプルを、二連に生成し、５℃で保存
し、そして次の日に、粘度、粒子サイズ、および沈殿に
ついて試験した。

【０２９３】２．３粘度測定粘度を、ＢｏｈｌｉｎＶＯＲＲｈｅｏｍｅｔｅｒシ
ステム（ＢｏｈｌｉｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅ
ｔｒｉｃＧｒｏｕｐＬｔｄ．，Ｇｌｏｕｃｅｓｔ
ｅｒｓｈｉｒｅ，ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ）を用
いて測定した。サーモスタットでの調温を、Ｂｏｈｌｉ
ｎ低部プレート温度制御ユニットによって達成した。粘
度を、９１．９ｓ^-1の剪断速度で測定した。測定温度は
２０℃であり、そしてサンプルを、測定前に２０℃にて
約１時間維持した。使用した測定系は、Ｃ１４（同軸円
柱状系）であった。使用したトルクエレメントは、０．
２５ｇｃｍであった。取り込み時間は５ｓ、測定間隔
は３０ｓ、そして自動照準は使用しなかった。装置制御
および一次データ処理を、ＢｏｈｌｉｎＲｈｅｍｅｔ
ｅｒＳｏｆｔｗａｒｅバージョン４．０５とともにＰ
Ｃで行った。

【０２９４】２．４粒子サイズ測定粒子平均直径Ｄ［４．３］を、ＭａｌｖｅｒｎＭａｓ
ｔｅｒｓｉｚｅｒＭｉｃｒｏＰｌｕｓ（Ｍａｌｖｅ
ｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｉｍｉｔｅｄ，Ｗ
ｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で測定した。装
置設定を以下のようにした：提示コード：５ＮＢＤ、お
よび分析モデル：多分散。装置制御および一次データ処
理を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒＭ
ｉｃｒｏｐｌｕｓバージョン２．１５を用いてＰＣで行
った。

【０２９５】４番のペクチンから作製した酸性化乳飲料
のバッチから得た超遠心分離透過物を、希釈に用いた。
超遠心分離を、ＧＲ６１ＰＰ膜（２０．０００Ｄａの分
子量カットオフを有する）を装着したＤＤＳＵＦＬ
ａｂ２０−０．３６モジュールを用いて行った。

【０２９６】２．５沈殿沈殿測定を、ＩＥＣＣｅｎｔｒａ−８ＲＣｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｑｕｉｐ
ｍｅｎｔ，ＮｅｅｄｈａｍＨｔｓ，ＭＡ，ＵＳ
Ａ）を用いて、サンプルの遠心分離によって行った。
２．５ｇの酸性化乳飲料を、２０℃にて２５分間および
２４００ｇで遠心分離した。上清を除去し、管を１５分
間逆さまにし、そして沈殿物の重量を決定し、そして
（使用した乳飲料の量の）割合として示した。二重測定
を、各サンプルで行った。

【０２９７】３．結果および議論３．１試験系のサイズこの新規なシステムを、以前の試験系と小部分比較する
が、５５０ｇの酸性化乳飲料に基づいて示す試験系と同
じ特性を維持するままである。酸性化乳飲料においてペ
クチンを試験するためのモデル系を作製する最も簡単な
方法は、ペクチン溶液とヨーグルトを単に撹拌しながら
混合し、そしてこの混合物の測定を行うことである。こ
のことはまた、任意の規模で実際に行い得るという利点
を有する。しかし、ＧＬＡＨＮおよびＲＯＬＩＮ（６）
は、均質化は、安定化に必要なペクチンの量を減少さ
せ、そして均質化および加熱処理の両方は、安定性にお
いて非常に重要な効果を有することを示した。均質化お
よび加熱処理は、５５０ｇ規模（産業プロセスの規模）
で存在する系に組み込まれたので、両方の処理もまた、
小規模系に存在することが必要であった。産業におい
て、上流（加熱前）および下流（加熱後）均質化の両方
を使用する。このモデル系において、本発明者らは、均
質化を加熱処理後におくことを選択した。なぜなら、こ
のことは、より均質なサンプルを生じ、それにより例え
ば、粘度の再現性測定を得ることを容易にするからであ
る。

【０２９８】ＭｉｎｉＪｅｔＨｏｍｏｇｅｎｉｓｅ
ｒでの再現性均質化を達成するために、そして、サンプ
ル移入の間の種々の欠失を補うために、４０ｍｌのサン
プルで均質化段階を操作することが所望された。８〜９
ｍｌのみが、試験に必要であったので（粘度測定につい
て２．５ｍｌ、沈降について５ｍｌ、および粒子サイズ
決定について０．５〜１ｍｌ）、大量のサンプルを必要
とする工程は、均質化であり、それゆえ、結果は、存在
する試験系は、５５０ｇから４０ｇ乳飲料にスケールダ
ウンした。

【０２９９】３．２加熱処理スケールダウン系模倣を作製するために、それに可能な
限り近い存在する試験系は、加熱処理工程に対する改変
を行うことが所望された。存在する５５０ｇ系で、加熱
は、６００ｍｌＢｌｕｅ−ｃａｐボトルにおいて、３
０分間、７５℃の水浴中で、５分毎に撹拌しながら行っ
た。

【０３００】新たな４０ｇ系で、加熱処理を、水で満た
した６００ｍｌＢｌｕｅ−ｃａｐボトルの内側に設置
した５０ｍｌプラスチック遠心管において行った。ここ
で、７５℃の水浴では加熱に強すぎ、これはおそらく、
水の熱伝導度が、凝固牛乳のものより高いからである。
それゆえ、７０から７５℃の異なる温度を試験し、そし
て７２℃で３０分間（撹拌せず）が、大きな系における
温度プロフィールによい近似を与えることを見いだし
た。

【０３０１】３．３小規模系の試験本発明の改変ＰＭＥで処理したペクチンで安定化した乳
飲料が、ほとんど沈殿および小粒子を示さなかった場
合、次いで、このことは、使用のための良好なペクチン
を示し、そしてさらに本発明の改変ＰＭＥがこのような
使用に適切であることを示す。

【０３０２】４．総括酸性化乳飲料の安定化粉末であるペクチンを試験するた
めの系は、５５０ｇの乳飲料から４０ｇの乳飲料へと首
尾良くスケールダウンされており、これは、ペクチンの
必要量が、約１．７ｇから約０．１５ｇに減少されるこ
とを意味する。これは、本発明の改変ペクチンで処理し
た実験用ペクチンサンプルのスクリーニングを可能にす
るのに十分少ない。２つの方法の間の粒子サイズ、粘
度、および沈殿について得られた結果の間の高い相関関
係が、実証されている。加熱および均質化を含むままで
あるが、スケールダウン方法は、比較的単純であり、こ
れは、産業関連性にとって重要であると考えられる。

【０３０３】便宜上、本発明者らは、アミノ酸について
使用したコードを示す表を提示する。アミノ酸３文字表記１文字記号アラニンＡｌａＡアルギニンＡｒｇＲアスパラギンＡｓｎＮアスパラギン酸ＡｓｐＤシステインＣｙｓＣグルタミンＧｌｎＱグルタミン酸ＧｌｕＥグリシンＧｌｙＧヒスチジンＨｉｓＨイソロイシンＩｌｅＩロイシンＬｅｕＬリジンＬｙｓＫメチオニンＭｅｔＭフェニルアラニンＰｈｅＦプロリンＰｒｏＰセリンＳｅｒＳスレオニンＴｈｒＴトリプトファンＴｒｐＷチロシンＴｙｒＹバリンＶａｌＶ任意の残基ＸａａＸ上記明細書にて言及した全ての刊行物を、本明細書中で
参考として援用する。本発明の記載した方法および系の
種々の改変および変更は、本発明の精神および範囲を逸
脱しないことが、当業者には明らかである。本発明は、
特定の好ましい実施態様と関連して記載されていおる
が、請求される発明は、このような特定の実施態様に過
度に限定されるべきではないことが理解されるべきであ
る。実際には、生化学およびバイオテクノロジーまたは
関連分野の当業者に想到される、本発明を行うための記
載した態様の種々の改変は、以下の請求項の範囲内であ
ることが意図される。

【０３０４】（１）ＫＲＡＶＴＣＨＥＮＫＯ，Ｔ．
Ｐ．，ＰＡＲＫＥＲ，Ａ．，ＴＲＥＳＰＯＥＹ，Ａ．：
ＩｎＦｏｏｄＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｎ
ｄＣｏｌｌｏｉｄｓ（Ｅ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎおよび
Ｄ．Ｌｏｒｉｅｎｔ編）ＴｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅ
ｔｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
（１９９５）（２）ＧＬＡＨＮ，Ｐ．−Ｅ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ
ｎＦｏｏｄＮｕｔｒｉｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ６
１７１−１７７（１９８２）（３）ＦＯＬＥＹ，Ｊ．，ＭＵＬＣＡＨＹ，Ａ．Ｊ．：
ＩｒｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＳｃｉ
ｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３４３
−５０（１９８９）（４）ＡＭＩＣＥ−ＱＵＥＭＥＮＥＵＲ，Ｎ．，ＨＡＬ
ＵＫ，Ｊ．−Ｐ．，ＨＡＲＤＹ，Ｊ：Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ７８（１２）２６
８３−２６９０（１９９５）（５）ＡＭＢＪＥＲＧＰＥＤＥＲＳＥＮ，Ｈ．Ｃ．，
ＪＯＲＧＥＮＳＥＮ，Ｂ．Ｂ．：ＦｏｏｄＨｙｄｒｏ
ｃｏｌｌｏｉｄｓ５（４）３２３−３２８（１９９
７）（６）ＧＬＡＨＮ，Ｐ．Ｅ．，ＲＯＬＩＮ，Ｃ．：Ｆｏ
ｏｄＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓＥｕｒｏｐｅ，Ｃｏｎ
ｆ．Ｐｒｏｃ．２５２−２５６（１９９４）（７）ＢＵＲＧＡＵＤ，Ｉ．，ＤＩＣＫｌＮＳＯＮ，
Ｅ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｅ．：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５，３９−４６
（１９９０）ＦｉｎｅｒＪＪ，ＶａｉｎＰ，ＪｏｎｅｓＭＷ
＆ＭｃＭｕｌｌｅｎＭＤ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐａｒｔｉｃ
ｌｅｉｎｆｌｏｗｇｕｎｆｏｒＤＮＡｄｅｌｉ
ｖｅｒｙｔｏｐｌａｎｔｃｅｌｌｓＰｌａｎｔ
ｃｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１１：３２３−３２８ＫｌｅｉｎＴＭ，ＷｏｌｆＥＤ，ＷｕＲ＆Ｓ
ａｎｆｏｒｄＪＣ（１９８７）Ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ
ｔｉｌｅｓｆｏｒｄｅｌｉｖｅｒｙｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄｓｉｎｔｏｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓＮａｔｕｒｅ３２７：７０−７３ＳａｎｆｏｒｄＪＣ，ＫｌｅｉｎＴＭ，Ｗｏｌ
ｆＥＤ＆ＡｌｌｅｎＮ（１９８７）Ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｉｎ
ｔｏｃｅｌｌｓａｎｄｔｉｓｓｕｅｓｕｓｉｎ
ｇａｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
ｐｒｏｃｅｓｓＰａｒｔｉｃｕｌａｔｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７−３７ＶａｉｎＰ，ＫｅｅｎＮ，Ｍｕｒｉｌｌｏ
Ｊ，ＲａｔｈｕｓＣ，ＮｅｍｅｓＣ＆Ｆｉ
ｎｅｒＪＪ（１９９３）ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＰａｒｔｉｃ
ｌｅＩｎｆｌｏｗＧｕｎＰｌａｎｔｃｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒ
ｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ３３：２３７−２４６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）のアミノ酸配列：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ
９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５
−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−
Ａ２２（Ｉ）であって、ここで、Ａ１は、疎水性もしくは極性アミノ酸または中性アミノ
酸Ａ２は、疎水性アミノ酸Ａ３は、疎水性アミノ酸Ａ４は、極性アミノ酸Ａ５は、極性もしくは荷電アミノ酸または中性アミノ酸Ａ６は、極性アミノ酸Ａ７は、極性または荷電または疎水性アミノ酸Ａ８は、疎水性アミノ酸Ａ９は、疎水性または極性アミノ酸Ａ１０は、疎水性または極性アミノ酸Ａ１１は、荷電アミノ酸Ａ１２は、荷電または極性または疎水性アミノ酸Ａ１３は、疎水性もしくは荷電アミノ酸または中性アミ
ノ酸Ａ１４は、疎水性もしくは極性アミノ酸または荷電もし
くは中性アミノ酸Ａ１５は、荷電または極性または疎水性アミノ酸Ａ１６は、極性もしくは疎水性もしくは荷電アミノ酸ま
たは中性アミノ酸Ａ１７は、極性または荷電アミノ酸または中性アミノ酸Ａ１８は、極性または荷電または疎水性アミノ酸Ａ１９は、極性アミノ酸または中性アミノ酸Ａ２０は、疎水性または極性アミノ酸Ａ２１は、疎水性アミノ酸Ａ２２は、極性または疎水性アミノ酸である、アミノ酸配列。
【請求項２】請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ
酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項３】改変されたＰＭＥであって、ここで、該
改変されたＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含まな
い最初のＰＭＥを提供すること；および改変されたＰＭ
Ｅが、請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列を
含むように該最初のＰＭＥを改変することによって入手
可能である。
【請求項４】改変されたＰＭＥであって、ここで、該
改変されたＰＭＥは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む最
初のＰＭＥを提供すること；および改変されたＰＭＥ
が、請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列を含
まないように該最初のＰＭＥを改変することによって入
手可能である。
【請求項５】改変されたＰＭＥをコードする遺伝子で
あって、ここで、該改変されたＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含ま
ないＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供すること；
および請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列を含むようにＰＭＥをコー
ドする該最初の遺伝子を改変することによって入手可能
である。
【請求項６】改変されたＰＭＥをコードする遺伝子で
あって、ここで、該改変されたＰＭＥをコードする遺伝
子は、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする配列を含む
ＰＭＥをコードする最初の遺伝子を提供すること；およ
び請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を含まないようにＰＭＥをコー
ドする該最初の遺伝子を改変することによって入手可能
である。
【請求項７】ＰＭＥを改変するプロセスであって、式
（Ｉ）のアミノ酸配列を含まない最初のＰＭＥを提供す
る工程；および請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ
酸配列を含むように該最初のＰＭＥを改変する工程を包
含する、プロセス。
【請求項８】ＰＭＥを改変するプロセスであって、式
（Ｉ）のアミノ酸配列を含む最初のＰＭＥを提供する工
程；および請求項１に規定される式（Ｉ）のアミノ酸配
列を含まないように該最初のＰＭＥを改変する工程を包
含する、プロセス。
【請求項９】改変されたＰＭＥをコードする遺伝子を
調製する方法であって、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコー
ドする配列を含まないＰＭＥをコードする最初の遺伝子
を提供する工程；および請求項１に規定される式（Ｉ）
のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むよ
うにＰＭＥをコードする該最初の遺伝子を改変する工程
を包含する、プロセス。
【請求項１０】改変されたＰＭＥをコードする遺伝子
を調製する方法であって、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ
ードする配列を含むＰＭＥをコードする最初の遺伝子を
提供する工程；および請求項１に規定される式（Ｉ）の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含まない
ようにＰＭＥをコードする該最初の遺伝子を改変する工
程を包含する、プロセス。
【請求項１１】ＰＭＥ活性に影響を及ぼすための、式
（Ｉ）のアミノ酸配列の使用。
【請求項１２】酵素活性に影響を及ぼすための、式
（Ｉ）のアミノ酸配列の使用。
【請求項１３】請求項１に規定される式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列を含む、改変された酵素。
【請求項１４】請求項１に規定される式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列の使用によって調製される、食品。
【請求項１５】前記食品がペクチンである、請求項１
４に記載の食品。
【請求項１６】請求項１に規定される式（Ｉ）のアミ
ノ酸配列を含む、改変されたＰＭＥ。
【請求項１７】ペクチンを脱メチル化するプロセスで
あって、ペクチンを、請求項１に規定される式（Ｉ）の
アミノ酸配列を含む改変されたＰＭＥと接触させる工程
を包含する、プロセス。
【請求項１８】食品を調製するプロセスであって、脱
メチル化ペクチンを用いる工程を包含し、ここで、該脱
メチル化ペクチンが、ペクチンを、請求項１に規定され
る式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む改変されたＰＭＥと接
触させる工程によって調製される、プロセス。
【請求項１９】実質的に本明細書中に記載されるアミ
ノ酸配列。