NL1012028C2 - Aminozuursequentie. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Aminozuursequentie.

5

Deze uitvinding heeft betrekking op een aminozuursequentie.

Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een nucleotidesequentie die hiervoor codeert.

In het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een 10 aminozuursequentie die in staat is enzymatische werkzaamheid te beïnvloeden. Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een nucleotidesequentie die hiervoor codeert.

Pectine is een belangrijke grondstof in de huidige industrie.

Het kan bijvoorbeeld in de voedingsmiddelenindustrie worden toegepast 15 als verdikkingsmiddel of gelerend middel, voor bijvoorbeeld het bereiden van jams.

Pectine is een structureel polysacharide dat doorgaans in plantencelwanden wordt aangetroffen in de vorm van propectine. Het pectineskelet omvat a-1,4-gekoppelde galacturonzuurresten die zijn 20 onderbroken door een klein aantal 1,2-gekoppelde a-L-ramnose- eenheden. Daarnaast omvat pectine in hoge mate vertakte gebieden in een nagenoeg afwisselende ramno-galacturonanketen. Deze zeer vertakte gebieden bevatten eveneens andere suikereenheden (zoals D-galactose, L-arabinose en xylose) die door glucosidekoppelingen zijn gehecht aan 25 de C3- of C4-atomen van de ramnose-eenheden, of aan de C2- of C3- atomen van de galacturonzuur-eenheden. De lange ketens van de a-1,4-gekoppelde galacturonzuurresten worden doorgaans "gladde” gebieden genoemd, terwijl de zeer vertakte gebieden doorgaans "harige" gebieden worden genoemd.

30 Sommige carboxylgroepen van de galacturonresten zijn veresterd (bijvoorbeeld zijn de carboxylgroepen gemethyleerd). Typische esterificatie van de carboxylgroepen vindt plaats na polymerisatie van de galactaronzuurresten. Het is echter uitermate zeldzaam dat alle carboxylgroepen geësterificeerd zijn (bijvoorbeeld 35 gemethyleerd). Doorgaans varieert de mate van esterificatie van 0 tot 90%. Wanneer 50% of meer van de carboxylgroepen zijn geësterificeerd wordt het betreffende pectine aangehaald als "hoog-ester-pectine" (afgekort "HE-pectine") of als "hoog-methoxyl-pectine". Wanneer minder dan 50% van de carboxylgroepen zijn geësterificeerd wordt het 40 betreffende pectine een "laag-ester-pectine" (afgekort "LE-pectine") 1012028 2 of een "laag-methoxyl-pectine" genoemd. Wanneer 50% van de carboxylgroepen zijn geësterificeerd wordt het betreffende pectine een "medium-ester-pectine" (afgekort "ME-pectine") of een "medium-methoxyl-pectine" genoemd. Wanneer het pectine geen - of slechts en-5 kele - geësterificeerde groepen bevat wordt het doorgaans pectinezuur genoemd.

De structuur van het pectine, in het bijzonder de mate van esterificatie (bijvoorbeeld methylering) bepaalt veel van de betreffende fysische en/of chemische eigenschappen van het pectine.

10 Bijvoorbeeld hangt het geleren van pectine af van de chemische aard van het pectine, in het bijzonder de mate van esterificatie.

Daarnaast hangt gelering van pectine echter eveneens af van het gehalte oplosbare-vaste stoffen, de pH en de calciumionenconcentratie. Wat betreft deze laatste is men van mening 15 dat de calciumionen complexen vormen met vrije carboxylgroepen, in het bijzonder met die van een LE-pectine.

Pectine-enzymen worden geclassificeerd op basis van de wijze waarop deze het galacturonangedeelte van het pectinemolecuul aanvallen. Een overzichtsartikel van sommige pectine-enzymen is 20 opgesteld door Pilnik en Voragen (Food Enzymology, onder redactie van P.F. Fox, Elsevier, (1991), blz. 303-337). In het bijzonder zijn pectinemethylesterasen (EC 3.1.1.11), eveneens PMEs genoemd, in staat om HE-pectinen tot LE-pectinen of pectinezuren te deësterificeren. Daarentegen splijten pectine-depolymerases bijvoorbeeld de 25 glycosidekoppelingen tussen galacturonosyl-methylesterresten.

Meer in detail vormt PME-werkzaamheid vrije carboxylgroepen en vrij methanol. De toename in vrije carboxylgroepen kan eenvoudig worden nagegaan door automatische titratie. Wat dit betreft hebben eerdere onderzoeken aangetoond dat sommige PMEs in staat zijn 30 pectinen op een willekeurige wijze te deësterificeren, in die zin, dat deze elke willekeurige geësterificeerde (bijvoorbeeld gemethyleerde) galacturonzuurrest op één of meer dan één van de pectineketens deësterificeren. Voorbeelden van PMEs die pectines op willekeurige wijze deësterificeren kunnen worden verkregen uit 35 schimmels, zoals Aspergillus aculeatus (zie W094/25575) en

Aspergillus japonicus (Ishii et al 1980 J Food Sci 44^ blz 611-14) . Baron et al (1980 Lebensm. Wiss. M-Technol 13 blz 330-333) hebben blijkbaar een schimmel-PME uit Aspergillus niger geïsoleerd. Beschreven is dat dit schimmel-PME een molecuulgewicht heeft van 40 39000D, een isoëlectrisch punt van 3,9, een optimale pH van 4,5 en 1 ηl20? fi 3 dat de Km-waarde (mg/ml) 3 bedraagt.

Daarentegen is het van sommige PMEs bekend dat deze pectinen bloksgewijs deësterificeren, in die zin, dat men aanneemt dat deze pectinen ofwel aan de niet-reducerende uiteinden of naast vrije 5 carboxylgroepen aanvallen en vervolgens langs de pectinemoleculen voortschrijden via een enkelketening mechanisme, waarbij blokken ongeësterificeerde galacturonzuureenheden worden gevormd die calciumgevoelig kunnen zijn. Voorbeelden van dergelijke enzymen die pectine enzymatisch bloksgewijs deësterificeren zijn planten-PMEs.

10 Men heeft gesuggereerd dat er tot 12 PME-isovormen bestaan in de citrusboom (Pilnik, W en Voragen (Food Enzymology, onder redactie van P.F. Fox, Elsevier, (1991), blz. 303-337). Deze isovormen hebben verschillende eigenschappen.

Willekeurige of blöksgewijze verdeling van vrije carboxyl-15 groepen kan worden onderscheiden door middel van hoge prestatie-ionenuitwisselingschromatografie (Schols et al Food Hydrocolloids 1989 6 blz 115-121). Deze tests worden vaak gebruikt om te controleren op ongewenste achterblijvende PM-werkzaamheid in citroensap na pasteurisatie, omdat achterblijvend PME zogenaamd 20 "wolkverlies" in sinaasappelsap kan veroorzaken, naast de vorming van methanol in het sap.

Versteeg et al (J Food Sci £5 (1980) blz 969-971) hebben ogenschijnlijk een PME uit sinaasappel geïsoleerd. Men heeft beschreven dat dit planten-PME in meerdere isovormen met 25 verschillende eigenschappen voorkomt. Isovorm I heeft een molecuulgewicht van 36000 D, een isoëlectrisch punt van 10,0, een optimum-pH van 7,6 en de Km-waarde (mg/ml) bedraagt 0,083. Isovorm II heeft een molecuulgewicht van 36200 D, een iso-electrisch punt van 11,0, een optimum-pH van 8,8 en de Km-waarde (mg/ml) bedraagt 0,0046. 30 Isovorm III (HMW-PE) heeft een molecuulgewicht van 54000 D, een isoëlectrisch punt van 10,2, een optimum-pH van 8 en de Km-waarde bedraagt (mg/ml) 0,041. Op dit moment zijn er echter zeer beperkte sequentiegegevens voor deze PMEs beschikbaar.

Volgens Pilnik en Voragen (ibid), kunnen PMEs worden 35 aangetroffen in een aantal andere hogere planten zoals in appel, abrikoos, avocado, banaan, bessen, limoen, grapefruit, mandarijn, kersen, aalbessen, druiven, mango, papaya, passievrucht, perzik, peer, pruimen, bonen, wortels, bloemkool, komkommer, prei, uien, erwt, aardappel, radijs en tomaat. Er zijn echter op dit moment zeer 40 beperkte sequentiegegevens voor eveneens deze PMEs.

1012028 H In WO-A-97/03574 is een planten-PME beschreven. Dit PME heeft de volgende kenmerken: een molecuulgewicht van ongeveer 36 kD tot H ongeveer 64 kD, een pH-optimum van pH 7-8, wanneer gemeten met 0,5% H limoenpectine in 0,15 M NaCl, een temperatuuroptimum van ten minste 5 50°C, een temperatuurgevoeligheid in het gebied van 10°C tot ten minste 40°C, een Km-waarde van 0,07%, een werkzaamheidsmaximum bij een concentratie van ongeveer 0,25 M NaCl, een werkzaamheidsmaximum van ongeveer 0,2 M Na2S04, en een werkzaamheidsmaximum bij een concentratie van ongeveer 0,3 M NaN03.

10 Een ander PME is in WO 97/31102 beschreven.

H PMEs hebben in de industrie belangrijke toepassingen. Zij kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in of als sekwestreermiddelen H voor calciumionen. In dit opzicht, en volgens Pilnik en Voragen H (ibid), kan veevoeder worden bereid door het toevoegen van 15 calciumhydroxide aan schillen van citrusvruchten na sapextractie. Na toevoeging activeren de hoge pH en de calciumionen het natieve PME in de schillen, hetgeen een snelle deësterificering van het pectine veroorzaakt, waarbij calcium-pectaat-coagulatie plaats vindt.

I Gebonden vloeibare fase komt vrij en kan op eenvoudige wijze worden 20 uitgeperst, zodat slechts een fractie van het oorspronkelijke watergehalte verwijderd hoeft te worden door kostbare thermische droging. De persvloeistof wordt vervolgens als diervoeder gebruikt.

Zoals hierboven is aangegeven is een PME verkregen uit I Aspergillus aculeatus (WO 94/25575). Dit PME kan blijkbaar worden I 25 gebruikt om de sterkte van een pectinebevattend materiaal te verbeteren, of om pectine te demethyleren, of om de viscositeit van een pectinebevattend materiaal te verhogen.

Het is eveneens in zwang geraakt om PME te gebruiken bij de I bereiding van voedingsmiddelen die zijn bereid uit fruit of 30 groentematerialen die pectine bevatten - zoals jams of conserveermiddelen. WO-A-94/25575 beschrijft bijvoorbeeld de bereiding van sinaasappelmarmelade en tomatenpuree onder toepassing van PME dat is verkregen uit Aspergillus aculeatus.

JP-A-63/209553 beschrijft gels, die zijn verkregen door de 35 werking van pectine-methylesterase, in de aanwezigheid van een polyvalent metaalion, op een pectine-polysaccharide dat als belangrijkste bestanddeel een hoog-methoxyl-poly a-l,4-D-galacturonideketen bevatte en een werkwijze voor de bereiding ervan. Pilnik en Voragen (ibid) beschrijven toepassingen van endogene 40 PMEs, waaronder toevoeging ervan aan de vruchtensappen om de 5 viscositeit van het sap te verlagen wanneer dit te veel pectine bevat dat uit het fruit afkomstig is, de toevoeging ervan als pectinase-oplossingen aan de gasbellen in de albedo van citrusfruit dat is verwarmd tot een kerntemperatuur van 20 tot 40°C om de verwijdering 5 van de schil en andere membranen van intacte sapsegmenten te vergemakkelijken (US-A-4284651) en toepassing ervan bij het beschermen van verbeteren van de textuur en sterkte van diverse bewerkte vruchten en groenten, zoals appel (Wiley & Lee 1970 Food Technol 2£ 1168-70), ingeblikte tomaten (Hsu et al 1985 J Food Sci 30 10 blz. 583-588) en aardappelen (Bartolomé & Hoff 1972 J Agric Food Chem 20 blz 262-266).

Glahn en Rolin (1994 Food Ingredients Europe, Conf Proceedings blz 252-256) beschrijven de hypothetische toepassing van het industriële ”GENU pectin type YM-100" voor een interactie met 15 zuremelkdranken. Er worden echter in het geheel geen details gegeven wat betreft de wijze waarop GENU pectine-type-YM-100 wordt bereid.

EP-A-0664300 beschrijft een chemische fractioneringswerkwijze voor het bereiden van calciumgevoelig pectine. Men beweert dat dit calciumgevoelig pectine voordelig is voor de voedingsmiddelen-20 industrie.

Aldus zijn pectinen en gedeësterificeerde pectinen, naast PMEs, van industrieel belang.

Wij hebben nu gevonden dat het mogelijk is de enzymatische werkzaamheid van een PME te beïnvloeden door een tamelijk kleine 25 aminozuursequentie in een PME in te brengen, daaruit te verwijderen of daarin te wijzigen. In dit opzicht kan de enzymatische werkzaamheid van een PME worden gewijzigd door het inbrengen of het verwijderen van een specifieke aminozuursequentie of door een dergelijke sequentie te wijzigen. Het is echter belangrijk dat het 30 resulterend PME nog steeds in staat is als een PME te werken.

Volgens deze uitvinding wordt voorzien in een aminozuursequentie met de formule (I): A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22 (I) 35 waarin

Al A, V, G of T is A2 V of L is A3 L, F of I is A4 S, T, Y, H, C, N, Q of W is 40 A5 N, D, K, G Of S is 1012028 Η A6 C of S is A7 D, Q, K, E, Y of L is A8 I, L of F is A9 Η, N, V, M of L is 5 A10 A, C, I, P, L of S is

All R is I A12 K, R, L, Q of Y is A13 P, G of R is A14 N, G, M, A, L, R of S is I 10 A15 S, K, E, P of D is I A16 G, Y, Η, N, K of V is I A17 Q, G of K is I A18 K, Q, F, Y, T of S is I A19 N, C of G is I 15 A20 M, L, I, T, V, H of N is I A21 V of I is A22 L, T of S is, waarbij de aanwezigheid van genoemde aminozuursequentie in een H pectinemethylesterase betekent dat het pectinemethylesterase een I 20 pectinemethylesterasesubstraat bloksgewijs kan deësterificeren.

I Een aminozuursequentie volgens formule (I), gekozen uit de I groep, bestaande uit:

I AVLQDCDINARRPNSGQKNMVT

VVFQKCQLVARKPGKYQQNMVT

25 W FQKS QLVARK PMS N QKNMVT

I GVFQNCKLVCRLPAKGQQCLVT

I AVFQNCEFVIRRPMEHQQCIVT

I VVFQGCKIMPRQPLSNQFNTIT

I AVFQNC YLVLRL PRKKGYNVIL

I 30 TVIQNSLILCRKGSPGQTNHVT en,

I AVLQNCDIHARKPNSGQKNMVT

I waarin de aanwezigheid van deze aminozuursequentie in een I pectinemethylesterase betekent dat het pectinemethylesterase een I pectinemethylesterasesubstraat bloksgewijs kan deësterificeren.

35 Zoals is aangegeven hebben wij gevonden dat de aminozuurse- I quentie volgens formule (I) PME-werkzaaraheid beïnvloedt.

I In het bijzonder hebben wij gevonden dat de aminozuursequentie I volgens formule (I) een rol speelt in de vraag of een PME in staat is I tot bloksgewijze deësterificering van een PME-substraat of tot een I 40 willekeurig deësterificeren van een PME-substraat.

7

Meer in het bijzonder hebben wij gevonden dat de aanwezigheid van de aminozuursequentie volgens formule (I) in een PME betekent dat het PME in staat is een PME-substraat bloksgewijs te deësterificeren. Anderzijds betekent de afwezigheid van een deel of de volledige 5 aminozuursequentie volgens formule (I) in een PME dat de PME in staat is een PME-substraat willekeurig te deësterificeren.

Deze resultaten zijn verrassend - in die zin dat een relatief korte aminozuursequentie ten minste enigszins het werkingstype van een enzym, en in het bijzonder een PME kan sturen.

10 Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op de toepassing van een aminozuursequentie volgens de formule (I) voor het beïnvloeden van enzymatische werkzaamheid.

Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een gemodificeerd enzym, dat de aminozuursequentie volgens formule (I) omvat.

15 Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een voedingsmid del, bereid door toepassing van een aminozuursequentie volgens formule (I) .

Bij voorkeur is het voedingsmiddel een pectine.

Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een gemodificeerd 20 PME, dat de aminozuursequentie volgens formule (I) omvat.

Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze voor het demethyleren van pectine, omvattend het in contact brengen van het pectine met een gemodificeerd PME dat de aminozuursequentie volgens formule (I) omvat.

25 Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een voedingsmiddel, omvattend het toepassen van gedemethyleerd pectine, waarin het gedemethyleerd pectine wordt bereid door het in contact brengen van pectine met een gemodificeerd PME dat de aminozuursequentie volgens formule (I) omvat.

30 In het bijzonder heeft deze uitvinding eveneens betrekking op een PME-enzym dat de aminozuursequentie volgens formule (I) omvat. In deze uitvoeringsvorm heeft deze uitvinding echter geen betrekking op een natief PME, wanneer dit zich in zijn natuurlijke omgeving bevindt en wanneer dit tot expressie wordt gebracht door de natieve coderende 35 nucleotidesequentie die zich eveneens in haar natuurlijke omgeving bevindt en wanneer deze nucleotidesequentie onder de controle staat van de natieve promotor ervan die zich eveneens in zijn natuurlijke omgeving bevindt. Ten behoeve van de eenvoud wordt deze uitvoeringsvorm van de uitvinding "een niet-natief PME" genoemd.

40 Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op nucleotidese- 1012028 H quenties die voor de aminozuursequentie volgens formule (I) coderen.

Aldus heeft deze uitvoering eveneens betrekking op een H nucleotidesequentie die codeert voor een PME-enzym die de H aminozuursequentie volgens formule (I) omvat. In deze uitvoeringsvorm

H 5 heeft deze uitvinding echter geen betrekking op een natief voor PME

H coderend gen wanneer dit zich in zijn natuurlijke omgeving bevindt en wanneer dit gen onder de controle staat van zijn natieve promotor, die zich eveneens in zijn natuurlijke omgeving bevindt. Ten behoeve van de eenvoud wordt deze uitvoeringsvorm van de uitvinding "een 10 niet-natief voor PME coderend gen" genoemd.

Informatie met betrekking tot constructen, vectoren, plasmiden, cellen, weefsels, organen en organismen die de aminozuursequentie volgens formule (I) - waarbij de aminozuursequentie deel kan zijn van een grotere aminozuursequentie (bijvoorbeeld als PME-enzym) - en/of 15 de nucleotidesequentie wordt hierin besproken en is ten behoeve van informatieverschaffing opgenomen.

Bovendien wordt informatie met betrekking tot werkwijzen voor I het tot expressie brengen of het toelaten van expressie of transformeren van de nucleotidesequenties, het construct, het 20 plasmide, de vector, de cel, het weefsel, het orgaan of het I organisme, alsmede de producten daarvan, hierin besproken en opgenomen ten behoeve van informatieverschaffing.

De term "vector" omvat expressievectoren en transformatie- vectoren.

25 De term "expressievector" betekent een construct dat in staat is tot in vivo- of in vitro-expressie.

De term "transformatievector" betekent een construct, dat in staat is om van de ene soort naar een andere te worden getransformeerd - zoals van een E.coli naar een filamenteuze schimmel 30 (bij voorkeur Aspergillus) of naar een niet-filamenteuze schimmel I (bijvoorbeeld Pichia). Het kan zelfs een construct zijn dat in staat is om van een E.coli naar een Agrobacterium naar een plant te worden overgebracht.

De term "weefsel" omvat geïsoleerd weefsel en weefsel binnen I 35 een orgaan. Het weefsel kan een plantenweefsel zijn.

I De term "organisme" met betrekking tot deze uitvinding omvat elk organisme (waaronder micro-organismen en unicellulaire I organismen) die de nucleotidesequentie volgens deze uitvinding of daarvan verkregen producten kunnen omvatten, waarin de I 40 nucleotidesequentie volgens deze uitvinding tot expressie kan worden 9 gebracht wanneer deze in het organisme aanwezig is. Een organisme dat voorkeur verdient is een micro-organisme, zoals een schimmel, zoals Aspergillus of gist. Het organisme kan eveneens een plant zijn.

De getransformeerde cel of het getransformeerde organisme kan 5 aanvaardbare hoeveelheden van het gewenste PME vervaardigen, dat op eenvoudige wijze uit de cel of het organisme kan worden gewonnen.

Bij voorkeur omvat het construct volgens deze uitvinding de nucleotidesequentie volgens deze uitvinding en een promotor.

De term "promotor" wordt in de gebruikelijke zin van het 10 vakgebied toegepast, dat wil zeggen een RNA-polymerase-bindingsplaats volgens de Jacob-Monod-genexpressietheorie.

In een aspect is de promotor volgens deze uitvinding in staat de nucleotidesequentie volgens deze uitvinding tot expressie te brengen.

15 In een aspect kan de nucleotidesequentie volgens deze uitvinding (zoals die, welke voor een PME volgens deze uitvinding codeert), onder de controle staan van een promotor die een cel- of weefselspecifieke promotor kan zijn. Wanneer het organisme bijvoorbeeld een plant is, dan kan de promotor er een zijn die de 20 expressie van de nucleotidesequentie beïnvloedt in de vrucht-, zaad-, stengel-, knop-, wortel- en/of bladweefsels. De promotor kan daarnaast kenmerken omvatten om de expressie in een geschikte gastheer te verhogen. Bijvoorbeeld kunnen de eigenschappen geconserveerde gebieden, zoals een Pribnowbox of een TATA-box zijn.

I 25 Het construct volgens deze uitvinding kan zelfs andere I sequenties bevatten om de mate van expressie van de nucleo- I tidesequentie volgens deze uitvinding te beïnvloeden (zoals I handhaven, verhogen of verlagen). Bijvoorbeeld omvatten geschikte I andere sequenties het Shl-intron of een ADH-intron. Andere sequenties I 30 omvatten induceerbare elementen, zoals temperatuur-, chemisch, licht- I of stress-induceerbare elementen. Ook kunnen geschikte elementen I aanwezig zijn om de transcriptie of translatie te versterken. Een I voorbeeld van een laatstgenoemd element is de TMV 5’-signaalsequentie I (zie Sleat, Gene 217 (1987) 217-225; en Dawson, Plant Mol. Biol. 23 35 (1993) 97).

I De aminozuursequentie volgens formule (I) kan zelfs worden gebruikt om te screenen op PME-enzymen, die in staat kunnen zijn bloksgewijze deësterificering van een PME-substraat te vertonen.

Bijvoorbeeld kan de screening worden uitgevoerd met een 40 computerdatabank. Als andere mogelijkheid, of in aanvulling daarop, Η kan een aminozuursequentie volgens formule (I) worden gebruikt om ^B antilichamen te vormen die in staat zijn een aantoonbare ^B iitunuunresponsie/-reactie met sequenties op te wekken die gelijk zijn H aan de aminozuursequentie volgens formule (I). Deze antilichamen H 5 kunnen vervolgens worden gebruikt om te screenen op PME-enzymen die H in staat kunnen zijn tot bloksgewijze deësterificering van een PME- H substraat.

Aldus omvat de uitvinding eveneens de toepassing van de H aminozuursequentie volgens de formule (I) of een antilichaam 10 daartegen om te screenen op een PME-enzym dat in staat kan zijn tot bloksgewijze deësterificering van een PME-substraat.

H Antilichamen kunnen worden opgewekt tegen het enzym volgens deze uitvinding door konijnen in te spuiten met het gezuiverd enzym H en door de immunoglobulinen uit antiserum te isoleren volgens de 15 werkwijzen die zijn beschreven door N. Harboe en A. Ingild ("Immunization, Isolation of Immunoglobulins, Estimation of Antibody

Titre" In A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and

Applications, onder redactie van N.H. Axelsen, et al., Univer- sitetsforlager, Oslo, Noorwegen (1973) en door T.G. Cooper ("The 20 Tools of Biochemistry", John Wiley & Sons, New York, USA, 1977). Bij wijze van voorbeeld kan de aminozuursequentie volgens formule (I) H worden verknoopt met een difterie-toxidoïd-drager. Antilichamen worden vervolgens tegen het conjugaat opgewekt. Een screening op PME's die de aminozuursequentie volgens formule (I) omvatten kan 25 vervolgens worden uitgevoerd door gebruik te maken van onder andere de antilichamen en SDS-PAGE (zie Marcussen en Poulsen 1991 Analytical

Biochem 198: 318-323).

De nucleotidesequentie die voor de aminozuursequentie volgens formule (I) codeert - of zelfs een sequentie die in staat is daarmee 30 te hybridiseren (bij voorkeur onder stringente omstandigheden -d.w.z. 65°C en 0,1 SSC {lxSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 Na3-citraat pH 7,0}) kan eveneens worden toegepast om op genen te screenen die coderen voor PME-enzymen, die in staat kunnen zijn tot bloksgewijze deësterificering van een PME-substraat. Bijvoorbeeld kan de screening 35 worden uitgevoerd op een klonenbibliotheek of zelfs op een com-puterdatabank.

De nucleotidesequentie volgens deze uitvinding kan eveneens worden gebruikt om antisense-sequenties te ontwikkelen die in staat kunnen zijn het voor PME coderend gen dat een gebied omvat, dat voor 40 de aminozuursequentie volgens formule (I) codeert, stil te leggen.

11 I Aldus kunnen de antisense-nucleotidesequenties in staat zijn om op I selectieve wijze een PME uit te schakelen. Deze uitvinding is van I voordeel omdat het voorziet in een middel om de PME-werkzaamheid te I beïnvloeden door het gebruik van een relatief korte I 5 aminozuursequentie en/of een nucleotidesequentie die hiervoor I codeert.

I De aminozuursequentie volgens formule (I) kan in een bestaand I PME worden ingebracht met behulp van geschikte chemische of I biologische technieken. Wanneer van toepassing, kan de I 10 aminozuursequentie volgens formule (I) gedeeltelijk, volledig of I zelfs als deel van een groter fragment worden ingebracht. Bij I voorkeur is de hieruit voortvloeiende aminozuursequentie volgens I formule (I) nabij het C-eindstandige gedeelte van de PME-werkzame I plaats gelegen.

I 15 In dit opzicht geloven wij dat de PME-werkzame plaats (die de I katalytische plaats kan worden genoemd) typisch wordt gekenschetst I door de aminozuursequentie volgens formule (II).

I N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-H-N-H-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-N- I 20 n_n_p_C-P-H-N-H-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-N-G- I n-N-C-N-H-H-G-N-N-N (Π) I waarin I H onafhankelijk een hydrofoob aminozuur vertegenwoordigt I 25 C onafhankelijk een geladen aminozuur vertegenwoordigt I P onafhankelijk een polair aminozuur vertegenwoordigt I G glycine vertegenwoordigt I N onafhankelijk glycine of een hydrofoob of geladen of polair aminozuur vertegenwoordigt.

I 30 Ten aanzien van de aminozuursequentie volgens formule (II) omvatten voorbeelden van hydrofobe aminozuren: Ala (A), Val (V), Phe (F), Pro (P), Met (M), lie (I), Leu (L); voorbeelden van geladen aminozuren: Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R); en voorbeelden van I polaire aminozuren: Ser (S), Thr (T), Tyr (Y) , His (H), Cys (C), Asn I 35 (N) , Gin (Q), Trp (W).

I Wij geloven dat de aminozuursequentie volgens formule (II) belangrijk is voor het definiëren van de actieve plaats omdat eerder

uitgevoerde onderzoeken hebben getoond dat voor Aspergillus-PME

aminozuur 14 betrokken is in de actieve plaats, daar vervangen van 40 een histidine door een alanine een verlies van PME-werkzaamheid M ') Ü veroorzaakte (Duwe en Khanh (1996) Biotechn. Letters vol. 18: 621-626).

Als andere mogelijkheid is het ook mogelijk om een bestaande aminozuursequentie, die in een PME is gelegen, te wijzigen, 5 bijvoorbeeld door een of meer aminozuren polairder te maken door gebruik te maken van plaatsspecifieke chemische wijzigingen en, daardoor, deze aminozuursequentie om te zetten in een sequentie met de formule (I) en aldus het PME om te zetten in een PME dat H bloksgewijs een PME-substraat kan deësterificeren.

10 Als andere mogelijkheid kan de coderende sequentie voor een PME

worden gewijzigd door het inbrengen of verwijderen of vervangen van een nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie H volgens formule (I). In geschikte gevallen kan de nucleotidesequentie die codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I) H 15 gedeeltelijk, volledig of zelfs als deel van een groter fragment H worden ingebracht. Bij voorkeur is de hieruit voortvloeiende nucleotidesequentie die voor de aminozuursequentie volgens formule (I) codeert gelegen nabij het 3'-uiteinde van de PME-actieve plaats.

In dit opzicht, wanneer het gewenst is om een PME-enzym aan te 20 passen, dat normalerwijze willekeurige deësterificeringseigenschappen vertoont, is het mogelijk een of meer van de codons van een coderende nucleotidesequentie die binnen de PME-coderende sequentie zijn gelegen (maar niet de actieve plaats daarvan) te verwijderen of te substitueren - of zelfs een of meer aanvullende codons aan deze 25 nucleotidesequentie toe te voegen - en daardoor een deel van een nucleotidesequentie die niet codeert volgens een aminozuursequentie volgens formule (I) om te zetten in een die wel codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I) en aldus de werking van het PME zodanig te wijzigen dat het in staat is bloksgewijze 30 deësterificeringseigenschappen te vertonen.

Als voorbeeld is het mogelijk om een gedeelte van een voor PME coderend gen uit bijvoorbeeld Aspergillus te klieven en genoemd gedeelte vervolgens te vervangen door een nucleotidesequentie die codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I). Het hieruit 35 voortvloeiend gemodificeerd Aspergillus-PME zal dan in staat zijn bloksgewijze deësterificeringseigenschappen op PME-substraten te vertonen.

Deze uitvinding heeft eveneens betrekking op een gemodificeerd PME, dat bloksgewijze deësterificeringseigenschappen kan vertonen, 40 waarin het gemodificeerd PME verkregen is uit een eerste PME dat 13 normalerwijs willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en geen aminozuursequentie volgens de formule (I) omvat en waarin het eerste PME gemodificeerd is door vervanging van een I aminozuursequentie volgens formule (I) volgens deze uitvinding in de I 5 aminozuursequentie van het eerste PME en waarin deze I aminozuursequentie nabij het C-eindstandige gedeelte van de PME- I werkzame plaats is geplaatst.

I Daarnaast omvat deze uitvinding een werkwijze voor het I modificeren van een PME, omvattende de stappen van het verschaffen I 10 van een eerste PME dat normalerwijs willekeurige deësterificatie- I eigenschappen vertoont geen aminozuursequentie volgens formule (I) I omvat, waarbij het eerste PME wordt gemodificeerd door het vervangen I van een aminozuursequentie volgens formule (I) volgens deze I uitvinding in de aminozuursequentie van het eerste PME en waarin de I 15 aminozuursequentie wordt geplaatst nabij het C-eindstandige gedeelte I van de PME-werkzame plaats.

I Het modificatie-aspect van deze uitvinding omvat eveneens het I modificeren van bestaande aminozuurresten in een PME, zodat het I hieruit voortvloeiend PME de aminozuursequentie volgens formule (I) I 20 omvat.

I Zoals is aangegeven kan de modificatiestap vervanging van een of meer aminozuren omvatten.

I Om het correcte vouwingspatroon van het gemodificeerd enzym te I waarborgen, kan het noodzakelijk zijn een of meer aminozuurresten te I 25 verwijderen. Wanneer het noodzakelijk is een of meer aminozuurresten te verwijderen, wordt of worden doorgaans die rest of resten I verwijderd op de plaats waar het volledige of een deel van de I aminozuursequentie volgens formule (I) wordt ingebracht. Als I voorbeeld, wanneer de volledige lengte van de aminozuursequentie 30 volgens formule (I) wordt ingebracht in een sequentie om een gemodificeerd enzym te vormen, kan het noodzakelijk zijn een gedeelte van 22 aminozuren uit het enzym te verwijderen. Natuurlijk kan de verwijderingsstap voorafgaand, gedurende of na de inbrengstap plaatsvinden.

H 35 Deze uitvinding omvat eveneens een gen dat codeert voor een H gemodificeerd PME dat bloksgewijze deësterificatie-eigenschappen kan

vertonen, waarin het gen dat codeert voor het gemodificeerd PME

verkregen wordt uit een eerste gen dat codeert voor een PME dat H normalerwijs willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en H 40 geen sequentie omvat die codeert voor een aminozuursequentie volgens I formule (I), waarbij het eerste gen dat voor het PME codeert gemodificeerd is door vervangen van een nucleotidesequentie die codeert voor een aminozuursequentie volgens de formule (I) volgens deze uitvinding, in een nucleotidesequentie van het eerste gen dat 5 codeert voor het PME en waarin deze nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I) is geplaatst nabij het 3'-uiteinde van de PME-werkzame plaats.

Deze uitvinding omvat eveneens een werkwijze voor het bereiden van een gen dat codeert voor een gemodificeerd PME, omvattende de 10 stappen van het verschaffen van een eerste gen dat codeert voor een PME dat normalerwijs willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en geen sequentie omvat die codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I), waarbij het eerste gen dat codeert voor het PME gemodificeerd wordt door het vervangen van een 15 nucleotidesequentie die codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I) volgens deze uitvinding in een nucleotidesequentie van het eerste gen, coderend voor het PME en waarin de nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I) wordt geplaatst nabij het 3'-uiteinde van de PME-werkzame 20 plaats.

Zoals is aangegeven kan de modificatiestap vervanging van een of meer nucleotiden omvatten.

Het PME volgens deze uitvinding kan worden verkregen door het modificeren van een PME uit natuurlijke bronnen of zelfs worden 25 verkregen uit natuurlijke bronnen of het kan chemisch worden gesynthetiseerd. Bijvoorbeeld kan het PME voor modificatie verkrijgbaar zijn uit een schimmel, zoals bijvoorbeeld een PME van schimmeloorsprong (d.w.z. een PME dat uit een schimmel is verkregen). Als andere mogelijkheid kan het PME voor modificatie verkrijgbaar 30 zijn uit een bacterie, zoals bijvoorbeeld een PME van bacteriële oorsprong (d.w.z. een PME dat is verkregen uit een bacterie). Als andere mogelijkheid kan het PME voor modificatie verkrijgbaar zijn uit een plant, zoals bijvoorbeeld een PME van plantaardige oorsprong (d.w.z. een PME dat verkregen is uit een plant). In een 35 voorkeursuitvoeringsvorm wordt het PME volgens deze uitvinding bereid met behulp van recombinant-DNA-technieken.

Zo kan ook het gen dat voor het PME volgens deze uitvinding codeert worden verkregen door het modificeren van een gen dat codeert voor een PME uit natuurlijke bronnen of zelfs worden verkregen uit 40 natuurlijke bronnen of het kan chemisch worden gesynthetiseerd.

15

Bijvoorbeeld kan het te modificeren gen dat voor een PME codeert verkrijgbaar zijn uit een schimmel, zoals bijvoorbeeld een gen dat codeert voor een PME van schimmeloorsprong (d.w.z. een gen dat codeert voor een PME dat is verkregen uit een schimmel). Het is ook 5 mogelijk dat het te modificeren gen dat voor een PME codeert verkrijgbaar kan zijn uit een bacterie, zoals bijvoorbeeld een gen dat codeert voor PME van bacteriële oorsprong (d.w.z. een gen dat codeert voor een PME dat is verkregen uit een bacterie). Het is ook mogelijk dat het te modificeren gen dat voor een PME codeert 10 verkrijgbaar is uit een plant, zoals bijvoorbeeld een gen dat codeert voor een PME van plantaardige oorsprong (d.w.z. een gen dat codeert voor een PME, dat is verkregen uit een plant). In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het gen dat codeert voor een PME volgens deze uitvinding bereid door toepassing van recombinant-DNA-15 technieken.

De aminozuursequentie volgens formule (I) omvat hydrofobe, polaire, geladen en neutrale aminozuren. Een of meer van de hydrofobe, polaire, geladen of neutrale aminozuren kan een niet-natuurlijk aminozuur zijn. In dit opzicht kan het bijvoorbeeld mogelijk zijn een 20 niet-polair, van nature voorkomend aminozuur zodanig te derivatiseren dat het een polair aminozuur wordt. Leringen met betrekking tot nietnatuurlijke aminozuren kunnen worden gevonden in Creighton (1984 Proteins: Structures and Molecula Principles. W.H. Freeman en Company, New York, USA). Deze verwijzing verschaft eveneens enige algemene 25 leringen wat betreft de modificatie van aminozuurresten, zoals glycosylering, fosforylering en acetylering.

In een aspect dat voorkeur verdient zijn de hydrofobe, polaire, geladen, neutrale aminozuren van nature voorkomende aminozuren.

Informatie met betrekking tot hydrofobe, geladen, polaire en 30 neutrale aminozuren wordt hierin besproken en als informatieverschaffing opgenomen. Voorbeelden van hydrofobe aminozuren die de voorkeur verdienen: Ala (A), Val (V), Phe (F), Pro I(P), Met (M), lie (I), Leu (L).

Voorbeelden van geladen aminozuren die de voorkeur verdienen: 35 Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R).

Voorbeelden van polaire aminozuren die de voorkeur verdienen:

Ser (S), Thr (T), Tyr (Y), His (H), Cys (C), Asn (N), Gin (Q), Trp

Een voorbeeld van een neutraal aminozuur dat voorkeur verdient 40 glycine (G).

1 λ 1 o n o o

Bij voorkeur is A4 Q.

Wanneer het gemodificeerd PME eenmaal volgens deze uitvinding is bereid of hoeveelheden PME zijn bereid die zijn geïdentificeerd met de screening volgens deze uitvinding, kan dat PME volgens deze 5 uitvinding worden toegevoegd aan een of meer PME-substraten. De PME-substraten kunnen verkrijgbaar zijn van diverse bronnen en/of kunnen verschillende chemische samenstellingen hebben.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is ten minste één van de PME- H substraten pectine of is een substraat dat van pectine afleidbaar of H 10 afgeleid is (bijvoorbeeld een pectinederivaat).

H De term "afgeleid van pectine" omvat gederivatiseerd pectine, H gedegradeerd (zoals partieel gedegradeerd) pectine en gemodificeerd H pectine. Een voorbeeld van een gemodificeerd pectine is pectine dat van tevoren is behandeld met een enzym, zoals een PME. Een voorbeeld 15 van een pectinederivaat is een pectine dat chemisch is behandeld, bijvoorbeeld geamideerd.

H Bovendien kan het PME volgens deze uitvinding worden gebruikt in samenhang met aanvullende, al dan niet verschillende PME(s).

Wanneer er meer dan één PME aanwezig is, kunnen de PME's 20 verkrijgbaar zijn uit verschillende bronnen en/of kunnen een andere samenstelling hebben en/of kunnen een ander reactiviteitsprofiel (bijvoorbeeld een verschillend pH-optimum en/of een verschillend temperatuuroptimum) hebben.

In deze uitvinding kan het PME-enzym volgens deze uitvinding de 25 PME-substraten bloksgewijs deësterificeren. Wanneer er meer dan één PME aanwezig is, wordt elk PME onafhankelijk gekozen uit een PME dat het PME-substraat of -substraten bloksgewijs kan deësterificeren.

In een volgende voorkeursuitvoeringsvorm heeft het gemodificeerd PME-enzym volgens deze uitvinding een laag pH-optimum 30 (zoals van pH 2 tot 5, bij voorkeur van pH 2,5 tot 4,5) en een hoge affiniteit voor pectine (zoals < 1 mg/ml) en het vermogen pectine bloksgewijs te demethyleren.

In het geval van meer dan een PME wordt elk PME onafhankelijk gekozen uit een PME-enzym dat gevoelig is voor natriumionen (Na-35 gevoelig) of een PME-enzym dat niet gevoelig is voor natriumionen (Na-ongevoelig). In een voorkeursuitvoeringsvorm is het (of ten minste één) PME-enzym een PME-enzym dat natriumgevoelig is.

Het aanvullende PME kan verkrijgbaar zijn uit natuurlijke bronnen of zelfs worden verkregen uit natuurlijke bronnen of het kan 40 chemisch worden gesynthetiseerd. Bijvoorbeeld kan het aanvullende PME

17 verkrijgbaar zijn uit een schimmel, bijvoorbeeld een PME van schimmeloorsprong (d.w.z. een PME dat uit een schimmel is verkregen). Het is ook mogelijk dat het aanvullend PME verkrijgbaar is uit een bacterie, zoals bijvoorbeeld een PME van bacteriële oorsprong (d.w.z.

5 een PME dat verkregen is uit een bacterie). Het is ook mogelijk dat het aanvullend PME verkrijgbaar is uit een plant, zoals bijvoorbeeld een PME van plantaardige oorsprong (d.w.z. een PME dat uit een plant is verkregen). In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het aanvullend PME bereid door toepassing van recombinant-DNA-werkwijzen.

10 Bijvoorbeeld kan het aanvullend PME een recombinant-PME zijn, zoals is beschreven in WO-A-97/03574, of het PME, beschreven in WO-A-94/25575 of WO-A-97/31102, alsmede varianten, derivaten of homologen van de sequenties die in deze octrooiaanvragen zijn beschreven. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het aanvullend PME het recombinant-15 PME volgens WO-A-97/03574 (waarvan de inhoud hierin onder aanhaling is opgenomen) en/of het PME volgens WO-A-94/25575 (waarvan de inhoud hierin onder aanhaling is opgenomen), of een variant, derivaat of homoloog daarvan.

Men gelooft dat pectine dat is gedeësterificeerd door het 20 gemodificeerd PME een andere structuur kan hebben dan dat wat i gedeësterificeerd is door een niet-gemodificeerd PME. In dit opzicht, wanneer het niet-gemodificeerd PME geen aminozuursequentie volgens formule (I) omvat, terwijl het gemodificeerd PME deze wel bevat, zal het pectine, behandeld door het gemodificeerd PME, tenminste 25 gedeeltelijk bloksgewijs - in tegenstelling tot een willekeurig gedeësterificeerd kunnen zijn met het niet-gemodificeerd PME. Bovendien gelooft men dat aspecten, zoals calciumgevoeligheid van het met PME behandeld pectine eveneens kunnen wijzigen, afhankelijk of het gemodificeerd PME al dan niet de aminozuursequentie volgens 30 formule (I) omvat. Men gelooft dat wanneer het gemodificeerd PME de aminozuursequentie volgens formule (I) omvat, het met PME behandeld pectine een hogere calciumgevoeligheid kan hebben dan het pectine dat is behandeld door het niet-gemodificeerd PME.

Men gelooft eveneens dat de totale affiniteit van PME voor 35 pectine door modificatie kan wijzigen.

Men gelooft eveneens dat er een wijziging in de pH-optimum voor het PME door modificatie kan plaatsvinden.

Dit betekent dat het mogelijk is, een gemodificeerd PME op maat te maken, zodat het voldoet aan afzonderlijke vereisten, zoals 40 optimale reactie-omstandigheden. Het kan aldus mogelijk zijn een I plantaardig PME dat een hoog pH-optimum heeft en het vermogen pectine bloksgewijs te deësterificeren te modificeren tot een gemodificeerd PME dat nog steeds een hoog pH-optimum heeft, maar waarin het PME nu het vermogen heeft pectine op een willekeurige wijze te deëste-5 rificeren, door op eenvoudige wijze de aminozuursequentie volgens formule (I) of de sequentie die hiervoor codeert te verwijderen, te wijzigen of stil te leggen (zoals door een selectieve antisense-techniek). Zo kan het ook mogelijk zijn een schimmel-PME of een bacterieel PME dat een laag pH-optimum heeft en het vermogen pectine 10 op een willekeurige wijze te deësterificeren te modificeren tot een gemodificeerd PME dat nog steeds een laag pH-optimum heeft, maar waarin het PME nu het vermogen heeft pectine tenminste gedeeltelijk bloksgewijs te deësterificeren, door op eenvoudige wijze een amino-zuursequentie volgens formule (I) in te brengen of een bestaand 15 gedeelte van de sequentie hierin om te zetten en/of het wijzigen van de coderende sequentie zodat deze hiervoor codeert.

Het PME volgens deze uitvinding kan worden gebruikt om voedingsmiddelen te bereiden.

De term "voedingsmiddelen" kan voedsel omvatten voor consumptie 20 door mens en/of dier. Typische voedingsmiddelen omvatten jams, marmelades, gelei's, zuivelproducten (zoals melk of kaas), vleesproducten, gevogelteproducten, visproducten en bakkerijproducten. Het voedingsmiddel kan zelfs een drank zijn. De drank kan een drinkyoghurt, een vruchtensap of een drank zijn die 25 wei-eiwit omvat.

Het PME volgens deze uitvinding kan worden gebruikt in samenhang met andere typen enzymen.

Voorbeelden van andere typen enzymen omvatten andere pectinasen, pectinedepolymerasen, polygalacturonasen, pectaatlyasen, 30 pectinelyasen, rhamno-galacturonasen, galactanasen, cellulasen, hemicellulasen, endo-ft-glucanasen, arabinasen, acetylesterasen of pectine-vrijzettende enzymen of combinaties daarvan.

Voorbeelden van aminozuursequenties volgens formule (I) omvatten:

35 AVLQNCDIHARKPNSGQKNMVT

AVLQDCDINARRPNSGQKNMVT WFQKCQLVARKPGKYQQNMVT WFQKCQLVARKPGKYQQNMVT 40 WFQKSQLVARKPMSNQKNMVT

19

GVFQNCKLVCRLPAKGQQCLVT AVFQNCEFVIRRPMEHQQCIVT I WFQGCKIMPRQPLSNQFNTIT

I 5

I AVFQNCYLVLRLPRKKGYNVIL

I TVIQNSLILCRKGSPGQTNHVT

I Zoals hierboven is aangegeven omvat deze uitvinding I 10 nucleotideseguenties die coderen voor de aminozuursequentie volgens I formule (I). Uiteraard kan de vakman de geschikte verzameling codons I selecteren die uiteindelijk een nucleotidesequentie opleveren die kan I coderen voor een aminozuursequentie volgens formule (I). Als niet- I beperkend voorbeeld kan een voorbeeld voor een geschikte I 15 aminozuursequentie volgens formule (I) zijn:

I AYLQNCDIHARKPNSGQKNMVT

I en een geschikte coderende nucleotidesequentie kan zijn:

I 20 GCCGTGTTACAAAATTGTGACATCCATGCACGAAAGCCCAATTCCGGCCAAAA

I AAATATGGTCACA.

I Ter informatie is het mogelijk getranformeerde cellen, I getransformeerde organen of getransformeerde organismen te bereiden, I 25 waarin endogene PME-vormi'ng is gestopt of onderdrukt of verwijderd, en waarin daarvoor in de plaats exogeen gemodificeerd PME volgens deze uitvinding tot expressie wordt gebracht. De cel kan een I plantencel zijn. Het orgaan kan een plantenorgaan zijn. Bij voorkeur I is het organisme een schimmel (zoals Aspergillus of gist). Het H 30 organisme kan zelfs een plant zijn. Dit aspect van deze uitvinding heeft het voordeel dat bijvoorbeeld getransformeerde planten volgens I deze uitvinding door te rijpen een of meer andere typen pectine zullen vormen dan de niet-gemodificeerde plantencellen.

I Ofschoon WO-A-97/035574 niet eens het PME volgens deze 35 uitvinding suggereert, laat staan de aminozuursequentie volgens formule (I), verschaft lering ervan enkele bruikbare gegevens wat betreft de wijze een PME volgens deze uitvinding te vormen door H gebruik te maken van een gemodificeerd voor PME coderend gen (zoals door een van de hierboven beschreven modificaties). Daarnaast 40 verschaffen deze leringen eveneens een goede achtergrond wat betreft I 101202« Η de wijze getransformeerde cellen, getransformeerde organen en ge-transformeerde organismen te bereiden die in staat zijn een aminozuursequentie volgens formule (I) op zich of als deel van een groter bestanddeel (zoals wanneer als onderdeel van een PME volgens 5 deze uitvinding) tot expressie te brengen. Enkele van deze leringen worden hieronder beschreven.

Om een recombinant-PME tot expressie te brengen kan het gastheerorganisme een prokaryoot of een eukaryoot organisme zijn. Voorbeelden van geschikte prokaryote gastheren omvatten E. coli en 10 Bacillus subtilis. Instructies voor de transformatie van prokaryote H cellen is goed beschreven in het vakgebied, zie bijvoorbeeld Sambrook H et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e editie, 1989, Cold H Spring Harbor Laboratory Press). Wanneer een prokaryote gastheer H wordt gebruikt, kan het zijn dat het gen voorafgaand aan 15 transformatie geschikt moet worden gemodificeerd, zoals door het verwijderen van introns.

In een uitvoeringsvorm kan het gastheerorganisme van het geslacht Aspergillus zijn zoals Aspergillus niger. Een transgene

Aspergillus kan worden bereid door de volgende beschrijvingen van 20 Rambosek, J. en Leach, J, 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi:

Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6:357-393),

Davis R.W. 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion H in Aspergillus. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors)

Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology deel 25 29, Elsevier Amsterdam 1994, biz. 525-560), Ballance, D.J. 1991 I (Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of

Fungal Gene structure. In: Molecular Industrial Mycology. Systems and I Applications for Filamentous Fungi, onder redactie van Leong, S.A., I Berka R.M. Marcel Dekker Inc., New York, USA, 1991, biz. 1-29) en I 30 Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Aspergillus: 50 fl years on, onder redactie van Martinelli S.D., Kinghorn J.R. Progress I in industrial microbiology deel 29, Elsevier Amsterdam 1994, biz.

I 641-666.

I Het volgende commentaar levert echter een samenvatting van de 35 beschrijvingen voor het bereiden van transgene Aspergillus.

I Bijna een eeuw geleden werden filamenteuze schimmels algemeen toegepast in vele industrietakken voor de verkrijging van organische I verbindingen en enzymen. Bij traditionele Japanse koji- en sojafermentaties is bijvoorbeeld gebruik gemaakt van Aspergillus sp.

I 40 Ook in deze eeuw is Aspergillus niger gebruikt voor de vorming van I 21 I organische zuren, in het bijzonder citroenzuur en voor de vorming van I diverse enzymen voor industriële toepassing.

I Er zijn twee hoofdredenen waarom filamenteuze schimmels zo I breed in de industrie zijn toegepast. Ten eerste kunnen filamenteuze I 5 fungi grote hoeveelheden extracellulaire producten vormen, I bijvoorbeeld enzymen en organische verbindingen, zoals antibiotica en I organische zuren. Ten tweede kunnen filamenteuze fungi op goedkope I substraten, zoals granen, zemelen, bietenpulp, enz. groeien. Deze I redenen hebben de filamenteuze fungi aantrekkelijke organismen I 10 gemaakt als gastheren voor heterologe expressie voor recombinant PME.

I Om transgeen Aspergillus te bereiden worden expressie- I constructen bereid door een benodigde nucleotidesequentie in een I construct in te brengen, dat bestemd is voor expressie in I filamenteuze fungi.

15 Er zijn diverse typen constructen ontwikkeld die worden I gebruikt voor hydrologe expressie. Deze constructen kunnen een I promotor bevatten die in schimmels werkzaam is. Voorbeelden van I promotoren omvatten een schimmelpromotor voor een in hoge mate tot I expressie gebracht extracellulair enzym, zoals de glucoamylase- 20 promotor of de a-amylase-promotor. De nucleotidesequentie kan aan een I signaalsequentie worden gefuseerd, die het eiwit dat door de I nucleotidesequentie wordt gecodeerd tot uitscheiding laat brengen.

Doorgaans wordt een signaalsequentie van schimmeloorsprong gebruikt.

Een terminator die in schimmels werkzaam is beëindigt het 25 expressiesysteem.

Er is een ander type expressiesysteem in schimmels ontwikkeld, waarin de nucleotidesequentie gefuseerd kan worden aan een kleiner of groter gedeelte van een schimmelgen, dat voor een stabiel eiwit codeert. Dit kan het eiwit dat door de nucleotidesequentie wordt 30 gecodeerd stabiliseren. In een dergelijk systeem kan een H klievingsplaats, die wordt herkend door een specifiek protease, worden ingebracht tussen het schimmeleiwit en het eiwit dat door de H nucleotidesequentie wordt gecodeerd, zodat het gevormd fusie-eiwit op H deze positie kan worden gekliefd door het specifieke protease, 35 waarbij het eiwit dat door de nucleotidesequentie wordt gecodeerd H aldus wordt vrijgemaakt. Men kan bijvoorbeeld een plaats inbrengen die wordt herkend door een KEX-2-achtig peptidase dat in ten minste enkele Aspergilli wordt aangetroffen. Een dergelijke fusie leidt tot in vivo-klieving, hetgeen resulteert in bescherming van het tot 40 expressie gebracht product en niet van een groter fusie-eiwit.

Ci> /-¾ i /"\ ,τ».

IHeteróloge expressie in Aspergillus is voor diverse genen die van bacteriële, schimmel-, vertebraat- en planteneiwitten coderen beschreven. De eiwitten kunnen intracellulair worden afgegeven wanneer de nucleotidesequentie niet aan een signaalsequentie is 5 gefuseerd. Dergelijke eiwitten zullen in het cytoplasma accumuleren en zullen doorgaans niet worden geglycosyleerd, hetgeen een voordeel kan zijn voor enkele bacteriële eiwitten. Wanneer de nucleotidesequentie is voorzien van een signaalsequentie zal het eiwit extracellulair worden geaccumuleerd.

10 Met betrekking tot de productstabiliteit en de gastheerstam- modificaties zijn enkele heterologe eiwitten niet zeer stabiel wanneer deze in de kweekvloeistof van schimmels worden uitgescheiden. De meeste schimmels vormen diverse extracellulaire proteasen die de heterologe eiwitten afbreken. Om dit probleem te vermijden zijn 15 speciale schimmelstammen met verlaagde proteasevorming gebruikt als gastheer voor heterologe bereiding.

Voor de transformatie van filamenteuze fungi zijn voor vele filamenteuze fungi verschillende transformatieprotocollen ontwikkeld (Ballance 1991, ibid). Hiervan zijn vele gebaseerd op de bereiding 20 van protoplasten en het inbrengen van DNA in protoplasten onder toepassing van PEG en Ca2+-ionen. De getranformeerde protoplasten regenereren vervolgens en de getransformeerde schimmels worden door gebruik te maken van diverse selectieve merkers geselecteerd. Onder de merkers die worden gebruikt voor transformatie zijn een aantal 25 auxotrofe merkers, zoals argB, trpC, niaD en pyrG, antibioticumresistentiemerkers, zoals benonylresistentie, hygromycineresistentie en fleomycineresistentie. Een doorgaans gebruikte transformatiemerker is het amdS-gen van A. nidulans, dat, bij hoog kopie-aantal, de schimmel op acrylamide als de enige 30 stikstofbron kan laten groeien.

In een andere uitvoeringsvorm kan het transgene organisme een gist zijn. In dit opzicht zijn gisten eveneens veel gebruikt als een vehicel voor heterologe genexpressie. De soort Saccharomyces cerevisiae heeft een lange geschiedenis wat betreft industriële 35 toepassing, inclusief toepassing ervan voor heterologe genexpressie. Expressie van heterologe genen in Saccharomyces cerevisiae is in een overzichtsartikel beschreven door Goodey et al (1987, Yeast Biotechnology, onder redactie van D.R. Berry et al., blz. 401-429, Allen and ünwin, Londen) en door King et al. (1989, Molecular and 40 Cell Biology of Yeasts, onder redactie van E.F. walton en G.T.

23

Yarronton, biz. 107-133, Blackie, Glasgow).

Om verschillende redenen is Saccharomyces cerevisiae goed geschikt voor heterologe genexpressie. Ten eerste is het niet pathogeen voor de mens en is het niet in staat bepaalde endotoxinen 5 te vormen. Ten tweede heeft het een lange geschiedenis van veilig gebruik gedurende meerdere eeuwen van commerciële exploitatie ten behoeve van diverse doeleinden. Dit heeft geleid tot een algemene aanvaardbaarheid door het publiek. Ten derde heeft de extensieve commerciële toepassing en het onderzoek dat aan het organisme is 10 gewijd, geleid tot een overvloed aan kennis omtrent de genetica en fysiologie alsmede omtrent de grootschalige fermentatiekenmerken van Saccharomyces cerevisiae.

Een overzichtsartikel van de principes van heterologe genexpressie in Saccharomyces cerevisiae en uitscheiding van 15 genproducten wordt gegeven door E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes",

Yeasts, deel 5, onder redactie van Anthony H. Rose en J. Stuart Harrison, 2e editie, Academic Press Ltd.).

Diverse typen gistvectoren zijn beschikbaar, waaronder 20 integratieve vectoren, waarbij recombinatie met het gastheergenoom noodzakelijk is voor de handhaving ervan, en autonoom replicerende plasmidevectoren.

Om transgeen Saccharomyces te bereiden worden expres-sieconstructen bereid door het inbrengen van de nucleotidesequentie 25 in een construct, dat bestemd is voor expressie in gist. Diverse typen constructen die worden gebruikt voor heterologe expressie zijn ontwikkeld. De constructen bevatten een promotor die in gist werkzaam I is, gefuseerd aan de nucleotidesequentie; doorgaans wordt een promotor van gist-oorsprong, zoals de GALl-promotor gebruikt.

I 30 Doorgaans wordt een signaalsequentie van gist-oorsprong, zoals de sequentie die voor het SUC2-signaalpeptide codeert gebruikt. Een I terminator die in gist werkzaam is, beëindigt het expressiesysteem.

Voor de transformatie van gist zijn verschillende transformatieprotocollen ontwikkeld. Een transgeen Saccharomyces kan 35 bijvoorbeeld worden bereid door de beschrijving van Hinnen et al.

(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929), Beggs, J.D. (1978, Nature, Londen, 275, 104), en Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168) te volgen.

De getransformeerde gistcellen worden geselecteerd met diverse 40 selectieve merkers. Onder de merkers die gebruikt worden voor I transformatie zijn een aantal auxotrofe merkers, zoals LEU2, HIS4 en TRP1 en dominante antibioticumresistentiemerkers, zoals aminoglycoside-antibioticummerkers, bijvoorbeeld G418.

Een ander gastheerorganisme is een plant. In dit opzicht kent 5 het vakgebied veel referenties voor de bereiding van transgene planten. Twee documenten die enig achtergrondcommentaar leveren op de typen technieken die kunnen worden toegepast om transgene planten te bereiden zijn EP-B-0470145 en CA-A-2006454, waarvan enig commentaar hieronder is weergegeven.

10 Het basisprincipe bij de constructie van genetisch gemodificeerde planten is het inbrengen van genetische informatie in het plantengenoom om een stabiele handhaving van het ingebrachte genetische materiaal te verkrijgen.

Diverse technieken bestaan voor het inbrengen van de genetische 15 informatie, waarbij de twee hoofdprincipes directe inbreng van de genetische informatie en indirecte inbreng van genetische informatie met behulp van een vectorsysteem zijn. Een overzicht van de algemene technieken kan worden gevonden in artikelen door Potrykus (Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. (1991) 42: 205-225) en Christou 20 (Agro-Food-Industry Hi-Tech Maart/April 1994, 17-27).

Een geschikt transformatiesysteera voor een plant kan een vector omvatten, maar het kan twee vectoren omvatten. In het geval van twee vectoren wordt het vectorsysteem normalerwijs aangehaald als een binair vectorsysteem. Binaire vectorsystemen zijn in meer detail 25 beschreven in Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.

Een uitgebreid toegepast systeem voor de transformatie van plantencellen met een gegeven promotor of nucleotidesequentie of construct is gebaseerd op de toepassing van een plasmide Ti van 30 Agrobacterium tumefaciens of een Ri-plasmide van Agrobacterium rhizogenes, zoals is beschreven in An et al. (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 en Butcher D.N. et al (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, onder redactie van D.S. Ingrams en J.P. Helgeson, 203-208.

35 Diverse verschillende Ti- en Ri-plasmiden zijn geconstrueerd, die geschikt zijn voor de constructie van de bovenbeschreven planten-of plantencelconstructen. Een niet-beperkend voorbeeld van een dergelijk Ti-plasmide is pGV3850.

De nucleotidesequentie of het construct dient bij voorkeur in 40 het Ti-plasmide te worden ingebracht tussen de terminale sequenties 25 van het T-DNA of naast een T-DNA-sequentie, om verstoring van de sequenties die direct om de T-DNA-grenzen zijn gelegen te vermijden, omdat ten minste één van deze gebieden essentieel blijkt te zijn voor het inbrengen van een gemodificeerd T-DNA in het plantengenoom.

5 Zoals men uit bovenstaande uitleg zal begrijpen, is het vectorsysteem, wanneer het organisme een plant is, bij voorkeur een die de sequenties bevat die noodzakelijk zijn om de plant te infecteren (bijvoorbeeld het vir-gebied) en tenminste een grensgedeelte van een T-DNA-sequentie, waarbij het grensgedeelte 10 gelegen is op dezelfde vector als het genetisch construct. Bij voorkeur is het vectorsysteem een Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmide of een Agrobacterium rhizogenes Ri-plasmide of een derivaat daarvan, omdat deze plasmiden algemeen bekend zijn en vaak worden toegepast voor de constructie van transgene planten, en er vele 15 vectorsystemen bestaan die gebaseerd zijn op deze plasmiden of derivaten ervan.

Bij de constructie van een transgene plant kan de nucleotidesequentie eerst in een micro-organisme worden geconstrueerd, waarin de vector kan repliceren, en welk micro-20 organisme eenvoudig is te manipuleren, voordat inbreng in de plant plaatsvindt. Een voorbeeld van een bruikbaar micro-organisme is E. coli, maar andere micro-organismen met bovengenoemde eigenschappen kunnen worden gebruikt. Wanneer een vector of een vectorsysteem zoals hierboven is gedefinieerd geconstrueerd is in E. coli, wordt het, 25 wanneer dit noodzakelijk is, in een geschikte Agrobacterium-stam, bijvoorbeeld Agrobacterium tumefaciens overgebracht. Het Ti-plasmide dat de nucleotidesequentie of het construct bevat wordt aldus bij voorkeur in een geschikte Agrobacterium-stam, bijvoorbeeld A. tumefaciens overgebracht, om een Agrobacterium-cel te verkrijgen die 30 de nucleotidesequentie bevat, waarvan het DNA vervolgens wordt overgebracht in de te modificeren plantencel.

Zoals in CA-A-2006454 is beschreven, is een groot aantal kloneringsvectoren beschikbaar, welke vectoren een replicatiesysteem in E. coli en een merker die selectie van de getransformeerde cellen 35 toelaat bevatten. pBR 322, de püC-reeks, de M13mp-reeks, pACYC 184, enz. zijn zulke vectoren.

Op deze wijze kan de nucleotidesequentie in een geschikte restrictieplaats in de vector worden ingebracht. Het hierin aanwezige plasmide wordt gebruikt voor de transformatie in E. coli. De E. coli-40 cellen worden in een geschikt nutriëntenmedium gekweekt en vervolgens 1012028 Η Η geoogst en gelyseerd. Het piasmide wordt vervolgens gewonnen. Als H analysemethode zijn er de algemeen gebruikte sequentie-analyse, restrictie-analyse, elektroforese en andere biologisch-moleculaire biologische werkwijzen. Na elke manipulatie kan de gebruikte DNA- 5 sequentie aan restrictie worden onderworpen en worden gekoppeld aan de volgende DNA-sequentie. Elke sequentie kan in hetzelfde of een ander plasmide worden gekloneerd.

Na elke inbrengwijze van de gewenste promotor of construct of nucleotidesequentie in de planten kan de aanwezigheid en/of de 10 inbreng van verdere DNA-sequenties noodzakelijk zijn. Wanneer bijvoorbeeld voor de transformatie van de plantencellen het Ti- of

Ri-plasmide wordt gebruikt, kunnen tenminste de rechtergrens en vaak echter de rechter- en linkergrens van het Ti- en Ri-plasmide-T-DNA, H als flankerende gebieden van de ingebrachte genen worden gekoppeld.

15 De toepassing van T-DNA voor de transformatie van plantencellen is intensief onderzocht en beschreven in EP-A-120516; Hoekema, in: The

Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Ranters B.B., I Alblasserdam, 1985, hoofdstuk V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant I Sci., 4: 1-46; en An et al., EMBO J. (1985) 4: 277-284.

I 20 Directe infectie van plantenweefsel door Agröbacterium is een eenvoudige techniek die vaak is toegepast en welke is beschreven in

Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant H Pathologists, onder redactie van D.S. Ingrams en J.P. Helgeson, I 203-208. Voor verdere beschrijvingen van dit onderwerp, zie Potrykus I 25 (Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. (1991) 42: 205-225) en

Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Maart/April 1994, 17-27). Met deze techniek kan infectie van een plant worden uitgevoerd op een bepaald gedeelte of weefsel van de plant, bijvoorbeeld op een deel van een blad, een wortel, een stengel of ander deel van de plant.

I 30 Typisch wordt bij directe infectie van plantenweefsels door

Agrobacterium die de promotor en de nucleotidesequentie volgens deze uitvinding draagt, een te infecteren plant verwond, bijvoorbeeld door de plant met een scheermes aan te snijden of door een naald in de plant te steken of de plant met een schuurmiddel af te wrijven. De 35 wond wordt vervolgens met Agrobacterium geïnoculeerd. De geïnoculeerde plant of plantdeel wordt vervolgens op een geschikt kweekmedium gekweekt, waarna men het geheel tot volwassen planten laat ontwikkelen.

Wanneer de plantencellen worden geconstrueerd kunnen deze 40 cellen worden gekweekt en gehandhaafd volgens de algemeen bekende 27 weefselkweekwerkwijzen, zoals door het kweken van de cellen in een geschikt kweekmedium, dat is aangevuld met de noodzakelijke groeifactoren, zoals aminozuren, plantenhormonen, vitaminen, enz. De regeneratie van getransformeerde cellen tot genetisch gemodificeerde 5 planten kan worden bereikt door gebruik te maken van bekende werkwijzen voor de regeneratie van planten van cel- of weefselkweken, bijvoorbeeld door het selecteren van getransformeerde spruiten door gebruik te maken van een antibioticum en door het kweken van de spruiten op een medium dat de geschikte nutriënten, plantenhormonen, 10 enz. bevat.

Een andere techniek voor het transformeren van planten is ballistische transformatie. Oorspronkelijk ontwikkeld om stabiele transformanten van plantensoorten te bereiden die zich niet lieten transformeren door Agrobacterium tumefaciens, heeft ballistische 15 transformatie van plantenweefsel, waarbij DNA op het oppervlak van metaaldeeltjes in cellen wordt ingebracht, toepassing gevonden bij het testen van de prestatie van genetische constructen gedurende transiënte expressie. Op deze wijze kan genexpressie worden onderzocht in transient getransformeerde cellen, zonder stabiele 20 integratie van het gen waarin men is geïnteresseerd, en aldus zonder de tijdrovende vorming van stabiele transformanten.

In meer detail werd de ballistische transformatietechniek (ook bekend als de deeltjesbombarderingswerkwijze) voor het eerst beschreven door Klein et al. (1987), Sanford et al. (1987) en Klein 25 et al (1988), en wordt veel toegepast vanwege eenvoudige behandeling van de cellen of het weefsel waarin men is geïnteresseerd en omdat men dit niet hoeft voor te behandelen.

Het principe van de deeltjesbombarderingswerkwijze is directe afgifte van met DNA beklede microprojectielen in intacte 30 plantencellen door een stuwende kracht (bijvoorbeeld een elektrische ontlading of gecomprimeerde lucht). De microprojectielen penetreren de celwand en de celmembraan, waarbij slechts onbeduidende schade wordt veroorzaakt, en de getransformeerde cellen brengen vervolgens de promotorconstructen tot expressie.

35 Een deeltjesbombarderingstechniek die kan worden uitgevoerd maakt gebruik van een deeltjesinstroomgeweer (PIG) (welke was ontwikkeld en beschreven door Finer et al. (1992) en Vain et al. (1993). De PIG versnelt de microprojectielen in een stroom van stromend helium, door een partieel vacuum in de plantencellen.

40 Een van de voordelen van PIG is dat de versnelling van de 1012028 28 microdeeltjes kan worden beheerst door een timer-relay-solenoïde en door regulering van de verschafte heliumdruk. De toepassing van onder druk gebracht helium als drijvende kracht heeft het voordeel dat dit inert is, en geen residu achterlaat en reproduceerbare versnelling 5 levert. Het vacuum verlaagt de vertraging op de deeltjes en vermindert de weefselbeschadiging door verdeling van het heliumgas voorafgaand aan de inslag (Finer et al., 1992).

Andere werkwijzen voor het transformeren van planten omvatten de siliciumhaartjestechniek en virale transformatietechnieken.

10 Verdere beschrijvingen van plantentransformatie kan worden aangetroffen in EP-A-0449375; US-A-5387757; US-A-5569831; US-A-5107065; EP-A-0341885; EP-A-0271988, EP-A-0416572; EP-A-0240208; EP-A-0458367; WO-A-97/37023; WO-A-94/21803; WO-A-93/23551; WO-A-95/23227.

15 Ofschoon men gelooft dat de aminozuursequentie volgens formule (I) een belangrijke rol in de bloksgewijze deësteri-ficeringseigenschappen van een PME speelt, geloven wij eveneens dat de sequentie de enzymatische werkzaamheid van andere enzymen beïnvloedt, wanneer het aanwezig is in de sequentie voor deze andere 20 enzymen. Bijvoorbeeld kan de aminozuursequentie volgens formule (I) worden ingebracht in enzymen, zoals pectineacetylesterase of rhamnogalacturonanacetylesterase. In dit opzicht kan de aanwezigheid van een aminozuursequentie volgens formule (I) een acetylesterase opleveren, dat in staat is tot bloksgewijze deacetylering (van 25 bijvoorbeeld respectievelijk het suikerbietpectine of het "harige" gebied in de diverse pectines). De aminozuursequentie volgens formule (I) kan zelfs worden ingebracht in enzymen, zoals xylanacetylesterase. In dit opzicht kan de aanwezigheid van de aminozuursequentie volgens formule (I) een acetylesterase opleveren 30 die in staat is xylan bloksgewijs te deacetyleren. Derhalve kan elk van bovengenoemde uitvoeringsvormen van deze uitvinding die betrekking hebben op een gemodificeerd PME eveneens toepasbaar zijn op een gemodificeerd enzym in algemene zin.

Zoals hierboven is aangegeven omvat deze uitvinding eveneens 35 homologen van de weergegeven sequenties. Zoals eveneens is aangegeven kan de mate van homologie (of identiteit) worden bepaald door een eenvoudige ”oogbaln-vergelijking (d.w.z. een stricte vergelijking) van een of meer van de sequenties met een andere sequentie of door in de handel verkrijgbare computerprogramma's te gebruiken die het 40 percentage homologie tussen twee of meer sequenties kunnen berekenen.

29

Wanneer een in de handel verkrijgbaar programma wordt gebruikt, kan de sequentiehomologie (of identiteit) worden bepaald door gebruik te maken van een geschikt homologie-algoritme, door bijvoorbeeld default-parameters te gebruiken. Bij voorkeur wordt het BLAST-5 algoritme toegepast, waarbij de parameters op default-waarden zijn ingesteld. Het BLAST-algoritme wordt gedetailleerd beschreven op http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html, dat hierin onder aanhaling is opgenomen. De zoekparameters worden als volgt gedefinieerd, en zijn bij voorkeur op de gedefinieerde default-10 parameters ingesteld.

Bij voorkeur is "substantiële homologie", wanneer dit wordt bepaald door BLAST, gelijk aan sequenties die overeenkomen met een EXPECT-waarde van ten minste 7, bij voorkeur ten minste ongeveer 9 en met de meeste voorkeur 10 of meer. De default-drempel voor EXPECT bij 15 het zoeken met BLAST bedraagt doorgaans 10.

I BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) is het heuristisch zoekalgoritme dat wordt toegepast door de programma’s blastp, blastn, blastx, tblastn en tblastx; deze programma's schrijven significantie aan hun vindingen toe met behulp van de statistische methoden van 20 Karlin en Altschul (zie http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html), met een klein aantal versterkingen. De BLAST-programma's werden toegesneden op het zoeken naar sequentiegelijkenis, bijvoorbeeld om homologen van een gevraagde sequentie te identificeren. De programma's zijn doorgaans niet 25 bruikbaar bij zoeken op basis van motief. Voor een bespreking van de basisonderwerpen bij het zoeken op basis van gelijkenis in sequentiedatabanken, zie Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6: 119-129.

De vijf BLAST-programma's die beschikbaar zijn op 30 http://www.ncbi.nlm.nih.gov voeren de volgende taken uit: blastp vergelijkt een gevraagde aminozuursequentie met een eiwitsequentiedatabank; blastn vergelijkt een gevraagde nucleotidesequentie in een nucleotidesequentiedatabank; 35 blastx vergelijkt de conceptuele translatieproducten van de zes leesframes van een gevraagde nucleotidesequentie (beide strengen) in een eiwitsequentiedatabank; tblastn vergelijkt een gevraagde eiwitsequentie in een nucleotidesequentiedatabank, welke dynamisch wordt getranslateerd in 40 alle zes leesframes (beide strengen).

Η tblastx vergelijkt de translaties van de zes leesframes van een gevraagde nucleotidesequentie met de translaties van de zes leesframes van een nucleotidesequentiedatabank.

BLAST gebruikt de volgende zoekparameters: 5 HISTOGRAM geeft een histogram met scores voor elke zoekactie weer; de default is ja (zie parameter H in de BLAST-handleiding).

DESCRIPTIONS beperkt het aantal korte beschrijvingen van passende gemelde sequenties tot het aangegeven aantal; de default-limiet bedraagt 100 beschrijvingen (zie parameter V op de 10 handleidingspagina). Zie eveneens EXPECT en CUTOFF.

ALIGNMENTS beperkt de databanksequenties tot het aangegeven H aantal waarvoor hoog-scorende segmentparen (HSPs) worden gemeld; de H default-limiet is 50. Wanneer meer databanksequenties dan dit aan de H statistische significantiedrempel voor doorgifte blijken te voldoen H 15 (zie EXPECT en CUTOFF hieronder) worden alleen de toegewezen overeen- stemmingen met de grootste statistische significantie gemeld (zie parameter B in de BLAST-handleiding).

H EXPECT. De statistische significantiedrempel voor het melden van overeenstemmingen met databanksequenties; de default-waarde is 20 10/ zodat men verwacht dat 10 overeenstemmingen slechts op basis van kans volgens het stochastische model van Karlin en Altschul (1990) worden gevonden. Wanneer de aan een overeenstemming toegeschreven statistische significantie groter is dan de EXPECT-drempel, zal de overeenstemming niet worden gemeld. Lagere EXPECT-drempels zijn I 25 stringenter, hetgeen leidt tot een kleiner aantal gemelde overeenstemmingen op basis van kans. Fractionele waarden zijn I aanvaardbaar (zie parameter E in de BLAST-handleiding).

CUTOFF Begrenzingsscore voor het melden van hoog-scorende segmentparen. De default-waarde wordt berekend uit de EXPECT-waarde I 30 (zie hierboven). HSPs worden voor een databanksequentie alleen gemeld wanneer de daaraan toegewezen statistische significantie ten minste I zo hoog is als die welke aan een enkele HSP met een score die gelijk I is aan de CUTOFF-waarde, zou worden toegeschreven. Hogere CUTOFF- waarden zijn stringenter, hetgeen ertoe leidt dat minder willekeurige I 35 overeenstemmingen worden gemeld (zie parameter S in de BLAST- handleiding). Typisch kunnen de significantiedrempels intuïtiever I worden beheerst met EXPECT.

I MATRIX specificeert een alternerende scoringsmatrix voor I BLASTP, BLASTX, TBLASTN en TBLASTX. De default-matrix is BLOSUM62 I 40 (Henikoff & Henikoff, 1992). De geldige alternatieve keuzes omvatten 31 PAM40, PAM120, PAM250 en IDENTITY. Geen alternerende scoringsmatrices zijn beschikbaar voor BLASTn; specificatie van de MATRIX-opdracht in BLASTN-verzoeken stuurt een fout-respons terug.

STRAND beperkt een TBLASTN-zoekactie tot slechts de top- of 5 bottom-streng van de databanksequenties, of beperkt een BLASTN-, BLASTX- of TBLASTX-zoekactie tot slechts de leesframes van de top- of bottom-streng van de gevraagde sequentie.

FILTER maskeert segmenten van de gevraagde sequentie die lage compositionele complexiteit hebben, zoals dit wordt bepaald door het 10 SEG-programma van Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163, of segmenten die bestaan uit interne herhalingssequenties met korte periodiciteit, zoals wordt bepaald door het XNU-programma van Claverie & States (1993) Computers and Chemistry 17: 191-201, óf, voor BLASTN, door het DÜST-programma van 15 Tatusov en Lipman (zie http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Filteren kan statistisch significante, maar biologisch niet interessante meldingen van de BLAST-output (bijvoorbeeld hits op gebruikelijke zure, basische of prolinerijke gebieden) elimineren, waardoor de biologisch meer interessante gebieden van de gevraagde sequenties beschikbaar 20 worden gelaten voor specifieke overeenstemming met databanksequenties.

Een lage complexiteitssequentie die door een filterprogramma wordt gevonden, wordt vervangen door gebruik te maken van de letter "N" in de nucleotidesequentie (bijvoorbeeld, "NNNNNNNNNNNNN") en de 25 letter "X" in eiwitsequenties (bijvoorbeeld, "XXXXXXXXX").

Filteren wordt alleen op de gevraagde sequentie toegepast (of op de translatieproducten ervan), niet op de databanksequenties. Default-filtering is DUST voor BLASTN, SEG voor andere programma's.

Het is niet ongebruikelijk dat er helemaal niets wordt 30 gemaskeerd door SEG, XNU of beide, wanneer dit wordt toegepast op sequenties in SWISS-PROT, zodat men niet moet verwachten dat filteren altijd een effect oplevert. Voorts worden in enkele gevallen sequenties als geheel gemaskeerd, hetgeen aangeeft/ dat de statistische significantie van overeenkomsten die worden gemeld op de 35 ongefilterde gevraagde sequentie verdacht zijn.

NCBI-gi veroorzaakt dat NCBI-gi-identifiers in de output worden getoond in aanvulling op de toegangs- en/of locusnaam.

Met de meeste voorkeur worden sequentievergelijkingen uitgevoerd met het eenvoudige BLAST-zoekalgoritme dat wordt gegeven 40 op http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

«J n 1 o n o o Η

Andere computerprogrammamethoden om de identiteit en gelijkenis tussen twee sequenties te bepalen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het GCG-programmapakket (Devereux et al. 1984, Nucleic Acids H Research 12: 387) en FASTA (Atschul et al. 1990 J. Mol. Biol.

5 403-410).

H Wanneer Gap Penalties worden gebruikt om een sequentie- H identiteit te bepalen, worden bij voorkeur de volgende parameters H toegepast fiSSSSaesS=S2=55SS=S=S=SS==^^a=SSS:^a^SSSSSBSSS=SS=S=S3asaSS^^^5SBi^SSSSSSSSSSSESI^S==S=3=SSS:

VOOR BLAST

I GAP OPEN 0 GAP EXTENSIE 0

VOOR CLUSTAL DNA

WOORDGROOTTE 2 I GAP PENALTY 10 I GAP EXTENSIE 0,1

Zoals hierin wordt gebruikt, omvatten de termen "variant", I "homoloog", "fragment" en "derivaat" allel-variaties van de sequenties.

I De term "variant" omvat eveneens sequenties die complementair I 15 zijn aan sequenties die in staat zijn met de hierin weergegeven nucleotidesequenties te hybridiseren.

Deze uitvinding zal nu slechts worden beschreven bij wijze van voorbeeld.

20 Voorbeeld 1

De nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I), zoals hieronder is weergegeven, wordt ingebracht in een gen dat codeert voor een PME, dat geen bloksgewijze deësterificeringseigenschappen vertoont - zoals het PME van 25 Aspergillus niger.

Inbrengsequentie:

GCCGTGTTACAAAATTGTGACATCCATGCACGAAAGCCCAATTCCGGCCAAAA

AAATATGGTCACA

33

Deze sequentie kan een synthetische sequentie zijn of kan worden bereid door toepassing van recombinant-DNA-technieken.

De plaats van de sequentie is nabij het 3'-uiteinde van het 5 gengebied dat voor de actieve plaats van PME codeert.

Een sequentie ter grootte van 66 nucleotiden naast de inbrengplaats is verwijderd.

Het hieruit voortvloeiend gemodificeerd PME van Aspergillus niger wordt vervolgens bereid door bijvoorbeeld Aspergillus te 10 transformeren door bovenbeschreven leringen en referenties voor Aspergillus-transformatie op geschikte wijze aan te passen. Het gemodificeerd PME wordt vervolgens gebruikt om een pectine te modificeren door het pectine in contact te brengen met het gemodificeerd PME in een geschikte reactie-omgeving. Het monster 15 gemodificeerd PME kan een geïsoleerd en/of zuiver monster zijn of het kan een ruw extract zijn.

De bloksgewijze deësterificeringseigenschappen van PME en de eigenschappen van een pectine dat hierdoor is behandeld kan worden bepaald door de hierna genoemde protocollen.

20 Verrassenderwijs vertoont het tot expressie gebracht gemodificeerd PME een ander PME-profiel, met name vertoont het enige bloksgewijze deësterificeringseigenschappen (d.w.z. ten minste een partieel bloksgewijze deësterificeringseigenschap).

25 Voorbeeld 2

De nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I) werd verwijderd uit een gen dat voor een PME codeert dat bloksgewijze deësterificeringseigenschappen vertoont - zoals PME uit sinaasappel.

30 De te verwijderen sequentie is:

GCCGTGTTACAAAATTGTGACATCCATGCACGAAAGCCCAATTCCGGCCAAAA

AAATATGGTCACA.

35 Vervolgens werd een sequentie ter grootte van 66 nucleotiden in de verwijderingsplaats ingebracht. Deze sequentie ter grootte van 66 nucleotiden codeert niet voor een aminozuursequentie volgens formule (I) .

Het hieruit voortvloeiend gemodificeerd PME uit sinaasappel 40 werd vervolgens bereid door, bijvoorbeeld, een geschikte gastheercel 1012028 Η - zoals een plantencel - te transformeren door bovengenoemde leringen en referenties voor plantentransformatie op geschikte wijze aan te H passen. Het gemodificeerd PME werd vervolgens gebruikt om een pectine te modificeren door het pectine in contact te brengen met het 5 gemodificeerd PME in een geschikte reactie-omgeving. Het monster gemodificeerd PME kan een geïsoleerd en/of zuiver monster zijn of het kan een ruw extract zijn.

De willekeurige deësterificeringseigenschappen van het PME en de eigenschappen van een pectine dat hierdoor is behandeld kan worden 10 bepaald door de hieronder genoemde protocollen.

Verrassenderwijs vertoont het tot expressie gebracht gemodificeerd PME een ander PME-profiel, met name vertoont het willekeurige deësterificeringseigenschappen.

I 15 Voorbeeld 3

De nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie I volgens formule (I) werd verwijderd uit een gen dat codeert voor een I PME dat bloksgewijze deësterificeringseigenschappen vertoont - zoals I het PME uit tomaat.

I 20 De te verwijderen sequentie is:

I GCCGTGTTACAAAATTGTGACATCCATGCACGAAAGCCCAATTCCGGCCAAAA

I AAATATGGTCACA.

I 25 Vervolgens werd een sequentie ter grootte van 66 nucleotiden in I de verwijderingsplaats ingebracht. Deze sequentie ter grootte van 66 I nucleotiden codeert niet voor een aminozuursequentie volgens formule I (ï) · I Het hieruit voortvloeiend gemodificeerd PME uit tomaat werd I 30 vervolgens bereid door, bijvoorbeeld, een geschikte gastheercel - I zoals een plantencel - te transformeren door bovengenoemde leringen I en referenties voor plantentransformatie op geschikte wijze aan te I passen. Het gemodificeerd PME werd vervolgens gebruikt om een pectine I te modificeren door het pectine in een geschikte reactie-omgeving in I 35 contact te brengen met het gemodificeerd PME. Het monster gemodifi- I ceerd PME kan een geïsoleerd en/of zuiver monster zijn of het kan een I ruw extract zijn.

I De willekeurige deësterificeringseigenschappen van het PME en de eigenschappen van een pectine dat hierdoor is behandeld kan worden I 40 bepaald door de hieronder genoemde protocollen.

35

Verrassenderwijs vertoont het tot expressie gebracht gemodificeerd PME een ander PME-profiel, met name vertoont het willekeurige deësterificeringseigenschappen.

In dit voorbeeld wordt expressie van het gemodificeerd PME 5 bereid door gebruik te maken van de bloemkoolmozaïekvirus (CaMV)-35S-promotor in diverse plantentypen, zoals tomatengenotypen. Deze in hoge mate tot expressie gebrachte constitutieve promotor is algemeen beschikbaar. Andere promotoren kunnen eveneens worden toegepast. De constitutieve CaMV 35S-promotor zal aanvankelijk worden gebruikt voor 10 de voorgestelde experimenten omdat getoond is dat deze promotor de vorming van grote hoeveelheden eiwit in de meeste plantenorganen, waaronder tomatenvruchten, bevordert.

Allereerst wordt een DNA-construct gevormd - dat de nucleotidesequentie omvat die codeert voor een gemodificeerd PME. Dit 15 DNA-construct bevat minimaal een promotor die de transcriptie in tomatenplanten doelmatig bevordert, een cDNA-kloon die voor het gemodificeerd PME codeert en een sequentie die de transcriptie doelmatig beëindigt. Met standaard-moleculair biologische werkwijzen wordt de CaMV35S-promotor aan de coderende sequentie gekoppeld. Een 20 geschikte terminatiesequentie, zoals de nopaline-synthase-3'- terminator wordt stroomafwaarts van het cDNA-insert geplaatst. Het DNA-construct wordt in een geschikte vector voor plantentransformatie I geplaatst. Voor Agrobacterium-bemiddelde transformatie zal het promotor/cDNA/terminator-construct bij voorkeur zijn geplaatst in een 25 op Ti gebaseerd plasmide, zoals pBI121, een standaard-binaire vector. Doorgaans wordt de transformatie bij voorkeur uitgevoerd met twee standaard Agrobacterium binaire vectoren: pBI121 (verkocht door Clontech Laboratories, Palo Alto Calif., USA) en pGA643 (ontwikkeld door G. An op de Washington State University). pBI121 bevat een CAMV-30 promotor en het GUS-reporter-gen. De voor GUS coderende sequentie wordt verwijderd door het digereren met SstI en Smal (stomp uiteinde). De te gebruiken sequentie die voor gemodificeerd PME codeert kan worden bereid door dit met geschikte restrictie-enzymen te digereren. De kleverige/stompe uiteinden maken een gerichte 35 klonering in pBI121 mogelijk. Standaard-werkwijzen voor klieven, ligeren en E. coli-transformatie worden gebruikt.

Voor plantentransformatie is het mogelijk om doorgaans de werkwijzen te volgen van McCormick (1986, Plant Cell Reporter 5: 81-84) en Plant Tissue Culture Manual B6: 1-9 (1991) Kluwer Academie 40 Publishers. Deze laatste referentie verzamelt/vergelijkt diverse 1012028

H PROTOCOLLEN

Η PROTOCOL I

CALCIUMGEVOELIGHEIDSINDEX (CF) Η 5 Calciumgevoeligheid wordt gemeten als de viscositeit van een H pectine dat is opgelost in een oplossing van 57,6 mg calcium/g H pectine, gedeeld door de viscositeit van exact dezelfde hoeveelheid H pectine in een oplossing zonder toegevoegd calcium. Een calcium- H ongevoelig pectine heeft een CF-waarde van 1.

H 10 Een monster van 4,2 g pectine wordt opgelost in 550 ml warm water waarbij doelmatig wordt geroerd. De oplossing wordt tot ongeveer 20°C afgekoeld en de pH wordt met IN HC1 ingesteld op 1,5.

H De pectine-oplossing wordt met water tot 700 ml ingesteld en geroerd.

Van deze oplossing werd afzonderlijk 145 g in vier viscositeitsglazen 15 afgemeten. Aan twee van de glazen (dubbele bepalingen) werd onder roeren 10 ml water toegevoegd en aan de twee andere glazen 10 ml I 250 mM CaCl2.

Aan alle vier viscositeitsglazen wordt tijdens doelmatig I 20 magnetisch roeren 50 ml acetaatbuffer (0,5 M, oH onaeveer 4,6) I toegevoegd, waarbij de pH van de pectine-oplossing tot boven pH 4,0 wordt gebracht. De magneten worden verwijderd en men laat de glazen gedurende de nacht bij 20°C staan. De viscositeiten worden de volgende dag gemeten met een Brookfield-viscometer. De 25 calciumgevoeligheidsindex wordt als volgt berekend: I Viscositeit van een oplossing met 57,6 mg Ca2+ /g pectine

Cf= - I Viscositeit van een oplossing met 0,0 mg Ca-2/g pectine I 30

I PROTOCOL II

I ESTERIFICERINGSGRAAD (%DE) I Aan 50 ml oplossing van 60% isopropanol en 5% HC1 werd een I monster van 2,5 g pectine toegevoegd, hetgeen men gedurende I 35 10 minuten roerde. De pectine-oplossing werd door een glasfilter I gefiltreerd en met 15 ml 60% isopropanol/5% HCl-oplossing zesmaal gewassen, gevolgd door aanvullende wasstappen met 60% isopropanol tot I het filtraat vrij is van chloriden. Het filtraat wordt gedurende de I nacht bij 80°C gedroogd.

37 nacht bij 80°C gedroogd.

In een conische kolf worden 20,5 ml 0,5N NaOH en 20,0 ml 0,5N HC1 gecombineed en worden twee druppels fenolftaleïne toegevoegd. Dit wordt met 0,1N NaOH getitreerd totdat een permanente kleurswijziging 5 wordt verkregen. Het 0,5N HC1 dient enigszins sterker te zijn dan het 0. 5N NaOH. Het toegevoegde volume 0,1N NaOH wordt als V0 genoteerd.

In een conische kolf wordt 0,5 g van het gedroogd pectinemonster (het filtraat) afgemeten en het monster wordt bevochtigd met 96%'s ethanol. Men voegt 100 ml vers gekookt en 10 gekoeld gedestilleerd water toe en de hieruit voortvloeiende oplossing wordt geroerd tot het pectine volledig is opgelost. Vervolgens worden vijf druppels fenolftaleïne toegevoegd en wordt de oplossing getitreerd met 0,1N NaOH (tot een kleurswijziging en de pH 8,5 bedraagt). De hoeveelheid 0,1N NaOH die hier wordt gebruikt wordt 15 als Vi genoteerd. Men voegt 20,0 ml 0,5N NaOH toe en de kolf wordt krachtig geschud, waarna men de kolf gedurende 15 minuten laat staan. Men voegt 20,0 ml 0,5N HC1 toe en de kolf wordt geschud totdat de paarse kleur verdwijnt. Vervolgens worden drie druppels fenolftaleïne toegevoegd en wordt de hieruit voortvloeiende oplossing getitreerd 20 met 0,1N NaOH. Het volume gebruikt 0,1N NaOH wordt als V2 genoteerd.

De esterificeringsgraad (% DE: percentage van alle carboxygroepen) wordt als volgt berekend: v2-v0 %DE - 25 ν, + ^-ν»)

PROTOCOL III DRINKTEST

Kleinschalige werkwijze .voor het screenen op pectine in een 30 aangezuurde meikdrank-systeem.

1. Inleiding.

Aangezuurde melkdranken met lange houdbaarheid zijn zeer populair, vooral in het Verre Oosten. Een warmtebehandeling is 35 noodzakelijk om een lange houdbaarheid te verkrijgen en om sedimentatie van eiwit gedurende en na verwarmen te verhinderen wordt pectine als stabilisatiemiddel toegevoegd. Omdat de kwaliteit van de aangezuurde melkdrank in hoge mate afhangt van de eigenschappen en de concentratie van het gebruikte pectine, is het effect van 40 pectinestabilisatie in diverse modelsystemen onderzocht.

1 Π 1 9 n 9 A

H KRAVTCHENKO et al. (1) gebruikten commerciële yoghurt als basis. De yoghurt werd gehomogeniseerd en een pectine-oplossing werd toegevoegd, zonder enige daaropvolgende warmtebehandeling. GLAHN (2) zuurde gereconstrueerde taptemelkpoeder aan met glucono-d-lacton H 5 (GDL). Na toevoeging van in suiker gedispergeerde pectine werd het mengsel gehomogeniseerd, met warmte behandeld en een tweede maal

gehomogeniseerd. Nagenoeg dezelfde werkwijze werd gebruikt door FOLEY

AND MULCAHY (3), ofschoon deze de laatste homogenisatie weglieten.

AMICE-QUEMENEUR et al. (4) gebruikten eveneens gereconstrueerde 10 taptemelkpoeder, aangezuurd met ofwel GDL of een yoghurtkweek. Aan de yoghurtbasis werd een pectine-oplossing in water toegevoegd en dit werd gehomogeniseerd met een ültra-Turrax, waarbij geen I warmtebehandeling werd toegepast. PEDERSEN AND JO,/RGENSEN (5) gebruikten een waterig mengsel van pectine en caseïne zonder enige 15 homogenisatie of warmtebehandeling.

De meeste in deze onderzoeken gebruikte systemen benodigen I tamelijk grote hoeveelheden pectine. Een andere beperking is dat in de meeste gevallen slechts één type pectine werd toegepast. Omdat het stabiliserend vermogen van pectine zeer afhankelijk is van de 20 chemische structuur en de functionele eigenschappen kan dezelfde test, uitgevoerd met andere typen pectine leiden tot verschillende gevolgtrekkingen, gezien de mechanismen die betrokken zijn bij het stabiliseren van melkeiwitten. Het is derhalve waardevol om een I systeem op te zetten dat het testen van vele pectinemonsters I 25 (bijvoorbeeld experimentele laboratoriummonsters) mogelijk maakt.

I Omdat de vorming van pectinen in een laboratorium doorgaans zeer lage hoeveelheden monster opleveren is het belangrijk dat een dergelijk modelsysteem slechts een kleine hoeveelheid pectine benodigt.

In het navolgende wordt een protocol beschreven, waarin slechts 30 ongeveer 1,7 g pectine tot zo min mogelijk pectine wordt toegepast.

De gebruikte werkwijzen om de prestatie van het systeem te evalueren waren viscometrie, centrifugale sedimentatie en deeltjesgroottebepaling. 1 2 3 4 5 6 2. Materialen en methoden.

2 2.1 Materialen 3

Taptemelkpoeder met ongeveer 36% eiwit werd verkregen van 4

Mejeriernes Faelles Indk0b (Kolding, Denemarken) . Pectinen voor het 5 testen werden verkregen door een pectine te behandelen met een 6 gemodificeerd PME volgens deze uitvinding. Deze pectinen kunnen 39 verschillende eigenschappen hebben zoals wat betreft de esterificatiegraad en het molecuulgewicht, afhankelijk van het type toegepast gemodificeerd PME.

5 2.2 Bereiding van de melkdrank.

De melkdranken werden bereid door het mengen van aangezuurde melkoplossing en een pectine-oplossing, gevolgd door verdere bewerking.

Een melkoplossing werd bereid door 17% (w/w) taptemelkpoeder op 10 te lossen in gedestilleerd water bij 68°C en gedurende 30 minuten te roeren. De melkoplossing werd vervolgens aangezuurd tot pH 4,1 bij 30°C door het toevoegen van 3% (w/w) glucono-d-lacton (GDL).

De pectine-oplossing werd in verschillende stappen bereid. Ten eerste werd pectine droog gemengd met dextrose bij een 15 gewichtsverhouding van 3:2, en vervolgens werd een 1,11%'s (w/w) oplossing van dit mengsel in gedestilleerd water bereid. De laatste stap in de bereiding van de pectine-oplossing was het toevoegen van sucrose tot een eindconcentratie van 17,8% (w/w).

I Melkdranken werden vervolgens bereid door het mengen van één I 20 deel melkoplossing met 1,13 delen (w/w) pectine-oplossing, gevolgd I door warmtebehandeling (zie deel 3.2) en homogenisatie bij 20-22 MPa I en 20°C met een Mini Jet Homogeniser (Burgaud et al., 1990). Door I deze procedure te volgen bedroeg de eindconcentratie van pectine in de melkdrank 0,3% (w/w). Alle monsters werden in tweevoud bereid, bij I 25 5°C opgeslagen en de volgende dag getest op viscositeit, I deeltjesgrootte en sedimentatie.

de Bohlin Rheometer Software versie 4.05.

2.4. Deeltjesgroottemeting.

H De gemiddelde deeltjesdiameter D[4.3], werd gemeten met een 5 Malvern Mastersizer Micro Plus (Malvern Instruments Limited, H Worcestershire, UK). De instrumentele instellingen waren: H presentatiecode: 5NBD, en analysemodel: polydispers. Instrumentele

H controle en primaire gegevensverwerking werden uitgevoerd op een PC

met Mastersizer Microplus voor Windows, versie 2.15.

10 Men gebruikte ultrafiltratiepermeaat, verkregen uit een lading H aangezuurde melkdrank, vervaardigd met pectine nr. 4 voor verdunning.

H De ultrafiltratie werd uitgevoerd met een DDS UF Lab 20-0.36-moduul, H voorzien van GR61PP-membranen met een molecuulgewichtsscheidingsgrens van 20.000 Da.

2.5. Sedimentatie.

Sedimentatiemetingen werden uitgevoerd door centrifugatie van de monsters met een IEC Centra-8R Centrifuge (International

Equipment, Needham Hts., MA, USA). Men centrifugeerde 2,5 g 20 aangezuurde melkdrank gedurende 25 minuten bij 20°C en 2400 g. De I bovenstaande vloeistof werd verwijderd, waarna men de buizen gedurende 15 minuten omgekeerd liet staan en het gewicht van het sediment werd bepaald en uitgedrukt als een percentage (van de hoeveelheid toegepaste melkdrank). Van elk monster werden 25 duplicaatmetingen uitgevoerd.

3. Resultaten en discussie.

3.1. Grootte van het testsysteem.

Dit nieuwe testsysteem is klein in vergelijking met de 30 voorgaande testsystemen, maar het behoudt dezelfde eigenschappen als het bestaande testsysteem, gebaseerd op 550 g aangezuurde melkdrank. De eenvoudigste wijze om een modelsysteem voor het testen van pectinen in aangezuurde melkdranken te maken is het eenvoudig mengen van geroerde yoghurt met een pectine-oplossing en door de metingen op 35 dit mengsel uit te voeren. Dit heeft ook het voordeel dat dit op nagenoeg elke schaal kan worden uitgevoerd. GLAHN AND ROLIN (6) hebben echter aangetoond dat een homogenisatie de hoeveelheid benodigde pectine voor stabilisatie verlaagt en dat zowel homogenisatie en warmtebehandeling aanzienlijke effecten op de 40 stabiliteit hebben. Omdat zowel homogenisatie als warmtebehandeling 41 in het bestaande systeem op een schaal van 550 g waren opgenomen,

Idaar deze in industriële processen plaatsvinden, moeten beide behandelingen eveneens aanwezig zijn in het kleinschalige systeem. In de industrie wordt zowel stroomopwaartse (voorafgaand aan het 5 verwarmen) als stroomafwaartse (na verwarmen) homogenisatie toegepast. In dit modelsysteem hebben wij ervoor gekozen de homogenisatie na de warmtebehandeling uit te voeren omdat dit een meer homogeen monster oplevert, hetgeen het verkrijgen van reproduceerbare metingen wat betreft bijvoorbeeld viscositeit eenvoudiger 10 maakt.

Om een reproduceerbare homogenisatie met de Mini Jet Homogeniser te verkrijgen en om voor diverse verliezen gedurende de monsteroverdracht te compenseren, was het gewenst om te werken met 40 ml monster tijdens de homogenisatiestap. Omdat slechts 8-9 ml 15 nodig was voor de tests (2,5 ml voor viscometrie, 5 ml voor sedimentatie en 0,5-1 ml voor deeltjesgroottebepaling) was de stap die de grootste hoeveelheid monster benodigde de homogenisatie en het resultaat was derhalve dat het bestaande testsysteem werd beperkt van 550 g tot 40 g melkdrank.

3.2. Warmtebehandeling.

Om het kleinschalige systeem het bestaande testsysteem zo goed mogelijk na te bootsen was het wenselijk om modificaties in de warmtebehandelingsstap aan te brengen. Bij het bestaande 550 g-25 systeem vond verwarming plaats in een 600 ml Blue-cap-fles gedurende 30 minuten in een waterbad van 75°C, waarbij elke 5 minuten werd geroerd.

Bij het nieuwe 40 g-systeem werd de warmtebehandeling uitgevoerd in een 50 ml-kunststofcentrifugebuis die in een 600 ml 30 Blue-cap-fles die gevuld was met water, werd geplaatst. In dit geval leverde 75°C in het waterbad een te sterke verwarming, waarschijnlijk omdat de thermische geleidendheid van water groter is dan die van gecoaguleerde melk. Diverse temperaturen tussen 70 en 75°C werden derhalve getest en het bleek dat 72°C gedurende 30 minuten, zonder 35 roeren, een goede benadering gaf van het temperatuurprofiel in het grote systeem.

3.3. Testen van het kleinschalige systeem.

Wanneer een melkdrank, gestabiliseerd met een pectine, 142 behandeld met een gemodificeerd PME volgens deze uitvinding, weinig sedimentatie en kleine deeltjes vertoonde, gaf dit een goed te gebruiken pectine aan en dit is bovendien indicatief dat het gemodificeerd PME volgens deze uitvinding geschikt is voor een 5 dergelijke toepassing.

4. Conclusie.

Een systeem voor het testen van het stabiliserend vermogen van pectinen in aangezuurde melkdranken is met succes beperkt van 500 g 10 tot 40 g melkdrank, hetgeen betekent dat de vereiste hoeveelheid pectine wordt verlaagd van circa 1,7 g tot circa 0,15 g. Dit is laag genoeg om experimentele pectinemonsters, die zijn behandeld met gemodificeerde pectinen volgens deze uitvinding, te screenen. Een hoge correlatie tussen resultaten die zijn verkregen voor deeltjesgrootte, 15 viscositeit en sedimentatie tussen de beide werkwijzen is aangetoond. De kleinschalige werkwijze is relatief eenvoudig, ofschoon het nog steeds verwarming en homogenisatie bevat, hetgeen van belang wordt geacht gezien de industriële relevantie.

Voor het gemak geven wij nu een Tabel weer waarin de codes die 20 zijn gebruikt voor de aminozuren zijn aangegeven.

43

i AMINOZUUR DRIELETTERIGE EENLETTERIG

AFKORTING SYMBOOL

Alanine Ala A

Arginine Arg R

Asparagine Asn N

Asparaginezuur Asp D

Cysteine Cys C

Glutamine Gin Q

Glutaminezuur ^

Glycine Gly G

Histidine His H

Isoleucine He I

Leucine Leu L

Lysine Lys K

Methionine Met M

Fenylalanine ^

Proline Pro P

Serine Ser S

Threonine Thr T

Tryptofaan ΓΤτρ |W

Tyrosine Tyr Y

Valine Val V

Willekeurige rest · Xaa X

1 n 1 9fl 9 ft 144 REFERENTIES: (1) KRAVTCHENKO, T.P.. PARKER, A., TRESPOEYA.: In Food Macromolecules and Colloids (Ed. E. Dickinson and D. Lorient). The Royal Society of Chemistry, Cambridge (1995) (2) GLAHN, P.-E.: Progress in Food Nutrient Science 6 171-177 (1982) 5 (3) FOLEY, J., MULCAHY, A.J.: Irish Journal of Food Science and Technology 13 43-50 (1989) (4) AMICE-QUEMENEUR, N., HALUK, J.-P., HARDY, J.: Journal of Dairy Science 78 (12) 2683-2690 (1995) (5) AMBJERG PEDERSEN, H.C., J0RGENSEN, B.B.: Food Hydrocolloids 5 (4) 323-10 328(1997) (6) GLAHN, P.E., ROLIN, C.: Food Ingredients Europe, Conf . Proc. 252-256 (1994) (7) BURGAUD, L, DICKINSON, E., Nelson, E.: International Journal of Food Science and Technology 25, 39-46 (1990) 15 •Finer JJ, Vain P, Jones MW & McMullen MD (1992)

Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells Plant cell Reports 11: 323-328

Klein TM, Wolf ED, Wu R & Sanford JC (1987)

High-velocity microprojectiles for delivery nucleic acids into living cells 20 'Nature 327: 70-73

Sanford JC, Klein TM, Wolf ED & Allen N (1987)

Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process Particulate Science and Technology 5: 27-37

Vain P, Keen N, Murillo J, Rathus C, Nemes C & Finer JJ (1993) 2 5 1 Development of the Particle Inflow Gun

Plant cell. Tissue and Organ Culture 33: 237-246 . . l

Claims (12)

1. Aminozuursequentie met de formule (I): Al-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9 - Al0-Al1-Al2-Al3-Al4-Al5-Al6-A17-Al8-Al9- i5 A20-A21-A22 (I) waarin Al A, V, G of T is A2 V of L is A3 L, F of I is

2. Aminozuursequentie volgens formule (I), gekozen uit de groep, bestaande uit: AVLQDCDINARRPNSGQKNMVT 35 WFQKCQLVARKPGKYQQNMVT WFQKSQLVARKPMSNQKNMVT GVFQNCKLVCRLPAKGQQCLVT AVFQNCEFVIRRPMEHQQCIVT VVFQGCKIMPRQPLSNQFNTIT 40 AVFQNCYLVLRL PRKKGYNVIL 146 TVIQNSLILCRKGSPGQTNHVT en AVLQNCDIHARKPNSGQKNMVT, waarin de aanwezigheid van deze aminozuursequentie in een pectinemethylesterase betekent dat het pectinemethylesterase een 5 pectinemethylesterasesubstraat bloksgewijs kan deësterificeren.

3. Gemodificeerd PME dat bloksgewijze deësterificatie-eigenschappen kan vertonen, waarin het gemodificeerd PME is verkregen uit een eerste PME dat normalerwijs willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en geen aminozuursequentie volgens formule (I) 10 omvat, waarbij het eerste PME is gemodificeerd door vervangen van een aminozuursequentie van de formule (I) zoals is gedefinieerd in een van de conclusies 1 of 2, in de aminozuursequentie van het eerste PME en waarin deze aminozuursequentie is geplaatst nabij het C-eindstandige gedeelte vah de PME-werkzame plaats.

4. Gen, coderend voor een gemodificeerd PME, dat bloksgewijze deësterificatie-eigenschappen kan vertonen, waarin het gen dat codeert voor het gemodificeerd PME is verkregen uit een eerste gen dat codeert voor een PME dat normalerwijs willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en geen sequentie omvat die 20 codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I), waarbij het eerste gen dat codeert voor het PME is gemodificeerd door vervangen van een nucleotidesequentie die condeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I) zoals is gedefinieerd in een van de conclusies 1 of 2 in de nucleotidesequentie van het eerste gen, dat codeert voor 25 het PME en waarin de nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I) is geplaatst nabij het 3'-uiteinde van de PME-werkzame plaats.

5. Werkwijze voor het modificeren van een PME, omvattende de stappen van het verschaffen van een eerste PME dat normalerwijze 30 willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en geen aminozuursequentie volgens formule (I) omvat, waarbij het eerste PME wordt gemodificeerd door het vervangen van een aminozuursequentie volgens de formule (I), zoals is gedefinieerd in een van de conclusies 1 of 2 in de aminozuursequentie van het eerste PME en 35 waarin deze aminozuursequentie wordt geplaatst nabij het C-eindstandige gedeelte van de PME-werkzame plaats.

6. Werkwijze voor het bereiden van een gen dat codeert voor een gemodificeerd PME, omvattend de stappen voor het verschaffen van een eerste gen dat codeert voor een PME dat normalerwijs willekeurige 40 deësterificatie-eigenschappen vertoont en geen sequentie omvat die I codeert voor een aminozuursequentie volgens formule (I), waarbij het I eerste gen dat codeert voor het PME wordt gemodificeerd door het I vervangen van een nucleotidesequentie die codeert voor een I aminozuursequentie volgens de formule (I) zoals is gedefinieerd in I 5 een van de conclusies 1 of 2 in de nucleotidesequentie van het eerste I gen dat codeert voor het PME en waarin de nucleotidesequentie die I codeert voor de aminozuursequentie volgens formule (I) wordt I geplaatst nabij het 3'-uiteinde van de PME-werkzame plaats.

7. Toepassing van een aminozuursequentie volgens formule (I) I 10 zoals is gedefinieerd in conclusie 1 of 2 voor het beïnvloeden van de I PME-deësterificatiewerkzaamheid waarin een eerste PME dat I normalerwijs willekeurige deësterificatie-eigenschappen vertoont en I geen aminozuursequentie volgens formule (I) omvat wordt gemodificeerd door het vervangen van een aminozuursequentie volgens formule (I) in I 15 de aminozuursequentie.

8. Gemodificeerd PME, bereid volgens de werkwijze van I conclusie 5, omvattend de aminozuursequentie volgens formule (I) I zoals is gedefinieerd in een van de conclusies 1 of 2.

9. Voedingsmiddel, bereid door toepassing van het I 20 gemodificeerd PME volgens conclusie 8.

10. Voedingsmiddel volgens conclusie 9, waarin het I voedingsmiddel een pectine is.

10 A4 S, T, Y, H, C, N, Q of W is A5 N, D, K, G of S is A6 C of S is A7 D, Q, K, E, Y of L is A8 I, L of F is 15 A9 Η, N, V, M of L is AIO A, C, I, P, L of S is All R is A12 K, R, L, Q of Y is A13 P, G of R is 20 Al4 N, G, M, A, L, R of S is Al5 S, K, E, P of D is A16 G, Y, Η, N, K of V is Al7 Q, G Of K is Al8 K, Q, F, Y, T of S is 25 Al9 N, C of G is A20 M, L, I, T, V, H of N is A21 V of I is A22 L, T of S is, waarbij de aanwezigheid van genoemde aminozuursequentie in een 30 pectinemethylesterase betekent dat het pectinemethylesterase een pectinemethylesterasesubstraat bloksgewijs kan deësterificeren.

11. Werkwijze voor de-methyleren van pectine, omvattend het in I contact brengen van pectine met een gemodificeerd PME volgens 25 conclusie 3, of bereid met behulp van de werkwijze volgens conclusie 5, welk PME de aminozuursequentie volgens formule (I) zoals is I gedefinieerd in een van de conclusie 1 of 2 omvat.

12. Werkwijze voor het bereiden van een voedingsmiddel, I omvattende het toepassen van een gedemethyleerd pectine, waarin het 30 gedemethyleerde pectine is bereid door het in contact brengen van het I pectine met een gemodificeerd PME volgens conclusie 3 of een gemodificeerd PME, bereid volgens de werkwijze van conclusie 5, welk PME de aminozuursequentie volgens formule (I) zoals is gedefinieerd H in een van de conclusie 1 of 2 omvat. I 1012028