CZ20013511A3

CZ20013511A3 - Pektin se sníľenou citlivostí vůči vápníku

Info

Publication number: CZ20013511A3
Application number: CZ20013511A
Authority: CZ
Inventors: Karin Meyer Hansen; Flemming Moeller
Original assignee: Cp Kelco Aps
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2002-04-17
Also published as: BR0009496A; ES2241595T3; EP1171473A1; RU2001128764A; TW499689B; DK1171473T3; ATE299152T1; DE60021181T2; JP2002540258A; AU3915000A; WO2000058367A1; TWI252235B; KR100791157B1; MXPA01009799A; CN1352653A; EP1171473B1; KR20020001807A; DE60021181D1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká pektinů zajištujících stabilizaci proteinů bez nežádoucího vzrůstu viskozity. Zejména se tento vynález týká pektinu, upraveného enzymaticky nebo chemicky za vzniku pektinu, který zajišťuje stabilizaci proteinů při poměrně nízké citlivosti vůči vápníku.

Dosavadní stav techniky

Pektin je přečištěný glycidický produkt, který se získává extrakcí vhodných jedlých rostlinných materiálů vodou, například citrusových plodů a jablek. Pektin lze například komerčně extrahovat z kůry citrusových plodů nebo jablečných výlisků v mírně kyselých podmínkách. Typická výroba pektinu zahrnuje tři primární stupně, extrakci z rostlinného materiálu, čištění extraktu, izolaci pektinu z přečištěného roztoku a případně-deesterifikaci.

.. Chemicky je pektin methylester polygalakturonové kyseliny. Sestává hlavně z jednotek D-galakturonové kyseliny a methylesterů galakturonové kyseliny, jež vytvářejí lineární polysacharidové řetězce s jednotkami Dgalakturonové kyseliny spojenými β-l,4-glykosidovými vazbami. Často jsou též přítomny některé neutrální kyseliny jako rhamnóza a arabinóza. Polygalakturonová kyselina je zčásti esterifikována methylovými skupinami a volné karboxyly mohou být částečně nebo úplně neutralizovány sodnými, draselnými nebo amonnými ionty. Poměr esterifikovaných skupin galakturonové kyseliny k veškerým, skupinám galakturonové kyseliny, který se nazývá stupeň esterifikace (DE), ovlivňuje vlastnosti pektinu, zvláště jeho rozpustnost a tvorbu gelu.Pektin se normálně klasifikuje podle stupně esterifikace a v této souvislosti se může dělit do dvou • ·

hlavních kategorii: pektin s vysokým obsahem (methyl)esteru (HM) a pektin s nízkým obsahem (methyl)esteru (LM). (Pro potřeby této specifikace se termíny pektin s nízkým obsahem esteru a pektin s nízkým obsahem methylesteru považují za zaměnitelné stejně jako termíny pektin s vysokým obsahem esteru a pektin s vysokým obsahem methylesteru.) LM pektiny jsou takové, v nichž je v podobě methylesteru méně než 50 % karboxylových skupin, zatímco HM pektiny jsou takové, v nichž se 50 % nebo více karboxylových jednotek vyskytuje jako methylester. Pro účely kategorizace posiluje tuto nomenklaturu definice FCC, podle níž je HM pektin každý pektin s DE 50 % nebo více, zatímco každý s DE pod 50 % je LM pektin.

HM pektiny vytvářejí gely snáze v přítomnosti vysoce rozpustných pevných látek a při nízkém pH, kdežto.LM pektiny typicky gelovatí v přítomnosti dvojmocného kationtu jako je vápník nebo hořčík. I když je tvorba gelu základní charakteristikou pektinu, lze jí využít pro zlepšení stability potravinářských výrobků a nápojů. Pektin je zvláště užitečný-při stabilizaci nápojů obsahujících .. ~ proteiny, jako jsou mléčné proteiny, zvláště při nízkém pH. Jednou kategorií takových nápojů jsou okyselené mléčné nápoje, jež lze připravit fermentací nebo přímým okyselením. Na základě čistě praktických poznatků se zdá, že pektin stabilizuje proteiny jako například kasein interakcí s iontovými náboji na povrchu takových proteinů. Když nedojde k takové stabilizaci, mohou proteinové částice v nápoji reagovat mezi sebou aglomerací, jejímž výsledkem je zákal a/nebo srážení. Pektin je schopen stabilizovat proteiny interakcí kyselých oblastí se záporným nábojem podél hlavního řetězce pektinu s iontovými náboji na povrchu proteinu. Protože je kasein amfoterní, může ke stabilizaci dojít vytvořením vápníkového můstku mezi kyselými oblastmi s negativními, náboj i podél hlavního řetězce pektinu a oblastmi ····· · ·♦ ♦· · • · · ···· ···· • · · · · ♦ · ·· · · ···♦· • · · · · · · ··· · ··· ···· ·· ··· na povrchu částice kaseinu rovněž s negativním nábojem. Při nízkém pH asi kolem 4,4 však má kasein převážné kladný náboj, takže tvorba vápníkového můstku má minimální rozsah, takže ke stabilizaci pektinem dochází hlavně nebo výhradně v důsledku elektrostatické interakce mezi pektinem a kaseinem.

Výrobci potravin a nápojů se mohou setkávat se značnou proměnlivostí surovin, z nichž se jejich výrobky vyrábějí. V případě výrobků obsahujících mléko a/nebo ovoce, včetně jogurtů a nápojů, může tato proměnlivost znamenat značné změny pH, koncentrace proteinů a koncentrace vápníku, jejichž výsledkem jsou změny ve zpracování, změny v surovinách, nebo obojí. Stabilizace takových produktů množstvím pektinu postačujícím pro stabilizaci při typickém nebo normovaném složení produktu může mít za následek vznik výrobku se sníženou kvalitou nebo dokonce nepoužitelného, pokud realizace určitého produktového složení překračuje stabilizační mohutnost daného množství použitého pektinu. Tomuto riziku lze čelit předávkováním pektinu, to znamená přídavkem takového množství pektinu, které je nadbytečné ve' srovnání s množstvím teoreticky potřebným pro stabilizaci typické nebo standardní vsádky. Rozsah předávkování je různý podle výrobce a aplikace, ale může být dosti značný, například 50 %, 100 % nebo více. V závislosti na faktorech jako je pH, obsah pevných látek a obsah vápníku v daném produktu nebo výrobní vsádce však může pektin navíc způsobit značný vzrůst viskozity, někdy nazývaný viskozita z předávkování. Například výrobky obsahující mléčnou sušinu nebo na ní založené, jako jsou okyselené mléčné nápoje, mohou, též obsahovat značné množství vápenatých iontů. V takovém případě může výrobce potravin nebo jejích zpracovatel čelit dilematu, protože pektiny zajišťující lepší stabilizaci mohou též způsobit značnou viskozitu z předávkování.

Pro řešení tohoto problému se zkoušely nebo navrhovaly

Λ · ♦ · * ··· · ··· ···· různé přístupy. Akahoshi a další v patentu (JS 5 690 975 popisuje způsob výroby fermentovaného mléka nebo fermentovaných mléčných nápojů obohacených vápníkem. Tento způsob předpokládá přídavek HM pektinu a vápníku jednotlivě spolu se sirupem do mléčného nápoje fermentovaného kyselinou mléčnou a homogenizaci vzniklé směsi; nebo homogenizovat okyselený výrobek fermentovaný kyselinou mléčnou, přidat sirup a HM pektin, míchat, přidat vápník a opět míchat. V obou případech se jako HM pektin může použít blokový pektin - pektin s nahloučenými kyselými skupinami jako HM pektin. Z hlediska výrobce potravin nebo nápojů by však obecně bylo výhodnější minimalizovat technologické změny. Proto by bylo žádoucí mít k dispozici pektin, který by se mohl použít v potravinách a nápojích s poměrně vysokým obsahem rozpustných pevných látek a nízkým pH, který by zajišťoval stabilitu bez nežádoucího zvýšení viskozity, a to i v případě předávkování. - ~~ _

Podstata vynálezu

Tento vynález se zaměřuje na pektin, který má stupeň shlukování skupin kolem řetězce nejméně asi 10 %, stupeň esterifikace nejméně asi 55 % a ACS nepřekračujicí asi 100 centipoise.

ACS pektinu nemá být víc než asi 30 centipoise, nebo ne víc než asi 20 centipoise, nebo ne víc než asi 10 centipoise, nebo ne víc než asi 5 centipoise a nejvýhodněji je kolem 0 centipoise. Je výhodné, když ÁCS je v rozmezí mezi asi 0 centipoise a asi 20 centipoise, výhodněji mezi asi 0 centipoise a asi 10 centipoise.

Pektin má mít stupeň shlukování nejméně kolem-20 %. Je výhodné, když stupeň shlukování nepřekračuje asi 30 %. Výhodnější je, když je stupeň shlukování mezi asi 15 % a asi 25 %.

Stupeň esterifikace pektinu má být nejméně kolem 60 %, nejméně kolem 70 % nebo nejméně kolem 80 %. Rozmezí stupně esterifikace má být mezi asi 55 % a asi 80 % a je výhodně mezi asi 60 % a asi 72 %.

Molekulová hmotnost pektinu podle tohoto vynálezu je nejméně kolem 40 000, výhodně nejméně kolem 50 000, a výhodněji nejméně kolem 70 000 a může být nejméně kolem 200 000. Výhodné rozmezí molekulové hmotnosti je mezi asi 50 000 a asi 200 000, přičemž se zejména preferuje rozmezí mezi asi 70 000 % a asi 90 000.

V jiném provedení může mít pektin stupeň shlukování mezi asi 10 a asi 15, stupeň esterifikace mezi asi 70 a asi 75 a ÁCS ne větší než asi 18. Alternativně může ÁCS být ne více než asi 14, nebo ne více než asi 10, nebo ne více než asi 6, nebo ne více než asi 3, nebo ne více než asi 2, nebo ne více než asi 1. .

V ještě jiném provedení je tento- vynález, zaměřen na proces přípravy pektinu včetně stupně úpravy primární-ho pektinu se stupněm shlukování nejméně kolem 10 %, stupněm esterifikace nejméně kolem 55 % a ÁCS-větším než asi 0 centipoise pektinlyázou v podmínkách dostačujících pro přípravu upraveného pektinu s ÁCS nižším než je ÁCS primárního pektinu. Primární pektin může mít stupeň shlukování nejméně kolem 20 %; alternativně může mít primární pektin stupeň shlukování nepřekračující asi 30 %. Je výhodné, když je stupeň shlukování primárního pektinu mezi asi 15 % a asi 25 %.

Stupeň esterifikace primárního pektinu může být nejméně kolem 55 %, nebo nejméně kolem 70 .%, nebo nejméně kolem 80 %. Výhodné rozmezí stupně esterifikace primárního pektinu je mezi asi 55 % a asi 80 % a výhodnější rozmezí je mezi asi 60% a asi 72%.

Primární pektin může mít ÁGS nejméně kolem 20 nebo nejméně kolem 200, nebo nejméně kolem 300 nebo nejméně kolem

500.

Zpracovaný pektin vyrobený tímto způsobem má ÁCS nepřekračující asi 20 centipoise, výhodně nižší než asi 10 centipoise, výhodněji nižší než asi 5 % a nejvýhodněji kolem 0 centipoise. Výhodné rozmezí ÁCS zpracovaného pektinu je mezi kolem 0 centipoise a asi 20 centipoise, přičemž se za nejvýhodnější považuje rozmezí mezi kolem 0 centipoise a asi 10 centipoise.

Primární pektin má molekulovou hmotnost nepřekračující 240 000 a výhodně nepřekračující asi 150 000 a má mít molekulovou hmotnost nejméně asi 100 000.

V alternativním způsobu se pektin se stupněm shlukování nejméně kolem 10 %, stupněm esterifikace nejméně kolem 70 % a ÁCS větším než asi 0 centipoise může upravovat rostlinnou pektinmethylesterázou v podmínkách postačujících k tomu, aby vznikl deestrifikovaný pektin se stupněm shlukování nejméně kolem 10 %, stupněm esterifikace nejméně kolem 55 % a ÁCS větší-m než asi 0; a pak se deestrifikovaný^-pektin může upravovat pěktinlyázou v podmínkách postačujících k tomu, aby vznikl pektin se stupněm shlukování nejméně kolem 10 % a s ÁCS ne vyšším než asi 20 centipoise.

Tento vynález zahrnuje i pektin připravený výše uvedenými způsoby.

V ještě jiném provedení se tento vynález zaměřuje na jedlou kompozici zahrnující kterýkoliv z pektinu nebo pektinu zpracovaných v souladu s tímto vynálezem, jak je popsáno výše, V jednom provedení má tento pektin stupeň shlukování ne-jméně kolem 10 %, stupeň esterifikace- nejméně kolem 55 % a ÁCS nepřekračující asi 100 centipoise. Jedlá kompozice může obsahovat ka.sein a výhodně jde o nápoj, zvláště okyselený mléčný nápoj.

V dalším provedení sě tento vynález zaměřuje na způsob • ·

-} · · ·· · · · / ··« · ··· ···· ·· ·♦· zvětšeni skladovatelnosti jedlé kompozice, zahrnující formulaci jedlé kompozice s kterýmkoliv z pektinů nebo zpracovaných pektinů podle tohoto vynálezu, popsaných výše.

Pomocí tohoto vynálezu lze získat pektiny s dobrou stabilizační mohutností, aniž by došlo k většímu a nežádoucímu zvýšení viskozity, a to i když se užije v relativně vyšších koncentracích.

Až dosud představovaly dispozice pro stabilizaci proteinu a minimální vzrůst viskozity v pektinů protichůdné cíle. Aniž bychom se zabývali teorií, může to být způsobeno tím, že stabilizaci proteinu zajišťuje přítomnost záporných nábojů na pektinů, hlavně v podobě kyselých skupin, které jsou též zodpovědné za síťování nebo tvorbu můstků dvojmocných kationtů, jež jsou příčinou vzrůstu viskozity až po gelovatěni a včetně gelovatění. Proto zvýšené množství kyselých skupin, které by zlepšilo stabilizaci, by také zvýšilo tendenci pektinů zvýšit viskozitu kapařin ₇ obsahujících dvojmocné kationty, například vápenaté. Naopak by se při volbě pektinů s vhodně nízkým obsahem kyselých skupin předešlo většímu vzrůstu viskozity, ale také by sedosáhlo jen slabé stabilizační mohutnosti. Teoreticky by mohlo být alespoň možné vybrat pektin představující střední polohu mezi těmito dvěma extrémy, který by měl určitou stabilizační mohutnost aniž by podstatně zvyšoval viskozitu. V praxi by však užitečnost takových pektinů byla potlačena nutností výše uvedeného předávkování, protože v podmínkách předávkování se tento kompromis mezi charakteristikami zruší a dojde ke vzrůstu viskozity.

Přihlašovatelé objevili pektiny poskytující dobrou stabilitu, aniž by kupod-ivů bylý -příčinou nežádoucího vzrůstu viskozity, a to i v podmínkách předávkování. Pektiny podle tohoto vynálezu se mohou charakterizovat různými vlastnostmi, včetně stupně esterifikace (% DE); stupně shlukování (DB); citlivosti vůči vápníku (ACS); molekulové hmotnosti; stabilizační mohutnosti vůči proteinům (YOG); rosolotvorné mohutnosti (VIS); a poměru mezi rosolotvorné mohutností a stabilizační mohutností (VIS/YOG). Tyto parametry a způsoby jejich měření budou podrobněji popsány a vysvětleny v dalším.

Stupeň esterifikace (% DE):

Jak je uvedeno výše, stupeň esterifikace pektinu je mírou procentuálního podílu kyselých skupin přítomných v molekule pektinu ve formě esteru. V případě HM pektinů je nejméně 50 % obsažených karboxylových skupin v podobě methylesterů. Při poklesu % DE klesá i citlivost vůči vápníku a logicky i stabilizační schopnost. Pektiny podle vynálezu se vyznačují tím, že % DE je nejméně asi 55 %, přičemž výhodné rozmezí je od asi 60 nebo 70 % do asi 72 %, přičemž může být % DE kolem 80 %. Zvláště při těchto vysokých rozmezích lze očekávat nízkou stabilizační ”'~ mohutnost a toto .očekávání se zakládá na teorii, že při malém počtu karboxylů je k dispozici málo záporných nábojů pro účinnou stabilizaci proteinu. Stojí za zmínku, že když se pektin podle vynálezu vyrobí enzymatickou úpravou primární enzymatické suroviny, její % DE se v podstatě nezmění.

Příprava vzorku

Naváží se 2^0000 g pektinu do skleněné kádinky o obsahu 250 ml; přidá se 100 ml okyseleného alkoholu (100 ml 60% alkoholu + 5 ml dýmavé HC1) a míchá se magnetickým míchadlem 10 minut. Výsledný roztok se zfiltruje přes vysušený a odvážený kelímek se skleněným filtrem. Kádinka se kvantitativně vypláchne 6 x 15 ml okyseleného alkoholu a výplach se rovněž zfiltruje. Filtrát se promyje 60% isopropylalkoholem (IPA) dokud není prokazatelně beze .stop chloridů, což se prokáže odebráním přibližně 10 ml filtrátu do zkumavky, přidáním asi 3 ml 3N HNO₃ a několika (asi 2 nebo 3) kapek AgNO₃. Filtrát lze považovat, že neobsahuje chloridy, je-li roztok čirý a nedochází ke sráženi chloridu stříbrného. K tomu typicky postačuje promytí dávkou 500 ml IPA. Po zjištění, že filtrát neobsahuje chloridové ionty, se promyje dalšími 20 ml 100% IPA a suší se při 105 °C 2,5 hodiny. Po vysušení se převáží kelímek se skleněným filtrem.

Měření.

Dva vzorky filtrátu po 0,4000 g se odváží do dvou skleněných kádinek obsahu 250 ml; druhý vzorek je určen pro srovnávací pokus a oba vzorky se podrobí stejným procedurám. Pektin se zvlhčí asi 2 ml 100% IPA a přidá se asi 100 ml deionizované vody za stálého míchání magnetickým míchadlem. Nyní je vzorek připraven k míchání. Tentýž postup se zopakuje s druhým vzorkem a druhé titrační množství se -označí jako 31.

Títrace.,

1/Titruje se-0,lN NaOH na pH~8,5; zaznamená se titrační množství jako titr Vi.

2-.· Přidá se 20,00 ml 0,5N. NaOH a ponechá se 15 minut v klidu přikryto folií._

3. Přidá se 20,00 ml 0,5 N HC1 a míchá se magnetickým míchadlem až se pH stane konstantním.

4. Titruje se 0,1 NaOH do pH 8,5; výsledek se zaznamená jako titr V₂.

Srovnávací test:

1. Titruje se 100 ml deionizované vody zbavené oxidu uhličitého na pH 8,5 NaOH koncentrace 0,lN.

2. Přidá se 20,00 ml 0,5N NaOH a ponechá se přesně 15 -minut v klidu přikryto folií.

3. Přidá se 20,00-mí' 0,5 N HC1 a míchá se magnetickým míchadlem až se pH stane konstantním.

4. Titruje se 0,1 NaOH do pH 8,5; výsledek se zaznamená jako titr Bi.

Maximální množství přípustné pro titřáci ve stupni 4

• · · · • · · výše je 1 ml O,1N NaOH. Je-li třeba vice než O,1N NaOH, procedura se opakuje, přičemž se 0,5N HC1 ze stupně 3 zředí malým množstvím deionizované vody; podobně když pH vzorku ve stupni 3 výše neklesne po přidání 0,5N HC1 pod 8,5, zředí se 0,5N NaOH ve stupni 2 malým množstvím deionizované vody. Když je toto zředění nutné, je maximální přípustné zředění takové, aby výsledný roztok měl koncentraci mezi 0,52N a 0,48N.

Výpočet

Výpočet esterifikace se děje podle následujících rovnic:

(V₂-Bí)x100 %DE

V_t

Stupeň shlukování (DB)

Stupeň shlukování. Je .měřítkem distribuce kyselýchskupin v molekule pektinu. Týká se toho, zda se karboxyly shlukují do bloků nebo zda jsou rozptýleny relativně nahodile podél tohoto polymeru. Když jsou kyselé skupiny distribuovány nahodile, jejich individuální negativní náboje jsou poměrně slabé a proto lze očekávat, že budou mít slabý účinek na stabilizaci proteinu nebo vzrůst viskozity. Pokud se však kyselé skupiny vyskytují ve shluku, jsou negativní náboje bloků poměrně velké a tím se zvyšuje stabilizační a rosolotvorná mohutnost pektinu. Pro potřeby tohoto popisu se %DB vyjadřuje jako množství'molekul nemethylované galakturonové.kyseliny (mono- di--a trimerů) uvolněných pomocí endopolygalakturonázy (PG, EC 3.2.1.15)', jako procentuální podíl celkového množství molekul neesterifikované galakturonové kyseliny na gram pektinu. Pektiny podle vynálezu mají %DB v.rozmezí od asi 10 do asi

30. Stejně jako je tomu v případě %DE, připravi-li se pektin podle vynálezu enzymatickou úpravou primárního pektinového materiálu, zachová se v produktu v podstatě stejné %DB jako v primárním materiálu.

Princip a výpočty

Je známo, že polygalakturonáza štěpí polymer pektinu hydrolytickým štěpením galakturonového řetězce. Atakuje jen nemethylované zbytky galakturonové kyseliny, což znamená, že uvolnění monogalakturonové kyseliny, digalakturonové kyseliny a trigalakturonové kyseliny z pektinového polymeru závisí na a) množství přítomných nemethylovaných zbytků galakturonové kyseliny a b) na intramolekulární distribuci nemethylovaných zbytků galakturonové kyseliny. Čím větší je množství nemethylovaných zbytků galakturonové kyseliny v pektinu, tím více monomerů, dimerů a trimerů se uvolni z pektinového polymeru při inkubaci s PG, zachová-li se intramolekulární distribuce nemethylovaných zbytků galakturonové kyseliny konstantní. Čím více mají nemethylované zbytky galakturonové kyseliny charakter shluků, tím. větší množství monomerů, dimerů a trimerů se inkubací v PG uvolní z pektinového polymeru, pokud se množství nemethylovaných zbytků galakturonové kyseliny udrží konstantní.

U pektinu s daným %DE se stupeň shlukování jako %DB stanovil kvantifikací neesterifikovaných monomerů, dimerů a trimerů galakturonové kyseliny uvolněných působením PG. Toto kvantitativní stanovení se provádělo vysokoúčinnou anexovou chromatografií (HPAEC) popsanou v článku od Daas, P.J.H. a dalších,· Anal.- Biochem. , 257 - (2), ss. 195-202- (1988), zde zahrnutém ve formě odkazu. Příprava polygalakturonázy

Zde použitý preparát polygalakturonázy PG-1 pochází z A.niger. Zatímco zde použitý PG-1 se získal klonováním v rámci projektu podporovaného EU AIR2-CT941345, tento enzym se přirozeně vyskytuje v A.niger a může se z A.niger získat za pomoci běžných způsobů izolace enzymu a technik čištění, na jejichž popisy jsme již dříve odkázali.

Aktivita polygalakturonázy

Aktivita PG se měřila následujícím způsobem: přidalo se 260 μΐ roztoku polygalakturonové kyseliny (poly-Dgalakturonová kyselina (C₆H₈O6) _n ca 150 USB) k 210 μΐ 50 mM octanu sodného a teplota výsledného roztoku se upravila na 30 °C. Potom se přidalo 50 μΐ analyzovaného enzymu. Směs se opatrně míchala. Po 0, 1, 2, 3, 4, a 5 minutách se odebralo 50 μΐ vzorku. Reakce se ihned zastavila pipetováním vzorku do 1 ml Na2CO3 (26,5 g/1). Po opatrném protřepání vzorku se přidalo 0,5 ml roztoku neucoproinu (400 mg hydrochloridu neucoproinu CR, C14H13CIN2I + 200 mg CuSO₄.5H₂O v 1 litru vody prošlé ionexem). Vzorek byl 15 minut inkubován při ucpiotě 65 ⁰C7 a ponechán 15 minut přl· pokojové teplotě>. Potom se preparát vpravil do kyvety a při 460 nm se měřila absorbance proti vzorku odebranému v minutě 0. Pro stanovení množství redukujících koncových skupin v μπιοί se připravila standardní křivka z roztoku D-galakturonové kyseliny (8,57 mg/ml). Alikvoty roztoku galakturonové kyseliny v množství 0, 15, 30, 45 a 60 μΐ se zředily s 50 mM octanu sodného na 1 ml. Potom se 50 μΐ všech vzorků upravilo podle popisu uvedeného výše od slov Reakce se ihned zastavila.... Standardní křivka se konstruovala vynášením pmol galakturonové kyseliny proti absorpci měřené při 460 nm. Aktivita se vyjádřila jako

AU (jednotka) = pmol vytvořených redukujících koncových skupin x min^_1/ml

Úprava pomoci PG před chromatografickou analýzou

250 mg pektinu určeného k analýze se navlhčilo 40 μΐ ethanolu a rozpustilo, v 50 ml vody po“ výměně iontů za

9 99

9 9

99 9

9

9 9 ·· ··· mícháni magnetickým michadlem a při teplotě 70 °C. Vzorek pektinu se ochladil na 40 °C a pH se upravilo na 4,2. Potom se 1,5 ml pektinového preparátu přidalo k 3,5 jednotkám PG1. Vzorek se 30 minut inkuboval při 40 °C za trvalého mícháni. Reakce se zastavila přidáním 70 μΐ HNO₃ a zahřívala 10 minut při 80 °C.

Chromatografická analýza

Produkty enzymatického rozkladu pektinu získané úpravou pektinu pomocí PG se analyzovaly dle popisu Daase, P.J.H. a dalších s malými modifikacemi, jak je popsáno níže.

Použil se systém vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) DX-500 firmy Dionex (Sunnyvale, Ca, USA) vybavený čepadlem pro čtyřsložkový gradient GP40, automatickým dávkovačem vzorků AS3500 a modulem pro odplynění eluentu . heliem. Detekce se prováděla systémem kombinujícím smíšení, výtoku z kolony s NaOH a detekci v elektrochemickém detektoru Dionex ED40 s ampérometrickou celou. Detektorpracoval v režimu pulzní ampérometrické detekce (PAD) a-byl vybaven zlatou měrnou elektrodou a referenční elektrodou Ag/AgCl. Systém přípravy výtoku k detekci sestával z čerpadla DQP-1, průtočného tlumiče pulzů a ochranné kolony (GM-3). Výstup byl napojen pomocí kapilární T-spojky na výtok z chromatografické kolony a míchán ve směšovací kapilární spirále objemu 1500 μΐ. Po smíchání eluátu s hydroxidem sodným (2,5M) se vzorek uvedl do detektoru PAD. Chromatogramy se zaznamenávaly pomocí softwaru Dionex Peak Net software verze 4.11. Oligomery se oddělily v koloně Dionex CarboPac PA Γ s předkolonou CárboPac PA-1. Eluce se prováděla s lineárním gradientem počínáje Ch, 05-0,7M octanem sodným (pH 5,0) při rychlosti 0,5 ml/min pod dobu 65 min, následoval lineární gradient s 1M octanem sodným po dobu 10 min a stupeň promývání s 0,5 ml. Po stupni ekvilibrace s 0,05M octanem sodným během 15 minut při pH.5,0 se

# #· ·· *

Μ t t · · ·· • · · · « • · · · · 9 • · * · « «<··««· ·· ·* · injektovalo 80 μΐ vzorků. Pak se nastavilo čerpadlo za kolonou tak, aby finální průtoková rychlost na celu PAD byla 1,0 ml/min.

Acetátový pufr se připravil zředěním octové kyseliny vodou, úpravou 50% roztokem hydroxidu sodného na pH 5,0 a úpravou objemu vodou na konečnou koncentraci l,0M octanu. Gradient se zajistil smíšením acetátového pufru s vodou z Milipore systém.

Sled trojitých impulzů užívaný pro ampérometrickou detekci zahrnoval následující potenciály a doby: E_x = 0,05 V (ti = 0,4 s), E₂ = 0,75 V (t₂ = 0,2 s) a E₃ = -0,15 V (t₃ = 0,4 s). Integrace za 0,2 s po prodlevě 0,2 sekund.

Pro kvantitativní stanovení detekovaného množství neesterifikované kyseliny monogalakturonové, digalakturonové a trigalakturonové bylo třeba stanovit koeficienty odezvy PAD těchto složek (viz Hotchkiss A.T. a další,

Anal. Biochem. , 184,. s. 200-206 (1990)’. Nejdříve se získaly plochy píků různých množství dimerů a trimerů (0,05-2,5 μιηοΐγ) a srovnaly se s plochami píků- identických množství monogalakturonové kyseliny. Vypočítaly se příslušné koeficienty odezvy. V každé řadě se stanovila plocha odezvy PAD standardního množství monogalakturonové kyseliny (0,051 μη) pro usnadnění přesného výpočtu koncentrací mono-, di- a trigalakturonové kyseliny v každé řadě. Z množství mono-, di- a trigalakturonové kyseliny se vypočítal stupeň shlukování za pomoci vzorce pro %DB uvedeného výše.

Molekulová hmotnost (MW)

Hmotnostně průměrná molekulová hmotnost pektinu se může pohybovat v širokých mezích podl-e jeho zdroje a způsobu extrakce. Pro účely tohoto vynálezu má pektin použitý jako primární materiál obvykle molekulovou hmotnost nižší než asi 240 000 a výhodně je v rozmezí od asi 100 000 do asi

		φ *·		•
	··		·· * o	Λ ·	• ·
	•	•	• ·	f *	•
15	• •	• · •	• · • ·	• ·	9 •
	···	a	<»* · »··	e·

000. (Pokud se výslovně neuvádí jinak, rozumějí se zde uváděné molekulové hmotnosti v Daltonech). Po enzymatické úpravě je ovšem molekulová hmotnost upraveného pektinu nižší než molekulová hmotnost vybraného primárního materiálu a obecně bývá v rozmezí od asi 40 000 do asi 200 000 Daltonů. Zdá se, že pod molekulovou hmotností asi 40 000-50 000 je účinnost upraveného pektinu podstatně snížená a že trochu snížená, ale ještě použitelná je v rozmezí od asi 40 000 50 000 do asi 70.000. Preferované rozmezí molekulové hmotnosti pektinu podle tohoto vynálezu je od asi 70 000 do asi 90 000.

Příprava pektínového vzorku

Molekulová hmotnost pektinu se stanoví měřením relativní viskozity 0,1% pektínového roztoku pomocí hexametafosfátu sodného. Nejprve se připraví vzorek podle popisu v odstavci týkajícím se stanoveni %DE. Roztok hexametafosfátu sodného se připraví rozpuštěním. 20,0 g hexametafosfátu sodného v 1800 ml vody z ionexu odvzdušněné varem, nastavením pH na 4,50 ± 0,05 pomocí 1M HC1 a zředěním na 2000 deionizované varem odvzdušněné vody. Těsně před měřením še potřebné množství roztoku hexametafosfátu zfiltruje přes filtr č. 3. Potom se do vytárované kádinky naváží asi 90 g roztoku hexametafosfátu sodného a vloží se do ní magnet.

Potom, se postupně a za míchání do kádinky přidá 0,1000 g pektinu promytého kyselinou. Roztok se zahřeje za míchání na 70 °C a míchání pokračuje do úplného rozpuštění pektinu. Potom se roztok ochladí na 25 °C, přídavkem roztoku hexametafosfátu sodného se jeho hmotnost zvýší na .100,0 g a

- zfiltruje se přes filtr č. 3. . ; Měření molekulové hmotnosti Při stanovení molekulové hmotnosti se na dvou rozdílných viskozimetrech měří doby průtoku roztoku pektin/hexametafosfátu za použití procedury uvedené níže.

Molekulová hmotnost se vypočítává odděleně pro každý viskozimetr na základě měřeni průtokové doby roztoku hexametafosfátu daného viskozimetru. Je-li rozdíl mezi dvěma vypočtenými molekulovými hmotnostmi menší než 3 500, vypočítá se střední hodnota a zaokrouhlí se na nejbližší násobek 1000. Je-li rozdíl mezi dvěma vypočítanými molekulovými hmotnostmi 3 500 nebo více, viskozimetry se vyčistí a provede se nové měření průtokových dob roztoku hexametafosfátu.

Pro změřeni doby průtoku se viskozimetr dvakrát vypláchne vzorkem. Potom se do viskozimetru vlije 5,00 ml vzorku a viskozimetr se umístí do vodní lázně vybavené termostatem nejméně 15 minut před měřením při 25,0 °C ± 0,3 °C. Doba průtoku se měří na dvou průtocích. Je-li rozdíl mezi těmito hodnotami větší než 0,2 sekundy (měři-li se roztok hexametafosfátu), nebo větší než 0,4 sekundy (měři-li se vzorky), měření se opakují až je rozdíl menší než přípustná hodnota.- Doba průtoku použitá pro stanovení molekulové hmotnosti j_e střední hodnota mezi výše zmíněnými identickými nebo v zásadě identickými výsledky měření.

Relativní viskozita se vypočítá následujícím způsobem: í K 1 to-l t_o J n_r = ----------ί κ ] t_h-l th J kde tý je doba průtoku pektinu a t_h doba průtoku roztoku hexametafosfátu.

Parametr K se' může pro Witeg-Ostwaldův viskozimetr s postačující přesností stanovit jako 107 s². Jinak lze K vypočítat takto:

Qxt²v

K = ---------------------Q + (0,226 x Lxt_v) kde Q = objem baničky viskosimetru v cm³, L = délka kapilární trubice v cm a t_v = doba průtoku vody v sekundách.

Molekulová hmotnost pektinu se vypočítá takto:

(n_r ^1/p - 1)

M = -------------- X P k x C kde P je fixně 6 a k je fixně 4,7 x 10”⁵ rnol.g'¹; C je obsah pektinu v % hmotnostních ve vzorku. Po vložení číselných hodnot získáváme:

M = 1,277 . 10⁶(n_r ^1/6 - l)g/mol.

Citlivost vůči vápníku (ÁCS)

- Citlivost - zpracovaného pektinu vůči vápníku se-pomocí tohoto vynálezu podstatně sníží, což překvapuje zvláště proto, že DB zůstane v zásadě stálý. Jak se podrobněji vysvětluje níže, citlivost vůči vápníku představuje rozdíl ve viskozitě mezi referenčním roztokem obsahujícím pektin bez vápníku a roztokem obsahujícím pektin s vápníkem, který se proto může označovat jako ÁCS. Pektin podle vynálezu má ÁCS menší než asi 100, výhodně menší než asi 20, například v rozmezí od asi 5 do asi 10 a výhodně je kolem 0. ÁCS výchozího primárního materiálu může mít jakoukoliv hodnotu vískozity nad 20 a'může být velmi vysoká, například větší než asi 300 nebo dokonce větší než asi 500.

Citlivost pektinu vůči vápníku se měří v roztoku obsahujícím 0,5 % pektinu, výhodně čistého pektinu. Vápenatá sůl a pektin se smísí při nízkém pH, aby se předešlo

intenzivní interakci vápenatých iontů a pektinu. Potom se reakce pektinu a vápenatých iontů odstartuje přídavkem pufru octan sodný/kyselina octová. Viskozita roztoku pektinu obsahujícího vápník se srovná s viskozitou téhož roztoku bez vápníku a rozdíl viskozit je citlivost vůči vápníku nebo ACS, měřená v centipoisech.

Přesněji se připraví 400 g roztoku obsahujícího 2,4 g pektinu (0,6% roztok). Pokud se nepoužívá čistý pektin, je třeba složení roztoku korigovat použitím množství pektinu vypočítaného podle vzorce

0,6 x 400

A kde A je obsah pektinu v % ve vzorku.

Množství testovaného, pektinu (2,4 g je-li čistý, júnak vypočítaného -jak uvedeno výše) se odváží s přesností na tři desetinná místa. Pektin se disperguje ve vroucí deionizované . vodě míchadlem s velkým střihovým napětím (Waring Blender Model ..34BL-99, .Waring Product Division Dynamic Corpojzation of ._ America, New Hartford, Connecticut) asi 4 minuty při vysoké rychlosti. (Veškerá zde použitá deionizovaná voda je voda prošlá ionexem s vodivostí nižší než 1,0 μβ/οιη.) Rozmíchaný roztok pektinu se vlije do vytárované kádinky a vloží se magnet před mícháním magnetickým míchadlem JK IKA-Combimag REO (Janke and Kunkel (IKA), Staufen, SRN). Míchadlo s vysokým střihovým napětím se vypláchne dalšími 100 ml deionizované vody, jež se přidá k roztoku pektinu v kádince. Roztok se ochladí na 25 °C ± 1 °C a potom se pH upraví na 1,5 pomocí 1M chlorovodíkové - kyseliny za mícháním Přidá se další deionizovaná voda .pro zvýšení hmotnosti roztoku na 400 g a do každé ze dvou viskozimetrických skleněných nádob (Holm and Halb) rozměrů 50 x 100 mm se odváží 145 g ± 1 g roztoku pektinu. Do každé z těchto viskozimetřiekých nádob • · · · • ·

se vloží magnet. Do jedné z nich se vnese 5 ml deionizované vody a do druhé 5 ml 250 mM Ca⁺⁺ roztoku (36,7550 g/1 CaCl₂ , 2H₂O) , v obou případech za míchání magnetickým míchadlem IKA MAG EOA 9 na 1. stupni. Potom se do každé viskozimetrické nádoby přidá 25 ml 1M acetátového pufru (68,04 g/1 500 mM CH₃COONa, 3H₂O a 28,6 ml/1 500mM CH₃COOH, 100%) za intezivniho míchání magnetickým míchadlem IKA MAG RET. Míchání pokračuje 2 minuty na 1. stupni, pak se magnety odstraní a roztoky se přikryjí folii Parafilm® a ponechají v klidu přes noc při 25 °C. Potom se měří viskozita viskozimetrem Brookfield LVT při 60 otáčkách/min stále v termostaticky kontrolované vodní lázni při teplotě 25 °C. Rozdíl mezi viskozitami obou roztoků v centipoise je citlivost vůči vápníku daného pektinu označovaná ÁCS.

Pektiny podle vynálezu se mohou vyrobit úpravou primárního pektinu pektinlyázou za podmínek postačujících k tomu,- aby se získal pektin s potřebnými, vlastnostmi, jak se popisuje dále. Způsob přípravy pektinů podle vynálezu podstatně neovlivňuje stupeň'shlukováni nebo stupeň ester-ifik-ace primárních materiálů. Protože_ĎB se. týká toho, jak jsou kyselé skupiny uspořádány podél základního řetězce pektinu a koncentrace kyselých skupin je ve vztahu k citlivosti k vápníku, je velmi překvapivé, že citlivost vůči vápníku může klesnout bez změny DB.

Zdá se, že rozhodující význam nemá ani druh pektinlyázy použité při této modifikaci, ani zdroj pektinu použitého jako primární materiál, takže se mohou zvolit nebo korigovat jako rutinní předmět optimalizace procesu. Pektinlyázy jsou dobře známé a i když lze vycházet i z jiných zdrojů, obvykle se získávaj-í z Aspergillus nigeř, obsahujících více variant lyáz; viz například Van Houdenhoven, F.E.A., Studies on Pectin Lyase, Ph.D.Thesis, Wageningen Agricultural University, The Nederlands, 17 (1975); a Kusters-Van

Someren, M.A., Characterization of an Aspergillus niger

Pectin Lyase Gene Family, Ph.D.Thesis, Statě University Utrecht, The Netherlands (1991), jejichž popisy jsou zde zahrnuty ve formě odkazů. Přítomnost nečistot a zvláště biologicky aktivních nečistot v preparátech lyázy snižuje možnost uskutečnit tento proces a získat pektiny podle tohoto vynálezu, a proto se může používat jen lyázových preparátů získaných v principiálně čisté formě nebo se přečistí tak, aby v zásadě dosáhly homogenity.

Jak již bylo dříve uvedeno, pektin je obsažen v mnoha rostlinných zdrojích, z nichž jej lze extrahovat. Zahrnují poměrně běžné obchodně dosažitelné zdroje jako citrony, limety, pomeranče, grepy, jablka a cukrovku.

Příklady provedeni vynálezu

Enzymy

Bylo použito čtyř různých enzymových, preparátů obsahujících pektinlyázu (PL, E.C. 4.2.2.10). Preparát A byl pektinlyá.za A (PÍ A) získaný z Aspergillus niger a preparát B byl pektinlyáza D (PL D) rovněž získaný z A. niger. I~když byly vzorky PL A a PL D použité v následujících příkladech připraveny klonováním v rámci projektu AIR2-CT941345 sponzorovaném EU, tyto enzymy se vyskytují v A. niger přirozeně a lze je z A. niger izolovat za pomoci běžných izolačních a purifikačních technik, jak je například popisuje Van Houdenhoven. Enzym je třeba přečistit tak aby byl v podstatě homogenní v zájmu maximalizace aktivity a aby nedošlo ke kontaminacím a/nebo nežádoucím postranním reakcím, k nimž může dojít u nečistých preparátů.

Preparát C byl komerční plísňový enzymatický preparát prodávaný jako Pectinase 444 L firmou Biocatalysts, UK, -zatímco přípravek D byl komerční enzymatický preparát prodávaný jako Rohapect PTE, připravovaný firmou Róhm, SRN, z geneticky modifikovaných organismů (Aspergillus

species) .

Aktivita enzymu

Enzymové přípravky A až D se testovaly na PL aktivitu.

PL katalyzuje nehydrolytické štěpení pektinu transeliminačním štěpením základního řetězce polymeru na C4 a zároveň eliminuje H z C5, čímž vzniká dvojná vazby mezi C4 a C5, což vede ke zvýšení absorbance na 235 nm. Proto se aktivita pektinlyázy testovala spektrofotometricky při 30 °C měřením vzrůstu optické hustoty na 235 nm. Testovaná směs obsahovala 1,4 ml Mcllvainova pufru (36,85 mM kyseliny citrónové, 126,3 mM NaHzPCh, pH upraveno na 5,5 pomocí 0,5N NaOH), 0,4 ml 0,0625% pektinu (formulace B-rapid s DE 72 %, Copenhagen Pectin A/S, Dánsko) a 0,2 ml enzymu. Aktivita se vypočítala pomocí koeficientu molární extinkce Σ235 5500. Jedna jednotka aktivity (1U) se definovala jako množství enzymu jež vytvoří 1 pmol nenasyceného produktu za minutu.

Pokud se zde popsané procedury odvolávají na vhodné množství pektinlyázy (nebo termín s podobným významem), jde o množství vypočítané na základě cílové molekulové hmotnosti pektinu modifikovaného lyázou a specifické aktivity použité lyázy. Množství enzymu, jež je třeba užít, je dáno rovnicí _e(y-a/b> _{= χ}, y j_e snížení molekulové hmotnosti (proto

AMW) a x je množství pektinu v g. V této rovnici je jednotkou procesní doby při úpravě benzinu jedna hodina; a a b jsou konstanty specifické pro enzym, jež se stanoví po provedení několika zkoušek s daným enzymem.

Enžymatická úprava

Enzymatické úpravě pektinu preparáty obsahujícími PL se podrobily tři různé primární materiály; šťáva získaná ze sušené kůry extrakcí HM, šťáva upravovaná rostlinnou methylesterázou (PME) a sušený pektinový prášek.

Šťáva ze sušené kůry získaná extrakcí HM

Sušená kůra z citronů v množství 600 kg se přidala k 1700 1 vody po průchodu ionexem. Materiál se zahřál na 70 °C a míchal 2 hodiny; potom se přidalo 98 1 62% HNO₃ a 1 hodinu se prováděla extrakce. Potom se k extrahovanému materiálu přidalo 103 kg papírové buničiny pro usnadnění filtrace. Preparát se zfiltroval vakuově a pomocí infuzóriové hlinky. Zfiltrovaná šťáva se podrobila výměně iontů na silném ionexu (IRC 120, 3ayer Corporation); odpařila se na asi 50 % původního objemu, což vedlo ke koncentraci pektinu od asi 3 % do asi 5 % hmotnostních na bázi hmotnosti sušiny; ochladila se na teplotu místnosti. PH se upravilo na 5,5 přídavkem NH₃ (2% roztok, zředěný deionizovanou vodou z 25% roztoku NHj) a přidalo se vhodné množství PL.

Enzymatická reakce trvala, dokud se nedosáhlo požadované molekulové hmotnosti. Pro zastavení reakce se pH snížilo na 2,5 přídavkem zředěné HNO₃ (-10% obj./obj.) a teplota se na 10 minut zvýšila z pokojové teploty na 80 °C za pomoci topného pláště. Pektin se vysrážel v 80% 2propanolu -při poměru 1:3. Vysrážený pektin se lisoval a promýval v 60% 2-propanolu. Po vylisování se pektin sušil 16 až 20 hodin při 70 °C. Vysušený vzorek se mlela proséval zkušebním sítem s velikostí oka 0,25 mm.

Štáva upravená PME

Sušená citrónová kůra v-množství 1 300 kg se přidala k 25 500 1 vody prošlé ionexem a 126 1 62% HNO₃. Extrakce probíhala 7 hodin. K extrahovanému materiálu se přidalo 100 kg papírové buničiny pro usnadnění filtrace. Materiál se vakuově zfitroval a následovala filtrace přes infuzóriovou hlinkuFiltrovaná.štáva se podrobila výměně iontů silným ionexem (IRC 120).); odpařila se na asi 50 % původního objemu, ccž vedlo ke koncentraci pektinu od asi 3 % do asi 5 % hmotnostních na bázi hmotnosti sušiny; ochladila se na 45 °C a pH se upravilo na 5,5 přídavkem 2% NH₃.

• · 9 ·

*

9 9 9 9 *

9 9

Přidalo se vhodné množství PME a reakce probíhala do dosažení potřebného stupně esterifikace. Požadovaný stupeň esterifikace se stanovil ze vztahu y = l,6x, kde y je změna %DE (proto A%DE) a x je množství NH3 v gramech na kg pektinu (g Ní^/kg pektinu). Během reakce se pH udržovalo na konstantní hodnotě automatickou titrací 2% NH₃. PME se dezaktivovala přídavkem HNO₃ do dosažení pH 2,5 a zahříváním na 80 °C po dobu 10 minut. Po ochlazení na pokojovou teplotu se pH upravilo na 5,5 přídavkem 2% roztoku NH₃ (obj./obj.) a přidalo se vhodné množství PL. Enzymatická reakce se nechala v běhu dokud se nedosáhlo požadované molekulové hmotnosti. Pro zastavení reakce se pH snížilo na 2,5 přídavkem zředěné HNO₃ a teplota se na 10 minut zvýšila z pokojové teploty na 80 °C. Pektin se vysrážel v 80% 2-propanolu při poměru 1:3. Vysrážený pektin se lisoval a promýval v 60% 2-propanolu. Po vylisování se .pektin sušil 16 až 20 hodin při 70 °C. Vysušený vzorek se mřel a prošéval zkušebním sítem s velikostí oka 0,25 mm.

Sušený pektinový prášek

500 g pektinu se při 70 °C rozpustilo v 10 1 vody prošlé ionexem za intenzivního míchání.Potom se pektinový roztok ochladil na teplotu místnosti a pH se uzpravilo na 5,5 přídavkem 2% NH3. Přidalo se vhodné množství PL a enzymatická reakce se nechala proběhnout do dosažení potřebné molekulové hmotnosti. Pro zastavení reakce se pH snížilo na 2,5 přídavkem zředěné HNO3 a teplota se na 10 minut zvýšila z pokojové teploty na 80 °C. Pektin se vysrážel v 80% 2-propanolu při poměru 1:3. Vysrážený pektin se lisoval a promýval v 60% 2--propanolu. Po vylisování . se pektin sušil 16 až 20 hodin při 70 ČC. Vysušený vzorek se mlel a prošéval zkušebním sítem s velikostí oka 0,25 mm.

Výsledky jsou uvedeny níže:

Příklad 1 - PL D

Látka	DB	DE	Acs	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
Výchozí pektin	13	72	298	144	169	148	88
PL D-1A	13	72	1	81	101	66	65
PL D-2A	13	72	1	67	94	0	0
PL D-3A	13	72	2	42	48	0	0
PL D-4A	13	72	1	34	SEP	SEP	SEP
PL D-5A	13	72	2	25	SEP	SEP	SEP

Příklad 2 - PL A

Látka	DB	DE	Acs	MW	YOG C	VIS c	YOG/VIS
Výchozí pektin	13	72	298	144	169	148	88
PL A-1A	13	71	90/ .	108„ 5	142	70	49 -
PL A-2A	13	71	30 '	95	88	63	7 2
PL A-3A	13	72 --	6	94,5 .	84 .	42	50 '
PL A-4A	13	72	1	71,5	37	0	0
PL A-5A	13	72	0	41,5	SEP	SEP	-SEP

Příklad 3 - 444L

Látka	DB	DE	ÁCS	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
Výchozí pektin	13	72	298	144	169	148	88
444L-1A	13	71	14	106	126	104	82
444L-1A	13	72	3	96	112	94	83
444L-1A	13	71	1	83	96	52	54
444L-1A	13	72	2	70	75	39	5.2
444L-1A	13	72	3	70	72	35	49P

Příklad 4 - PTE

Látka	DB	DE	ÁCS	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
Výchozí pektin	13	72	298	144	169	148	88
PTE-1A	13	71	18	102	117	91	78
PTE-2A	13	72	18	99	109	78	72
PTE-3A	13	72	10	71	75	52	69
PTE-4A	13	70	3	66	49	55	112
PTE-5A	13	72	1	48	SEP	SEP	SEP
PTE-6A	13	71	1	37	SEP	SEP	SEP

Třebaže se těchto výsledků docílilo enzymatickou úpravou, lze docílit srovnatelných výsledků i chemickou úpravou, při níž by se nezměnilo %DE a %DB primárního pektinu. Jmenovitě lze použít každé chemické úpravy vedoucí ke štěpení 1,4-glykosidické vazby cestou beta-eliminace k přípravě pektinu s vlastnostmi srovnatelnými s pektinem vyrobeným výše popsaným enzymatickým působením. Například působení na roztok pektinu alkalickým činidlem jako je NaOH po zvýšení pH roztoku nad 7 by muselo poskytnout podobné výsledky.

Bylo potřebné popsat zde tento vynález ve vazbě na určité specifické metody a materiály. Výčet těchto způsobů a materiálů byl však jen ilustrativní a neměl nikterak omezovat rozsah tohoto vynálezu. Lze očekávat, že odborníci v oboru mohou zjistit a uskutečnit varianty nebo alternativy zde popsaných specifických instrukcí aniž by překročili rozsah vynálezu.

Claims

1. Pektin, vyzná shlukování je nejméně asi č u j i

10 %, se t asi % a ÁCS není větší m, m, m, m, m, m, m, m,

Pektin že nemá

Pektin i m, stupeň esterifikace nejméně než asi 100 centipoise.

podle nároku 1, v

ÁCS větší než asi podle nároku

2, v

ÁCS větší než asi podle nároku 3, v

ÁCS větší než asi podle nároku 4, v

ÁCS větší než asi “podle nároku- 5, v že stupeň že~má ÁCS asi

Pektin podle

30 centipoise

20 centipoise

10 centipoise

0 centipoise nároku

3, v y centipoise.

že má ÁCS mezi asi 0

Pektin podle nároku že má ÁCS mezi asi 0

Pektin podle nároku centipoise centipoise

Ir že má stupeň shlukování v y z n nejméně asi asi

20 centipoise.

jící se

10 centipoise.

asi 20 ící se

10. Pektin podle nároku 1 m, že má stupeň shlukování v y z n a č u nepřekračuj ící j .1 c i se asi 30 %.

···♦

11. Pektin podle nároku 10, vyznačuj ící s e tím, že má stupeň shlukování mezi asi 15 % a asi 25

O.

o ·

12. Pektin podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že má stupeň esterifikace nejméně asi 60 %.

13. Pektin podle nároku 12, vyznačuj ící se t i m, že má stupeň esterifikace nejméně asi 70 %.

14. Pektin podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že má stupeň esterifikace nejméně asi 80 %.

15. Pektin podle nároku 1, v y z n a č u j i c i s e t i m, že má stupeň esterifikace mezi asi 55 % a asi 80 % • 16. Pektin podle nároku 15, v y z n a č u j i c i s e t i m, že má stupeň esterifikace mezi asi 60 % a asi 72 % - -

Pektin podle nároku 1, vyznačující m, že má molekulovou hmotnost nejméně asi

40 000.

Pektin podle nároku 17, v y z m, že má molekulovou hmotnost nejméně asi

50 000.

19.

Pektin podle nároku 18, v y z m, že má molekulovou hmotnost nejméně asi

70 000.

Pektin podle nároku 19, vy z m, že má molekulovou hmotnost nejméně asi

200 000.

21.

Pektin podle nároku 1.7, v y z • · ♦ · se t í m, že má molekulovou hmotnost mezi asi 50 000 a asi

200 000.

22. Pektin podle nároku 21, vyznačuj lei se t i m, že má molekulovou hmotnost mezi asi 70 000 a asi 90 000.

23. Pektin podle nároku 1, vyznačující se tím, že má stupeň shlukování mezi asi 10 a asi 15, stupeň esterifikace mezi asi 70 a asi 75 a ACS není větší než asi 18.

24. Pektin podle nároku 23, vyznačuj ící tím, že má ACS nepřekračující asi 14.

25. Pektin podle nároku 24, vyznačuj ící tím, že má ACS nepřekračující asi 10.

26. Pektin.podle nároku 25, •n ač

c.

.i m, že má ACS nepřekračující asi 6.

27. Pektin podle nároku 26, m, že má ACS nepřekračující asi 3.

28. Pektin podle nároku 27, m, že má ACS nepřekračující asi 2.

29. Pektin podle nároku 28, m, že má ACS nepřekračující asi 1.

30. Způsob přípravy m, že uvedený proces pektinu, .který má stupeň pektinu, v y z n a č u zahrnuje stupeň úpravy shlukování nejméně asi j primárního

10 %, stupeň ící • ·· · esterifikace nejméně asi 55 % a ACS větší než asi O centipoise, pektinlyázou v podmínkách postačujících k přípravě zpracovaného pektinu s ACS nižším než je ÁCS uvedeného primárního pektinu.

31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má stupeň shlukování nejméně kolem 20 %.

32. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má stupeň shlukování nepřekračující asi 30 %.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má stupeň shlukování mezi asi 15 % a asi 25 %.

34. Způsob podle nároku 30, vyznačující s .e tím, že uvedený primární pektin má stupeň esterifikace nejméně asi 55 %. “

35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má stupeň esterifikace nejméně asi 70 %.

36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má stupeň esterifikace nejméně asi 80 %.

37. /Způsob podle nároku 30, v y z n a. č ú. j 'i c i se tím, že uvedený primární pektin má stupeň esterifikace mezi asi 55 % a asi 80 %.

38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se · • ·

4 · • Φ * * · ·· · • · · * · • « • · tím, že uvedený primární pektin má mezi asi 60 % a asi 72 %.

39. Způsob podle nároku 30, v y m, že uvedený primární pektin má

40. Způsob podle nároku 39, v y m, že uvedený primární pektin má

41. Způsob podle nároku 40, v y m, že uvedený primární pektin má

42. Způsob podle nároku 41, v y m, že uvedený primární pektin má

43. -Způsob podle nároku 3Ό, v y stupeň esterifikace

z n a č u j i c í s e ÁCS nejméně asi 20. z n a č u j i c i s e ÁCS nejméně asi 200. z n a č u j i c i s e ÁCS nejméně asi 300. z n a č u j i c i s e ÁCS nejméně asi 500. z n a č u j i c i s e

nepřekračuj ící

ÁCS asi m, že uvedený zpracovaný pektin má

20 centipoise.

44. Způsob podle nároku-43, v y z asi m, že uvedený zpracovaný

10 centipoise.

pektin má

ÁCS nepřekračuj ící asi

45. Způsob podle nároku m, že uvedený zpracovaný

5 centiooise.

m,

47. Způsob podle nároku m, že uvedený zpracovaný

44, v y z pektin má

ÁCS nepřekračuj ící

4 5, v y z n a č u pektin má ÁCS asi’ 3.0,. v y z n a č u pektin má ÁCS mezi

j centippise.

j asi 0 ící se ící s ·<

centipoise a asi 20 centipoise.

48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že uvedený zpracovaný pektin má ÁCS mezi asi 0 centipoise a asi 10 centipoise.

49. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má molekulovou hmotnost nepřekračující asi 240 000.

50. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má molekulovou hmotnost nepřekračující asi 150 000.

51. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že uvedený primární pektin má molekulovou hmotnost nejméně asi' 100 000. - ' ~

52. Pe'ktin vyrobený způsobem podle nároku 3Ό.

53. Způsob přípravy pektinu, vyznačující se t i m, že uvedený způsob zahrnuje stupně

a) úpravy pektinu se stupněm shlukování nejméně asi 10 %, stupněm esterifikace nejméně asi 70 % a ÁCS větším než asi 0 centipoise rostlinnou pektinmethylesterázou v podmínkách postačujících k tomu, aby vznikl deesterifikovaný pektin se stupněm shlukování nejméně asi 10 %, stupněm esterifikace nejméně asi 55 % a ÁCS větším než asi 0, a

b) úpravy uvedeného deestrifukovaného pektinu pekti-nlyázou v podmínkách postačujících k tomu, aby vznikl pektin se stupněm shlukování nejméně asi 10 % a ÁCS nepřekračujícím asi 20 centipoise.

* * « 4 · • • 4 • W ·· · ® 4 · • 4 4 • 4 4 · • · • · 4 4 ® • 9 4 4 4 • 4 4 4 » · · 4 · · • · • 4

54. Pektin připravený způsobem podle nároku 53.

55. Jedlá kompozice, vyznačující se tím že obsahuje pektin se stupněm shlukování nejméně asi 10 %, stupněm esterifikace nejméně asi 55 % a ACS nepřekračujícím asi 100 centipoise.

56. Jedlá kompozice podle nároku 55, vyznačující se tím, že dále obsahuje kasein.

57. Jedlá kompozice podle nároku 56, vyznačující se tím, že uvedená jedlá kompozice je nápoj.

58. Jedlá kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že uvedený nápoj je okyselený mléčný nápoj.

59. Jedlá kompozice podle nároku 55, vyznačující se ti m,- že uvedený pektin má ACS nepřekračující asi 20 centipoise.

60. Jedlá kompozice podle nároku 55, vyznačující se tím, že uvedený pektin má stupeň shlukování mezi asi 15 % a asi 25 %.

61. Jedlá kompozice podle nároku 55, vyznačující se tím, že uvedený pektin má stupeň esterifikace mezi asi 60 % a asi .72 % ..

62. Jedlá kompozice podle nároku 55, vyznačující se tím, že uvedený pektin má molekulovou hmotnost mezi asi 70 000 a asi 90 000.

0 ···· • *· ·· • • · • • 0 · · 4 • ® · • • « * • 0 • • 0 • 4 • ® • • • • • 0 • 0 0 • 0 « 0 000 000« «0

63. Způsob zvýšeni skladovatelnosti jedlé kompozice, vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje formulování uvedené jedlé kompozice s pektinem, který má stupeň shlukování nejméně asi 10 %, stupeň esterifikace nejméně asi 55 % a ACS nepřekračující 100 centipoise.