KR100791157B1

KR100791157B1 - 칼슘 감수성이 감소된 펙틴

Info

Publication number: KR100791157B1
Application number: KR1020017012395A
Authority: KR
Inventors: 카린 마이어 한손; 플레밍 묄러
Original assignee: 씨피 켈코 에이피에스
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2008-01-02
Also published as: BR0009496A; ES2241595T3; EP1171473A1; RU2001128764A; TW499689B; DK1171473T3; ATE299152T1; DE60021181T2; JP2002540258A; AU3915000A; WO2000058367A1; TWI252235B; MXPA01009799A; CN1352653A; CZ20013511A3; EP1171473B1; KR20020001807A; DE60021181D1

Abstract

본 발명은 약 10% 이상의 블록화도, 약 55% 이상의 에스테르화도 및 약 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약 10% 이상의 블록화도, 약 55% 이상의 에스테르화도 및 약 0 센티포이즈를 초과하는 ΔCS를 가진 출발 펙틴을 그 출발 펙틴의 ΔCS 보다 낮은 ΔCS를 갖는 가공 펙틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 펙틴 리아제로 처리하는 단계를 포함하는 펙틴의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따라서 그러한 펙틴을 함유하는 식용 조성물, 및 그 조성물을 그러한 펙틴과 함께 조제하여 식용 조성물의 저장 안정성을 증가시키는 방법이 제공된다.

Description

칼슘 감수성이 감소된 펙틴 {Pectin Having Reduced Calcium Sensitivity}

본 발명은 바람직하지 않은 점도 증가 없이 단백질의 안정화를 제공하는 펙틴에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 칼슘에 대해 비교적 낮은 감수성을 가지면서 단백질 안정화를 제공하게 하는 효소적 또는 화학적 수단에 의해 처리된 펙틴에 관한 것이다.

펙틴은 적절한 식용 식물 재료, 일반적으로 감귤류 과일 또는 사과의 수성 추출에 의해 얻어지는 정제된 탄수화물 생성물이다. 예를 들면, 펙틴은 약산성 조건 하에서 감귤류 껍질 또는 사과즙을 짜고 난 찌끼로부터 상업적으로 추출될 수 있다. 전형적인 펙틴 제조는 3 내지 4가지의 주요 단계, 즉 식물 재료로부터 추출, 추출물의 정제, 정제된 용액으로부터 펙틴의 단리 및 임의로 탈에스테르를 포함한다.

화학적으로, 펙틴은 폴리갈락투론산의 메틸화 에스테르이다. 그것은 주로 선형 다당류 사슬을 형성하는 D-갈락투론산 및 갈락투론산 메틸 에스테르 단위로 주로 이루어지며, 그 D-갈락투론산 단위는 β-1,4 글리코시드 결합에 의해 함께 결합된다. 일부 중성 당, 예를 들면 람노스 및 아라비노스도 또한 일반적으로 존재한다. 폴리갈락투론산은 메틸기로 부분적으로 에스테르화되고, 유리산 기는 나트 륨, 칼륨 또는 암모늄 이온으로 부분적으로 또는 완전히 중화될 수 있다. 에스테르화도 (DE)로서 불리우는, 총 갈락투론산 기에 대한 에스테르화된 갈락투론산 기의 비는 펙틴의 특성, 특히 그의 용해성 및 겔 형성 특성에 영향을 미친다.

펙틴은 일반적으로 그의 에스테르화도에 따라서 분류되며, 이 단락에서는 2개의 주요 부류: 높은 (메틸) 에스테르 (HM) 펙틴 및 낮은 (메틸) 에스테르 (LM) 펙틴으로 구분될 수 있다. (본 발명의 논의를 위하여, 낮은 에스테르 및 낮은 메틸 에스테르는 높은 에스테르 및 높은 메틸 에스테르와 같이 상호 교환가능한 용어로서 간주될 수 있다). LM 펙틴은 카르복실산의 50% 미만이 메틸 에스테르로서 존재하는 것인 반면, HM 펙틴은 카르복실산의 50% 이상이 메틸 에스테르로서 존재하는 것이다. 이 명명법은 규제의 목적으로 FCC 정의에 의해 시행되는 것이며, 그 정의에 의하면 50% DE 이상의 임의의 펙틴은 HM 펙틴이며, 50% DE 아래의 것은 LM 펙틴이다.

HM 펙틴은 높은 가용성 고형분 및 낮은 pH의 존재 하에 대부분 쉽게 겔을 형성하는 반면, LM 펙틴은 칼슘 및(또는) 마그네슘과 같은 이가 양이온의 존재하에 특징적으로 겔을 형성한다. 겔화가 펙틴의 주요 특징이긴 하지만, 그것은 또한 식료품의 안정성을 개선시키는데 이용될 수도 있다. 펙틴은 특히 낮은 pH에서 우유 단백질과 같은 단백질을 함유하는 음료를 안정화시키는데 특별한 유용성을 갖는다. 그러한 음료의 한 부류는 발효에 의해 또는 직접 산성화에 의해 생산될 수 있는 산성화된 우유 음료이다. 이론에 기초한 것은 아니지만, 펙틴은 카제인과 같은 단백질의 표면에서 발견된 이온성 전하와 상호작용함으로써 그러한 단백질을 안정화시 키는 것으로 보인다. 안정화되지 않았을 때, 음료 중의 단백질 입자는 서로 상호작용하여 응집하여 혼탁 및(또는) 침전이 일어나게 된다. 펙틴은 펙틴 골격을 따른 음하전된 산 영역과 단백질 표면 상의 이온성 전하와의 상호작용에 의해 단백질을 안정화시킬 수 있다. 카제인이 양쪽성이기 때문에, 안정화는 펙틴 골격을 따른 음하전된 산 영역과 카제인 입자 표면 상의 음하전된 영역 사이의 칼슘 가교를 통해 일어날 수도 있다. 그러나, 낮은 pH, 예를 들면 약 pH 4.4 미만에서 카제인은 우세적으로 양 전하를 가져서 칼슘 가교는 최소가 되고 펙틴에 의한 안정화는 펙틴과 카제인 사이의 정전 상호작용의 결과로서 주로 또는 유일하게 일어난다.

식료품 생산자는 그의 제품을 제조하는 출발 물질의 상당한 변화에 직면할 수 있다. 과일 및(또는) 우유를 함유하는, 요구르트 및 음료를 비롯한 제품의 경우에, 그 변화는 가공 상의 변화, 원료의 변화 또는 둘다가 원인이 되는, pH, 단백질 농도 및 칼슘 농도의 상당한 변화를 포함할 수 있다. 전형적인 또는 표준화된 제품 조성물을 안정화시키는데 충분한 양의 펙틴에 의한 그러한 제품의 안정화는 특정 제품 조성물의 구성이 펙틴 사용량의 안정화력을 넘을 때 열등한 질 또는 심지어는 이상한 제품이 되게 할 수 있다. 이러한 위험은 펙틴에 의한 "과잉 투여"에 의해, 즉 전형적인 또는 표준 배치를 안정화하는데 이론적으로 필요한 양 보다 많은 양의 펙틴을 첨가함으로써 보상될 수 있다. 과잉투여의 양은 생산자 및 용도에 따라 변화될 수 있지만, 예를 들어 50%, 100% 또는 그 이상 만큼 아주 클 수 있다. 그러나, 특정 제품 또는 제품 배치의 pH, 고형분 및 칼슘 함량과 같은 인자에 따라서, "엑스트라" 펙틴은 때로는 과잉투여 점도로 불리우는 상당한 점도 증가를 야기시킬 수 있다. 예를 들면, 우유 고형물을 포함하거나 또는 그것을 기재로 한 제품, 예를 들면 산성화된 우유 음료는 상당한 농도의 칼슘 이온을 함유할 수도 있다. 이때, 더 양호한 안정화력을 제공하는 펙틴이 상당한 과잉투여 점도를 야기시킬 수도 있으므로 식품 생산자 또는 가공자는 딜레마에 접할 수 있다.

이 문제점을 처리하기 위한 각종 방법이 시도되거나 또는 제안되어 왔다. 아카호시 (Akahoshi) 등의 미국 특허 제5,690,975호는 칼슘 풍부 발효유 또는 발효유 음료의 제조 방법을 논의한다. 이 방법은 젖산 발효유 음료에 HM 펙틴 및 "시럼과 함께 또는 개별적으로 칼슘"을 첨가하고 결과 혼합물을 균질화하거나; 또는 산성화된 젖산 발효유를 균질화시키고, 거기에 시럽 및 HM 펙틴을 첨가하고, 혼합하고, 칼슘을 첨가하고 다시 혼합하는 것을 포함한다. 어느 방법에서는, "블록식 타입 펙틴"을 HM 펙틴으로서 사용할 수 있다. 그러나, 식료품 생산자 관점에서, 공정 변화를 최소화하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 그러므로, 과잉투여 조건 하에서도 바람직하지 못한 점도 증가 없이 안정성을 제공하는, 비교적 높은 가용성 고형분 및 낮은 pH를 가진 식료품과 함께 사용될 수 있는 펙틴을 얻는 것이 바람직할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 약 10% 이상의 블록화도, 약 55% 이상의 에스테르화도 및 약 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴에 관한 것이다.

펙틴의 ΔCS는 약 30 센티포이즈 이하, 또는 약 20 센티포이즈 이하, 또는 약 10 센티포이즈 이하, 또는 약 5 센티포이즈 이하일 수 있으며, 가장 바람직하게 는 약 0 센티포이즈이다. ΔCS의 범위는 바람직하게는 약 0 센티포이즈 내지 약 20 센티포이즈, 더욱 바람직하게는 약 0 센티포이즈 내지 약 10 센티포이즈이다. 다.

펙틴은 약 20% 이상의 블록화도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 블록화도는 약 30% 이하이다. 더욱 바람직하게는, 블록화도는 약 15% 내지 약 25%이다.

펙틴의 에스테르화도는 약 60% 이상, 약 70% 이상 또는 약 80% 이상일 수 있다. 에스테르화도의 범위는 약 55% 내지 약 80%일 수 있으며, 바람직하게는 약 60% 내지 약 72%이다.

본 발명의 펙틴의 분자량은 약 40,000 이상, 바람직하게는 약 50,000 이상, 더욱 바람직하게는 약 70,000 이상이며, 약 200,000 이상일 수 있다. 바람직한 분자량 범위는 약 50,000 내지 약 200,000이며, 약 70,000 내지 약 90,000의 범위가 특히 바람직하다.

또다른 양태에서, 펙틴은 약 10 내지 약 15의 블록화도, 약 70 내지 약 75의 에스테르화도 및 약 18 이하의 ΔCS를 가질 수 있다. ΔCS는 또한 약 14 이하, 또는 약 10 이하, 또는 약 6 이하, 또는 약 3 이하, 또는 약 2 이하, 또는 약 1 이하일 수 있다.

또다른 양태에서, 본 발명은 약 10% 이상의 블록화도, 약 55% 이상의 에스테르화도 및 약 0 센티포이즈를 초과하는 ΔCS를 가진 출발 펙틴을 그 출발 펙틴의 ΔCS 보다 낮은 ΔCS를 갖는 가공 펙틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 펙틴 리아제로 처리하는 단계를 포함하는 펙틴의 제조 방법에 관한 것이다. 출발 펙틴은 약 20% 이상의 블록화도를 가질 수 있으며, 또한 출발 펙틴은 약 30% 이하의 블록화도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 출발 펙틴의 블록화도는 약 15% 내지 약 25%이다.

출발 펙틴의 에스테르화도는 약 55% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상일 수 있다. 출발 펙틴의 바람직한 블록화도의 범위는 약 55% 내지 약 80%이며, 더욱 바람직한 범위는 약 60% 내지 약 72%이다.

출발 펙틴은 약 20 이상, 또는 약 200 이상, 또는 약 300 이상, 또는 약 500 이상의 ΔCS를 가질 수 있다.

이 방법에 의해 생산된 가공 펙틴은 약 20 센티포이즈 이하, 바람직하게는 약 10 센티포이즈 이하, 더더욱 바람직하게는 약 5 센티포이즈 이하, 가장 바람직하게는 약 0 센티포이즈의 ΔCS를 갖는다. 가공 펙틴의 바람직한 ΔCS 범위는 약 0 센티포이즈 내지 약 20 센티포이즈이며, 약 0 센티포이즈 내지 약 10 센티포이즈의 범위가 가장 바람직하다.

출발 펙틴은 약 240,000 이하, 바람직하게는 약 150,000 이하의 분자량을 가질 수 있으며, 약 100,000 이상의 분자량을 가져야 한다.

별법에서, 약 10% 이상의 블록화도, 약 70% 이상의 에스테르화도 및 약 0 센티포이즈를 초과하는 ΔCS를 가진 펙틴이 약 10% 이상의 블록화도, 약 55% 이상의 에스테르화도 및 약 0을 초과하는 ΔCS를 가진 탈에스테르된 펙틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 식물 펙틴 메틸에스테라제로 처리될 수 있으며; 그후에 탈에스테르된 펙틴은 약 10% 이상의 블록화도 및 약 20 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙 틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 펙틴 리아제로 처리될 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 펙틴으로 확대된다.

또다른 양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 임의의 펙틴 또는 가공 펙틴을 포함하는 식용 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 이 펙틴은 약 10% 이상의 블록화도, 약 55% 이상의 에스테르화도 및 약 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 갖는다. 이 식용 조성물은 카제인을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 음료, 특히 산성화된 우유 음료이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 식용 조성물을 상기한 본 발명의 임의의 펙틴 또는 가공 펙틴과 함께 조제하는 것을 포함하는, 식용 조성물의 저장 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 비교적 고농도로 사용될 때에도 실질적이고 바람직하지 못한 점도 증가 없이 양호한 안정화력을 제공하는 펙틴을 얻을 수가 있다 .

이전에, 단백질 안정화 및 최소 점도 증가의 특성은 일반적으로 펙틴에 있어서 일치하지 않는 목표를 나타내었다. 이론에 기초한 것은 아니지만, 이것은 겔화를 포함하여 그때까지 점도 증가를 나타내는 이가 양이온 가교 또는 교차 결합의 원인이 되기도 하는, 주로 산 기 형태의, 펙틴 상의 음전하의 존재에 의해 제공되는 단백질 안정화로부터 일어날 수 있다. 그러므로, 개선된 안정화를 제공하는, 산 기의 증가된 양은 또한 펙틴이 칼슘과 같은 이가 양이온을 함유하는 액체에 점도를 추가시키는 경향을 증가시킨다. 반대로, 적절히 낮은 산 함량을 가진 펙틴을 선택하는 것은 상당한 점도 증가를 피할 수 있지만, 상대적으로 불량한 안정화력을 형성하기도 할 것이다. 이론에서, 적어도 그것은 이러한 두 극단의 상태 사이의 중간 입장을 나타내는 펙틴을 선택할 수 있으며 실질적인 점도 증가 없이 약간의 안정화력을 제공한다. 그러나, 실제로 그러한 펙틴의 유용성은 이전에 논의된 과잉투여의 필요성에 의해 부정되는데, 그 이유는 과잉투여 조건 하에서 이러한 특성의 절충이 실패되며, 바람직하지 못한 점도 증가가 일어나기 때문이다.

본 발명자는 놀랍게도 과잉 투여 조건 하에서도 바람직하지 않거나 또는 부적합한 점도 증가를 야기시키지 않고 양호한 안정성을 제공하는 펙틴을 발견하였다. 본 발명의 펙틴은 에스테르화도 또는 %DE; 블록화도 또는 DB; 칼슘 감수성 또는 ΔCS; 분자량; 단백질 안정화력 또는 YOG; 점성화력 또는 VIS를 비롯한 각종 특성에 의해; 또한 안정화력에 대한 점성화력의 비 또는 VIS/YOG에 의해 특징지워질 수 있다. 이들 파라메터, 및 이의 측정 방법은 아래에 더 논의되고 설명될 것이다.

에스테르화도 (%DE): 이미 설명한 바와 같이 펙틴의 에스테르화도는 펙틴 분자에 메틸 에스테르로서 존재하는 산 기의 백분율의 척도이다. HM 펙틴의 경우, 카르복실산 단위의 50% 이상이 메틸 에스테르로서 존재한다. %DE가 증가할 때, 칼슘 감수성은 감소하고, 예상으로 안정화력도 그렇게 될 것이다. 본 발명의 펙틴은 약 55 이상의 %DE에 의해 특징지워지며, 약 60 또는 70 내지 약 72의 범위가 바람직하며, %DE는 약 80 정도로 높을 수 있다. 특히 이러한 더 높은 범위에서, 안정화력은 불량한 것으로 예상되며, 이 예상에 대한 한 이론 기준은 남아있는 비교적 적은 산 기로부터 얻은 음 전하는 단백질을 효율적으로 안정화시키기에 불충분하다는 것이다. 본 발명의 펙틴이 펙틴 출발 물질을 효소로 처리하여 생산될 때, 출발 물질의 %DE가 거의 변화되지 않음에 주목해야 한다.

샘플 제조. 펙틴 2.0000 g을 칭량하여 250 ㎖ 유리 비이커에 덜어내고, 산 알코올 100 ㎖ (60% 이소프로필 알코올 100 ㎖ + 발연 37% HCl 5 ㎖)를 첨가하고, 자석 교반기 상에서 10분 동안 교반시킨다. 결과 용액을 건조된, 칭량 유리 필터 도가니를 통해 여과시킨다. 비이커를 6 x 15 ㎖ 산 알코올로 완전히 헹구고, 헹군 용액을 다시 여과시킨다. 여액 약 10 ㎖를 시험관에 넣고, 3N HNO₃ 약 3 ㎖를 첨가하고 AgNO₃ 수 방울 (예를 들면, 2 또는 3 방울)을 첨가하여 여액에 염화물이 없는 것으로 확인될 때 까지 여액을 60% 이소프로필 알코올 (IPA)로 세척한다. 은 염화물의 침전이 관찰되는 것과 반대로, 용액이 맑다면 이 여액은 염화물이 없는 것으로 간주될 수 있다. 전형적으로, IPA 세척액 약 500 ㎖가 충분할 것이다. 일단 여액이 염화물이 없는 것으로 확인되면, 그것을 100% IPA 20 ㎖로 세척하고 105 ℃에서 2.5시간 동안 건조시킨다. 건조 후에 도가니를 칭량한다.

측정. 두 여액 샘플, 각 0.4000 g을 칭량하여 별개의 250 ㎖ 유리 비이커에 덜어내고, 제2 샘플을 제1 샘플에 대해 체크하고, 그후에 각 샘플에 대해 동일한 절차를 실시하였다. 펙틴을 100% IPA 약 2 ㎖로 습윤시키고, 자석 혼합기 상에서 교반시키면서 탈이온수 약 100 ㎖를 첨가한다. 그 샘플은 이제 적정을 위해 준비된 것이다. 제2 샘플에 대해 동일한 절차를 수행하고, 제2 적정량을 B₁로서 기록한 다.

적정

1. 0.1N NaOH로 pH 8.5로 적정하고, 적정량을 V₁ 역가로서 기록한다.

2. 0.5N NaOH 20.00 ㎖를 첨가하고, 호일로 커버된 15분 동안 건드리지 않고 정치시킨다.

3. 0.5N HCl 20.00 ㎖를 첨가하고, pH가 일정하게 될 때 까지 자석 교반기 상에서 교반시킨다.

4. 0.1N NaOH를 사용하여 8.5의 pH로 적정하고, 그 결과를 V₂ 역가로서 기록한다.

맹시험을 위해:

1. 탈이온, 이산화탄소 제거수 100 ㎖를 0.1N NaOH를 사용하여 pH 8.5로 적정한다.

4. 0.1N NaOH를 사용하여 8.5의 pH로 적정하고, 그 결과를 B₁ 역가로서 기록한다.

상기 단계 4에서 적정을 위해 허용되는 최대량은 0.1N NaOH 1 ㎖이다. 0.1N NaOH가 1 ㎖ 보다 많이 필요하다면, 그 절차를 반복하고, 단계 3으로부터 얻은 0.5 N HCl을 소량의 탈이온수로 희석한다. 마찬가지로, 샘플 pH가 상기 단계 3에서의 0.5N HCl 첨가 시에 8.5 미만에 속하지 않는다면, 단계 2에서의 0.5N NaOH를 소량의 탈이온수로 희석한다. 희석이 필요할 때, 희석을 위해 허용되는 최대량은 결과 용액이 0.52 내지 0.48 N 사이가 되도록 하는 양이다.

계산. 에스테르화도는 다음 방정식에 따라 계산된다:

V_t = V₁ + (V₂-B₁)

블록화도 (DB): 블록화도는 펙틴 분자를 따른 산 기의 분포의 척도이다. 블록화도는 중합체를 따라 비교적 무질서하게 분포되는 것과는 반대로 블록으로 함께 밀집된 산 기의 특성에 관한 것이다. 산 기가 무질서하게 분포될 때, 그의 개개의 음 전하는 비교적 약하고, 따라서 단백질 안정화 또는 점도 증가에 있어서 거의 효과를 갖지 않는 것으로 예상될 것이다. 그러나, 산 기가 블록식 방식으로 존재할 때, 그 블록과 관련된 음 전하는 비교적 크고, 펙틴의 안정화 및 점성화력이 증가하게 된다. 본 발명의 설명을 위하여, %DB는 펙틴 g 당 비에스테르화된 갈락투론산 분자의 총수의 백분율로서, 엔도 폴리갈락투로나제 (PG, EC 3.2.1.15)에 의한 처리에 의해 유리되는 비메틸화 갈락투론산 분자 (모노머, 다이머 및 트라이머)의 양으로서 표시된다. 본 발명의 펙틴은 약 10 내지 약 30 범위의 %DB를 갖는다. %DE에서와 같이, 본 발명의 펙틴이 펙틴 출발 물질을 효소로 처리하여 생산될 때, 출발 물질의 %DB는 생산물에서 실질적으로 보존된다.

원리 및 계산. 폴리갈락투로나제는 갈락투론산 사슬의 가수분해 분해에 의해 펙틴 중합체를 분할하는 것으로 알려져 있다. 그것이 비메틸화 갈락투론산 잔기 만을 공격하며, 그것은 펙틴 중합체로부터의 모노갈락투론산, 디갈락투론산 및 트리갈락투론산의 방출이 (a) 존재하는 비메틸화 갈락투론산 잔기의 양 및 (b) 비메틸화 갈락투론산 잔기의 분자내 분포에 좌우됨을 의미한다. 비메틸화 갈락투론산 잔기의 분자내 분포가 일정하게 유지된다면, 펙틴에 존재하는 비메틸화 갈락투론산 잔기의 양이 클수록, PG에 의한 인큐베이션에 의해 펙틴 중합체로부터 방출될 모노머, 다이머 및 트라이머의 양이 크다. 비메틸화 갈락투론산 잔기의 양이 일정하게 유지된다면, 비메틸화 갈락투론산 잔기가 더 많이 밀집되거나 또는 블록화될수록, PG에 의한 인큐베이션에 의해 펙틴 중합체로부터 방출될 모노머, 다이머 및 트라이머의 양이 크다.

일정한 %DE를 가진 펙틴의 경우, %DB로서의 블록화도는 PG에 의한 처리 후에 방출되는 갈락투론산의 비에스테르화된 모노머, 다이머 및 트라이머의 정량화에 의해 결정된다. 정량화는 본원에 참고로 인용된 문헌 [Daas, P.J.H., et al., Anal. Biochem., 257(2) pp. 195-202 (1988)]에 기재된 바와 같이 고속 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC)에 의해 수행된다.

폴리갈락투로나제 제제. 본원에 사용된 폴리갈락투로나제 제제, PG-1은 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger)로부터 유래된 것이다. 본원에 사용된 PG- 1이 EU-투자된 프로젝트 "AIR2-CT941345"와 관련하여 클로닝됨으로써 생산되긴 하지만, 그 효소는 에이. 니게르에 천연적으로 존재하며 이전에 참조된 바와 같은 통상의 효소 단리 및 정제 기술을 이용하여 에이. 니게르로부터 단리될 수 있다.

폴리갈락투로나제 활성. PG 활성은 다음과 같이 분석된다: 폴리갈락투론산 용액 (폴리-D-갈락투론산 (C₆H₈O₆)_{n 약 150} USB)의 260 :l (본원에 사용된 바와 같이, 부호 ":l"은 마이크로리터를 의미함)을 50 mM 아세트산 나트륨의 210 :l에 첨가하고, 결과 용액의 온도를 30 ℃로 조정한다. 다음에, 분석될 효소 50 :l를 첨가한다. 그 용액을 조심스럽게 혼합한다. 0, 1, 2, 3, 4 및 5분 후에, 각각 50 :l의 샘플을 취한다. 샘플을 Na₂CO₃ (26.5 g/l) 1 ㎖에 피펫팅하여 반응을 즉시 중지시킨다. 샘플을 조심스럽게 진탕시킨 후에, 뉴코프로인 용액 (1 리터 이온 교환수 중의 400 ㎎ 뉴코프로인-염산염 CR, C₁₄H₁₃ClN₂l + 200 ㎎ CuSO₄, 5 H₂O) 0.5 ㎖를 첨가한다. 그 샘플을 65 ℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고 실온에 15분 동안 둔다. 그후에, 그 제제를 쿠베트에 가하고 0분에 취한 샘플에 대해 460 ㎚에서 흡광도를 측정한다. 감소 말단 기의 양 (μmol)을 확인하기 위하여, D-갈락투론산 (8.57 ㎎/㎖)의 용액으로부터 표준 곡선을 준비한다. 갈락투론산 용액의 0, 15, 30, 45 및 60 :l의 부분표본을 50 mM 아세트산 나트륨으로 1 ㎖가 될 때 까지 희석한다. 각 샘플 50 :l를 "반응이 중지되는 ..." 것을 시작으로 하여 상기한 바와 같이 처리한다. 460 ㎚에서 측정된 흡광도에 대하여 μmol 갈락투론산을 플롯팅하여 표준 곡선을 만든다. 활성은 다음과 같이 표시된다:

1U (유닛) = μmol 생성된 감소 말단기 x 분^-1/㎖

크로마토그래피 분석 전의 PG에 의한 처리. 분석될 펙틴 250 ㎎의 양을 에탄올 40 ㎕로 습윤시키고 자석 교반기 상에서 교반시켜 70 ℃에서 이온 교환수 50 ㎖에 용해시킨다. 펙틴 샘플을 40 ℃로 냉각시키고, pH를 4.2로 조정한다. 다음에, 펙틴 제제 1.5 ㎖를 3.5 유닛의 PG-1에 첨가한다. 샘플을 일정하게 혼합시키며 40 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 70 ㎕ HNO₃을 첨가하고 80 ℃로 10분 동안 가열하여 반응을 중지시킨다.

크로마토그래피 분석. PG 처리 후에 얻어진 펙틴 분해물을 다스 (Daas, P.J.H.) 등의 문헌에 기재된 바를 하기하는 바와 같이 약간 변형시켜 분석한다.

GP40 4요소 구배 펌프, AS3500 오토샘플러 및 용출 탈가스 (He) 모듈이 장치된 디오넥스 (Sunnyvale, CA, USA) DX-500 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 사용한다. 수산화 나트륨 포스트컬럼 전달계 및 전류적정 전지를 갖춘 디오넥스 ED40 전기화학 검출기로 검출을 실시한다. 그 검출기는 펄스된 전류적정 검출 (PAD) 방식으로 작동하며 금 작용 전극 및 AG/AgCl 기준 전극이 장치되어 있다. 포스트컬럼 전달계는 DQP-1 펌프, 펄스 제동계 및 가드 컬럼 (GM-3)으로 이루어진다. 출구를 크로마토그래피 컬럼 출구에 T-접속으로 연결하고 1500 ㎕ 혼합 코일에 합한다. 용출액을 수산화 나트륨 (2.5 M)과 혼합한 후에, 샘플을 PAD 검출기에 넣는다. 크로마토그램을 디오넥스 피이크 네트 소프트웨어 버젼 4.11로 기록한다. 올리고머를 카르보팩 PA-1 가드컬럼을 갖춘 디오넥스 카르보팩 PA 1 컬럼 상에 분 리한다. 0.5 ㎖/분으로 65분 동안 0.05-0.7 M 아세트산 나트륨 (pH 5.0)으로부터의 선형 구배로, 이어서 1M 아세트산 나트륨으로부터의 10분 선형 구배 및 0.5 ㎖의 세척 단계로 용출을 실시한다. 0.05M 아세트산 나트륨 (pH 5.0)에 의한 15분의 평형화 단계 후에, 80 ㎕ 샘플을 주입한다. PAD 전지로의 최종 유속이 1.0 ㎖/분이 되도록 포스트컬럼 펌프를 조정한다.

아세트산을 물에 희석하고, 50% 수산화 나트륨 용액으로 pH 5.0으로 적정하고, 그 부피를 물로 조정하여 1.0 M 아세테이트의 최종 농도를 제공하여 아세테이트 완충액을 제조한다. 아세테이트 완충액과 밀리포어 시스템 수를 혼합하여 구배를 달성한다.

전류적정 검출에 사용되는 트리플-펄스 순서는 다음 전위 및 지속시간을 포함한다: E₁ = 0.05 V (t₁ = 0.4 s), E₂ = 0.75 V (t₂ = 0.2 s) 및 E₃ = -0.15 V (t₃ = 0.4 s). 0.2초의 지연 후에 0.2초 동안 통합이 이루어진다.

검출된 비에스테르화된 모노-, 디- 및 트리갈락투론산 양의 총계를 정량화하기 위해서는, 이들 성분의 PAD 응답 인자가 확인되어야 한다 (Hotchkiss A.T. et al., Anal. Biochem., 184, 200-206 (1990)). 먼저, 각종 양의 다이머 및 트라이머 (0.05-2.5 μmol)의 피이크 면적을 얻고 동일한 양의 모노갈락투론산의 것과 비교한다. 상대 응답 인자를 계산한다. 각 시리즈 중에, 그 시리즈 내의 모노-, 디- 및 트리갈락투론산 농도의 정확한 계산을 가능하게 하기 위해 모노-갈락투론산 (0.051 ㎛)의 표준량의 PAD-응답 면적을 확인한다. 모노-, 디- 및 트리갈락투론산 의 양으로부터 상기한 %DB에 대한 식을 이용하여 블록화도를 계산한다.

분자량 (MW): 펙틴의 (중량 평균) 분자량은 추출에 사용된 원료 및 방법에 따라 넓은 범위 내에 속할 수 있다. 본 발명을 위하여, 출발 물질로서 사용되는 펙틴은 일반적으로 약 240,000 미만, 바람직하게는 약 100,000 내지 약 150,000의 근사 범위의 분자량을 가질 것이다. (달리 명시하지 않으면, 본원에 제공된 분자량 단위는 달톤이다). 효소 처리 후에, 가공 펙틴의 분자량은 선택된 출발 펙틴의 것 보다 낮을 것이며, 일반적으로 약 40,000 내지 약 200,000 달톤의 범위일 것이다. 가공 펙틴의 효능은 약 40-50,000의 분자량 아래에서 실질적으로 감소되며, 약 40-50,000 내지 약 70,000의 범위에서는 약간 감소되지만, 여전히 유용한 것으로 보인다. 본 발명의 펙틴의 바람직한 분자량 범위는 약 70,000 내지 약 90,000이다.

펙틴 샘플 제조. 펙틴의 분자량은 헥사메타인산 나트륨을 사용하여 0.1% 펙틴 용액의 상대 점도를 측정함으로써 평가된다. 먼저, 샘플을 %DE의 확인에 관한 단락에 기재된 바와 같이 제조한다. 이온교환된, 탈포 (비등)수 1800 ㎖에 헥사메타인산 나트륨 20.0 g을 용해시키고, 1M HCl로 pH를 4.50 ±0.05로 조정하고 이온교환된, 탈포 (비등)수로 2000 ㎖까지 희석하여 헥사메타인산 나트륨 용액을 제조한다. 측정하기 직전에, 필요량의 헥사메타인산염 용액을 유리 필터 #3을 통해 여과시킨다. 그후에, 자석이 첨가된 칭량된 비이커에 헥사메타인산 나트륨 용액 약 90 g을 칭량하여 덜어낸다.

다음에, 산-세척된 펙틴 0.1000 g을 교반시키며 비이커에 서서히 첨가한다. 그 용액을 교반시키며 70 ℃로 가열하고, 펙틴이 완전히 용해될 때 까지 교반을 계속한다. 용액을 25 ℃로 냉각시키고, 헥사메타인산 나트륨 용액으로 중량을 100.0 g으로 만들고 유리 필터 #3을 통해 여과시킨다.

분자량 측정. 각 분자량 측정을 위하여, 아래 절차를 이용하여 2개의 다른 점도계 상에서 펙틴/헥사메타인산염 용액에 대해 배출 시간을 측정한다. 분자량은 당해의 점도계 상에서 헥사메타인산염 용액에 대해 측정된 배출 시간을 이용하여 각 점도계에 대해 개별적으로 계산된다. 두 계산된 분자량의 차이가 3500 미만이면, 평균 값을 계산하여 가장 가까운 1000의 배수로 우수리를 잘라버린다. 두 계산된 분자량의 차이가 3500 이상이면, 점도계는 세정되어야 하고 헥사메타인산염 용액에 대한 배출 시간의 새로운 측정이 실시되어야 한다.

배출 시간을 측정하기 위하여, 점도계를 샘플로 두번 헹군다. 다음에, 샘플 5.00 ㎖를 점도계에 붓고 측정 전에 25.0 ℃ ± 0.3 ℃에서 15분 이상 동안 온도조절 장치가 장치된 수조에 놓는다. 배출 시간은 두 출구에서 측정한다. 시간 차이가 0.2초를 넘거나 (헥사메타인산염 용액을 측정할 때) 또는 0.4초를 넘으면 (샘플을 측정할 때), 그 차이가 적절한 값 미만이 될 때까지 측정을 반복한다. 분자량 결정에 이용되는 배출 시간은 상기 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 측정 결과의 평균 값이다.

상대 점도는 다음과 같이 계산된다:

여기서, t_o 및 t_h는 각각 펙틴 용액 및 헥사메타인산염 용액에 대한 배출 시간이다.

파라메터 K는 위테그-오스트왈드 (Witeg-Ostwald) 점도계를 사용하여 107 s²에서 충분한 정확도로 고정될 수 있다. 그렇지 않으면, K는 다음과 같이 계산될 수 있다:

여기서, Q = ㎤ 단위의 점도계 구(球)의 부피이고, L = ㎝ 단위의 모관 길이이고, t_v = 초 단위의 물에 대한 배출 시간이다.

펙틴의 분자량은 다음과 같이 계산된다:

여기서, P는 6에서 고정되며 k는 4.7 x 10^-5 mol·g^-1에서 고정되며, C는 샘플계 내의 펙틴의 중량 백분율이다. 수치를 삽입하면, 이것은 다음과 같이 된다:

M = 1.277 ·10⁶(n_r ^1/6-1)g/mol

칼슘 감수성 (ΔCS): 가공 펙틴의 칼슘 감수성은 본 발명에 의해 실질적으로 감소되며, 그것은 DB가 거의 일정하게 남아있다고 가정한다면 특히 놀라운 일이다. 아래에 더 설명되는 바와 같이, 칼슘 감수성은 칼슘 없이 펙틴을 함유하는 기준 용액과 칼슘과 함께 펙틴을 함유하는 용액과의 점도 차이를 나타내며, 이런 이유로 ΔCS로서 나타내어질 수 있다. 본 발명의 펙틴은 약 100 미만, 바람직하게는 약 20 미만, 예를 들면 약 5 내지 약 10 범위의 ΔCS를 가질 것이며, 약 0의 ΔCS가 바람직하다. 출발 물질의 ΔCS는 약 20을 넘는 임의의 값일 수 있으며, 약 300을 넘거나 심지어는 약 500을 넘는 매우 높은 값일 수 있다.

펙틴의 칼슘 감수성은 0.5% 펙틴, 바람직하게는 순수한 펙틴을 가진 용액에서 측정된다. 칼슘 염 및 펙틴은 칼슘 이온과 펙틴이 많이 침강되는 것을 피하기 위하여 낮은 pH에서 혼합된다. 그후에, 펙틴과 칼슘 이온 사이의 반응은 아세트산 나트륨/아세트산 완충액을 첨가함으로써 개시된다. 칼슘 함유 펙틴 용액의 점도는 칼슘 없는 동일한 용액의 점도와 비교되며, 센티포이즈로 측정되는 점도 차이는 칼슘 감수성 또는 ΔCS이다.

더욱 특별하게는, 펙틴 2.4 g을 가진 용액 (0.6% 용액) 400 g을 만든다. 순수한 펙틴이 사용되지 않으면, 그 용액은 다음 식에 따라 계산되는 펙틴의 양을 이 용하여 보정되어야 한다.

여기서, A는 샘플의 펙틴 백분율이다.

사용될 펙틴의 양 (순수하다면 2.4 g, 그렇지 않으면 상기한 바와 같이 계산됨)을 소수 세자리의 정확도로 칭량하여 덜어낸다. 펙틴을 고전단 혼합기 (Waring Blender Model 34BL99, Waring Product Division Dynamic Corporation of America, New Hartford, Connecticut)에서 비등 탈이온수 250 ㎖에 약 4분 동안 고속으로 분산시킨다. (본원에 사용된 모든 탈이온수는 1.0 μS/㎝ 미만의 전도도를 가진 이온 교환수이다). 전단된 펙틴 용액을 칭량된 비이커에 붓고, JK IKA-콤비매그 (Combimag) REO 자석 교반기 (Janke & Kunkel (IKA), Staufen, Germany) 상에서 혼합하기 위해 자석을 넣는다. 고전단 혼합기를 추가의 탈이온수 100 ㎖로 헹구고, 그것을 비이커 안의 펙틴 용액에 첨가한다. 용액을 25 ℃ ±1°로 냉각하고, 그후에 1M 염산을 사용하여 혼합시키며 pH를 1.5로 조정한다. 추가의 탈이온수를 첨가하여 용액 중량을 400 g으로 증가시키고, 펙틴 용액 145 g ±1g을 두 50 x 100 ㎜ 점도 글라스 (Holm & Halby) 각각에 칭량하여 덜어낸다. 각 점도 글라스에 자석을 넣는다. 단계 1에서 IKA MAG EOA 9 자석 판 교반기 상에서 교반시키면서, 점도 글라스 중 하나에는 5 ㎖의 탈이온수를 넣고 다른 점도 글라스에는 5 ㎖의 250 mM Ca⁺⁺ 용액 (CaCl₂, 2H₂O 36.7550 g/l)을 넣는다. 다음에, 25 ㎖의 1M 아세테이트 완 충액 (500 mM CH₃COONa, 3H₂O 68.04 g/l 및 500 mM CH₃COOH, 100%, 28.6 ㎖/l)을 IKA MAG RET 자석 교반기 상에서 격렬하게 교반시키면서 각 점도 글라스에 첨가한다. 단계 1에서 2분 동안 교반을 계속하고, 그후에 자석을 제거하고 용액을 파라필름 (Parafilm) (등록상표) 필름으로 커버하고 25 ℃에서 밤새 두었다. 점도를 온도 조절되는 수조에서 여전히 25 ℃에서 브룩필드 LVT 점도계로 60 RPM으로 측정한다. 센티포이즈 단위의, 두 용액의 점도 차이는 본 발명의 펙틴의 칼슘 감수성 또는 ΔCS이다.

본 발명의 펙틴은 본원에 더 설명되는 바와 같이 출발 펙틴을 바람직한 특성을 가진 펙틴을 얻기에 충분한 조건 하에서 펙틴 리아제로 처리함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 펙틴의 제조 방법은 출발 물질의 블록화도 또는 에스테르화도에 크게 영향을 미치지 않는다. DB는 펙틴 골격을 따라 산기가 얼마나 집중되어 있는지에 관한 것이고 산기의 농도는 일반적으로 칼슘 감수성과 관련이 있으므로, 칼슘 감수성이 DB의 변화 없이 감소될 수 있다는 것은 아주 놀라운 것이다.

처리를 위해 사용되는 특정 펙틴 리아제 또는 출발 물질로서 사용되는 펙틴의 원료 둘다가 중요한 것으로 생각되지 않으며, 그것은 공정 최적화의 통상적인 문제로서 선택되거나 또는 조정될 수 있다. 펙틴 리아제는 잘 알려져 있으며, 그것은 다른 공급원이 이용가능하긴 하지만 일반적으로 수개의 변이체가 존재하는 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger)로부터 얻어지며, 예를 들어 본원에 참고로 인용된 문헌 (Van Houdenhoven, F.E.A., "Studies on Pectin Lyase", Ph.D. Thesis, Wageningen Agricultural University, The Netherlands, 17 (1975); and Kusters-Van Someren, M.A., "Characterization of an Aspergillus niger Pectin Lyase Gene Family", Ph.D. Thesis, State University Utrecht, The Netherlands (1991))을 참고하면 된다. 리아제 제제 중의 오염물 및 특히 생물학적 활성 오염물의 존재는 방법을 실행하고 본 발명의 펙틴을 얻는 능력을 손상시킬 것이며, 그러므로 실질적으로 순수한 형태로 얻어지거나 또는 실질적인 균질도로 정제된 리아제 제제 만을 사용하여야 한다.

이미 나타낸 바와 같이, 펙틴은 광범위한 식물 원료에 존재하고 그로부터 추출될 수 있다. 이것은 비교적 일반적인 시판 원료, 예를 들면 레몬, 라임, 오렌지, 포도, 사과 및 사탕무를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

효소: 펙틴 리아제 (PL, E.C. 4.2.2.10)를 함유하는 4개의 다른 효소 제제를 사용하였다. 제제 A는 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger)로부터 유래된 펙틴 리아제 A (PL A)였으며, 제제 B는 역시 에이. 니게르로부터 유래된 펙틴 리아제 D (PL D)였다. 다음 실시예에 사용된 PL A 및 PL D의 샘플이 EU-투자된 프로젝트 "AIR2-CT941345"와 관련하여 클로닝됨으로써 생산되긴 하지만, 이 효소는 에이. 니게르에 천연적으로 존재하며 반 후덴호벤 (Van Houdenhoven)에 기재된 바와 같은 통상의 효소 단리 및 정제 기술을 이용하여 에이. 니게르로부터 단리될 수 있다. 효소는 활성을 최대화하기 위하여 또한 순수하지 않은 제제로부터 발생될 수 있는 오염 및(또는) 바람직하지 않은 부작용을 피하기 위하여 실질적인 균질도로 정제되 어야 한다.

제제 C는 바이오카탈리스츠 (Biocatalysts; United Kingdom)로부터 "펙티나제 444 L"로서 시판되는 이용가능한 진균성 효소 제제였으며, 제제 D는 롬 저매니 (Rohm Germany)에 의해 유전적으로 변형된 생물 (아스페르길루스 종)로부터 제조된 "로하펙트 (Rohapect) PTE"로서 시판되는 이용가능한 효소 제제였다.

효소 활성: 효소 제제 A 내지 D 모두는 PL 활성에 대해 시험되었다. PL은 C-4에서 중합체 골격의 트랜스 제거성 분할에 의한 펙틴의 비가수 분해를 촉매 작용하며, 동시에 C-5로부터 H를 제거하여 C-4와 C-5 사이에 이중 결합을 형성하여 235 ㎚에서 흡광도 증가를 야기시킨다. 따라서, 235 ㎚에서의 광학 밀도의 증가를 측정하여 30 ℃에서 분광광도법으로 펙틴 리아제 활성을 분석하였다. 분석 혼합물은 1.4 ㎖의 매킬바인 (McIlvaine) 완충액 (36.85 mM 시트르산, 126.3 mM NaH₂PO₄, 0.5N NaOH에 의해 5.5로 pH 조정됨), 0.4 ㎖의 0.0625% 펙틴 (72%의 DE를 가진 B-고속 세트, Copenhagen Pectin A/S, Denmark) 및 0.2 ㎖의 효소를 함유하였다. 몰 흡수 계수 Σ₂₃₅ 5500을 사용하여 활성을 계산하였다. 1 유닛 (1U)의 활성은 분 당 1 μmol의 비포화된 생성물을 생산하는 효소의 양으로서 결정된다.

본원에 기재된 절차가 펙틴 리아제의 "적정량" (또는 그 효과에 대한 단어)을 의미할 때, 이것은 리아제 처리된 펙틴의 표적 분자량 및 사용되는 리아제의 비활성을 기준으로 계산된 양이다. 사용될 효소의 양은 방정식 e^(y-a/b) = x (여기서, y는 분자량 감소 (그러므로, ΔMW)이고, x는 펙틴 500 g 당 효소의 양 (유닛 단위) 임)에 의해 정해진다. 이 방정식 사용시에, 효소 처리를 위한 가공 시간은 1시간으로 정해지며, a 및 b는 당해의 효소에 의한 수회의 시도를 실시한 후에 결정되는 효소 특이적 상수이다.

효소적 처리: 세가지 다른 출발 물질에 대해 PL을 함유하는 제제로 펙틴을 효소적 처리하였다; HM 추출에 의해 건조된 껍질로부터 얻은 쥬스, 식물 메틸 에스테라제 (PME)로 처리된 쥬스 및 건조된 펙틴 분말.

HM 추출에 의해 건조된 껍질로부터 얻은 쥬스. 600 ㎏의 양의 건조된 레몬 껍질을 이온 교환수 1700 리터에 첨가하였다. 그 제제를 70 ℃로 가열하고 2시간 동안 교반시키고, 그후에 62% HNO₃ 98 리터를 첨가하고, 1시간 동안 추출을 실시하였다. 다음에, 종이 펄프 100 ㎏을 여과를 용이하게 하기 위하여 추출된 재료에 첨가하였다. 그 제제를 진공으로 하고 규조토로 여과 ("블랭크 여과")시켰다. 여과된 쥬스를 강 양이온 교환기 (IRC 120, 바이엘 코포레이션) 상에 이온 교환시키고, 원래 부피의 약 50%로 증발시켜 중량/중량 건조 중량 기준으로 약 3 내지 약 5%의 펙틴 농도로 만들고, 실온으로 냉각시켰다. NH₃ (2% 용액, 25% NH₃으로부터 DI 수로 희석됨)를 첨가하여 pH를 5.5로 조정하고, 적정량의 PL을 첨가하였다.

원하는 분자량을 얻을 때 까지 효소 반응을 실시하였다. 반응을 중지시키기 위하여, 희석된 (10% v/v) HNO₃을 첨가하여 pH를 2.5로 낮추고, 가열 잭킷을 사용하여 온도를 실온에서 80 ℃로 상승시켰다. 펙틴을 80% 2-프로판올 중에 1:3의 비로 침전시켰다. 침전된 펙틴을 압착시키고, 60% 2-프로판올에서 세척하였다. 압착시 킨 후에, 펙틴을 70 ℃에서 16-20시간 동안 건조시켰다. 건조된 샘플을 분쇄하고 0.25 ㎜ 시험 체를 통해 체질하였다.

PME로 처리된 쥬스. 1300 ㎏의 양의 건조된 레몬 껍질을 이온 교환수 25,500 리터 및 62% HNO₃ 126 리터에 첨가하였다. 7시간 동안 추출을 실시하였다. 종이 펄프 (100 ㎏)를 여과를 용이하게 하기 위하여 추출된 재료에 첨가하였다. 그 제제를 진공 여과시키고, 이어서 블랭크 여과시켰다. 여과된 쥬스를 강 양이온 교환기 (IRC 120) 상에 이온 교환시키고, 원래 부피의 약 50%로 증발시켜 중량/중량 건조 중량 기준으로 약 3 내지 약 5%의 펙틴 농도로 만들고, 45 ℃로 냉각시키고, 2% NH₃을 첨가하여 pH를 5.5로 조정하였다.

식물 PME 적정량을 첨가하고 목적하는 에스테르화도를 얻을 때 까지 반응을 실시하였다. 목적하는 에스테르화도는 관계 식 y=1.6x (여기서, y는 %DE의 변화 (그러므로, Δ%DE)이고, x는 NH₃의 g/펙틴의 ㎏ (g NH₃/㎏ 펙틴)임)에 의해 결정된다. 반응 중에, 2% NH₃으로 자동 적정하여 pH를 일정하게 유지하였다. 2.5의 pH에 HNO₃을 첨가하고 80 ℃로 10분 동안 가열하여 PME를 불활성화시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에, NH₃의 2% v/v 용액으로 pH를 5.5로 조정하고 적정량의 PL을 첨가하였다. 목적하는 분자량이 얻어질 때까지 효소적 반응이 진행되도록 두었다. 반응을 중지시키기 위하여, 희석된 HNO₃을 첨가하여 pH를 2.5로 낮추고 온도를 80 ℃로 10분 동안 상승시켰다. 펙틴을 1:3의 펙틴 대 프로판올 비로 80% 2-프로판올에 침전 시켰다. 그후에, 침전된 펙틴을 압착시키고, 60% 2-프로판올에서 세척하였다. 압착시킨 후에, 펙틴을 70 ℃에서 16-20시간 동안 건조시켰다. 건조된 샘플을 분쇄하고 0.25 ㎜ 시험 체를 통해 체질하였다.

건조된 펙틴 분말. 500 g의 양의 펙틴을 격렬하게 교반시키며 70 ℃에서 이온 교환수 10 리터에 용해시켰다. 펙틴 용액을 실온으로 냉각시키고 2% NH₃를 첨가하여 pH를 5.50으로 조정하였다. 적정량의 PL을 첨가하고, 목적하는 분자량이 얻어질 때까지 효소적 반응이 진행되도록 두었다. 반응을 중지시키기 위하여, 희석된 HNO₃을 첨가하여 pH를 2.5로 낮추고 온도를 80 ℃로 10분 동안 상승시켰다. 펙틴을 80% 2-프로판올 (1:3)에 침전시켰다. 침전된 펙틴을 압착시키고, 60% 2-프로판올에서 세척하였다. 압착시킨 후에, 펙틴을 70 ℃에서 16-20시간 동안 건조시켰다. 건조된 샘플을 분쇄하고 0.25 ㎜ 시험 체를 통해 체질하였다.

그 결과를 아래에 나타내었다:

실시예 1 - PL D

재료	DB	DE	ΔCS	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
출발 펙틴	13	72	298	144	169	148	88
PL D-1A	13	72	1	81	101	66	65
PL D-2A	13	72	1	67	94	0	0
PL D-3A	13	72	2	42	48	0	0
PL D-4A	13	72	1	34	SEP	SEP	SEP
PL D-5A	13	72	2	25	SEP	SEP	SEP

실시예 2 - PL A

재료	DB	DE	ΔCS	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
출발 펙틴	13	72	298	144	169	148	88
PL A-1A	13	71	90	108.5	142	70	49
PL A-2A	13	71	30	95	88	63	72
PL A-3A	13	72	6	94.5	84	42	50
PL A-4A	13	72	1	71.5	37	0	0
PL A-5A	13	72	0	41.5	SEP	SEP	SEP

실시예 3 - 444L

재료	DB	DE	ΔCS	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
출발 펙틴	13	72	298	144	169	148	88
444L-1A	13	71	14	106	126	104	82
444L-2A	13	72	3	96	112	94	83
444L-3A	13	71	1	83	96	52	54
444L-4A	13	72	2	70	75	39	52
444L-5A	13	72	3	70	72	35	49P

실시예 4 - PTE

재료	DB	DE	ΔCS	MW	YOG C	VIS C	YOG/VIS
출발 펙틴	13	72	298	144	169	148	88
PTE-1A	13	71	18	102	117	91	78
PTE-2A	13	72	18	99	109	78	72
PTE-3A	13	72	10	71	75	52	69
PTE-4A	13	70	3	66	49	55	112
PTE-5A	13	72	1	48	SEP	SEP	SEP
PTE-6A	13	71	1	37	SEP	SEP	SEP

효소적 처리를 이용하여 이러한 결과가 얻어지긴 하지만, 그 처리가 출발 펙틴의 %DE 및 %DB를 변화시키지 않는다면 화학적 처리를 이용하여 동등한 결과를 얻을 수도 있다. 특히, 베타 제거를 통해 1,4 글리코시드 결합의 분해를 일으키는 임의의 화학적 처리를 이용하여 위에 특징지워진 효소적 처리에 의해 생산되는 펙틴과 동등한 특성을 가진 펙틴을 생산할 수 있다. 예를 들면, 용액의 pH를 7 이상으로 상승시키는 NaOH와 같은 알칼리성 시약에 의한 펙틴 용액의 처리는 유사한 결과를 나타내야 한다.

본 발명은 당연히 특정 방법 및 재료를 참고로 본원에 논의되어 왔다. 열거된 이들 방법 및 재료는 단지 예시적인 것이며, 어떻게든 본 발명의 영역을 제한하지 않는다. 당 업계의 숙련인은 본 발명의 영역을 벗어나지 않고 본원에 제공된 특정 교시를 이해하고 그의 변화 또는 그에 대한 대안을 실시할 수 있을 것이다.

Claims

10% 이상의 블록화도, 55% 이상의 에스테르화도 및 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴.

제1항에 있어서, 30 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴.

삭제

제2항에 있어서, 0 센티포이즈 내지 20 센티포이즈의 ΔCS를 가진 펙틴.

삭제

제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 20% 이상의 블록화도를 가진 펙틴.

제9항에 있어서, 30% 이하의 블록화도를 가진 펙틴.

삭제

제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 60% 이상의 에스테르화도를 가진 펙틴.

삭제

제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 55% 내지 80%의 에스테르화도를 가진 펙틴.

제15항에 있어서, 60% 내지 72%의 에스테르화도를 가진 펙틴.

제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 40,000 이상의 분자량을 가진 펙틴.

삭제

제17항에 있어서, 50,000 내지 200,000의 분자량을 가진 펙틴.

삭제

제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 10 내지 15%의 블록화도, 70 내지 75%의 에스테르화도 및 18 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴.

제23항에 있어서, 14 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴.

삭제

10% 이상의 블록화도, 55% 이상의 에스테르화도 및 0 센티포이즈를 초과하는 ΔCS를 가진 출발 펙틴을 상기 출발 펙틴의 ΔCS 보다 낮고 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 갖는 가공 펙틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 펙틴 리아제로 처리하는 단계를 포함하는 펙틴의 제조 방법.

제30항에 있어서, 상기 출발 펙틴이 20% 이상의 블록화도를 갖는 방법.

제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 출발 펙틴이 30% 이하의 블록화도를 갖는 방법.

삭제

제30항에 있어서, 상기 출발 펙틴이 55% 내지 80%의 에스테르화도를 갖는 방법.

삭제

제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 출발 펙틴이 20 센티포이즈 이상의 ΔCS를 갖는 방법.

삭제

제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 가공 펙틴이 20 센티포이즈 이하의 ΔCS를 갖는 방법.

삭제

제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 출발 펙틴이 240,000 이하의 분자량을 갖는 방법.

삭제

제30항 또는 제31항의 방법에 의해 얻을 수 있는 펙틴.

a) 10% 이상의 블록화도, 70% 이상의 에스테르화도 및 0 센티포이즈를 초과하는 ΔCS를 가진 펙틴을 10% 이상의 블록화도, 55% 이상의 에스테르화도 및 0을 초과하는 ΔCS를 가진 탈에스테르된 펙틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 식물 펙틴 메틸에스테라제로 처리하는 단계; 및

b) 상기 탈에스테르된 펙틴을 10% 이상의 블록화도 및 20 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴을 생산하기에 충분한 조건 하에서 펙틴 리아제로 처리하는 단계

를 포함하는 펙틴의 제조 방법.

제53항의 방법에 의해 얻을 수 있는 펙틴.

10% 이상의 블록화도, 55% 이상의 에스테르화도 및 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴을 포함하는 식용 조성물.

제55항에 있어서, 카제인을 더 포함하는 식용 조성물.

제56항에 있어서, 상기 식용 조성물이 음료인 식용 조성물.

제57항에 있어서, 상기 음료가 산성화된 우유 음료인 식용 조성물.

제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펙틴이 20 센티포이즈 이하의 ΔCS를 갖는 식용 조성물.

제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펙틴이 15% 내지 25%의 블록화도를 갖는 식용 조성물.

제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펙틴이 60% 내지 72%의 에스테르화도를 갖는 식용 조성물.

제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펙틴이 70,000 내지 90,000의 분자량을 갖는 식용 조성물.

식용 조성물을 10% 이상의 블록화도, 55% 이상의 에스테르화도 및 100 센티포이즈 이하의 ΔCS를 가진 펙틴과 함께 조제하는 것을 포함하는, 식용 조성물의 저장 안정성을 증가시키는 방법.