CN104892786B - 绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸lem及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从绿萼梅中获得的高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM、其制备方法和抑菌用途。具体而言，首先从绿萼梅中提取粗多糖，经过氧化氢脱色后，通过色谱及波谱鉴定后得一高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM。生物活性实验表明该多糖具有抑制金黄色葡糖球菌生长的作用，具有潜在的制备天然抑菌剂的用途。
Description
技术领域
本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说，涉及一种从绿萼梅中提取得到的一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM、其制备方法及在制备天然抑菌剂的应用。
背景技术
随着生活水平的提高，食品安全问题越来越引起人们的重视。在食品生产过程中，为了延长食品的保质期，常需要添加防腐抗菌剂。据调查研究，人们常用的苯甲酸钠、山梨酸钾等化学添加剂具有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等毒副作用。因而，广谱、高效、安全防腐抗菌剂的开发应用受到了人们的广泛关注。多糖是构成生命的四大基本物质之一，具有许多生物活性，包括抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用。已有多项研究显示多糖具有抑菌作用，甲酯其具有良好的生物相容性和生物无毒性等特性，是一种较为理想的天然防腐抗菌剂。
绿萼梅为蔷薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥花蕾。原产我国西南及台湾，主产江苏和浙江，现在四川和湖北。绿萼梅味酸，涩，性平，归肝、胃、肺经，具有舒肝，和胃，化痰之功效。其花色洁白，香味极浓，有“花中君子”的美称，最大特点就是能够理气，调理脾胃，疏理气血，但却不会伤阴，老少皆宜，非常难得，常用于郁闷心烦、肝胃气痛、食欲不振等症。此外，绿萼梅水外用还能预防面部血瘀形成斑点。多糖作绿萼梅生物活性的重要组成部分，其结构及活性尚无报道。本发明在对绿萼梅多糖进行提取的基础上，对其结构及抑菌活性进行了测定，以期为绿萼梅多糖开发天然抑菌剂提供理论基础。
发明内容
本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以绿萼梅为原料获得了一种绿萼梅多糖，其主要成分为半乳糖醛酸，具体为高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM(发明人定义该多糖为LEM)，活性实验表明高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM具有很好的抑菌效果。其在制备抑菌作用的药物及功能食品中具有潜在的应用价值。
本发明的一个目的在于提供一种甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其结构式如下：
均聚半乳糖醛酸为只有半乳糖醛酸单一单糖重复组成的多糖，其中R为半乳糖醛酸C6位的羟基被部分甲酯化。
其中，所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的重均分子量范围为1-100kDa；优选为1-50kDa；更优选为3-10kDa；
本发明的另一目的是提供本所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的绿萼梅经乙醇脱脂，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩得浓缩液，加入3倍于浓缩液体积的乙醇进行醇沉，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提绿萼梅粗多糖。
b.多糖脱色：取绿萼梅粗多糖，水溶解，离心，上清用2M NaOH溶液调节pH至9.0，加入30％过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7％，搅拌脱色3h；脱色结束后用盐酸调节溶液pH至中性，经透析除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM。
步骤a所述乙醇脱脂的过程为：按料液比(g/L)1:10-1:30的比例加入浓度为65-85％，pH值2.0-3.0的乙醇溶液进行脱脂处理2-4次，脱脂条件为：水浴温度60-80℃，脱脂时间1-3h，然后挤压除去乙醇。
步骤a中干燥的绿萼梅与每次加入的去离子水的料液比(g/L)为1:10-1:30，加热条件下提取的加热温度95-100℃水浴中，每次提取1-3小时。
步骤a中所述醇沉使用的乙醇为浓度95％的pH2.0-3.0的乙醇。
在步骤b中，透析优选为MW3500(截留分子量3500)的透析袋。
本发明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的抑菌作用。
本发明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制备天然抑菌剂中的用途。
附图说明：
图1为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的高效凝胶色谱图；
图2为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的13C-NMR谱图；
图3为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的HSQC谱图；
图4为所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM抑菌作用结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求中包括的变通和修改。
实施例1：绿萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备
a.多糖提取：
称取绿萼梅200g，按料液比(g/L)1:20的比例加入浓度为75％，pH值2.0的乙醇溶液进行脱脂处理三次，脱脂条件为：水浴温度70℃，脱脂时间2h；上述脱脂后的绿萼梅经挤压除去内部残留乙醇溶液，再加入蒸馏水4L，96℃水浴中搅拌提取三次，每次提取3小时，共提取3次；三次滤液合并，减压浓缩至200mL；浓缩液边搅拌边缓慢加入三倍体积的95％乙醇溶液(pH值2.0)进行醇沉，室温静置3-4h；上述溶液经1000rpm离心收集沉淀，沉淀物再以少量无水乙醇洗涤三次；沉淀物置85℃烘箱干燥得绿萼梅粗多糖。其中：pH＝2.0的乙醇是用盐酸将乙醇的pH调节至2-3制得。
b.多糖脱色：
干燥的绿萼梅粗多糖以料液比1：100加水搅拌溶解，离心弃去沉淀；上清用2MNaOH溶液调节pH至9.0，加入30％过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7％，搅拌脱色3h；脱色结束后用盐酸调节溶液pH至中性，经透析(透析袋，MW 3500)除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM。
c.多糖结构鉴定：
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM相对分子质量为6.9kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、PMP衍生化，萃取、浓缩后送入高效液相色谱分析。单糖组成分析结果显示，其主要含半乳糖醛酸。结合核磁共振分析(参见图2和图3)，确定LEM为一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
d.多糖结构解析：
经高效凝胶色谱法析(HPGPC)分析表明LEM的分子量为6.9kDa。单糖组成分析表明LEM主要含有半乳糖醛酸。13C-NMR谱中(图2)，位于δ101.64及δ100.80的端基碳信号，分别为甲基取代的半乳糖醛酸C1信号及未取代的半乳糖醛酸C1信号；δ69.84，δ69.01，δ80.25和δ71.94分别为C2，C3，C4，C5的信号。此外，在δ54.14处在54.59ppm处具有明显的糖醛酸羧基甲酯化的甲基碳原子信号，在δ171.99处为甲酯化的半乳糖醛酸C6的信号峰。从上述结果可以发现LEM为一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
实施例2.绿萼梅多糖LEM抑菌实验
1)检定菌：接Newman(Staphylococcus aureus)单克隆于TSB培养基中振摇过夜,接MPAO1(Pseudomonas aeruginosa)单克隆于LB培养基中振摇过夜。过夜培养的菌稀释至1OD(Newman:108cfu/ml/MPAO1:109cfu/ml)左右备用。
2)检定平板的制备：分别向TSA/LB平板上均匀涂布50μl稀释好的检定菌备用。
3)样品的加入：于检定平板上滴加样品10μl，并滴加10μl无菌dd H2O作为阴性对照，样品滴加后于无菌台中吹干。
4)检定平板的培养：检定平板于37℃培养箱中倒置培养12-24h后观察结果。
实验结果表明，该绿萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM能显著抑制金黄色葡萄球菌的生长(见图4)，可作为潜在的天然抑菌剂开发利用。
Claims (6)
1.一种绿萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的绿萼梅经乙醇脱脂，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩得浓缩液，加入3倍于浓缩液体积的乙醇进行醇沉，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提绿萼梅粗多糖；
b.多糖脱色：取绿萼梅粗多糖，水溶解，离心，上清用2M NaOH溶液调节pH至9.0，加入30％过氧化氢溶液至过氧化氢溶液终浓度为7％，搅拌脱色3h；脱色结束后用盐酸调节溶液pH至中性，经透析除去溶液中的离子和小分子物质，冷冻干燥即得甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM。
2.如权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于：重均分子量范围为1-100kDa。
3.如权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于：重均分子量范围为1-50kDa。
4.如权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于：重均分子量范围为3-10kDa。
5.根据权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于：步骤a所述乙醇脱脂的过程为：按料液比1:10g/L-1:30g/L的比例加入浓度为65-85％，pH值2.0-3.0的乙醇溶液进行脱脂处理2-4次，脱脂条件为：水浴温度60-80℃，脱脂时间1-3h，然后挤压除去乙醇。
6.根据权利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制备方法，其特征在于：步骤a中干燥的绿萼梅与每次加入的去离子水的料液比为1:10g/L-1:30g/L，加热条件下提取的加热温度95-100℃水浴中，每次提取1-3小时。
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