Olivenöl wird aus den Früchten des Olivenbaums (Klasse: Dicotyledoneae, Ordnung: Oleales, Familie: Oleaceae, Art: Olea europaea) gewonnen. Die Olivenfrucht (Olive) hat eine rundliche, im Querschnitt ovale Form und ist eine fleischige Kernfrucht mit bitterem Geschmack. Die physikalschen und chemischen Eigenschaften der Olivenfrüchte hängen von vielen Faktoren, wie z.B. Sorte, Reifegrad, Erntezeitpunkt, geographische Lage oder Wachstumsbedingungen ab. Strukturell kann die Olivenfrucht in zwei wesentliche Bestandteile gegliedert werden, diese sind das Pericarp und das Endocarp. Das Pericarp umfasst das Epicarp (Fruchthaut) und das Mesocarp (Pulpe), die das Endocarp '(hölzerner Kern) umschließen, in welches wiederum der Samen eingebettet ist.

Die Gewinnung von Öl aus den Olivenfrüchten ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Nach Angaben des internationalen Olivenölrates (International Olive Oil Council, IOOC) wird für das Produktionsjahr 2003/2004 eine weltweite Gesamtmenge von mehr als 2,8 Millionen Tonnen Olivenöl erwartet. Diese Menge wird mit den unterschiedlichsten technologischen Methoden dargestellt und beinhaltet verschiedene Qualitäten. Eine Unterteilung der Gewinnungsmethoden in zwei Prinzipien ist möglich, nämlich zu einem in die mechanisch-physikalische Technologie wie z.B. Pressung, Perkolation sowie Zwei- oder Drei-Phasen-Verfahren und zum anderen in Lösungsmittel-basierte Verfahren als chemisch-extraktive Technologie.

Die verwendete Technologie und die Art der Prozessführung bestimmt u.a. die Ausbeute an Olivenöl. Zur Verarbeitung in mechanisch-physikalischen Verfahren werden die Oliven zunächst zerkleinert, z.B. durch Mühlsteine oder Hammermühlen, gefolgt von einem Schritt, in dem die Olivenpaste für eine gewisse Zeit (typischerweise 30-90 Minuten) unter horizontalem Rühren, ggf. unter Zusatz von Wasser, zur weiteren Zerkleinerung und Mazerierung inkubiert wird. Anschließend erfolgt eine Zerlegung der erhaltenen Suspension in Flüssigkeit und Festsubstanz, typischerweise durch Druck (Pressung) oder durch Zentrifugalkraft (Zwei- oder Dreiphasenverfahren). Die durch Pressung oder durch Anwendung des Zweiphasenverfahrens in diesem Prozessschritt erhaltene Flüssigkeit ist idealerweise eine Öl/Wasser-Emulsion, die durch einen weiteren Zentrifugationsschritt getrennt wird. Beim Dreiphasenverfahren erfolgt die Spaltung der Suspension in Feststoffe, Wasser und Öl in einem Prozessschritt.

Im beschriebenen ersten Isolierungsschritt, d.h. bei dem Schritt, in den zerkleinerte Oliven direkt eingehen, werden je nach Verfahren typischerweise zwischen 50 und 85% des gesamten enthaltenen Öls isoliert. Die nach dem ersten Isolierungsschritt erhaltene Olivenmasse weist somit noch einen signifikanten Rest-Ölgehalt auf, dessen Reduktion durch ein- oder mehrfache Wiederholung des ersten Prozessschrittes herbeigeführt werden kann, ggf. unter Veränderung bestimmter Prozessparameter wie z.B. Temperatur, angelegte Zentrifugalkraft, Wasserzusatz etc.. Jedoch kann die Ölisolierung mit mechanisch-physikalischen Methoden ökonomisch sinnvoll nur bis zu einem bestimmten Restölgehalt durchgeführt werden. Um den Restölgehalt weiter zu senken und somit die Ölausbeute zu erhöhen, wird daher auf chemisch-extraktive Verfahren zurückgegriffen. Hierzu wird die Olivenpulpe getrocknet, ggf. nach optionaler Entfernung der Steinreste extrudiert und mit einem Lösungsmittel wie z.B. Hexan extrahiert. Das Öl wird aus dem Extrakt durch Entfernen des Lösungsmittels, z.B. durch Verdampfen gewonnen. Neben der Ausbeute wird außerdem die Qualität des Olivenöls von der Art des Verfahrens und der Prozessführung beeinflusst. Ökonomisch sinnvoll ist die Auswahl solcher Verfahren, die qualitativ hochwertiges Öl liefern, da die Qualität positiv mit dem zu erzielenden Preis korreliert ist. Besonders sind hierzu die mechanisch-physikalischen Verfahren geeignet. Auch aus Umwelt- und Sicherheitsaspekten ist man bestrebt, zu Gunsten der mechanisch-physikalischen Verfahren auf chemisch-extraktive Verfahren so weit wie möglich zu verzichten. Daher wurden in der Vergangenheit neben konstruktiven Verbesserungen der eingesetzten Maschinen außerdem biochemische Prozesshilfen entwickelt, die Ausbeute und Qualität des mittels mechanisch-physikalischer Verfahren gewonnenen Öls positiv beeinflussen können.

Aus der Literatur ist in diesem Zusammenhang die Anwendung von Enzymen bekannt. Enzyme sind funktionelle Polypeptide, die in der Lage sind, die Spaltung definierter Substrate oder die Synthese bestimmter Produkte zu katalysieren. Bezugnehmend auf den Prozess der Olivenölgewinnung wurden in der Vergangenheit bevorzugt solche Enzyme oder Enzymmischungen beschrieben, die in der Lage sind, degradierend auf bestimmte zelluläre Strukturen der Olivenfrucht zu wirken.

Der Einsatz zellwanddegradierender Enzyme in der Olivenölgewinnung wurde bereits 1954 von de Soroa y Pineda (de Soroa y Pineda, J. M. (1954) Oleagineux 9, 865-868. Emploi des enzymes dans l'extraction de l'huile d'olive.) beschrieben. Aus dem Stand der Technik ist weiterhin der Einsatz endogener oder exogener Enzyme wie Polygalacturonasen (EC 3.2.1.15 (endo-) oder EC 3.2.1.67 (exo-)), Pektinesterasen (EC 3.1.1.11), Pepsin (EC 3.4.23.1), Papain (EC 3.4.22.2), Cellulasen (EC 3.2.1.4), α-Amylase (EC 3.2.1.1), Proteasen (EC-3.4.2x.yz), β-Glucosidasen (EC 3.2.1.21), β-Galactosidasen (EC 3.2.1.23), α-Arabinosidasen (EC 3.2.1.55), α-Mannosidasen (EC 3.2.1.24), β-Xylosidasen (EC 3.2.1.37), β-N-Acetylglucoaminidase (EC 3.2.1.52), α-D-Galactosidase (EC 3.3.1.22), Pektin-Lyase (EC 4.2.2.10) und Pektat-Lyase (EC 4.2.2.2) bekannt. Die angegebenen EC-Nummern beziehen sich auf die Enzymnomenklatur gemäß der Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions (www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/ enzyme). Die EP 0 616 024 A1 beschreibt ein spezifisches Verfahren zur Gewinnung von Olivenöl aus entkernten Olivenfrüchten unter Verwendung einer Cellulase.

Die Verwendung von Polygalacturonasen in der Olivenölgewinnung wurde 1973 von Montedoro und Petruccioli (Rivista Italiana delle Sustanze Grasse 50(9), 331-343) beschrieben.

Jedoch sind die in der Literatur beschriebenen Systeme insofern nicht optimal, da sie die Ölausbeute bei der Gewinnung von Olivenöl nur verhältnismäßig geringfügig erhöhen. Zudem besteht ein Bedarf, neben der Quantität auch bestimmte Qualitätsparameter des erhaltenen Öls zu beeinflussen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, in einem Verfahren zur Ölgewinnung eine Enzymmischung bereitzustellen mit deren Hilfe die Ölquantität und -qualität im Prozess der Olivenölgewinnung signifikant verbessert und der Prozess der Ölabtrennung zudem erleichtert werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält zunächst eine Zusammensetzung bzw. Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen. Prinzipiell können darin verschiedene Bestandteile der Olivenfrucht in beliebigen Anteilen vorhanden sein. Bei der praktischen Ölgewinnung wird es sich in der Regel um eine Olivenmasse bzw. Olivenpulpe handeln, die die Pericarpanteile der Olivenfrucht, d.h. das Epicarp und das Mesocarp enthält. Es können jedoch auch Endocarpanteile enthalten sein. Vorzugsweise handelt es sich um eine Masse, in der die Oliven bzw. Olivenbestandteile bereits zerkleinert sind, insbesondere durch mechanische Verfahren wie Vermahlen. Überraschend wurde auch gefunden, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren nach einer Ausführungsform der Erfindung besonders gut zur Gewinnung von Öl aus Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen eignet, bei denen die Kerne nicht entfernt bzw. abgetrennt wurden. Dies ermöglicht ein vereinfachtes Verfahren, wobei eine sehr gute Ölausbeute und -qualität erzielt werden kann.

Weiterhin kann es sich um eine Masse vor oder nach der ersten Entölung (Ölgewinnung) handeln. Es hat sich jedoch überraschend gezeigt, dass besonders gute Ergebnisse im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhalten werden, wenn es sich bei der Masse um eine bereits vorentölte Masse handelt, d.h. der erste Ölgewinnungsschritt bereits erfolgt ist. Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird dabei eine gelagerte, vorentölte Olivenpulpe (manchmal auch "Orujo" genannt) eingesetzt, die nicht einem weiteren Trennschritt unterzogen wurde, bei dem Kerne und Pulpe getrennt werden, sondern die direkt einem weiteren Entölungsschritt unterzogen wird.

Allgemein kann das Vermischen von Enzym(en) und Olivenmasse mit allen üblichen und dem Fachmann geläufigen Mitteln (z.B. Rühren) erfolgen, wobei auch gleichzeitig eine (weitere) Zerkleinerung der Oliven(bestandteile) erfolgen kann, z.B. in einer Mühle.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält weiterhin eine Enzymmischung, wobei überraschenderweise gefunden wurde, dass bei einem Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase(n) zur Aktivität der endo-Polygalacturonase(n) von mindestens 0,13, und vorzugsweise einem Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase(n) zur Aktivität der exo-Polygalacturonase(n) von mindestens 0,3 besonders vorteilhafte Eigenschaften bei der Ölgewinnung erhalten werden. So hat sich unerwartet gezeigt, dass bei Einhaltung jeweils dieser Verhältnisse sowohl die Freisetzung des Öls aus der Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen mengenmäßig erhöht, als auch die Freisetzung und Abtrennung des wässrigen Anteils (der wässrigen Phase) in dem Ölgewinnungsprozeß erleichtert wird. Insgesamt lässt sich die Ölausbeute überraschend steigern. Auch ein unerwarteter Effekt auf die Ölqualität ist zu beobachten und wird nachstehend noch näher ausgeführt.

Unter einer Pektinesterase (PEase) wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.1.1.11 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymmischung enthält somit mindestens eine PEase(-aktivität).

Unter einer endo-Polygalacturonase (endo-PGase, endo-Pektinase) wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.15 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Die erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil (Pektinsäure (PGA) als Substrat) angegeben. Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymmischung enthält somit mindestens eine endo-PGase(-aktivität).

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Pektinesterase (PEase) zur Aktivität der endo-Polygalacturonase mindestens 0,15, vorzugsweise mindestens 0,16.

Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymmischung enthält weiterhin mindestens eine exo-Polygalacturonase (exo-PGase, exo-Pektinase), wobei das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase(n) zur Aktivität der exo-Polygalacturonase(n) mindestens 0,3 beträgt. Besonders bevorzugt ist ein Aktivitätsverhältnis von mindestens 0,33. Erfindungsgemäß wird unter einer exo-PGase ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.67 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben.

Es wird angenommen, ohne dass die Erfindung auf diesen theoretischen Mechanismus beschränkt wäre, dass durch den relativ hohen Pektinesteraseanteil, insbesonderebei gleichzeitiger Anwesenheit von endo- und exo-PGase(n) ein besonders effizienter Aufschluss der hochmolekularen Polysaccharidstrukturen erzielt wird, in denen das zu gewinnende Öl "eingeschlossen" ist. Es wird weiterhin angenommen, dass durch die Pektinesterase die Zugänglichkeit von Substraten der endo- und der exo-PGase sowie anderer polysaccharidspaltender Enzyme verbessert wird. Dadurch kann offenbar auch der Abbau von hochmolekularen Strukturen, mit denen das zu gewinnende Öl assoziiert ist, beschleunigt werden. Per definitionem katalysiert exo-PGase die Freisetzung von D-Galacturonat-Monomeren aus 1,4-alpha-D-Galacturonid-Polymeren durch Spaltung von endständigen O-glycosidischen Bindungen. Wird Pektin als Substrat eingesetzt, ist es wie auch bei der endo-PGase notwendig, dass das etwaige Methylsäureester der Polygalacturonsäure zunächst in die freie Säure bzw. in deren Salz umgewandelt werden, damit sie der exo-PGase als Substrat zur Verfügung steht. Die Einstellung des erfindungsgemäßen (Mindest-)Verhältnisses zwischen Pektinesterase und exo-PGase ist in diesem Zusammenhang offenbar besonders vorteilhaft. Die Spaltung der Säureester durch die Pektinesterase entlang der Polysaccharid-Kette erfolgt wohl statistisch. So wird die Kette im ersten Schritt der endo-PGase als Substrat zugänglich gemacht, die die Kette anschließend in Oligosaccharide zerteilt. Es ist möglich, dass die exo-PGase hier bereits eine endständige Abspaltung durchführt, jedoch nur solange, bis sie auf der Kette wiederum einen Methylsäureester vorfindet. Ein weiterer endständiger Abbau der Kette könnte dann nur erfolgen, wenn dieser Methylsäureester in die Säure umgewandelt wird. Das erfindungsgemäße Mindestverhältnis zwischen PEase und endo-PGase kann dafür sorgen, dass die statistische Spaltung der Methylsäureester durch die PEase so mit der exo-PGase-Aktivität abgestimmt ist, dass diese mit besonders hoher Leistungsfähigkeit ohne eine Einschränkung der Umsätze durch blockierende Methylester arbeiten kann. Auch sind weitere günstige Interaktionen zwischen den vorstehenden Enzymaktivitäten denkbar.

Besonders bevorzugt ist das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der endo-Polygalacturonase nicht grö-ßer als etwa 1, insbesondere als etwa 0,5, und das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der exo-Polygalacturonase nicht größer als etwa 1, insbesondere als etwa 0,6.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene Enzymmischung weiterhin mindestens eine Laminarinase (β-1,3-Glucanase). Erfindungsgemäß wird hierunter ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.39 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der Laminarinase mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30.

Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene Enzymmischung weiterhin mindestens eine Cellulase, insbesondere eine C1-Cellulase. Hierunter wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.91 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis der Aktivität der PEase zur Aktivität der C1-Cellulase mindestens 75, vorzugsweise mindestens 100.

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene Enzymmischung somit mindestens sechs verschiedene Einzelaktivitäten, wobei die bevorzugten Verhältnisse der Einzelaktivitäten sich überraschend positiv auf die erhaltene Ölquantität und -qualität sowie die Phasentrennbarkeit auswirken. Die bevorzugt enthaltenen Enzymaktivitäten sind nachstehend nochmals aufgelistet:

exo-Polygalacturonase	(EC 3.2.1.67)
endo-Polygalacturonase	(EC 3.2.1.15)
Pektinlyase	(EC 4.2.2.10)
Pektinesterase	(EC 3.1.1.11)
C1-Cellulase	(EC 3.2.1.91)
Laminarinase	(EC 3.2.1.39)

Es können jedoch auch weitere Komponenten in der erfindungsgemä-ßen Zusammensetzung enthalten sein. In Bezug auf die enzymatischen Komponenten der Enzymmischung können beispielsweise weitere Zell- bzw. Zellwandstrukturen degradierende Enzyme enthalten sein, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkend, Xylanase(n) (EC 3.2.1.8) oder auch proteolytische Enzyme (vgl. Beschreibungseinleitung und Enzymauflistung vor dem Methodenteil; nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform jedoch nicht in der Enzymmischung enthalten). Auch sind weitere Bestandteile in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (neben der Masse und der Enzymmischung) nicht ausgeschlossen. Solche Zusätze sind dem einschlägigen Fachmann geläufig und umfassen beispielsweise Salze, Cofaktoren, Inhibitoren oder Aktivatoren für Enzyme, Stabilisatoren wie Glycerin, etc.

Wie bereits erwähnt, eignet sich die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene Enzymmischung besonders vorteilhaft zur Erhöhung der Ausbeute in der Gewinnung von Olivenöl aus Olivenfrüchten oder deren Bestandteilen, besonders in mechanisch-physikalischen Gewinnungsprozessen.

Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden Enzymaktivitäten, die wie im nachstehenden Methodenteil angegeben bestimmt werden können:

Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Enzymmischung keine Phospholipase C-Aktivität bzw. Lipase-Aktivität, wobei der Nachweis wie im Methodenteil angegeben erfolgen kann. Gegebenenfalls kann eine Phospholipase C-Aktivität von nicht mehr als 5 U/ml, insbesondere von nicht mehr als 1 U/ml akzeptiert werden, jeweils bezogen auf die Enzymmischung, wobei zwischen etwa 50 und 400 ml der Enzymmischung/t Olivenpulpe eingesetzt werden.

Die Lipaseaktivität sollte vorzugsweise nicht mehr als 3 U/ml, insbesondere von nicht mehr als 0,5 U/ml, bestimmt wie im Methodenteil angegeben und bezogen auf die Enzymmischung, betragen, wobei zwischen etwa 50 und 400 ml Enzymmischung/t Olivenpulpe eingesetzt werden.

Die einzelnen Enzyme sind kommerziell erhältlich (z.B. Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, DE). Beispielhafte Enzymquellen sind nachstehend vor dem Methodenteil angegeben. Es können jedoch selbstverständlich auch Enzyme aus anderen Quellen verwendet werden, solange sie die entsprechende vorstehend angegebene Aktivität aufweisen. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme aus Kulturen bzw. dem Kulturüberstand von Mikrooganismen, insbesondere von Bakterien und Pilzen, einschließlich Hefen gewonnen. Eine bevorzugte Quelle sind Kulturen von Aspergillus, insbesondere von Aspergillus niger Stämmen, die mehrere oder sogar alle der in der erfindungsgemäßen Enzymmischung enthaltenen Enzymaktivitäten aufweisen.

Bezogen auf die Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen werden erfindungsgemäß besonders bevorzugt mindestes 50ml, insbesondere zwischen etwa 50 und 400 ml, vorzugsweise zwischen 100 und 300 ml, besonders bevorzugt zwischen 125 und 250 ml der vorstehend beschriebenen Enzymmischung pro Tonne Masse eingesetzt. In vielen Fällen sind vorzugsweise zwischen etwa 50 und 250 ml, vorzugsweise zwischen 100 und 175 ml, insbesondere zwischen 125 und 150 ml der vorstehend bestehenden Enzymmischung pro Tonne Masse vorteilhaft.

Bevorzugt liegt dabei die Protein- bzw. Enzymkonzentration in der eingesetzten Enzymmischung zwischen etwa 2 und 20 mg/1, vorzugsweise 2 und 12 mg/ml, insbesondere 3 und 10 mg/1. Die Proteinkonzentration kann anhand von Standardverfahren z.B. photometrisch bestimmt werden. Hieraus lassen sich einfach die bevorzugten absoluten Gesamtaktivitäten der einzelnen enthaltenen Enzyme pro Tonne der Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen errechnen.

Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Enzymmischung wie vorstehend definiert zur Behandlung von Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen, insbesondere von vorentölten Massen bei der Ölgewinnung. Als besonders vorteilhaft hat sich überraschend die Verwendung bei der physikalischen bzw. mechanisch-physikalischen Ölgewinnung herausgestellt. Wie eingangs ausgeführt, können bei diesen Verfahren hochwertigere Öle erhalten werden, so dass sich die gemäß der vorliegenden Erfindung gesteigerte Ölausbeute als besonders lohnend darstellt.

Im Prozess der Gewinnung von Olivenöl ist man auch bestrebt, möglichst große Mengen hochwertigen Öls zu produzieren, um auf diese Weise einen möglichst hohen Marktpreis erzielen zu können. In dem eingesetzten Produktionssystem besteht in erster Näherung eine Korrelation zwischen Ölmenge und Qualität: wird eine Anlage mit möglichst hoher Trenneffizienz gefahren, d.h. auf Ölmenge optimiert, so nimmt die Qualität ab und vice versa. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmischung kann überraschend ein hochqualitatives Öl bei gleichzeitig hoher Ausbeute erzielt werden.

Ein Parameter, der die Qualität eines Öles definiert ist z. B. der Säuregehalt. Die Ölhersteller sind bestrebt, diesen möglichst niedrig zu halten. Weiterhin ist zu beobachten, dass - wie oben beschrieben - durch scharfe Zentrifugation zwar die Ölausbeute erhöht wird, jedoch auf die Weise auch unerwünschte Nebenprodukte in das Öl eingehen. Diese Nebenprodukte setzen sich langsam als Sediment ab. Es kann festgehalten werden, dass die Ölhersteller bestrebt sind, dieses Sediment volumenmäßig möglichst gering, die Textur möglichst einheitlich und die Farbe möglichst neutral zu halten. Die genannten Parameter werden mit Hilfe der vorliegenden Erfindung positiv beeinflusst.

Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung somit die Verwendung einer Enzymmischung wie hierin definiert zur Behandlung von Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen, insbesondere von vorentölten Massen bei der Ölgewinnung, vorzugsweise zur Verbesserung der physikalischen oder mechanisch-physikalischen Ölgewinnung.

Eine weiter bevorzugte erfindungsgemäße Verwendung betrifft die Verbesserung der Qualität des erhaltenen Öls, insbesondere die Reduktion des Säuregehaltes, die Reduktion der Konzentration von konjugierten Dienen oder Trienen, die Reduktion von Sterolen oder Wachsen und/oder die Reduktion des Gehaltes an freien Fettsäuren in dem erhaltenen Öl. Eine weitere bevorzugte Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Öl um ein Olivenöl handelt und durch die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung keine negative Beeinflussung des Gehalts an Cholesterol, Brassicasterol, Stigmasterol, Δ-Stigmasterol und Trilinolein erfolgt.

Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen, umfassend die folgenden Schritte:

Wie bereits ausgeführt, kann dabei jede dem Fachmann geläufige Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen verwendet werden, wobei es sich in der Regel um eine Masse aus vorzerkleinerten Oliven oder Olivenbestandteilen handeln wird.

Die Zugabe der Enzymmischungen kann in flüssiger oder fester Form erfolgen. Aus Gründen der Dosierbarkeit wird sich jedoch die Herstellung einer Enzymlösung, d.h. einer flüssigen Enzymmischung vor der Zugabe zu der Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen empfehlen. Dabei kann z.B. von einer konzentrierten Stammlösung der Enzymmischung ausgegangen werden, die kurz vor der Zugabe zur Masse vorverdünnt wird. Die Enzymzugabe kann zu einem beliebigen Zeitpunkt erfolgen, vorzugsweise jedoch vor oder während einem Schritt zur Durchmischung und/oder Zerkleinerung der Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen. Eine besonders bevorzugte Zugabe erfolgt in den Mischbehältern mit vertikalem oder horizontalem Rührgestänge.

Auch das Vermischen der Masse und der Enzymmischung kann auf dem Fachmann geläufige herkömmliche Weise erfolgen, z.B. durch Rühren.

Die im Einzelfall optimale Enzyminkubationszeit und -temperatur kann vom Fachmann einfach anhand routinemäßiger Versuche bestimmt werden. In der Regel werden Temperaturen zwischen 20 und 60°C, vorzugsweise von 25-55°C, insbesondere 30-50°C und vorzugsweise Inkubationszeiten zwischen 5 bis 120 min, vorzugsweise 10-100 min, insbesondere 30-90 min zu guten Ergebnissen führen. Es können jedoch auch wesentlich kürzere oder längere Zeiten sinnvoll sein. Auch kann ggf. auf eine eigene Inkubationsphase ganz verzichtet werden.

Anschließend muss, wie bereits oben ausgeführt, das Öl aus der Mischung abgetrennt werden. Die Gewinnung des Öls unter Abtrennung der Ölphase kann auf jede beliebige, dem Fachmann geläufigen Weise geschehen, wobei auch auf die in der Beschreibungseinleitung angeführten Verfahren beispielhaft verwiesen wird. Vorzugsweise handelt es sich um ein mechanischphysikalisches Verfahren, d.h. es wird im Gegensatz zu den chemisch-extraktiven Verfahren kein Lösungsmittel wie z.B. Hexan zugesetzt bzw. zur Extraktion des Öls verwendet.

Im Rahmen der Erfindung wurde auch überraschend gefunden, dass durch den erfindungsgemäßen Einsatz der Enzymmischung eine besonders effiziente Ölgewinnung unter Verwendung eines Dreiphasen-Dekanters ermöglicht wird. Beim sogenannten Dreiphasen-Verfahren wird durch den Einsatz von mindestens einem Dreiphasen-Dekanter die eingebrachte Masse, z.B. die ölhaltige Olivenpulpe (in einem Arbeitsschritt) in eine flüssige Ölphase, eine wässrige Phase (manchmal auch "Papilla" genannt) und eine teilentölte und teilentwässerte (Feststoff)-Suspension (manchmal auch "alperujo" genannt) getrennt.'Aufgrund der begrenzten Trennleistung der Drei-phasen-Dekanter befindet sich jedoch herkömmlich eine signifikante Menge Öl in der Papilla. Dieses Öl wird üblicherweise in einem weiteren Prozessschritt aus der Papilla isoliert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird nun unerwartet die Trennleistung der Dreiphasen-Dekanter signifikant erhöht, wobei insbesondere die Ölausbeute steigt und der Ölanteil in der Papilla erheblich gesenkt werden kann. In den meisten Fällen ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens überraschend möglich, ggf. nachfolgende Prozessschritte zur Isolierung des Öls aus der Papilla überflüssig zu machen. Dreiphasen-Dekanter als solche sind dabei dem Fachmann bekannt, es können beliebige Modelle verwendet werden.

Nach einen anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass durch den erfindungsgemäßen Enzymeinsatz die Zwischenschaltung von Malaxern, d.h. dem Fachmann geläufigen Rührbecken mit horizontalem Rührgestänge, und/oder von dem Fachmann ebenfalls geläufigen Rührbecken mit vertikalem Rührgestänge sogar überflüssig gemacht werden kann. Besonders bevorzugt kann erfindungsgemäß der Malaxer im Verfahren weggelassen werden. Offenbar wird hier, ohne dass die Erfindung auf die Richtigkeit dieser Annahme beschränkt wäre, eine Verbesserung der Koaleszenz allein durch die Enzymmischung bewirkt. Durch die Möglichkeit der Weglassung der Malaxer lässt sich die Prozessökonomie erheblich steigern.
Nach einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann bei der nachstehenden Methode zur Bestimmung der Aktivität der endo-PGase als Substrat auch anstelle von Pektinsäure (PGA) Pektin eingesetzt werden. Auf diese Weise lässt sich eine Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme ermitteln. Im Rahmen dieser alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat sich dabei gezeigt, dass sich besonders vorteilhafte Eigenschaften bei der Ölgewinnung zeigen, wenn in der eingesetzten Enzymmischung das Verhältnis der PEase zur wie vorstehend bestimmten Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme in der Enzymmischung mindestens 0,035, vorzugsweise mindestens 0,04, insbesondere 0,05 beträgt. Nach einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher auch eine Zusammensetzung, enthaltend eine Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen und eine Enzymmischung, worin das Verhältnis der PEase zur wie vorstehend bestimmten Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme in der Enzymmischung mindestens 0,035, vorzugsweise mindestens 0,04, insbesondere 0,05 beträgt.

Die Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme liegt dabei vorzugsweise bei weniger als 8000 U/ml, insbesondere weniger als 7000 U/ml. Die Aktivitätswerte der anderen Enzyme sind vorzugsweise wie vorstehend angegeben. Auch die Aktivitätsverhältnisse von PEase zu exo-PGase, von PEase zu Laminarinase und von PEase zu C1-Cellulase sind vorzugsweise wie vorstehend angegeben. Es können die gleichen Mengen an Enzymgemisch wie vorstehend beschrieben eingesetzt werden.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Verwendung einer Enzymmischung wie vorstehend ausgeführt in einem der hierin beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen bzw. in einem Verfahren zur Ölgewinnung. Dabei kann nach einer Ausführungsform der Erfindung die Fest-/Flüssigtrennung bei der Ölgewinnung verbessert werden. Eine bevorzugte Verwendung betrifft hier die Entölung einer vorentölten Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fest-/Flüssigtrennung ausschließlich mit Hilfe mindestens eines Dreiphasen-Dekanters erfolgen.

Nach einem weiteren Verwendungsaspekt der vorliegenden Erfindung wird die Ölausbeute bei der Fest-/Flüssigtrennung erhöht, der Ölgehalt des wässrigen Ablaufs aus dem Dreiphasen-Dekanter gesenkt, die abgetrennte Wassermenge im wässrigen Ablauf erhöht und/oder der Öl- und/oder Wassergehalt der mit Hilfe des Dreiphasen-Dekanters gewonnenen Festphase reduziert.

Nach einem weiteren Verwendungsaspekt der vorliegenden Erfindung wird ermöglicht, die Prozesstemperatur bei der Ölgewinnung bei zumindest gleichbleibender Ölausbeute absenken zu können. Quellen für Enzyme:

a.	EC 3.2.1.15	endo-PGase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P4716, aus A. niger
b.	EC 3.2.1.67	exo-PGase (Kobayashi, T., Higaki, N., Yajima, N., Suzumatsu, A., Hagihara, H., Kawai, H., und Ito, S. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, S. 842-848) oder von ASA Spezialenzyme GmbH, Wolfenbüttel, DE in Form von exo-PGase-haltigen Enzymlösungen
c.	EC 3.1.1.11	Pektinesterase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P5400, aus Orangenschale
d.	EC 3.4.23.1	Pepsin, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P7012, aus Schweinemagenschleimhaut
e.	EC 3.4.22.2	Papain, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P4762, aus Papaya
f.	EC 3.2.1.4	Cellulase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. C1184, aus A. niger
g.	EC 3.2.1.1	α-Amylase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. A6211, aus A. oryzae
h.	EC 3.4.2x.yz	Proteasen, z.B. Pepsin und Papain, s.o.
i.	EC 3.2.1.21	β-Glucosidase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G6906, rekombinant
j.	EC 3.2.1.22	α-Galactosidase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G4408, aus A. niger
k.	EC 3.2.1.23	β-Galactosidase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G3522, aus A. niger
1.	EC 3.2.1.55	α-Arabinosidase
m.	EC 3.2.1.24	α-Mannosidase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. M7257, aus Bohnen
n.	EC 3.2.1.37	β-Xylosidase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. X3501, aus A. niger
o.	EC 3.2.1.52	β-N-Acetylglucosaminidase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. A2264, aus Bohnen
p.	EC 4.2.2.10	Pektin-Lyase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. PP7052, aus A. niger
q.	EC 3.2.1.6	Laminarinase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. L5272, aus Trichoderma spec.
r.	EC 3.2.1.8	Xylanase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. X3876, aus Trichoderma veride

Soweit nicht anders angegeben, werden die Enzymaktivitäten im Rahmen der Erfindung nach den im folgenden Methodenteil angegebenen Verfahren bestimmt.

exo-Polygalacturonase (exo-PGase) spaltet aus verseiftem Citruspektin Galacturonsäure-Einheiten ab, die aufgrund der reduzierenden Aldehydgruppen nach Reaktion mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen werden können.

Beim Erwärmen von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht.3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974).

Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.

2,2% verseifte Citruspektinlösung in 0,1 M Na-Citrat, pH 4,4; Verseifungsmethode: Vorschrift nach Boehringer Ingelheim, s.u.

12,0 g/l Galacturonsäure (GA) in dest. Wasser.

0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Enzymlösung mischen, bei 30°C für 30 min inkubieren, danach sofort ins Eisbad stellen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.

0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Wasser mischen, 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.

1,0 ml verdünnte Standardlösung mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz mischen und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.

Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der Kalibriergeraden:

c(GA) In g/l	Standardlsg. in µl	dest. Wasser in µl
0,6	50	950
1,2	100	900
1,8	150	850
3,0	250	750
4,5	375	625
6,0	500	500

$$\mathit{exo}\mathit{-}\mathit{PGase}\mathit{-}\mathit{Aktivität}\left[\mathit{U}\mathit{/}\mathit{ml}\right]\mathit{=}\frac{\mathit{\Delta }\mathit{C}\left(\mathit{GA}\right)}{\mathit{M}\left(\mathit{GA}\right)}\mathit{\cdot }\frac{{\mathit{V}}_{\mathit{Reaktionslsg}\mathit{.}}}{{\mathit{V}}_{\mathit{Enzym}\mathit{.}}{\mathit{t}}_{\mathit{Reaktion}}}\mathit{\cdot }\mathit{Verd}\mathit{.}$$

Eine 250 ml Flasche wird in einem Wasserbad auf 35°C eingestellt und Rührer mit Rührmotor darin befestigt. 2,2 g über 80% verestertes Citruspektin (v. Herbstreith und Fox KG, Pektin Classic CF 201, 00302026 v. 30.04.03) werden darin mit 4 ml reinem Alkohol unter langsamen Rühren benetzt. Bei stärkerer Rührbewegung werden daraufhin 50 ml dest. Wasser in die Mitte des Rührsoges eingegossen und 20 min nachgerührt. Es ist darauf zu achten, das dabei eine glatte, viskose Lösung ohne Klümpchen entsteht. Danach werden unter Zeitnahme zur Verseifung aus einem Tropftrichter 20 ml 0,5 N Natronlauge innerhalb von 5 min rasch zugetropft. Nach einer gesamten Verseifungszeit von genau 60 min bei 35°C unter stetem Rühren wird die Reaktion abgestoppt durch Zugabe von 10%-iger Zitronensäure aus einer Stabpipette. Durch Zugabe von 3 ml Zitronensäurelösung wird der pH-Wert auf 4,4 eingestellt. Der pH-Wert darf nicht nachträglich mit Lauge korrigiert werden.

Anschließend wird der Inhalt des Becherglases unter Nachspülen mit Pufferlösung in einen 100 ml-Messzylinder überführt. Nachdem die Lösung auf 20°C abgekühlt ist, wird das Volumen mit Citratpuffer pH 4,4 auf 100 ml aufgefüllt. Vor dem Gebrauch wird die fertige Pektinsäurelösung über Glaswolle filtriert.

Einer spezifischen endo-PGase-Einheit entspricht der mit 100 ml multiplizierte reziproke Wert der Enzymmenge in g, die in 30 min die Viskosität (-Wasserwert) von 1 Liter einer 2,2%-igen Pektinsäurelösung*) um 3/5 erniedrigt; (auf rel. Viskosität 0,40), bei 30°C und beim pH-Optimum von 4,4.

Messung des Viskositätsabbaues der fermentierten Fluka-Pektinsäurelösung im Ostwald-Viskosimeter.

21,01 g Zitronensäuremonohydrat in einem 1 Liter Messkolben in ca. 100 ml dest. Wasser lösen.
200 ml 1 N-Natronlauge dazu pipettieren und gut mischen, bis zur Eichmarke auffüllen.

Von der Basislösung werden ungefähr 350 ml in einem 800 ml Becherglas vorgelegt und eine Glaselektrode mit angeschlossenem pH-Gerät eingetaucht. Unter Rühren (Magnetrührer) wird nun langsam 0,1 N Salzsäure hinzugegeben,
bis der pH von 4,4 erreicht wird.

11 g Pektinsäure werden in einem 600 ml Becherglas (Flachform) vorgelegt und mit 20 ml Alkohol (Ethanol p.A.) versetzt. 30 Minuten quellen lassen. Anschließend wird das Becherglas in einem Wasserbad mit Einhängethermostat - eingestellt auf 35°C - fixiert und ein Rührmotor mit Flügelrührer derartig darüber angebracht, dass der Flügelrührer möglichst dicht über dem Boden des Becherglases hängt.

Bei starker Rührbewegung werden 240 ml dest. Wasser in das Becherglas eingegossen und anschließend bei konstanter, starker Rührgeschwindigkeit genau 20 Minuten nachgerührt.

Es ist darauf zu achten, dass eine glatte viskose Lösung ohne Klümpchen entsteht. Danach wird der pH-Wert der Lösung mit Natronlauge (zuerst 0,5 N dann 0,1 N) auf exakt pH 4,4 eingestellt (pH-Meter). Nicht übertitrieren, da bei pH-Werten über pH 4,4 Klümpchen durch Gelbildung entstehen! Nach der pH-Einstellung wird der Inhalt des Becherglases unter gutem Nachspülen mit der Citrat-Pufferlösung pH 4,4 in einen 500 ml Messkolben übergeführt und nach Abkühlen auf 20°C mit Citratpuffer zur Marke aufgefüllt.

Vor dem Gebrauch wird die fertige Pektinsäurelösung über Glaswolle filtriert.

Von der frisch hergestellten Pektinsäurelösung werden, entsprechend der Anzahl der Enzymproben, aus Vollpipetten je 30 ml in Reagenzgläser pipettiert und vor der Fermentierung im Ultrathermostat für Reagenzgläser - eingestellt auf 30°C - etwa 5 min auf 30°C erwärmt. Der Fermentzusatz von je 3 ml (Vollpipette ausblasen) zu den 30 ml temperierter Pektinsäurelösung erfolgt unter Zeitnahme durch Drücken einer Stoppuhr. Bei mehreren Enzymproben werden die entsprechenden Enzymlösungen im Abstand von jeweils 4 min zugesetzt. Nach einer Fermentierungszeit von nicht ganz 30 min bei 30°C wird die Reaktionsprobe dem Wasserbad entnommen und in das ebenfalls auf 30°C temperierte Ostwald-Viskosimeter gefüllt. Die Lösung im Viskosimeter wird sogleich hochgesaugt, und zwar so, dass sie im Auslauf die obere Marke genau 30 min nach Beginn der Fermentierung passiert. Die Durchlaufzeit zwischen den Eichmarken wird mit einer zweiten Stoppuhr gestoppt und als Endviskosität registriert. Bei mehreren Fermentproben ist auch hier der Abstand von jeweils 4 min zwischen jeder Messung genau einzuhalten.

Die Ausgangsviskosität wird im gleichen Viskosimeter bestimmt, indem man die Durchlaufzeit von 30 ml Pektinsäurelösung bei 30°C misst, nun aber anstelle von Fermentlösung 3 ml Citratpufferlösung pH 4,4 zufügt. Die Ausgangsviskosität soll unmittelbar vor der Endviskosität bestimmt werden. Wird eine ganze Serie von Enzymproben untersucht, so wird die Ausgangsviskosität unmittelbar vor und nach der Messreihe bestimmt und der Durchschnittswert genommen.

Die relative Viskosität der fermentierten Lösung entspricht dem Verhältnis von Endviskosität (-Wasserwert) zu Ausgangsviskosität (-Wasserwert) $$\mathrm{relative\; Viskosität}\mathrm{=}\frac{\mathrm{E}\mathrm{-}\mathrm{W}}{\mathrm{A}\mathrm{-}\mathrm{W}}$$

Der Wert der relativen Viskosität soll zwischen 0,36 - 0,45 liegen. Ist dies nicht der Fall, so ist die Messung mit einer entsprechend veränderten Enzym-Einsatzmenge zu wiederholen. Zur Bestimmung der neuen Einwaage kann eine Abschätzung der Aktivität mit Hilfe der "Eichkurve über weiten Bereich" vorgenommen und die damit berechneten Einheiten als Richtwert eingesetzt werden.

$$\mathit{endo}-\mathrm{Polygalacturonase}-\mathrm{Aktivität}\left[\mathrm{U}\mathrm{/}\mathrm{ml}\right]\mathrm{=}\frac{\mathrm{k}\mathrm{\times }{\mathrm{V}}_{\mathrm{T}}\mathrm{\times }{\mathrm{V}}_{\mathrm{F}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{E}}}$$

Der Viskositätstest wird mit verschiedenen Konzentrationen eines Standardenzyms (Panzym Combi 285/12, Boehringer Ingelheim) durchgeführt. Die Enzymkonzentration, die zu einer relativen Viskosität von 0,40 führt, wird mit dem Kurvenwert von 1.100 gleichgesetzt.

Nach der alternativen Ausführungsform der Erfindung wurde in der vorstehenden Vorschrift anstelle von Pektinsäure (PGA) Apfelpektin (Sigma, Katalog-Nr. P8471) eingesetzt. Dies ermöglicht eine parallele viskosimetrische Aktivitätsbestimmung folgender Enzymaktivitäten: Pektinesterase, Pektinlyase, endo- und exo-Polygalacturonase.

Bei der Pektinspaltung durch Pektinlyase entsteht eine Doppelbindung zwischen C-Atom 4 und C-Atom 5 des neu entstehenden nichtreduzierenden Kettenendes. Die Doppelbindung führt zur Lichtabsorption bei 235 nm. Die Geschwindigkeit, mit der die Extinktion zunimmt, dient als Maß für die Lyaseaktivität.

0,41 g Apfelpektin B (Citruspektin v. Herbstreith & Fox KG Nr. 00302026 v. 30.04.03) werden mit 0,1 n Citratpuffer von pH 5,0 auf 100 ml gelöst und (z.B. durch ein Glasfilter G2) filtriert.

In der Küvette mit 1 cm Schichtdicke werden 2,9 ml (auf 30°C temperierte) Substratlösung und 0,1 ml Enzymverdünnung pipettiert und gemischt. Bei 30°C und 235 nm wird die Extinktionszunahme über die Zeit im Vergleich zu einer Nullprobe aus 2,9 ml Substrat und 0,1 ml zuvor hitzeinaktivierter Enzymverdünnung gemessen.

Die Extinktionszunahme soll zu Beginn der Reaktion im Bereich zwischen 0,005 und 0,05 pro Minute liegen, andernfalls ist die Messung mit mehr oder weniger stark verdünnter Enzymlösung zu wiederholen.

Die Lyaseaktivität ergibt sich aus den gemessenen Extinktionszunahmewerten pro Minute (ΔExt.) bei Reaktionsbeginn: $$\mathrm{Pektinlyaseaktivität\; in\; U}\mathrm{/}\mathrm{ml}\mathrm{=}\frac{\mathrm{\Delta Ext}\mathrm{.}\mathrm{\times }\mathrm{1000}\mathrm{\times }\mathrm{30}\mathrm{\times }{\mathrm{V}}_{\mathrm{F}}}{\mathrm{5}\mathrm{,}\mathrm{5}}$$

V_F = Verdünnungsfaktor

Einer spezifischen Pektinesterase-Einheit (PEase-E) entspricht die Enzymmenge in g, die in einer Minute ein Mikroäquivalent Methylestergruppen in einer Pektinlösung, die 550 mg hochverestertes Citruspektin enthält, bei 30°C und dem pH-Optimum von 4,4 spaltet.

Alkalimetrische Titration der Pektinlösung während des En-zymierungsvorganges bei 30°C und bei konstant gehaltenem pH-Wert von 4,4 mit 0,02 N Natronlauge. Die ersten 5 min nach der Enzymzugabe zur Pektinlösung dienen zur Einstellung des Soll-pH-Wertes. Die eigentliche Titration von genau 20 min Dauer beginnt nach dieser Zeit.

In einem Wasserbad mit Einhängethermostat - eingestellt auf 30°C - wird ein Becherglas (200 ml) so befestigt, dass es zur Hälfte darin eintaucht. 20 ml der Pektinlösung werden in das Becherglas gegeben und genau 15 min temperiert.

Innerhalb dieser Zeit wird eine Glaselektrode, angeschlossen an ein pH-Meter mit Titrator, derart befestigt, dass sie in dem Becherglas in die Pektinlösung eintaucht. Ebenso werden ein Flügelrührer und die zwei Zuleitungen der Autobüretten mit . 0,1 N und 0,01 N NaOH installiert.

Nach Ablauf der 15 min werden 2 ml Enzymlösung in die Pektinlösung pipettiert und unter ständigem Rühren gehalten.

Nun wird zu der Autobürette mit 0,01 N NaOH gewechselt, gleichzeitig die Stoppuhr gedrückt und weiterhin der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe der 0,01 N NaOH auf pH 4,4 gehalten. Exakt 10 min nach der Zeitnahme wird die verbrauchte Menge 0,01 N NaOH abgelesen.

Die verbrauchte Menge 0,01 N NaOH soll zwischen 1,6 und 4 ml liegen. Ist dies nicht der Fall, so ist die Messung mit einer entsprechend veränderten Enzymeinsatzmenge bzw. Verdünnung zu wiederholen.

$$\mathrm{Pektinesteraseaktivität}\left[\mathrm{U}\mathrm{/}\mathrm{ml}\right]\mathrm{=}\frac{\mathrm{A}\mathrm{\times }\mathrm{M}\mathrm{\times }{\mathrm{V}}_{\mathrm{F}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{E}}\mathrm{\times }\mathrm{t}}$$

Cellulase spaltet die β-1,4-Bindung zwischen den Glucoseeinheiten innerhalb eines Stärkemoleküls. Die dabei freigesetzte Glucose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen.

Beim Erwärmen von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974).

Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.

Lösung A und Lösung C werden ohne Nachspülen in Lösung B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.

Substrat:	2,0 g Avicel in 90 ml Puffer
Puffer:	0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5
Standardlösung:	2,0 g/l Glucose (Traubenzucker) in dest. Wasser

1,5 ml Substratlösung (unter Rühren entnehmen!) 10 min. bei 50°C inkubieren, danach 0,5 ml flüssiges Enzympräparat (für den Blindwert 0,5 ml Puffer) zusetzen. Nach genau 20 min Reaktionszeit wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt, und 20 min bei 4200 rpm zentrifugiert. 1,0 ml Überstand werden mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz versetzt und 5 min im siedenden Wasserbad gekocht. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.

Statt Substrat- und Enzymlösung werden 2 ml Standard im Test eingesetzt. Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der Kalibriergeraden:

c(Glucose) in g/l	Standardlsg. in µl	dest. Wasser in µl
0,1	100	1900
0,125	120	1880
0,16	160	1840
0,22	220	1780
0,24	240	1760
0,28	280	1720
0,3	300	1700

$$\mathit{C}\mathit{1}\mathit{-}\mathit{Cellulase}\mathit{-}\mathit{Aktivität}\left[\mathit{U}\mathit{/}\mathit{ml}\right]\mathit{=}\frac{c\left(\mathit{Glucose}\right)}{\mathit{M}\left(\mathit{Glucose}\right)}\mathit{\cdot }\frac{{\mathit{V}}_{\mathit{Reaktionslsg}\mathit{.}}}{{\mathit{V}}_{\mathit{Enzym}\mathit{.}}{\mathit{t}}_{\mathit{Reaktion}}}\mathit{\cdot }\mathit{Verd}\mathit{.}$$

Laminarinase spaltet die β-1,3-Bindung zwischen den Glucoseeinheiten innerhalb des Laminarins. Die dabei freigesetzte Glucose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen.

Beim Erwärmen von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974)..

Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und 0-Methylsaccharide erfasst werden.

0,5 % Laminarin in 0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5 ; Puffer auf ca. 40°C erhitzen, Laminarin unter Rühren zugeben.

Puffer:	0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5
Standardlösung:	2,0 g/l Glucose (Traubenzucker) in dest. Wasser.

0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Enzymlösung mischen; bei 40°C für 15 min inkubieren, danach sofort in Eisbad stellen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min im siedenden Wasserbad kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.

0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Wasser mischen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min im siedenden Wasserbad kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.

1,0 ml verdünnte Standardlösung mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz mischen und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.

c(Glucose)	Standardlsg.	dest. Wasser
in g/l	in µl	in µl
0,092	50	950
0, 110	60	940
0,147	80	920
0,221	120	880
0,258	140	860
0,294	160	840

$$\mathit{Laminarinase}\mathit{-}\mathit{Aktivität}\left[\mathit{U}\mathit{/}\mathit{ml}\right]\mathit{=}\frac{c\left(\mathit{Glucose}\right)}{\mathit{M}\left(\mathit{Glucose}\right)}\mathit{\cdot }\frac{{\mathit{V}}_{\mathit{Reaktionslsg}\mathit{.}}}{{\mathit{V}}_{\mathit{Enzym}\mathit{.}}{\mathit{t}}_{\mathit{Reaktion}}}\mathit{\cdot }\mathit{Verd}\mathit{.}$$

Xylanase spaltet die β-1,4-Bindung zwischen den Xyloseeinheiten innerhalb eines Xylanmoleküls. Die dabei freigesetzte Xylose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen.

Beim Erwärmen von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Caboxylgrüppe oxidiert (Kakác und Vejdelek, 1974).

Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.

Lösung A:
38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml dest. Wasser lösen. In der Lösung werden dann 2,425 g NaOH (Plätzchen) gelöst.
Lösung B:
1,325 g 3,5-Dinitrosalicylsäure (C₇H₄N₂O₇; 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
Lösung C:
1,05 g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH (Plätzchen) und 1,05 g Na₂S0₄ zugeben und unter Rühren lösen.
Gebrauchslösung:
Lösung A und Lösung C werden ohne Nachspülen in Lösung B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.

Substrat:	2,0 g Xylan in 90 ml Puffer
Puffer:	0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5
Standardlösung:	2,0 g/l Xylose in dest. Wasser

1,5 ml Substratlösung (unter Rühren entnehmen!) 10 min bei 50°C inkubieren, danach 0,5 ml flüssiges Enzympräparat (für den Blindwert 0,5 ml Puffer) zusetzen. Nach genau 20 min Reaktionszeit wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt, und 20 min bei 4200 rpm zentrifugiert. 1,0 ml Oberstand werden mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz versetzt und 5 min im siedenden Wasserbad gekocht. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.

Statt Substrat- und Enzymlösung werden 2 ml Standard im Test eingesetzt. Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der Kalibriergeraden:

c(Xylose)	Standardlsg.	dest. Wasser
in g/l	in µl	in µl
0,1	100	1900
0,125	120	1880
0,16	160	1840
0,22	220	1780
0,24	240	1760
0,28	280	1720
0,3	300	1700

$$\mathit{Xylanase}\mathit{-}\mathit{Aktivität}\left[\mathit{U}\mathit{/}\mathit{ml}\right]\mathit{=}\frac{c\left(\mathit{Xylose}\right)}{\mathit{M}\left(\mathit{Xylose}\right)}\mathit{\cdot }\frac{{\mathit{V}}_{\mathit{Reaktionslsg}\mathit{.}}}{{\mathit{V}}_{\mathit{Enzym}\mathit{.}}{\mathit{t}}_{\mathit{Reaktion}}}\mathit{\cdot }\mathit{Verd}\mathit{.}$$

Die Lipase-Aktivität wird mit der pH-Stat-Methode bestimmt. Als Substrat wird Triolein verwandt. Es wird eine Substratlösung (30 ml) bestehend aus 2 % w/v Gummi Arabicum, 5 % v/v Substrat in Wasser hergestellt und mit einen Homogenisator emulgiert. Dazu wird 1 ml Enzymlösung gegeben. Die in der Reaktion freigesetzte Säure wird mit 0,01 M Natronlauge zurücktitriert, um den pH-Wert konstant zu halten. Aus der Menge an NaOH berechnet man die Menge der freigesetzten Säure und folglich die Aktivität des Enzyms. Zur Bestimmung der Autohydrolyse wird die Enzymlösung durch destilliertes Wasser ersetzt.

Die Messungen werden bei 37°C und pH 7,5 jeweils dreimal durchgeführt. Die erhaltenen Aktivitätswerte in U/ml werden auf die Gesamtzusammensetzung aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen und Enzymmischung (d.h. die Aktivität in der bereits zur Ölgewinnung eingesetzten Enzymmischung) umgerechnet.

Die Phospholipase C-Aktivität wird mit p-Nitrophenylphosphorylcholin als Testsubstanz durchgeführt. Zu 50 µl einer p-Nitrophenylphosphorylcholin-Lösung (100 mM in 50 mM Borax-HCl, pH 7,5) werden 50 µl Enzymlösung gegeben. Das durch die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphorylcholin entstehende p-Nitrophenol wird bei 410 nm am Photometer gemessen. Als Negativkontrolle wird die Enzymlösung durch destilliertes Wasser ersetzt. Zur Kalibrierung (Eichung) wird eine p-Nitrophenollösung (100 mM in 50 mM-Borax-HCl, pH=7,5) frisch angesetzt. Durch Herstellung geeigneter Verdünnungen und Vermessung dieser Lösungen bei 410 nm im Photometer ist die Erstellung einer Eichkurve möglich. Jede Messung wird jeweils dreimal durchgeführt. Die erhaltenen Aktivitätswerte in U/ml werden auf die Enzymmischung umgerechnet. Soweit p-Nitrophenylphosphorylcholin durch die Enzymlösungen nicht gespalten wird liegt keine Phospholipase C-Aktivität vor.

Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden nicht beschränkenden Beispiele näher erläutert.

Etwa 900 g vorentölte Olivenmasse (Olea europaea hojiblanca cv., zweite Reifestufe) wurden eingewogen, mit 50 ml Wasser bzw. wässriger Enzymlösung versetzt und für 60 min bei 40°C in einem 2000ml Becherglas unter Rühren mit einem Wendelrührer (150 rpm) inkubiert. Danach wurde eine Fest-Flüssigtrennung durch Zentrifugation in 500 ml Edelstahlbechern in einer Heräus Zentrifuge vom Typ KS IV (2000 g, 20°C) durchgeführt. Die Flüssig-FlüssigTrennung erfolgte in einem Scheidetrichter bei Raumtemperatur über Nacht. Die wässrige Phase wurde abgelassen, der Auslauf trocken gewischt und die Menge des verbleibenden Öls gravimetrisch bestimmt. Die relative Ölausbeute bei alleinigem Zusatz von Wasser ohne Enzymmischung (Vergleichsprobe) betrug 0,41% (w/w), bei einem Zusatz von 10 µl einer erfindungsgemäßen Enzymmischung (Enzymquellen wie vorstehend angegeben):

exo-PGase:	900 U/ml
Pektinlyase:	61.400U/ml
endo-PGase: (Viskositätstest; Substrat: Pektin)	5.500 U/ml
endo-PGase: (Viskositätstest; Substrat: PGA)	2.060 U/ml
Pektinesterase:	340 U/ml
Cl-Cellulase: (Avicelase)	2,8 U/ml
Laminarinase:	9,3 U/ml
Xylanase:	1.820 U/ml

betrug die Ausbeute 1,11% (w/w) oder 270% der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 50 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die Ausbeute 1,14% (w/w) oder 278% der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 100 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die Ausbeute 1,26% (w/w) oder 307% der Vergleichsprobe und bei einem Zusatz von 200 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die Ausbeute 1,45% (w/w) oder 354% der Vergleichsprobe.

Etwa 600 g vorentölte Olivenmasse (Olea europaea hojiblanca cv., dritte Reifestufe) wurden eingewogen und ohne bzw. mit wässriger Enzymlösung für 60 min bei 35°C in einem Edelstahlgefäß unter Rühren mit einem Wendelrührer (150 rpm) inkubiert. Die Fest-Flüssigtrennung erfolgte durch Zentrifugation bei 3.500 g für 60 s. Die Ölausbeute wurde nach einstündiger Phasentrennung in einem Standzylinder volumetrisch bestimmt.

Die relative Ölausbeute ohne Enzymzusatz (Vergleichsprobe) betrug 2,5 ± 0,1% (w/w), bei einem Zusatz von 150 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung (vgl. oben) betrug die relative Ausbeute 4,0 ± 0,2% (w/w) oder 163,6 ± 4,2% (w/w) der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 250 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die relative Ausbeute 4,3 ± 0,2% (w/w) oder 177,3 ± 3,9% (w/w) der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 350 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die relative Ausbeute 4,8 ± 0,1% (w/w) oder 195,5 ± 2,0% (w/w) der Vergleichsprobe und bei einem Zusatz von 450 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die relative Ausbeute 4,9 ± 0,1% (w/w) oder 200,0 ± 2,0% (w/w) der Vergleichsprobe.

1.500 kg Oliven der Sorte Olea europaea hojiblanca cv., 2. Reifephase, wurden eingewogen, zerkleinert (Hammermühle) und mit 1,5% (w/w) Talk (22.2 kg) für 68 min bei 28-30°C im horizontalen Rührbad (Pieralsi) inkubiert. Der Massenstrom war Q = 1100 kg/h. Das Öl wurde durch Fest-/Flüssigtrennung in einem horizontalen Zwei-Phasendekanter (Modell M-2 Pieralisi) und Flüssig-/Flüssigtrennung in einer vertikalen Zentrifuge isoliert (jeweils kontinuierlich). Restölgehalt und Feuchtigkeit der entölten Olivenmasse wurden bestimmt (Versuche 3F0498 und 3F0502). Anschließend wurden 1.250 kg der entölten Olivenmasse aus dem ersten Prozessschritt eingewogen. Die Masse wurde ohne Enzymzusatz (Referenzprobe) bzw. mit einem Zusatz von 150 ml erfindungsgemäßer Enzymmischung (vgl. oben) pro Tonne, jedoch in beiden Fällen ohne weiteren Zusatz von Talk, für 50 min bei 37-40°C (Referenzprobe) bzw. 39-40°C (enzymbehandelte Probe) im horizontalen Rührbad inkubiert. Das Öl wurde durch Fest-/Flüssigtrennung in einem horizontalen Zwei-Phasendekanter (Modell M-2 Pieralisi) und Flüssig-/Flüssigtrennung in einer vertikalen Zentrifuge isoliert (jeweils kontinuierlich). Der Massenfluss betrug wiederum Q = 1.100 kg/h. Restölgehalt und Feuchtigkeit in Referenzprobe (Versuch 3F0500) und behandelter Probe (3F0504) wurden bestimmt.

Die Bestimmung des Restölgehaltes wurde durch Soxhlet-Extraktion (Spanische Einheitsnorm UNE 55030) vorgenommen, die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehaltes durch Trocknen bei 110°C bis zur Gewichtskonstanz.

	Untersuchung 1	Untersuchung 2	Untersuchung 3	Durchschn.	Standardabweichung
Feuchtigkeit
(w/w)	53,35%	53,34%	52,93%	53,21%	0,24%
Restöl in TM
(w/w)	7,71%	7,78%	7,75%	7,75%	0,04%
Restöl in Rohmasse
(w/w)	3,59%	3,63%	3,65%	3,62%	0,03%

TM = Trockenmasse

	Untersuchung 1	Untersuchung 2	Untersuchung 3	Durchschn.	Standardabweichung
Feuchtigkeit
(w/w)	57,84%	57,75%	57,92%	57,84%	0,09%
Restöl in TM
(w/w)	5,05%	5, 07%	4,94%	5, 02%	0,07%
Restöl in Rohmasse
(w/w)	2,13%	2,14%	2,08%	2,12%	0,03%

	Untersuchung 1	Untersuchung 2	Untersuchung 3	Durchschn.	Standardabweichung
Feuchtigkeit
(w/w)	53,87%	53,89%	52,56%	53,77%	0,19%
Restöl in TM
(w/w)	7,98%	7,82%	7,83%	7,88%	0,09%
Restöl in Rohmasse
(w/w)	3,68%	3,61%	3,63%	3,64%	0,04%

	Untersuchung 1	Untersuchung 2	Untersuchung 3	Durchschn.	Standardabweichung
Feuchtigkeit
(w/w)	58, 01%	57,89%	58,16%	58, 03%	0,14%
Restöl in TM
(w/w)	4,63%	4,60%	4,62%	4,62%	0,02%
Restöl in Rohmasse
(w/w)	1,95%	1,94%	1,93%	1,94%	0,01%

Die relative Ölausbeute aus der zweiten Pressung ergibt sich durch die Berechnung der Differenz zwischen Restölgehalt in der Rohmasse nach dem ersten Schritt und dem äquivalenten Restölgehalt nach dem zweiten Schritt, geteilt durch den Restölgehalt aus dem ersten Schritt.

Für die Referenzprobe 3F0500 bedeutet dieses, dass im Verhältnis zur Probe 3F0498 eine relative Ölausbeute von 1,50% ± 0,04% _: 3,62% ± 0,03%, entsprechend 41,44% ± 1,42% bezogen auf Rohmasse erreicht wurde. Bezogen auf Trockenmasse ergibt sich eine relative Ölausbeute von 2,73% ± 0,08% : 7,75% ± 0,04%, entsprechend 35,22% ± 1,21%.

Für die mit der erfindungsgemäßen Enzymmischung behandelten Probe 3F0504 bedeutet dieses, dass im Verhältnis zur Probe 3F0502 eine relative Ölausbeute von 1,70% ± 0,04% : 3,64% ± 0,04%, entsprechend 46,70% ± 1,21% bezogen auf Rohmasse erreicht wurde. Bezogen auf Trockenmasse ergibt sich eine relative Ölausbeute von 3,26% ± 0,09 % : 7,88 % ± 0,09%, entsprechend 41,37% ± 1,62%.

Bei einer Zugabe von 150 ml erfindungsgemäßer Enzymmischung pro Tonne vorentölter Olivenmasse konnte in diesem Versuch eine mittlere Mehrausbeute von 17,5% bezogen auf Trockenmasse erzielt werden kann.

Insgesamt 31.000 kg vorentölte Olivenmasse, gewonnen aus der Sorte Olea europaea picual cv., die für 24 Tage unter Luftabschluss gekühlt gelagert worden war, wurden als Ausgangsmaterial für den nachfolgend beschriebenen Versuch eingesetzt. In einem semiparallelen Ansatz wurden zunächst jeweils 15.500 kg dieser Olivenmasse ohne bzw. mit Zusatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung (insgesamt 250 g/t, aufgenommen in 1,5 1 Wasser) für 60 min bei 33-35°C in horizontalen Rührbädern mit zwei Ebenen (Pieralisi) inkubiert. Das Öl wurde durch Fest-/Flüssigtrennung in einem horizontalen Zwei-Phasendekanter (Modell SPI7 Pieralisi, Massenstrom 2500-2725 kg/h) und Flüssig-/Flüssigtrennung in einer Zentrifuge (Modell P2000 Pieralisi) unter Zugabe von 300 1/h Wasser mit einer Temperatur von 38°C isoliert. Das in den parallelen Ansätzen isolierte Öl wurde anschließend gelagert und die Ausbeute über Ablesen einer Niveauanzeige in den Lagerungsbehältern bestimmt, wobei 1 cm Niveauunterschied einer Ölmenge von 95,26 kg entsprach.

	Feuchtigkeit (w/w)	(Rest-)Öl in TM (w/w)	(Rest-)Öl in Rohmasse (w/w)
Ausgangsmasse für Referenz	73,58%	12, 54%	3,31%
Masse nach Prozess Referenz	74,62%	4,69%	1,19%
Ausgangsmasse für Behandlung	73,14%	12,99%	3,49%
Masse nach Prozess mit Enzymbehandlung	75,33%	0,50%	0,12%

	Niveau-Unterschied	Ölmenge	Rel. Ausbeute
Referenz (ohne erf.-gem. Enzymmischung)	3,5 cm	333,41 kg	2,15%
Behandelte Probe (mit erf.-gem- Enzymmischung)	5,5 cm	523,93 kg	3,38%

Bei einer Zugabe von 250 g erfindungsgemäßer Enzymmischung pro Tonne vorentölter Olivenmasse unter den gegebenen Bedingungen konnte in diesem Versuch bezogen auf die bestimmten Trockenmassen eine Mehrausbeute von 63% im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe erzielt werden. Der minimale Restölgehalt in der behandelten Olivenmasse macht eine Weiterverarbeitung in einem chemisch-extraktiven Verfahren überflüssig.

In die Untersuchungen wurde das kommerziell erhältliche Produkt Olivex® der Firma Novozymes A/S, DK, einbezogen (nachstehend als KP1 bezeichnet). Für die nachfolgend beschriebenen Experimente wurden alle Enzymaktivitäten gemäß den im vorstehenden Methodenteil aufgeführten Verfahren bestimmt. Dabei konnten die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Einzelaktivitäten bestimmt werden:

Enzymaktivität	KP1 (U/ml)
exo-PGase	1.710
endo-PGase*	2.720
Pektinesterase	270
C1-Cellulase	4
Laminarinase	21

* bestimmt gemäß Methodenteil mit PGA (Pektinsäure) als Substrat

Für die Vergleichsmessungen wurden jeweils 600 g vorentölte Olivenmasse (Olea europaea hojiblanca cv., dritte Reifestufe) eingewogen und ohne bzw. mit wäßriger Enzymlösung (150 µl des Vergleichsprodukts, ggf. plus Zugabe von Pektinesterase) für 60 min bei 35°C in einem Edelstahlgefäß unter Rühren mit einem Wendelrührer (150 rpm) inkubiert. Die Fest-/Flüssigtrennung erfolgte durch Zentrifugation bei 3.500 g für 60 s. Die Ölausbeute wurde nach einstündiger Phasentrennung in einem Standzylinder volumetrisch bestimmt.

Unterschiedliche Verhältnisse zwischen Pektinesterase und den anderen Enzymen wurden in den Versuchen durch Zugabe von definierten Mengen einer Pektinesterase aus Orangenschale (Sigma/Aldrich, Katalognummer P5400) eingestellt. Dafür wurde das lyophilisierte Enzym in einem Puffer (3,2 M (NH₄)₂SO₄ und 0,1 M NaCl, pH=7,0) aufgenommen und auf eine Aktivität von 75 U/ml eingestellt. Die Zugabe wurde in Inkrementen von jeweils 7,5 U durchgeführt, es erfolgte eine Doppelbestimmung. Die Versuchsergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengestellt. Die Ölausbeute ohne jegliche Enzymzugabe betrug 14,7 ± 0,6 ml, die Ölausbeute bei Zugabe von 150 µl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug 24,5 ± 0,4 ml.

	KP1 (Zugabe 150 µl)
Zugabe PEase [U]	Ölausbeute 1 [ml]	Ölausbeute 2 [ml]	Mittelwert [ml]
0	17,0	17,4	17,2 ± 0,3
50	18,7	17,7	18,2 ± 0,7
100	18,7	20,1	19,4 ± 1,0
150	20,2	20,0	20,1 ± 0,1
200	20,8	21,4	21,1 ± 0,4
250	23,3	22,3	22,8 ± 0,7
300	23,1	22,9	23,0 ± 0,1
350	22,1	22,9	22,5 ± 0,6
400	22,3	21,7	22,0 ± 0,4
450	21,0	22,6	21,8 ± 1,1
500	22,2	21,0	21,6 ± 0,8
550	22,0	21,8	21,9 ± 0,1
600	21,0	21,0	21,0 ± 0,0

Eine grafische Auswertung beider Analysen ist in Fig. 1 zu finden. Es wird deutlich, dass die Veränderung der Verhältnisse der Enzymaktivitäten durch Zugabe von Pektinesterase zum Produkt KP1 zu einer deutlichen Verbesserung der Ölausbeute führt.

Die aus der Zugabe von Pektinesterase resultierenden Veränderungen der Aktivitätsverhältnisse sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt, Volumeneffekte wurden dabei nicht berücksichtigt. Aus den Tabellen geht hervor, dass die Einstellung der Verhältnisse der Enzymaktivitäten in die erfindungsgemäßen Bereiche mit einer starken Erhöhung der Ölausbeute bei KP1 korreliert ist. Einstellung Enzymaktivitäten KP1

Zugabe	Aktivität PEase	PEase:	PEase:
PEase [U]	[U]	exo-PGase	endo-PGase
0,0	40,5	0,158	0,099
7,5	48,0	0,187	0,118
15,0	55,5	0,216	0,136
22,5	63,0	0,246	0,154
30,0	70,5	0,275	0,173
37,5	78,0	0,304	0,191
45,0	85,5	0,333	0,210
52,5	93,0	0,363	0,228
60,0	100,5	0,392	0,246
67,5	108,0	0,421	0,265
75,0	115,5	0,450	0,283
82,5	123,0	0,480	0,301
90,0	130,5	0,509	0,320

Die nachfolgenden Beispiele belegen die Verbesserung der Qualität von Olivenöl bei Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmischung.

Frische, einfach industriell physikalisch/mechanisch vorentölte Olivenpulpe wurde in einem zweiten industriellen Prozessschritt (Entölungsanlage Pieralisi Typ M-2) unter Zugabe von 250 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung gemäß Beispiel 1 bzw. ohne Zugabe der erfindungsgemäßen Enzymmischung zum horizontalen Malaxer entölt. Die Inkubationszeit im horizontalen Malaxer betrug jeweils 60 min bei 40°C. Die erhaltenen Öle wurden hinsichtlich ihrer Säuregehalte und ihrer spektroskopischen Daten (nach EC 2568/91 in der letzten Änderung vom 6. November 2003 (EC 1989/2003)) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1: Analysenergebnisse Säuregehalt und spektrophotometrische Daten

	Öl ohne Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung	Öl bei Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung
Säuregehalt [%]	2,12	1,86
K270	0,42	0,30
K232	1,77	1,69
ΔK	0	-0,007

Durch Einsatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung im gegebenen Prozess wird der Säuregehalt des Öls um 12,3% erniedrigt. Die Extinktion bei λ=270 nm (K270), ein Maß für für die Konzentration an konjugierten Dienen bzw. Trienen im Öl, verringert sich in diesem Fall um 28,6%, die Extinktion bei λ=232 nm (K232), ein Maß für die Konzentration an peroxidischen Oxidationsprodukten im Öl, verringert sich um 4.5%. Die Veränderung des AK-Wertes (nach EC 2568/91 in der letzten Änderung vom 6. November 2003 (EC 1989/2003)), ein Maß für die Variation des Extinktionkoeffizienten bei 270 ± 4 nm und somit für die Art des Prozessierungsregimes für das betreffende Öl, kann hier vernachlässigt werden.

Zusammenfassend kann also festgehalten werden, dass der Einsatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung einen positiven Effekt (Reduktion) auf die Qualitätsparameter Säuregehalt und Konzentration an konjugierten Dienen bzw. Trienen des gewonnenen Öl hat.

Frische, einfach industriell physikalisch/mechanisch vorentölte Olivenpulpe wurde in einem zweiten industriellen Prozessschritt (Entölungsanlage Pieralisi Typ M-2) unter Zugabe von 250 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung gemäß Beispiel 1 bzw. ohne Zugabe der erfindungsgemäßen Enzymmischung zum horizontalen Malaxer entölt. Die Inkubationszeit im horizontalen Malaxer betrug jeweils 60 min bei 40°C. Die erhaltenen Öle wurden hinsichtlich ihrer Säuregehalte, ihrer spektroskopischen Daten und ihres Gehaltes an freien Fettsäuren (nach EC 2568/91 in der letzten Änderung vom 6. November 2003 (EC 1989/2003)) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2: Analysenergebnisse Säuregehalt, spektrophotometrische Daten und freie Fettsäuren

	Öl ohne Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung	Öl bei Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung	Reduktion bei Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung
Säuregehalt [%]	0,62	0,58	6,45%
K270	0,39	0,35	10,26%
K232	2,07	1,96	5,31%
ΔK	-0,004	-0,003	25,00%
Myristinsäure [%]	0,02	0,01	50,00%
Palmitinsäure [%]	15,89	15,69	1,26%
Palmitoleinsäure [%]	2,03	1,95	3,94%
Stearinsäure [%]	1,91	1,82	4,71%
Linolensäure [%]	0,70	0,63	10,00%
Arachidonsäure [%]	0,43	0,40	6,98%
Gadoleinsäure [%]	0,42	0,33	21,43%
Behensäure [%]	0,13	0,13	0,00%
Lignocerinsäure [%]	0,1	0,05	50,00%
trans-Ölsäure-Isomere [%]	0	0	-
trans-Linol-/ Linolensäure-Isomere [%]	0,03	0	100,00%

Es ist festzuhalten, dass der Einsatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung einen positiven Effekt (Reduktion) auf die Parameter Säuregehalt und Konzentration an konjugierten Dienen bzw. Trienen des gewonnenen Öl hat. Weiterhin ist ein positiver Einfluss (Reduktion) auf den Gehalt an freien Fettsäuren zu beobachten. Zusammengefaßt kann eine positive Einwirkung der erfindungsgemäßen Enzymmischung auf die hier dargestellten Qualitätsparameter des Olivenöls beobachtet werden.

Frische, einfach industriell physikalisch/mechanisch vorentölte Olivenpulpe wurde in einem zweiten industriellen Prozessschritt (Entölungsanlage Pieralisi Typ M-2) unter Zugabe von 250 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung gemäß Beispiel 1 bzw. ohne Zugabe der erfindungsgemäßen Enzymmischung zum horizontalen Malaxer entölt. Die Inkubationszeit im horizontalen Malaxer betrug jeweils 60 min bei 40°C. Die erhaltenen Öle wurden hinsichtlich der in Tabelle 3 aufgeführten Parameter (nach EC 2568/91 in der letzten Änderung vom 6. November 2003 (EC 1989/2003)) analysiert. Tabelle 3: Ergebnisse weiterer Analysen (Sterole, Wachse etc.)

	Öl ohne Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung	Öl bei Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung	Reduktion bei Verw. der erfindungsgem. Enzymmischung
Cholesterol [%]	0,13	0,13	0%
Brassicasterol [%]	0	0	0%
Campesterol [%]	3,86	3,75	2,85%
Stigmasterol [%]	1,28	1,28	0,00%
β-Sitosterol [%]	93,82	93,67	0,16%
Δ-5,24-Stigmastadienol [%]	0,62	0,52	16,13%
Δ-7-Avenasterol [%]	0,31	0,29	6,45%
Δ-7-Stigmasterol [%]	0,26	0,26	0%
Gesamt-Sterole [mg/kg]	2383	2308	3,15%
Wachse [mg/kg]	707	450	36,35%
Trilinolein [%]	0,23	0,23	0,00%
ΔECN42*	0,03	0	100,00%

* (nach EC 2568/91 in der letzten Änderung vom 6. November 2003 (EC 1989/2003))

Es ist festzuhalten, dass ein positiver Einfluss (Reduktion) auf die meisten der hier analysierten Parameter zu beobachten ist. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung hat keinen Einfluß Gehalt an Cholesterol, Brassicasterol, Stigmasterol, A-7-Stigmasterol und Trilinolein. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmischungen erhaltenen Öle keinerlei negativen Veränderungen in den hier untersuchten analytischen Parametern erfahren und die unbedingt erwünschte Echtheit des Olivenöls unter Verbesserung einiger analytischer Parameter erhalten bleibt.